CN103566360A - 用于治疗血小板减少的患者的纤维蛋白原包覆的白蛋白球的即用悬浮液的大规模生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗血小板减少的患者的纤维蛋白原包覆的白蛋白球的即用悬浮液以及其大规模生产。所述即用悬浮液是大量和少量的即用水性悬浮液组合物，包含人纤维蛋白原包覆的人白蛋白球和上清液，所述悬浮液可用于治疗血小板减少的患者。

Description

用于治疗血小板减少的患者的纤维蛋白原包覆的白蛋白球的即用悬浮液的大规模生产

技术领域

本发明的领域涉及纤维蛋白原包覆的白蛋白球与合适上清液的悬浮液，所述悬浮液用于治疗血小板减少的患者和预防性治疗因各种原因预计会变成血小板减少的患者。血小板减少的原因可以是外部出血，例如来自于创伤、战争情况或外科手术过程中。它可能因为内部情况，例如癌症、癌症治疗、在接触高剂量辐射后对骨髓的破坏、败血症、弥漫性血管内凝血、烧伤、病毒感染（例如HIV、埃博拉（Ebola）、登革（Dengue））、化学试剂或环境原因。用纤维蛋白原包覆的白蛋白球对这些患者中某些患者的治疗已经显示出改善了患者的状况，例如，减少了出血时间、减少了出血量、康复得更快、提高了存活率。

具体地，本发明涉及新的悬浮液制剂的发明，该悬浮液制剂包含尺寸受控减小的球和悬浮液的液相中的赋形剂组分的组合物。该新发明与所有现有技术的公开内容不同，在现有技术的公开内容中，现有技术的产品在以悬浮液形式能够在给予患者之前已经是冻干粉末，需要用液体恢复（reconstitution）成悬浮液。另外，恢复的悬浮液必须在悬浮液中的一些大球开始在容器底部沉淀形成沉积物之前在规定的期限内使用。相反，本专利申请的发明是不需要恢复步骤的即用制剂。在不振荡的情况下，即使在室温下长时间贮存，悬浮液中的球也不在容器底部形成沉淀的颗粒。悬浮液中的球和所有赋形剂组分都能经受住热处理。热处理对在将悬浮液密封于容器内之前的任何时间进入悬浮液的任何潜在的传染性病原体的灭活有效。

具体地，本发明还公开了一种具有良好一致性和重现性的生产大量悬浮液的方法。所得到的产品中不包含超过0.1%的直径大于1μm的球，且不包含任何聚集体。

具体地，本发明还包括终端灭菌的步骤，该终端灭菌无法在所有现有技术中公开的产品（即冻干产品）上进行。

本发明具有很多优点，包括：（a）在无需用规定体积的液体使干粉末恢复的情况下，将产品给予患者；（b）作为即用制剂，能够在短时间内无延迟（例如在包含恢复液体的其它瓶被打碎或遗失时）的情况下将该产品给予大量患者；（c）无需学习如何正确执行恢复方法的专门培训的人员；以及（d）如果不使用，该产品不会被浪费；与要是在规定的时间不使用就会被浪费的恢复的悬浮液相反，因为恢复的产品包含恢复后能够在悬浮液中沉淀的大球。另外，本发明容许产品（e）在室温贮存一年以上而没有可检测到的活性损失；（f）“终端灭菌”的步骤会增加产品远离传染性病原体的安全性。此外，去除现有技术中使用的步骤（即冻干步骤）会（g）降低生产和运输成本，这些成本的降低会直接转换成与全国卫生系统中血小板减少的患者的治疗和护理有关的成本的降低。

本发明具有新颖性，而且是非显而易见的，因为它涉及的是一种产品和该产品的生产方法，该产品是包含球和上清液部分的悬浮液，所述球和上清液二者对于甚至在热处理后直接用于患者是相容的。本发明公开了与现有技术的教导直接相反的教导，本发明中的球的尺寸比天然血小板的小，而且效果甚至比捐助血小板输血（transfusion）更好。

背景技术

许多发明者都曾试图生产适合静脉内给予患者的白蛋白球。这些早期的产品遇到的问题使得它们不适于大部分医疗用途，就更不用说用作人造血小板。更早的产品包括Widder的工作成果“用于抗癌药物的生物物理靶向的磁响应微球和其它载体”（K.J.Widder等人,《药理学与化学治疗进展》，第16卷，213-271页）。遗憾地是，这些球是通过在油中乳化蛋白质溶液、随后加热或深度聚合使蛋白质微滴硬化来制备。因此，它们对于身体作为外来颗粒出现，会在静脉内给药后几分钟内从血液循环中除去。因此，需要导致对体内防御系统“温和”的颗粒并使得该颗粒能够在无破坏或去除的情况下长时间停留在血液中的更好的生产方法。

Zee（1995年在中国申请的“用于促进从外科手术和医疗治疗痊愈的新型设备，其用途及生产方法”；“1995年在中国申请的“用于促进从外科手术和医疗治疗痊愈的方法，其用途及生产方法”）记载了一种适合用作人造血小板的特定类型的白蛋白球。然而，该生产方法包括添加表面活性剂，例如十四烷基磺酸钠或吐温-80，以确保球不形成直径大于7μm、能阻塞血管的聚集体。Zee还公开了通过他的方法所制备的产品需要冻干来用于长时间贮存。虽然Zee声称通过他的方法所制备的产品的“平均”尺寸小于1μm，但是很明显该产品包含一些大于1μm的大球。大于1μm的球通过水分子的布朗运动不能长时间保持悬浮。不管这些大球所占有的百分比是多少，这些大于1μm的球会快速沉淀到容器底部。仅通过振荡容器无法使这些沉积物重新分离成单个的球。在对患者静脉内给药时，沉淀层中块的存在能够造成血管堵塞。因此，Zee的产品必须在整个制备过程中在合成后不久冻干，在给予患者之前每次都需要立刻用液体通过恢复使干燥的粉末重新转换成悬浮液。Zee制备的恢复的悬浮液中的球会沉积到底层，该底层在8小时内通过肉眼可以看见。用于密封瓶中的内容物的橡皮帽会被刺穿两次：一次用于引入液体用于恢复，第二次是用于取出恢复的悬浮液。因此，增加了受污染的机会，特别是在具有第一次的刺穿孔的帽被暴露且未受到保护的情况下在第一次刺穿与第二次刺穿之间的时间内。因此，需要例如来自本发明的改良产品，本发明包含（a）长时间不沉淀形成沉积物的球，（b）球和上清液都能够经受终端灭菌而无破坏，以及（c）容器的帽和所有“屏障”直到准备对患者给予产品时才会被破坏。

需要冻干产品有很多缺点：（1）这个步骤消耗大量电；（2）在需要将水分子从冷冻的制剂（preparation）中“抽”走的几天中，瓶内的内容物被暴露，因为瓶帽必须在瓶的顶部处于松弛状态以便水分子从瓶内逃出。在冻干步骤最后将瓶帽紧紧地压入瓶以对瓶中的内容物进行密封之前，冻干器内任何浮在空气中的颗粒都有可能进入瓶内。（3）必须提供另一瓶无菌液体，从而使医护人员能够将干粉末恢复成悬浮液；这就增加了生产成本和运输成本。（4）在紧张的条件下，例如在战斗中或在大规模自然灾害后，另一瓶液体会遗失、被盗或打碎，使得无法使用干产品。（5）将干粉末正确恢复需要花时间。如果有大量患者，医护人员总想开始去将部分恢复的粉末静脉内给予患者，这不仅会降低能够执行保健作用的纤维蛋白原包覆的球的有效数量，而且还会造成患者血管堵塞。（6）任何恢复的产品必须在有限的时间内使用，否则大颗粒（直径大于1μm）会沉淀。（7）未被使用的恢复产品不得不浪费掉，因为无菌屏障已经被恢复步骤破坏。另外，在悬浮液已经冻干且容纳干粉末的瓶子被加盖后，终端灭菌无法进行—在密封的瓶内没有有效杀死与干粉末例如冻干粉末混合的微生物的方法。

因此，需要新产品，该新产品（a）避免使用某些患者可能对其过敏的表面活性剂；（b）包含能够长时间停留在悬浮液中的甚至更小尺寸的球（少于1%的球群的直径大于1μm）；（c）允许杀死可能在用悬浮产品填充瓶时可能已经进入瓶内的任何传染性病原体的终端灭菌的步骤。

然而，生产近乎全部（或者全部）都小于1μm的球在技术上具有挑战性。大部分颗粒实质上不是大于1μm就是小于10纳米。这归结于地球上支配稳定颗粒形成的物理力。例如，细菌通常比1μm大。甚至患者体内的血小板的直径通常也为2μm。没有生产直径在0.01μm和1μm之间的稳定颗粒的简单方法。另外，不能保证明显小于天然血小板的颗粒能有效减少血小板减少的患者的出血时间。这是因为颗粒的质量在尺寸减小的同时也明显减少了，同时其“单位质量的表面积”比大大减小。直径为1μm的颗粒（密度为1）的质量将会是5.2E-10毫克，表面积为3.1E-6平方毫米（单位质量的表面积比为0.6个单位）。经过对比，1/4大的颗粒（即直径为0.25μm）的质量将会是0.08E-10毫克，表面积为0.2E-6平方毫米，产生的单位质量的表面积比为2.5个单位。然而，如果能够开发出如在本发明中一致性地生产小球的技术，那么就会形成能高度有效的产品：因为对于给予每毫克产品，平均直径为0.25μm的产品会比平均直径为1μm的产品给予更多的颗粒。较小尺寸的产品也会具有更大的“总”表面积（即所有给予的较小球的所有表面积的总和）。较小尺寸的产品在其中医疗效果与用于与其它生物材料结合的表面（例如与伤口部位活化血小板的表面）的可用性相关的应用中特别有效。小于1μm的球也具有以下优点：它们会循环至比甚至天然血小板（直径通常为2μm）更接近血管的内皮。这是因为在“管”内流动的颗粒会倾向于根据流变学原理将它们自己排序，在所述流变学原理中，较大颗粒（例如红细胞）会流到管（例如血管）的中心附近，而较小的颗粒（例如血小板）会流到管壁附近。这很重要，因为伤口出现在血管壁上，而不是在血管中心。因此，本发明的产品将能够比天然血小板甚至更有效地塞住血管上的伤口。

发明者Yen已经公开了制备白蛋白球的各种方法，它们都包括洗涤剂的使用，将该洗涤剂添加到蛋白质溶液中以防止向蛋白质溶液中添加去溶剂化试剂（醇溶液）时聚集体形成。这样的一个例子是美国专利6,264,988B1“纤维蛋白原包覆的微球”。在去溶剂化试剂添加到蛋白质溶液之前不向蛋白质溶液中添加表面活性剂的一个例外是美国专利6,391,343B1“用于治疗用途的纤维蛋白原包覆的颗粒”。在这个唯一没有使用表面活性剂的例外中，Yen使用了大量化学物质和药物作为稳定剂。这样的试剂包括还原剂、氧化剂、磷酸化的化合物、含硫化合物、聚合物和它们的组合（参见第4栏第6-11行）。尚未对这些试剂（或它们的残留物）与球制剂同时给予时的生物学效应进行评价。这些试剂中的某些在这样的情形下给予患者时可能是有毒的。美国专利343B1中公开的主要想法是除了已知的交联剂（例如戊二醛）外的其它试剂能够用于使球稳定对抗醇浓度减小时的再增溶，以及对抗由可溶性蛋白质分子形成球的过程中聚集体的形成（第4栏第41-49行）。

因此，根据所有现有技术的教导，任何涉及以下情况中球的生产的方法都具有新颖性，并且是非显而易见的：所述球保持单一颗粒状态不形成聚集体，并且所述球在不添加表面活性剂的情况下通过戊二醛（不是专利343B1中列出的试剂列表）是稳定的。换言之，如果现有技术坚持包括一个步骤它才能成功，那么没有这个关键步骤而成功的新方法必然被视为新颖的、非显而易见的并且可获得专利权的方法。

Yen还公开了一种制备大量球的方法（参见美国专利号5716643，“药物包覆的交联蛋白微球的大规模生产”，以及美国专利号6013285，“具有瞬时组分混合和可控顺序混合特征的大规模生产方法”。然而，这些现有技术仅教导采用管道系统的生产方法。管道系统有可能很难处理，特别是在一种组分的添加与下一种组分的添加之间的时间很长时—实践者不得不降低泵速或增加管的直径，从而使管道的量不是非常大。然而，较大直径的管道允许在管腔内混合，从而会造成下一个组分与随后组分的添加时刻不准确。因此，需要一种能够保证大量液体组分彻底混合的更简单的系统，即使在各种组分的添加之间的时间很长（或很短）也能实现。

许多发明者也已经公开了通过使用热或高压使病毒剂和细菌剂灭活的方法。这些包括Yen在“通过极端压力使血浆蛋白中传染性病原体灭活”（公开号为US2011/0251127A1）中提供的列表（第0004到0010行）。然而，没有一个教导如何使可能隐藏在球内或已经结合到球表面的传染性病原体（将球表面用作保护层）灭活。事实上，Yen仅公开了一种仅通过极高的压力使与球关联的传染性病原体灭活的方法，该方法对常规的玻璃容器不起作用。玻璃容器受高压会破碎。因此，需要发明使在用悬浮液填充玻璃容器的步骤中引入的潜在的传染性病原体灭活的改良方法。另外，用于使传染性病原体灭活的方法一定不能导致新的抗原在球的表面产生或产生赋形剂分子中的任何组分。否则，产品作为整体将不适合用于患者进行单一（一次）给药或在同一患者上重复使用。发明内容

本发明涉及一种组合物和一种生产所述组合物的有效方法。所述组合物是大量和少量的即用水性悬浮液，包含人纤维蛋白原包覆的人白蛋白球和上清液，所述悬浮液可用于治疗血小板减少的患者。血小板减少的原因可归因于各种外部或内部因素。

生产的球群（在产量的体积小于10升时）的直径尺寸的典型范围为小于1μm到小于0.1μm。在室温长期贮存超过1年不会形成因任何球的沉积造成的可视的底层。

生产的球群（在产量的体积超过10升时）的尺寸直径的范围通常为约1μm到小于0.1μm，不到千分之一的群大于1μm。虽然一小部分球的尺寸可能大于1μm，但是悬浮液中这些较大的球因小于1μm的球的浓度高而保持悬浮，并且悬浮液在室温贮存的至少6个月期间不需要搅拌或搅动。

另外，组合物中球的表面从未暴露于空气，从未干燥过（包括被冻干），并且从未被阻止或使其远离直接与水接触。换言之，球自形成以后一直与水性介质直接接触，减少了在对患者给药后可能诱导免疫应答的球中构象变化的任何机会。

此外，所述组合物能够经受足以杀死与球有关联的传染性病原体的热处理，而不造成可能在随后给予人体后导致人体内抗体形成的表面变化。

根据本发明已经发现，以两步添加去溶剂化试剂的方法优于以一个单步向蛋白质溶液中添加去溶剂化试剂的现有技术；两步法允许使用更大量的去溶剂化试剂，在生产较小的球（所有较小的球的直径小于1μm）而不产生聚集体的同时，生产的球的产率较高（80%以上，并且几乎达到100%）。

根据本发明已经发现，所述组合物包含的球的尺寸是如此小以至于在长时间贮存例如至少6个月后在容器底部没有观察到球的沉积物，在此期间，没有有意振荡或搅动容器以摇匀容器内的球。

根据本发明已经发现，在形成白蛋白球后晚1个小时（或更晚），向白蛋白球的悬浮液中添加以溶液形式的人纤维蛋白原分子仍然能够自发地、立即和不可逆地结合到白蛋白球上，而不对悬浮液中白蛋白球的产量造成任何损失。

根据本发明已经发现，当每个组分液体的体积都超过10升并且当以正确的顺序、在正确的时间将各组分液体添加到彼此之中时，纤维蛋白原包覆的白蛋白球的悬浮液能够大规模生产，而没有聚集体形成，形成的有用产品的最终体积为至少100升。

已经发现，能够将通过上述大规模生产方法生产的纤维蛋白原包覆的白蛋白球的即用悬浮液填充到玻璃容器中并进行密封，随后用热将整个密封的组件处理12小时达到65℃，而所述纤维蛋白原包覆的白蛋白球的医疗活性没有遭受任何损失。

根据本发明已经发现，上述热处理能够导致隐藏在球内的传染性病原体灭活，而不造成球的医疗特性降低，并且在球中没有产生抗原性。

根据本发明已经发现，上述热处理还能够导致与球的表面关联的传染性病原体灭活，而没有造成球的医疗特性降低，并且在球中没有产生抗原性。

根据本发明已经发现，以每kg体重患者4毫克或更高的剂量将本发明静脉内给药会导致需要血小板输血的患者状况得到改善。具体地，小于1μm的球的尺寸将允许球循环至比甚至天然血小板更接近或靠近血管壁，因而在裂缝或伤口可能形成的任何时间和任何地点形成对抗血管壁上的任何这样的裂缝或伤口的堵塞物更有效。

从下面的详细描述、讨论和附加的权利要求书，并且结合附图，本发明的进一步的新颖性特征和其它目的会变得更加明显。

具体实施方式

虽然现在将参考附图来描述本发明的具体实施方式，但是应该理解的是，这些具体的实施方式仅是举例且仅仅是对能够代表本发明的原理的申请的许多可能的具体实施方式的小部分的说明。本发明所属领域的技术人员显而易见的各种变化和修改被视为在附加的权利要求书中进一步限定的本发明的精神、范围和意图内。

试验1：通过两步添加去溶剂化试剂在悬浮液中生产所有球的直径都小于1μm的球

目的：为了评价一步添加所有去溶剂化试剂是否与多步（划分成多份）添加去溶剂化试剂类似或比其更差

材料和方法：人血清蛋白（HSA）从包括以下公司的商业供应商购买：洛杉矶的阿尔法治疗公司、位于格伦代尔的贝克斯特康复公司、瑞士红十字会输血服务部中心实验室、位于罗彻斯特的Immuno-US公司、瑞士ZLB生物血浆公司（Bioplasma）。戊二醛（GL）从宾夕法尼亚州华盛顿堡的ElectronMicroscopy Sciences和圣路易斯的西格玛奥德里奇（Sigma-Aldrich）购买。采用来自Pierce公司的BCA法测定蛋白质浓度。为了获得反应的产率，通过高速离心除去球以获得清澈的上清液部分。每ml的蛋白质总浓度（球+上清液）与上清液部分的浓度的差别为每ml的球的浓度。反应的产率为球的浓度（mg/ml）除以总蛋白质的浓度（mg/ml），用百分率表示。

从上述商业供应商中每家购买的瓶中移出25%的HSA的等分试样，用蒸馏水稀释至9%。从上述供应商购买的GL也用蒸馏水稀释至0.05%。试验在室温（在18到23℃之间变化）下进行。将100μl的HSA（9%）的等分试样置于小的埃彭道夫管（Eppendorf tube）。在0时刻，将100μl的GL（0.05%）添加到上述管中并与HSA溶液彻底混合。

试验1A：一步添加去溶剂化试剂。在添加GL后时间等于60秒时，根据表1将各种体积的乙醇（在水中为70%）添加到混合物中。

表1：一步添加到HSA+GL混合物中的乙醇溶液的体积

管编号	乙醇溶液的体积（μl）	乙醇的最终浓度	悬浮液
				1	300	42.0	轻度混浊
2	325	43.3	形成球
				3	350	44.5	观察到聚集体
4	375	45.7	大量聚集体
				5	400	46.7	大量聚集体

试验1B：以划分成多份（两步）来添加去溶剂化试剂。在添加GL后时间等于60秒时，将第一部分乙醇（在水中为70%）—在混合物中不产生混浊的非沉淀量，添加到混合物中，充分混合，然后在添加GL后时间为150秒时添加第二部分乙醇（在水中为70%），如表2中所示。

表2：在划分成多份法中用于制备球的乙醇的体积

结果：

悬浮液的显微镜检查显示：管10中没有球，管1和管11中有极少数球。管2中球的直径为约2μm，而在管3、4和5中，球的直径大于2μm且存在大量球的聚集体，致使悬浮液因存在直径大于7μm的聚集体而不适于静脉内给予患者。

相反，管12、13、14、15、16和17中的球都小于1μm，并且都没有出现可检测到的聚集体。

通过一步法获得的管2中试验的产率（每ml中球的mg数除以每ml中总蛋白质的mg数）为31%，而通过划分成多份法得到的管12、13、14、15、16和17中的试验产率分别测得为70%、76%、85%、92%、95%和98%。

评论：

虽然采用不同供应商提供的HSA的结果显示出形成的球的尺寸及产率有变化，但是该试验的结果适用于由所有供应商提供的HSA：划分成份法比一步法优越是清楚的。在一步法中，当乙醇的最终浓度达到44.5%（如管3中）时，形成了聚集体。相反，在划分成份法中，当乙醇的最终浓度超过44.5%（如管12中）以及甚至为52%（如管17中）时，没有看见聚集体。任何反应中球的产率似乎都与管中乙醇的最终浓度直接相关，即，较高最终浓度的乙醇会产生较高产率的球。

本发明中划分成份法是非显而易见的，并且实际上与现有技术的教导相反，理由如下：（1）现有技术（包括Yen的许多在先公开）已经一致地教导了向蛋白质溶液（包含关键量的表面活性剂）中添加关键量以上或超过关键量的去溶剂化试剂（例如乙醇溶液）会导致不可逆地形成聚集体（不能重新分离成单独的单个球）（例如管3中的情况）。这里的划分成份法已清楚地证实了，根据本发明中的发现（例如这里管17中），现有技术的教导不再是正确的。添加到管17中的乙醇（70%）的体积为600μl，是添加到形成聚集体的管3中的乙醇体积（350μl）的171%。（2）在常规定义中，划分成份是指将有效体积的去溶剂化试剂（例如325μl，如在管2中）划分成较小的部分，这些较小部分的总和与未划分成份的量相同（为325μl）。然而，那不是这里的教导。本发明的教导是（a）第一部分不是任意的随机部分，而是次有效的量。“次有效”是指不具有能够在反应混合物中产生浑浊的浓度。在这种情况下，当添加250μl（在管11到管17中）时，没有球形成：管是清澈的，甚至没有轻度混浊。第一部分与第二部分的总和会显著超过显示出有效但超过会形成聚集体的单一份的量。然而，通过划分成份法，即使是超体积或超质量（定义为在一步法中会造成破坏的体积或质量），总添加量可以是一步添加的另外的破坏体积（或质量）的171%。（3）在第一部分与第二部分的添加之间必须有时间间隔，从而使溶液中蛋白质分子能够通过次有效的浓度（即，不会导致可溶性分子沉淀成固体的浓度）的去溶剂化试剂的存在而合适地制备，以便在添加第二部分去溶剂化试剂时，能够形成有用的产品（没有聚集体），并以高产率形成。第一部分与第二部分添加之间的时间间隔在本试验中为90秒，但是也可以潜在地更短（例如15秒）或更长（例如1个小时）。（4）虽然将该方法称为划分成份法，但是它不是简单地将去溶剂化试剂划分成多份的事情。例如，管5已经添加了400μl的乙醇溶液；管13也一样。但是结果却完全不同：如果将管5中的内容物注射到患者的血液中，它们可能堵塞血管，导致胸痛、中风或者甚至死亡；而管13中的内容物具有医疗作用，副作用很少。因此，这两种方法之间的数学相似性（这两个管中乙醇的总量相等）并没有产生类似的结果—非显而易见性的一个明显的例子。

令人印象深刻的是，如现有技术中的教导，在不存在向蛋白质溶液中添加的洗涤剂或表面活性剂时，能够形成球，但是如果分步添加去溶剂化试剂（乙醇溶液），则没有聚集体形成。应该注意的是，在分步法中，第一部分去溶剂化试剂必须是非沉淀量，即以产生在混合物中不能独自形成蛋白质沉淀的浓度（但是在添加第二部分时能够产生球）。通常，第一部分为在一步向蛋白质悬浮液中添加时会导致轻度混浊的去溶剂化试剂的约85%（或更少量），例如，当300μl的乙醇溶液单步添加到蛋白质溶液中时会产生轻度混浊时，用划分成份法的好的开始是使用约250μl作为第一部分，随后通过使用各种其它体积作为第二部分以形成有用的球。

应该注意的是，在许多现有技术的公开内容中，各种尺寸的球的混合物在合成时形成。虽然在合成球后能够努力减小颗粒的尺寸范围，例如通过过滤或离心来除去不希望的部分，但是可能伴随这些额外的步骤发生大量产率损失和大量引进污染物。本发明导致在悬浮液中形成所有球的直径都小于1μm的球；尺寸分布是只有一个峰的正态分布，这就不需要额外的步骤来除去不希望的峰。

试验2：向白蛋白球悬浮液中添加纤维蛋白原的最佳时间

目的：为了找出球形成后通过添加纤维蛋白原溶液使球能够稳定且不重新溶解的最佳的时间量

材料和方法：初步的数据已经表明，使用次有效浓度（即，太低以至于不能阻止乙醇浓度降低时球的再增溶的去溶剂化试剂的浓度）的添加到蛋白质溶液中的戊二醛（GL）溶液具有产生非常均匀尺寸的球的作用。然而，为了在用不包含去溶剂化试剂的液体稀释来减少（除去）去溶剂化试剂时使球稳定对抗再增溶，之后必须向球悬浮液中添加第二部分交联剂（例如，戊二醛），或者第二部分交联剂必须存在于去溶剂化试剂（预混入去溶剂化试剂中）中。

对试验1的管17中使用的方法修改如下：（1）在0时刻，将1ml HSA（7%）与1ml GL（在水中的次有效浓度为0.125mg/ml）混合；（2）在第60秒（在向蛋白质溶液中添加GL后），添加第一部分去溶剂化试剂（含有有效浓度为每ml0.5mg GL的70%的乙醇），并与蛋白质-GL溶液充分混合。第一部分的体积为2.5ml，在管中没有产生任何混浊。（3）在第250秒（在向蛋白质溶液中添加GL后），添加3.5ml第二部分去溶剂化试剂（也含有每ml0.5mg GL的70%的乙醇）。此后，将混浊的悬浮液划分成多个等分试样（每管200μl），并在不同时刻添加800μl水，以评价球是否对重新溶解已变得完全稳定（在用水将乙醇的有效浓度稀释了五倍的溶液中）。

结果：在球形成的10分钟内（即，悬浮液中浑浊的外观），向球悬浮液中添加水会明显降低悬浮液的浊度。球的浓度分析显示出，在这些管中产率仅小于5%～10%。这就证实了，在足够浓度的去溶剂化试剂中形成的球需要至少10分钟来稳定。悬浮液中球的产率（抗重新溶解性）在15分钟之间随时间增加，并在1小时达到完全稳定（达到约为99%的最高产率的平稳时期）。

通过向球悬浮液中添加纤维蛋白原溶液（在1mg纤维蛋白原/ml到2mg纤维蛋白原/ml之间）来重复试验。发现对于1体积的白蛋白球悬浮液，要添加的纤维蛋白原溶液的最佳体积在1/5体积到1/3体积之间。而且，添加纤维蛋白原溶液的最佳时间为试验开始后约1小时（即，以0.125mg GL/ml向蛋白质溶液中添加GL溶液）。在向所述体积的球悬浮液中添加所述体积的纤维蛋白原溶液后，球的尺寸没有出现变化；它们仍小于1μm。通过显微镜检查没有观察到聚集体。由此制备的球悬浮液在冷藏温度下贮存时至少稳定3天，而没有聚集体形成。相反，通过单步法形成的悬浮液（添加或未添加纤维蛋白原）在长时间贮存后倾向于形成聚集体，除非在球形成的6小时内去除乙醇。

将纤维蛋白原包覆的球的悬浮液给予血小板减少的动物（低于它们健康身体的血小板浓度的1%）高度有效。数据表明，以4mg球/kg或更高剂量静脉内给药时，悬浮液对减少这些动物的出血时间和出血量有效。据预计，对血小板还未减少但预计会遭受大失血的患者（例如，将会接受困难的外科手术的患者，或还不是血小板减少但不久会变成血小板减少的正处于活动性出血的外伤患者）预防性给予悬浮液会减少这些患者在外科手术期间或失血期间以及之后的失血量。

评论：任何工业过程的产率都必须优化。这里发现，添加纤维蛋白原溶液的最佳时间为向蛋白质溶液中添加GL溶液后约1小时。在稍早于1小时添加纤维蛋白原溶液可能导致因使尚未完全稳定的球重新溶解而造成球的产率较低。与球悬浮液的体积相比，纤维蛋白原溶液的体积应该尽量小到不过度稀释球的浓度：纤维蛋白原溶液的体积为球悬浮液的体积的1/3是理想的。

在制备过程中在两点之间约60分钟的要求（将纤维蛋白原的添加延迟到出现浑浊后约1小时）会使得使用管道系统进行大规模生产极其困难（如Yen在现有技术所公开的）。必须安装非常长的管来允许部分交联的球的部分移动到管道系统（星形连接）中的下一个点，然后纤维蛋白原分子在此处能够与此时稳定的球结合。非常长的管价格昂贵，并且会在管道内部导致大量废物（“死空间”中部分处理的材料）。如果管比较长，与管壁的摩擦会造成最接近壁的材料比管中心处的材料移动得更慢；因此，用于将材料从一个地方移动到下一个地方所花费的时间可能与从“泵速”预计的时间有很大差异。如果管特别长，会存在管弯曲或弯折的区域，造成拐角周围的材料流动很不均匀—从而达不到允许在制备过程中在固定的时间点添加新材料的管道系统的最初目的。通过将要在下面的试验中公开的本发明的分批混合法，所有这些困难都得到克服。

试验3：量为至少100升的纤维蛋白原包覆的白蛋白球的即用制剂的大规模生产

目的：为了评价采用大量材料形成球的划分成份法的成功性

材料和方法：将试验2的方法按比例扩大10,000倍。使用的所有容器都是无菌的，并且已通过热除去热原（depyrogenated）。通过称量已知体积的溶液得到各种成分溶液的密度。这里描述的试验引用体积计量。然而，在制备过程的实际进行中，通过它们的重量来分配或混合确切的体积，这比体积计量测量得更准确。通过由已知密度的材料来转换得到要泵入容器的材料的重量。基本上：（1）将10升HSA（7%）泵入不锈钢桶（50加仑容量）内。（2）在0时刻，向上述桶中添加10升GL（0.125mg/ml），并使用能够快速搅动50加仑的桶的内容物的专门设计的平台振荡器（platform-shaker）来充分振荡。（3）在时间等于1分钟时，添加25升第一部分去溶剂化试剂（含有0.5mg GL/mg的70%的乙醇）。（4）在时间等于2.5分钟时，添加35升的第二部分去溶剂化试剂（与第一部分的组成相同）。悬浮液变浑浊。（5）在时间等于1小时时，向浑浊的溶液中添加20升纤维蛋白原溶液（1mg/ml）。（6）然后在5-9℃、在无菌条件下，将纤维蛋白原包覆的白蛋白球悬浮液贮存过夜。

此后，将该悬浮液进行透析以尽可能多地去除乙醇。添加无菌的山梨糖醇溶液以实现最终悬浮液中山梨糖醇为5%（以保持与血液相容的克分子渗透压浓度）。添加辛酸纳溶液（1%）以实现悬浮液中辛酸盐的最终浓度为每mg蛋白质（球+可溶性蛋白质）13.3mg辛酸盐。已知辛酸钠为可溶性蛋白质分子提供保护防止热变性。将球的浓度调节每ml悬浮液球为8mg。

将各为100ml的等分试样分配到各个100ml的玻璃小瓶中，并加盖。终端灭菌在65℃下进行12个小时。在-20℃、5～9℃、20～25℃和40～42℃下进行长期贮存。

结果：

在显微镜下的检查和通过激光技术对颗粒尺寸的分析表明，由两步法形成的所有球的直径都小于1μm，并且都具有只有一个峰的正态分布。这与采用Yen在美国专利号6264988“纤维蛋白原包覆的微球”中公开的方法得到的球具有几个峰（包括直径大于7μm的群）的结果形成鲜明的对比。

虽然这里引用特定浓度的HSA的、GL和乙醇浓度，但是很明显，可有效使用一定浓度范围的这些试剂（引用值±至少20%）。虽然在该试验过程中室温为20～21℃，但可以耐受更低或更高的室温。

辛酸钠已被用于防止可溶性蛋白质受热变性。该化合物能够保护固体形式的蛋白质（例如以如下方式结合的蛋白质球：球中各个位置的单独的分子可能已经或尚未变得更易发生热变性的方式结合）并不是显而易见的。因此，从现有技术来看，辛酸盐在这种情况中的有用性并不明显。

在室温贮存一年后研究上述小瓶的热原含量和无菌性。甚至在该贮存期间之后，这些小瓶也显示没有热原和传染性病原体。

对血小板严重减少的动物每kg重量给予1ml悬浮液（即每ml包含8mg球）表明，悬浮液在减少这些动物的出血时间和失血量、减少瘀斑的数量和逆转瘀点的形成方面有效。这些血小板减少的动物通常具有小于正常浓度的1%的内源性血小板，因而自发性内出血的倾向很大。

对于其他指征，例如对烧伤患者、败血病患者、DIC患者或与消耗血小板的病毒接触的患者，或接触致死剂量的辐射后的患者的治疗，纤维蛋白原包覆的白蛋白球的有效剂量可能不同。根据该指征，该剂量可高达32mg/kg患者重量，或者可低至2mg/kg患者重量。

没有新抗原在来自热灭活的球上形成的迹象。

对大规模生产的悬浮液中球的尺寸的仔细测量显示出，少于0.1%的球的直径可能会略大于1μm。而预计这些略大的球不堵塞任何毛细管（直径约为6-7μm），理论上在容器中长时间贮存后它们会沉淀到底部。然而，发现如果容器中的球的浓度为4mg/ml或更高，则直径小于1μm的高浓度的球（约为每ml几万亿个颗粒）会使略大于1μm的球保持悬浮，而在瓶中贮存至少6个月后不形成任何底层。由于冰箱在冷却循环过程中往往会振动，因此在冷藏条件下贮存有望导致保质期实质上更长。

评论：这种大规模生产方案的成功涉及的不只是能够大规模生产球的事实，或者球具有与以更好控制的较少量生产的批料相类似的尺寸分布与其他特性的事实。对多加仑材料的处理、保证设备和溶液绝对无菌和无致热性的需要、材料飞溅和溢出的倾向，所有这些都提出了挑战。因此，本发明包括终端灭菌的方法，该方法将确保即使某些已知或未知的传染性病原体无意进入了悬浮液，例如通过使用即将在下面描述的方法，也能够在不损害球和赋形剂组分的情况下使该传染性病原体灭活。

试验4：热处理对添加去溶剂化试剂之前添加到蛋白质溶液中的传染性病原体的灭活的作用

目的：为了证实即使传染性病原体隐藏在球内部，终端灭菌过程中的热灭活步骤也能在不破坏球和赋形剂组分的情况下使该传染性病原体灭活

材料和方法：根据试验1中使用的方法，制备纤维蛋白原包覆的白蛋白球的悬浮液，除了在添加去溶剂化试剂之前向白蛋白溶液中添加传染性病原体以形成球。这里使用的传染性病原体包括有包膜的病毒（例如，DNA病毒例如疱疹病毒、RNA病毒例如丁型肝炎病毒、逆转录病毒例如嗜肝DNA病毒）和无包膜的病毒（例如，诺如病毒（norovirus）、轮状病毒和人乳头状瘤病毒（HPV））。在制备好各种球悬浮液后，将它们填充到各自的玻璃瓶中，然后加盖和密封。所有悬浮液都含有最终浓度为5%的山梨糖醇和浓度为每g总蛋白质（可溶性蛋白质+球）13.3mg的辛酸钠，以防止蛋白质受热变性。将所述玻璃瓶置于热水浴中，并在65℃热处理12个小时。此后，将球悬浮液的等分试样从玻璃小瓶中无菌地移除；通过用无菌蛋白酶溶液处理使球溶解以释放可能困于球中的任何传染性颗粒。检测传染性病原体的滴度，并与阳性和阴性对照进行对比。

结果：数据表明阳性对照是阳性的，阴性对照是阴性的，如上所述的种有传染性病原体的球完全没有传染性。这表明热灭活对包括有包膜的病毒和无包膜的病毒的传染性病原体的灭活有效。这种热处理没有改变悬浮液中球的尺寸，将热处理的球静脉内给予试验动物也没有产生严重的临床表现和病症。对血小板减少的动物给予热处理的悬浮液显示出类似于给予对照（即未曾种有传染性病原体的未经热处理的悬浮液）的益处。

评论：Yen已公开通过极端高压使病毒和其它传染性病原体灭活（参见美国专利申请公开号2011/0251127A1，公开日为2011年10月13日）。Yen公开了通过压力灭活在受到压力会破碎的玻璃容器中会不起作用。然而，大部分商业玻璃“血清”瓶能够承受热而不开裂。来自本试验的数据表明，甚至在对玻璃容器内的悬浮液施加热时，潜在地可能隐藏在球内的病毒也能够通过上述的加热条件灭活。人们认为其它传染性病原体，如真菌、细菌、类病菌、卫星病灶（satellites）、朊病毒以及这些病原中某些病原的衍生物—在即用悬浮液的制备过程中潜在地可能被引入的这些病原的孢子和突变的蛋白质，也可以通过本发明中的热处理灭活，而不对悬浮液的医疗效果产生的任何损害且没有给患者引入副作用或不良反应。

这里用作赋形剂的山梨糖醇对热处理特别有用。其它常用的赋形剂化合物，例如葡萄糖、麦芽糖或乳糖，在经过长时间热处理后会变成深褐色（焦糖），致使悬浮液看起来肮脏而会被护理专家拒绝。赋形剂组分受热的这种分解无论在化学结构上还是甚至只是在颜色上在医疗产品中都将无法被接受。本发明中包含山梨糖醇的悬浮液经热处理后看上去为淡黄色。它对患者无害，更重要的是它不会为传染性病原体抗热灭活处理提供保护。虽然山梨糖醇用在本试验中，但是认为可以使用受热不褪色或不变性且不会为传染性病原体提供保护的其它赋形剂组分。

这里的试验使用包覆有纤维蛋白原的球。据预计，其它类型的球也能够经受热处理来成功地使传染性病原体灭活而不破坏球的医疗效果，它们包括携带其它生物分子、药物、化学物质、DNA、RNA和放射性标记的示踪物质的球，或者甚至是不包含制造过程中添加到它们中的任何其它分子的空白球。

试验5：热处理对球已经形成后添加到球悬浮液中的传染性病原体的作用

目的：为了评价在制造过程中热处理对球形成后添加到球悬浮液中的传染性病原体的灭活的成功

材料和方法：使用与试验4中相同的材料和方法，除了在球形成后将各传染性病原体添加到混浊的悬浮液中，而不是添加到蛋白质溶液中—从而使高滴度的传染性病原体有机会粘附到球表面，对蛋白质的热灭活和传染性病原体的遗传物质具有潜在的保护作用，因为它们接近蛋白质球的表面。

结果：该结果与试验4的结果类似。应该注意的是，在热灭活中的“成功”不仅包括传染性病原体被灭活的事实，而且还包括悬浮液的球和赋形剂组分没有受到热处理任何方式不利影响的事实。

评论：热处理的圆满成功对蛋白质球的即用悬浮液特别重要。如果热处理仅部分成功，那么任何传染性病原体，例如从该处理中存活下来的单个细菌也能够有机会在富营养的培养基中生长很长一段时间，达到一年。因球的存在而造成的悬浮液的浑浊会掩盖在这种悬浮液中某些“颗粒”可能是活细菌的事实。当将悬浮液给予患者时，病毒或细菌及它们的毒素的存在会对患者造成很大的伤害，这是绝对不允许发生的，而且已经表明这是能够通过本发明的热处理被阻止的。

对本发明的进一步概述和评论

本发明包括组合物发明和方法发明。组合物为悬浮液，不只是悬浮液中的球，而是悬浮液的球和上清液二者。下面提供进一步的评论和说明。

1．它是一种包含悬浮液的组合物，所述悬浮液进一步由（a）纤维蛋白原包覆的白蛋白球和（b）上清液组成，其中，所述球不会在六个月内在上清液中沉积形成层，所述球自从其合成以后一直与水相介质接触，所述球没有直接暴露于空气，所述悬浮液对治疗具有与血小板有关的出血问题的患者有效。

本发明在至少以下事实上与现有技术不同：形成单一的球群，该球群的正态分布范围为约1μm到小于0.1μm—它只有一个峰。相反，现有技术的组合物在最初合成球时常常有不止一个峰，需要进一步的“纯化”步骤例如通过过滤或离心来除去不希望尺寸的球。

本发明的球在长时间贮存期间不沉淀到底部这一事实表明球的密度（球的重量除以球的体积）非常接近1g/cm³的值—水或大部分水溶液的密度。通过上清液中分子的布朗运动使球悬浮在上清液中。在长期贮存期间，球没有漂浮到容器的顶部，这表明它们的密度并不小于1.00。据预计，在群中球的密度为1.00到1.10，上清液部分的密度也在1.00与1.10g/cm³之间。

通过肉眼观察贮存一段时间后玻璃容器底部，或者通过测量贮存的悬浮液的顶部部分的浊度（或者球的浓度）可以评价是否任何球形成了沉积物，与贮存的悬浮液的底部部分相比，所述顶部部分会具有降低的浊度和球的浓度。

虽然球自从它们合成以后就一直悬浮在水性悬浮液中，但是在其中合成它们的水性介质含有可能不适合用于某些患者的高浓度的酒精。因与克分子渗透压浓度的血液相容，也没有调节合成介质。需要除去过量的乙醇，之后需要将合适的赋形剂组分重新添加到悬浮液中，以致使该悬浮液与热处理和静脉内给药相容。本发明中的上清液不是指在其中合成球的介质，而是指要填充到玻璃容器中进行终端灭菌的最终悬浮液中的水性介质；对于球悬浮于其中的水性介质，在进行终端灭菌后，没有破坏球和上清液（热处理后的球和热处理后的上清液共同被称为最终产品）。

2.它也是一种组合物，包含纤维蛋白原包覆的白蛋白球和上清液的悬浮液，其中所述球在合成时的直径均小于1μm，所述球群不会在12个月内在上清液中沉积形成层，所述球一直与水相介质接触且没有暴露于空气，所述悬浮液对治疗与血小板有关的患者有效。

3.它也是一种如下的组合物，其中，所述水相介质包含赋形剂组分，所述赋形剂组分致使所述悬浮液与克分子渗透压浓度的血液相容，并且经热处理不分解。本发明涉及的不仅仅是球，而且还涉及上清液中的组分，即，赋形剂组分。球和上清液都对本发明的成功很重要，因为所述产品由悬浮液中的球和赋形剂分子二者组成，它们二者都必须进行用于终端灭菌的热处理。

4.这是一种组合物，其中包含所述赋形剂组分的悬浮液进一步在以下条件经受热处理：即传染性病原体是灭活的，但是所述悬浮液中所述球和所述赋形剂组分没有被破坏且不会引起在人体内形成抗体。

5.这是一种组合物，其中所述热处理包括将玻璃容器内的所述悬浮液加热至少10小时、可能为12小时至60℃以上、可能为65℃。

6.这是一种组合物，其中所述悬浮液对治疗数量上血小板减少的患者有效。血小板减少的标准定义为“血小板浓度在数量上低于正常浓度的患者的状况”，这意味着人患者每μl血液中血小板少于150,000个。在本发明中我们使用术语“数量上血小板减少”来区分称为“功能上血小板减少”的术语，说明如下。

7.这也是一种如下组合物，其中，所述悬浮液对治疗功能上血小板减少的患者有效。一类具有与血小板有关的出血问题的患者为给予抗血小板药物来阻止胸痛、心脏病发作或中风的心血管患者。在与药物（或其短暂的衍生物）接触后，化合物如阿司匹林和氯吡格雷将不可逆地抑制血小板的功能，但是该药物不会造成从体内除去灭活的血小板。因此，在数量上这些患者会表现出血液中血小板的总浓度没有降低。幸运的是，身体继续不断地产生新的未灭活的血小板。因为患者一天仅服药一次，且没有整天连续服药，所以体内总会有一些功能血小板，这样患者就不会过度出血。离上个剂量的抗血小板药物的时间越长，体内功能血小板就会越多。这些患者体内数值测量的血小板的浓度将反映不出无功能（或功能）血小板的百分率。我们使用术语血小板“功能”减少来描述这些患者。

8.这也是一种组合物，其中，所述悬浮液对预防性治疗预计会变成血小板减少的患者或能够从较高浓度的颗粒（能够塞住血管上的伤口）受益的患者有效。这样的患者包括将要进行困难外科手术的外科手术患者；或将进入放射性污染区域来进行检修或救援受害者的志愿者。接触致死剂量的辐射会破坏骨髓产生血小板和其他血细胞的能力，而且暴露的患者会在大约一周内变成血小板减少。

9.这个发明也是一种大规模生产白蛋白球的悬浮液的方法，其中，所述球在其合成时的群尺寸分布的直径范围为约1μm到小于0.1μm，不到0.1%的球的尺寸大于1μm，所述球一直与水相介质接触且没有暴露于空气，所述方法包括：

a.在不存在表面活性剂或洗涤剂的情况下，将白蛋白分子溶解于水溶液中；

b.添加交联溶液，产生用于通过所述交联剂将球完全交联的次有效浓度；（这里将次有效定义为在随后步骤中降低去溶剂化试剂的浓度时“不能或不能有效”防止球重新溶解，例如由用水稀释产生的，或由添加其中不含去溶剂化试剂的含纤维蛋白原的溶液产生的。）

c.添加第一部分去溶剂化溶液，产生不足以造成混合物持久混浊的去溶剂化试剂的浓度；

（换言之，如果在第一部分添加后出现持久混浊，那么去溶剂化溶液是过量的并且已经产生了不可逆的球。非持久性混浊是容许的，因为当第一部分去溶剂化试剂在被添加到蛋白质与交联溶液的混合物的过程中时，会存在各种组分局部不均匀的分布，即，某些局部区域会具有暂时与此处蛋白质分子反应的高浓度的去溶剂化试剂。这种由不充分混合造成的暂时混浊在经过进一步振荡容器后会立即重新溶解以均匀地分布各组分。通常，暂时混浊会在为使成分溶液充分混合而振荡容器的15秒内消失）。

d.在等待一段时间后，添加第二部分去溶剂化溶液，产生足以造成形成抗重新溶解而不形成聚集体的稳定球的去溶剂化试剂的组合浓度。

第二部分会引起形成球，虽然步骤（b）中的交联剂独自不足以造成球完全稳定对抗重新溶解，但是这种情况中大量去溶剂化试剂的存在（第一部分与第二部分的组合浓度）会为由此形成的球提供一定稳定性，以稳定对抗立即重新溶解。应该注意的是，本发明中第一与第二部分去溶剂化试剂的组合浓度远远高于在一步法现有技术中所使用的去溶剂化试剂的量所容许的浓度。本发明中的大量去溶剂化试剂独自对抗重新溶解的球具有一定的稳定作用。

即使如此，为了确保球在一小时后不重新溶解，可向第一部分去溶剂化试剂与第二部分去溶剂化试剂二者中添加额外量的交联剂。在所描述的试验中，去溶剂化试剂还含有每ml去溶剂化溶液0.5mg戊二醛。

在本试验中，添加成分溶液的记录时间为开始向50加仑桶内倾倒特定的成分溶液时的时间。将第一部分去溶剂化试剂（25升，如试验3中）完全倾倒入50加仑桶中所需要的时间量通常多于30秒。因此，开始倾倒第一部分与开始倾倒第二部分之间的时间必须比30秒长（取决于倾倒的确切量）。换言之，应该存在最小的等待时间，至少有15秒用于完全混合至此已添加到50加仑桶中的所有成分溶液。试验3允许开始倾倒第一部分去溶剂化试剂与开始倾倒第二部分之间有90秒—这使得能够充分混合50加仑桶中所有成分。在第一部分去溶剂化试剂与第二部分去溶剂化试剂的添加之间有充足的时间是非常重要的。这段时间将使得第一部分去溶剂化试剂能够充分准备静止溶解的白蛋白分子的表面，从而使它们能够耐受大量第二部分去溶剂化试剂而不造成聚集体的形成—如果一步（例如在现有技术方法中使用的）添加去溶剂化溶液，那么甚至较小量的去溶剂化试剂也会造成大量聚集体。

10.本发明还包括一种方法，其中所述白蛋白球的悬浮液的大规模生产包括另一个步骤：

e.在第二部分去溶剂化溶液添加后等待约1h后，向白蛋白球的悬浮液中添加包含纤维蛋白原的溶液，以产生纤维蛋白原包覆的白蛋白球的悬浮液。

11.本发明是一种方法，其中在所述悬浮液中球的产率超过80%。所述产率被定义为通常在1ml悬浮液中球的浓度除以总蛋白质的浓度（总蛋白质指的是球+上清液中残留的可溶性蛋白质）。

12.本发明是一种方法，其中在所述悬浮液中球的产率超过95%（采用一步法的现有技术的产率通常仅小于30%）。

13.本发明是一种方法，其中在第一部分去溶剂化溶液的添加完成到第二部分去溶剂化溶液的添加开始之间的所述等待时间超过15秒。

14.本发明是一种方法，其中在合成球时球的浓度超过每ml悬浮液1万亿个球。

（最终产品中球的浓度为约每ml悬浮液约8到12mg的球。很少有设备能够准确地计算这些小尺寸颗粒的数目。然而，采用估算1g/cm³的密度，能够计算出直径为0.4μm的球的重量。所述计算将表明平均直径为0.4μm的球在含有每ml悬浮液8mg球的1ml悬浮液中的浓度会超过每ml悬浮液1万亿个球。）

15.本发明是一种通过将成分溶液倾倒进大桶中来进行大规模生产的方法，其中所述悬浮液在形成球时的体积超过50升。（试验3描述了向10升白蛋白溶液中添加10升GL，然后添加25升第一部分，随后添加35升第二部分去溶剂化试剂，达到总量80升。该方法容易适用于生产50升到500升或更大体积的白蛋白悬浮液。）

16.本发明是一种大规模生产即用悬浮液的方法，其中所述去溶剂化试剂为乙醇，并且其中合成球时悬浮液中所述乙醇的浓度为45%或以上。

当然，本发明并不意图被限定为本文公开的任何特定的形式或安排、或任何具体的实施方式、或任何具体的应用，因为在不背离上文中示出或描述的要求保护的发明的精神或范围的情况下，可在各种细节上或关系上对本发明进行修改，上文示出或描述的要求保护的发明的装置或方法仅仅意在用于说明和公开有效的实施方式，而不是为了示出可能实施或操作本发明的所有各种形式或修改。

Claims (22)

1.一种包含悬浮液的组合物，所述悬浮液进一步由纤维蛋白原包覆的白蛋白球和上清液组成，其中，所述球不会在六个月内在上清液中沉积形成层，所述球的相对密度在1.00到1.10之间，所述球自从由可溶性蛋白质合成以后一直与水相介质接触，并且没有直接暴露于空气，所述悬浮液对治疗具有与血小板有关的出血问题的患者有效。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述上清液包含赋形剂组分，所述赋形剂组分致使所述悬浮液与克分子渗透压浓度的血相容，并且经热处理不分解。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述球和所述上清液进一步在以下条件下经受热处理：即传染性病原体是灭活的，并且所述球和所述上清液没有被破坏且不会引起在人体内形成抗体。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述热处理包括将玻璃容器内的所述球和所述上清液加热至少10小时、可能为12小时至60℃以上、可能为65℃。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述悬浮液对治疗数量上血小板减少的患者有效。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述悬浮液对治疗功能上血小板减少的患者有效。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述悬浮液对预防性治疗预计将变成血小板减少的患者有效。

8.一种包含悬浮液的组合物，所述悬浮液进一步由纤维蛋白原包覆的白蛋白球和上清液组成，其中，所述球在合成时的直径均小于1μm，所述球不会在12个月内在上清液中沉积形成层，所述球的相对密度在1.00到1.10之间，所述球自从由可溶性蛋白质合成以后一直与水相介质接触，并且没有直接暴露于空气，所述上清液的密度在1.00到1.10之间，所述悬浮液对治疗与血小板有关的患者有效。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述上清液包含赋形剂组分，所述赋形剂组分致使所述悬浮液与克分子渗透压浓度的血相容，并且经热处理不分解。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述球和所述上清液进一步在以下条件下经受热处理：即传染性病原体是灭活的，并且所述球和所述上清液没有被破坏且不会引起在人体内形成抗体。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述热处理包括将玻璃容器内的所述球和所述上清液加热至少10小时、可能为12小时至60℃以上、可能为65℃。

12.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述悬浮液对治疗数量上血小板减少的患者有效。

13.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述悬浮液对治疗功能上血小板减少的患者有效。

14.根据权利要求8所述的组合物，其中，所述悬浮液对预防性治疗预计将变成血小板减少的患者有效。

15.一种通过分批混合成分溶液大规模生产白蛋白球的悬浮液的方法，其中，所述球自它们形成以后一直与水相介质接触，并且没有直接暴露于空气，其中所述球完全保持悬浮，且在贮存至少6个月后不沉积，所述方法包括：

a.在不存在表面活性剂或洗涤剂的情况下，将白蛋白分子溶解于水溶液中；

b.添加交联溶液，产生不足以通过交联剂将球完全交联的交联剂的浓度；

c.添加第一部分去溶剂化溶液，产生不足以造成混合物持久混浊的去溶剂化试剂的浓度；

d.在等待一段时间后添加第二部分去溶剂化溶液，产生足以造成形成抗重新溶解且没有形成聚集体的稳定球的去溶剂化试剂的组合浓度。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述白蛋白球的悬浮液的大规模生产包括另一个步骤：

e.在所述添加第二部分去溶剂化溶液后等待约1小时后，向白蛋白球的悬浮液中添加包含纤维蛋白原的溶液，以产生纤维蛋白原包覆的白蛋白球的悬浮液。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述悬浮液中球的产率超过80%。

18.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述悬浮液中球的产率超过95%。

19.根据权利要求15或16所述的方法，其中，在第一部分去溶剂化溶液的添加完成到第二部分去溶剂化溶液的添加开始之间的所述等待时间超过15秒。

20.根据权利要求15或16所述的方法，其中，在合成球时球的浓度超过1万亿个球/ml悬浮液。

21.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述悬浮液在形成球时的体积超过50升。

22.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述去溶剂化试剂为乙醇，并且在所述悬浮液中，所述乙醇的浓度在合成球时为45%或以上。