CN103571856A - 一种生产1,3-二羟基丙酮工程菌的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产1,3-二羟基丙酮工程菌的制备方法，是以产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大肠杆菌表达载体pBluescriptSK-上，构建克隆载体pSK-gldA，并在E.ColiＪＭ１０９中成功表达。一种表达1,3-二羟基丙酮的方法，是用含甘油的培养基对本发明的用于表达1，3-二羟基丙酮的工程菌进行发酵，通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1,3-二羟基丙酮。本发明的1,3-二羟基丙酮高产重组工程菌的构建方法简单、产量高、成本低廉。基于上述优点，本发明的工程菌将在1,3-二羟基丙酮的生物法制备中发挥重要的作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种生产1,3-二羟基丙酮工程菌的制备方法。
背景技术
1,3-二羟基丙酮一种重要的化工、生化原料，医药、农药合成中间体和多功能食品添加剂，用途十分广泛。二羟基丙酮的合成方法主要有贵重金属催化氧化法和微生物法。重金属催化氧化甘油的合成法，由于无法克服催化选择性差的致命缺点，致使甘油转化率低于40%，DHA的产率低于25%。工业生产方法目前是利用微生物分批发酵。该法是在菌体生长到适当的时期，利用菌体产生的脱氢酶以甘油为底物进行脱氢反应，产生DHA。用于生产DHA的微生物主要是醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)微生物，尤其是弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖杆菌(Gluoonobacter Oxydans)。菌种在复苏后先进行预培养，然后转发酵罐扩大培养，待菌种达到一定浓度后，接种到含有甘油的发酵培养基当中，经过60-80h的耗氧发酵后，再将发酵液一次放出，经分离纯化得到DHA。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌体生长到对数期时，并在产物DHA达到一定水平后，放出部分产物，并补加原料和培养基，这样就可以减少达到生产水平的生物量的时间，提高底物甘油的利用率，节约成本。分批发酵的特点是微生物所处的环境是不断变化的，发生杂菌污染，能够很容易终止操作。在发酵生产中，使用的菌种处于对数生长期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。但该法的主要问题是底物甘油和产物DHA在培养基中的浓度过高时产生了高渗透压，使得发酵菌体裂解、失活，从而导致DHA的产率难以提高。本发明以产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大肠杆菌表达载体pBluescript SK-上，构建克隆载体pSK-gldA，并在E.Coli ＪＭ１０９中成功表达。构建的甘油脱氢合成1,3-二羟基丙酮工业工程菌，在含有甘油的培养基中发酵合成1,3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1,3-二羟基丙酮。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到75%以上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产1,3-二羟基丙酮的重组工程菌的制备方法。
本发明通过下述方法实现的：
以产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大肠杆菌表达载体pBluescript SK-上，构建克隆载体pSK-gldA，并在E.Coli ＪＭ１０９中成功表达。构建的甘油脱氢合成1,3-二羟基丙酮工业工程菌，在含有甘油的培养基中发酵合成1,3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1,3-二羟基丙酮。
质粒子及菌株：
克隆载体pBluescript SK-，大肠杆菌E.Coli ＪＭ１０９购自商业公司。
限制性内切酶，Taq酶，T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司。其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。
产气气杆菌分离培养基：蒸馏水1000mL,甘油5g,NaCl 5g,酵母粉5 g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红（Nile Red）2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。
富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10 g,琼脂粉10g,甘油3g,(NH4)2SO4 5g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.
产品发酵培养基：
磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH2PO4.12H2O 8.95g，KH2PO4 1.5g,pH7.0 0.1MPa灭菌，15min～20min,备用。
基因工程菌富集培养基为 LB 培养基。发酵培养基为添加15.0%甘油的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35℃。
产气气杆菌脱氢酶基因的获得与重组质粒的构建：
通过对1,3-二羟基丙酮合成酶gldA进行序列分析，设计了保守引物：primer-I:5`-GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3`primer-II:5`-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3`。以产气气杆菌基因组DNA为模版扩增得到一个大的片段，从中分析得到DHA合成酶基因1133bp大小的开放阅读框，根据获得的序列设计DHA合成酶基因gldA的扩增引物，在上下游分别引入了XbaI和EcoRI位。对pBluescript SK-和PCR扩增产物进行XbaI和EcoRI双酶处理，回收后在T4DNA连接酶作用下16℃连续过夜，以备转化。
PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。
将gldA基因和载体质粒pBluescript SK-同时进行XbaI和EcoRI双酶切，酶切后利用T4连接酶将gldA基因连接到质粒pBluescript SK-中，得重组质粒pSK-gldA。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：
根据《分子克隆实验指南》钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、150r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。
产气气杆菌发酵及DHA的提取：
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入产气气杆菌的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃～37℃、130r/min振荡培养72h。
重组大肠杆菌发酵生产1,3-二羟基丙酮：
-70℃保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，30℃～37℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1～2mmol/L的IPTG诱导gldA的表达，发酵培养72h。
发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:3～4体积）重结晶得到产品。
本发明的1,3-二羟基丙酮高产重组工程菌的构建方法简单、产量高、成本低廉。基于上述优点，本发明的工程菌将在1,3-二羟基丙酮的生物法制备中发挥重要的作用，应用前景广阔。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。
实施例1
质粒子及菌株：
克隆载体pBluescript SK-，大肠杆菌E.Coli ＪＭ１０９购自商业公司。
限制性内切酶，Taq酶，T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司。其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。
产气气杆菌分离培养基：蒸馏水1000mL,甘油5g,NaCl 5g,酵母粉5 g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红（Nile Red）2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。
富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10 g,琼脂粉10g,甘油3g,(NH4)2SO4 5g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.
产品发酵培养基：
磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH2PO4.12H2O 8.95g，KH2PO4 1.5g,pH7.0 0.1MPa灭菌，15min～20min,备用。
基因工程菌富集培养基为 LB 培养基：发酵培养基为添加15.0%甘油的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35℃。
产气气杆菌脱氢酶基因的获得与重组质粒的构建：
通过对1,3-二羟基丙酮合成酶gldA进行序列分析，设计了保守引物：primer-I:5`-GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3`primer-II:5`-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3`。以产气气杆菌基因组DNA为模版扩增得到一个大的片段，从中分析得到DHA合成酶基因1133bp大小的开放阅读框，根据获得的序列设计DHA合成酶基因gldA的扩增引物，在上下游分别引入了XbaI和EcoRI位。对pBluescript SK-和PCR扩增产物进行XbaI和EcoRI双酶处理，回收后在T4DNA连接酶作用下16℃连续过夜，以备转化。
PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。
将gldA基因和载体质粒pBluescript SK-同时进行XbaI和EcoRI双酶切，酶切后利用T4连接酶将gldA基因连接到质粒pBluescript SK-中，得重组质粒。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：
根据《分子克隆实验指南》钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、150r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。
产气气杆菌发酵及DHA的提取：
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入产气气杆菌的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养72h。
重组大肠杆菌发酵生产1,3-二羟基丙酮：
-70℃保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，33℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1mmol/L的IPTG诱导gldA的表达，发酵培养72h。
发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:3体积）重结晶得到1,3-二羟基丙酮23.1g(熔点78.9～80.0℃,收率77.0%)。
实施例2
各培养基的组成和培养条件同上。
产气气杆菌脱氢酶基因的获得与重组质粒的构建：
通过对1,3-二羟基丙酮合成酶gldA进行序列分析，设计了保守引物：primer-I:5`-GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3`primer-II:5`-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3`。以产气气杆菌基因组DNA为模版扩增得到一个大的片段，从中分析得到DHA合成酶基因1133bp大小的开放阅读框，根据获得的序列设计DHA合成酶基因gldA的扩增引物，在上下游分别引入了XbaI和EcoRI位。对pBluescript SK-和PCR扩增产物进行XbaI和EcoRI双酶处理，回收后在T4DNA连接酶作用下16℃连续过夜，以备转化。
PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。
将gldA基因和载体质粒pBluescript SK-同时进行XbaI和EcoRI双酶切，酶切后利用T4连接酶将gldA基因连接到质粒pBluescript SK-中，得重组质粒。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：
根据《分子克隆实验指南》钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中37℃、120r/min振荡培养4h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。
产气气杆菌发酵及DHA的提取：
前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入产气气杆菌的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入5瓶含有200m发酵培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养72h。
重组大肠杆菌发酵生产1,3-二羟基丙酮：
-70℃保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，36℃培养过夜，以1.5%的接种量接种于发酵培养基中，加入0.8mmol/L的IPTG诱导gldA的表达，发酵培养96h。
发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:4体积）重结晶得到1,3-二羟基丙酮36.33g(熔点78.7～80.0℃,收率80.7%)。
Claims (5)
1.本发明涉及一种生产1,3-二羟基丙酮工程菌的制备方法，包括：
（1）以产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA）；
（2）克隆到大肠杆菌表达载体pBluescript SK-上，构建克隆载体pSK-gldA；
（3）pSK-gldA在E.Coli ＪＭ１０９中表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于PCR扩增条件为：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。
3.利用权利要求1所述的重组工程菌制备1,3-二羟基丙酮的方法，包括：
（1）对所述重组工程菌进行发酵；
（2）分离发酵液，提取目的产物1,3-二羟基丙酮。
4.根据权利要求3所述的方法，其中重组产1,3-二羟基丙酮的发酵阶段发酵条件为在含有甘油的培养基中发酵合成1,3-二羟基丙酮，发酵的工艺技术条件为温度30℃～37℃、130r/min振荡培养72h。
5.根据按照权利要求3所述的方法，其特征在于发酵液先经过滤分离催化酶重复使用，利用乙酸丁酯萃取滤后发酵液，再将萃取液浓缩后，利用乙酸丁酯与石油醚按体积比1：3～4的组合溶剂重结晶，获得产品1,3-二羟基丙酮。
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| CN104845961A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-19 | 徐州奥格曼新材料科技有限公司 | 产1,3-二羟基丙酮重组基因工程菌的固定化及应用 |
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