CN109010804A - 用于控制外科手术出血的白蛋白纳米球制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于控制外科手术出血的白蛋白纳米球制剂，并且具体涉及用于控制非血小板减少的患者在外科手术之前、期间和之后的出血的白蛋白球悬浮液的产品、制备该白蛋白球悬浮液的方法和使用该白蛋白球悬浮液的方法。制备含有亚微米白蛋白球的白蛋白球悬浮液，其中自蛋白球能够控制体内出血。通过在接近冷冻温度下混合白蛋白溶液、亚稳定浓度的戊二醛溶液和含有稳定浓度的戊二醛的醇溶液来制备该悬浮液。加热混合的悬浮液，并且加入甘氨酸和山梨糖醇。可以冻干悬浮液以使悬浮液稳定。

Description

用于控制外科手术出血的白蛋白纳米球制剂

相关申请的交叉引用

本申请主张根据35U.S.C.119(e)的在2016年7月20日提交的待审的美国临时申请第62/364,764号的优先权。在先申请的全部公开内容通过引入并入本文。

技术领域

本发明涉及用于控制在外科手术之前、期间和之后的出血的白蛋白纳米球制剂和方法。

背景技术

在外科手术之前、期间和之后的出血是严重的事情。

一些患者在手术之前开始出血。如果出血部位是外部并且明显，则可以施加压力以暂时止住出血。如果红细胞浓度(或血红蛋白浓度)太低，则会给予输血(通常包装的红血细胞)，使得患者在外科手术期间能够耐受麻醉以及进一步的失血。

由于外科手术干预的性质，外科手术切口会有一些失血。如果可能，外科医生将尝试通过不直接切割血管来将失血减至最少。即便如此，在外科医生不必进行外科手术横向切割组织的情况下，许多组织中的血液也会从受损的组织中“渗出”。在那些情况下，外科医生会使用“棉签”或吸收材料来吸收血液，使得他至少能够清楚地看到外科手术部位以继续并完成外科手术。然而，由患者的身体状况、外科手术部位的难度或外科手术刀切割而造成的任何这样的出血都将需要外科手术团队花时间清理外科手术区域，这将拖延外科手术时间。由于大量其他高薪人员在周围帮助麻醉和外科手术，外科手术时间长可能很昂贵。

即使外科医生在手术期间充分控制失血，一些外科手术术后也会继续失血。实例包括膝盖和臀部的手术：血液将继续从外科医生无法“用缝合线闭合的”骨骼基质中流失。当发现患者已存在血小板减少时，会输注血小板。如果凝血系统存在功能障碍，则输注凝血因子(或凝血因子的组合，例如，在新鲜冷冻血浆或冷沉淀中发现的凝血因子)。不幸的是，输注血液制品常常导致输血反应，这可能给患者带来额外的并发症。

因此，有利地是具有能够控制在外科手术之前、期间和之后的出血的产品，使得卫生提供者花费较少的时间清理外科手术部位并且可以更快速地完成外科手术。患者将得益于患病降低、出院快速和输血并发症更少。

在制造白蛋白球期间加入或不加入凝血因子(特别是纤维蛋白原)来制造白蛋白球属于公共领域，例如，于2001年7月24日发布的Yen的名称为“白蛋白纳米球制剂和方法”(Albumin nanosphere preparations and method)的美国专利第6,264,988号。Yen的参考文献公开了许多白蛋白微球的性质及它们在疾病状况中的应用。然而，大部分应用是针对血小板减少的受试者。

本发明包括一种以高产率和较大尺寸均匀性(在球群体内的尺寸分布较窄)制备大量白蛋白纳米球的新方法。该方法克服了Yen的现有技术参考文献中公开的最困难的挑战之一。另外，本发明是悬浮液产品，可用于许多医疗应用，包括：控制在外科手术环境中的出血，特别是控制软组织的外科手术中的出血。因为外科医生没有办法在切割表面周围缝合缝合线，软组织的出血倾向大。这样的器官的一个实例是肝脏。

尽管上述器件满足了它们各自的具体目标和要求，但是上述专利没有描述能够控制在外科手术之前、期间和之后的出血的白蛋白纳米球制剂和方法。上述专利没有提供用于控制在外科手术之前、期间和之后的出血。

因此，需要可用于控制在外科手术之前、期间和之后的出血的新型白蛋白纳米球制剂和方法。在这方面，本发明基本上满足了这种需求。在这方面，根据本发明的白蛋白纳米球制剂和方法基本上脱离了传统概念和现有技术的设计，并且这样提供了一种主要为了控制在外科手术之前、期间和之后的出血而开发的装置。

发明内容

鉴于现有技术中目前存在的已知类型的白蛋白纳米球制剂和方法中固有的上述缺点，本发明提供了一种新型的白蛋白纳米球制剂和方法，并且克服了现有技术的上述缺点和缺陷。这样，随后将更详细地描述的本发明的总体目的是提供新型白蛋白纳米球制剂和方法，该方法具有以前提及的现有技术的所有优点以及许多新颖性特征，这些新颖性特征单独地或以其组合形式得到了通过现有技术无法预期、没有显而易见、没有明示或甚至暗示的白蛋白纳米球制剂和方法。

为了达到此目的，本发明实质上包括一种白蛋白纳米球制剂、一种制备白蛋白球悬浮液的方法，以及一种使用白蛋白球悬浮液来控制非血小板减少的患者在外科手术之前、期间和之后的出血的方法。

本发明包括一种用于施用于患者以控制在外科手术之前、期间和之后的出血的白蛋白纳米球制剂。该白蛋白纳米球制剂可以包括白蛋白球的悬浮液，该白蛋白球的悬浮液如下形成：最初在2℃～6℃的温度下在相邻的白蛋白分子之间没有形成稳定交联的情况下使白蛋白分子和醇分子之间平衡；随后在18℃～25℃的温度下有效交联进行一段时间，从而产生具有预定的尺寸分布的稳定的白蛋白球的悬浮液。

本发明还包括一种生产白蛋白球的悬浮液的方法，该白蛋白球的悬浮液用于施用于患者以控制在外科手术之前、期间和之后的出血。该方法可以包括：

(a)将白蛋白溶液、亚稳定浓度的戊二醛溶液和含有稳定浓度的戊二醛的醇溶液冷却至2℃～6℃的温度；

(b)在2℃～6℃的温度下混合所述白蛋白溶液、亚稳定浓度的戊二醛溶液和醇溶液，以在悬浮液中产生对于重新溶解而言不稳定的球；

(c)将包含该球的悬浮液的温度保持在2℃～6℃下；以及

(d)将包含该球的悬浮液加热至18℃～25℃的温度。

该方法还可以包括：在加热该悬浮液的步骤之后，向该悬浮液中加入含有纤维蛋白原的溶液，使得在该球对于重新溶解而言已经稳定之后纤维蛋白原分子包覆该球。

再进一步地，该方法可以包括加入甘氨酸和山梨糖醇以冻干该悬浮液。

更进一步地，该方法可以包括冻干该悬浮液的另一步骤，该另一步骤可以包括：

在第一温度下将该悬浮液冷冻第一段时间；

在第二温度下将该悬浮液再加热第二段时间；

向该悬浮液中加入额外的山梨糖醇和甘氨酸；

在第三温度下将该悬浮液冷冻第三段时间；以及

在第四温度下将该悬浮液再加热第四段时间。

甚至更进一步地，本发明可以包括一种使用白蛋白球的悬浮液用于施用于非血小板减少的患者以控制在外科手术之前、期间和之后的出血的方法。

因此，已经相当宽泛地概括了本发明的特征，以便可以更好地理解下面本发明的详细描述并且可以更好地理解对本领域做出的贡献。

当然，本发明的附加特征将在下文中进行描述并且将形成随附权利要求书的主题。

通过结合附图来阅读下面对本发明的详细描述以及本发明的示例性的实施方式时，本发明的许多目的、特征和优点将对于本领域技术人员而言显而易见。

因此，本发明的一个目的是提供具有现有技术的纤维蛋白原包覆的微球的所有优点并且没有所述缺点的新型白蛋白纳米球制剂和方法。

本发明的另一个目的是提供可以易于高效地进行制造和销售的新型白蛋白纳米球制剂和方法。

本发明的又一个目的是提供新型白蛋白纳米球制剂和方法，其在材料和劳动力方面的制造成本低，并因此易于以低价销售给消费人群，从而使得这样的白蛋白纳米球制剂和方法可经济地供购买人群使用。

本发明的又一个目的是提供新的白蛋白纳米球制剂和方法，其具有现有技术的装置和方法中的一些优点，并同时克服通常与其相关联的一些缺点。

本发明的再一个目的是提供用于控制在外科手术之前、期间和之后的出血的白蛋白纳米球制剂和方法。这能够减少失血和减少外科手术时间。

这些目的以及本发明的其他目的，连同表征本发明的各个新颖性特征在随附并且形成本发明的一部分的权利要求书中被特别指出。为了更好地理解本发明、其操作优点和通过本发明的使用所实现的特定目的，应参照图示本发明的实施方式的描述性内容和附图。

附图说明

在考虑本发明的下述详细描述时，将会更好地理解本发明，并且除了上面阐明的目的之外的目的将变得清楚。这样的描述参考了随附的附图，其中：

图1是使用本发明的试验组与对照盐水组之间的出血时间比较的图形视图。

图2是使用本发明的试验组与对照盐水组之间的失血比较的图形视图。

具体实施方式

本发明特别地涉及已被冻干并且在室温下贮藏期限长(在贮存期间稳定性可能超过10年)的制剂，该制剂可以用水或盐水进行重构，以便随后输注到患者体内，从而控制在外科手术之前、期间和之后的出血。

本发明包括一种以高产率和较大尺寸均匀性(在球群体内的尺寸分布较窄)制备大量白蛋白纳米球的新方法。该方法克服了现有技术公开的最困难的挑战之一。另外，本发明是悬浮液产品，可用于许多医疗应用，包括：控制在外科手术环境中的出血，特别是控制软组织的外科手中的出血术。因为外科医生没有办法在切割表面周围缝合缝合线，软组织的出血倾向大。这样的器官的一个实例是肝脏。

肝脏具有两个主要的供血来源。肝动脉引入含氧血液，但是它仅供应大约20％的运到肝脏的血液。另一供应(大约80％)来自肝门静脉，它携带来自肠的含营养(nutrient-laiden)的血液。在患有肝癌的患者中，肝脏本身已经因癌症而畸变。对将各种健康组织与癌症分开的需求也将得到外科医生的很多关注和努力。必须使用特殊技术来减少到肝脏的血流；否则患者将会在手术台上因出血而死亡。然而，减少从肝动脉到肝脏的血流可能使肝脏得不到所需的氧，因而在外科手术之后宣告患者因肝衰竭而死亡。另一种方法是限制来自肝门静脉的血流；但是这将造成血液阻塞，导致肠道充血，引起其他问题。因此，如果可以施用诸如本发明的产品来在不损害肝脏的供氧或不造成附近相关的器官中的血管充血的情况下减少自发出血的量，这将大大有利于患者以及外科手术人员。

现在很多外科医生经常进行“活供体肝切除术”，这意味着取出健康供体的大部分肝脏(通常是右叶)，然后将该部分移植到可从移植受益的患者。然而，移植的肝叶必须足够大，以维持受移植的患者的需要。因此，活供体冒着在外科手术期间和之后大量失血的风险。

患有肝癌的患者难以治疗，因为即使在外科手术之前，他们通常也有肝功能障碍或衰竭。肝脏是产生凝血因子的主要器官。衰竭的肝脏引起患者凝血因子不足，这导致出血机会增大。凝血因子是看不见的可溶性蛋白质，但是它们与可见的血小板、细胞颗粒结合起作用。在没有外科手术的情况下，两个系统对于充分控制出血而言都是需要的。当需要外科手术时，在外科手术可以安全进行之前必须使两个系统正常化。即便如此，在外科手术期间，一个或两个系统可能出故障并且会需要卫生提供者进行更正。

因此，一般而言，在外科手术之前、期间和之后的出血是主要挑战。许多患者在手术之前开始出血。如果出血部位是外部并且明显，则可以施加压力以暂时止住出血。如果红细胞浓度(或血红蛋白浓度)太低，则会给予输血(通常包装的红血细胞)，使得患者在外科手术期间能够耐受麻醉以及进一步的失血。

由于外科手术干预的性质，外科手术切口会有一些失血。如果可能，外科医生将尝试通过不切割血管来将失血减至最少。然而，在外科医生不必进行外科手术横向切割组织的情况下，许多组织中的血液也会从受损的组织中“渗出”。在那些情况下，外科医生会使用“棉签”或吸收材料来吸收血液，使得他至少能够清楚地看到外科手术部位以继续并完成外科手术。然而，由患者的身体状况、外科手术部位的难度或外科手术刀意外切割而造成的任何这样的出血都将需要外科手术团队花时间清理外科手术区域，这将拖延外科手术时间。由于大量其他高薪人员在周围帮助麻醉和外科手术，外科手术时间长可能很昂贵。

即使外科医生在手术期间充分控制失血，一些外科手术术后也会继续失血。实例包括膝盖和臀部的手术：血液将继续从外科医生无法“用缝合线闭合的”骨骼基质中流失。当发现患者已存在血小板减少时，会输注血小板。如果凝血系统存在功能障碍，则输注特定的凝血因子(或凝血因子的组合，例如，在新鲜冷冻血浆或冷沉淀中发现的凝血因子)。不幸的是，输注血液制品常常导致输血反应，这可能给患者带来额外的并发症。

因此，有利地是具有能够控制在外科手术之前、期间和之后出血的产品，使得(a)患者能够恢复得更快，和/或(b)卫生提供者花费较少的时间清理外科手术区域并且可以更快速地完成外科手术。“控制”在本申请中的含义不仅是指减少失血量，而且还是指在外科手术区域没有血液或仅有少量血液，使得外科医生不会紧张，并且可以与未施用本发明的患者的类似情况相比减少外科手术时间。患者将得益于出院快速，并且遭受更少的输血并发症。

本发明的方法的概述如下所示：

(1)根据本发明已经发现，白蛋白纳米球的悬浮液可以通过新方法制造，该新方法例如但不限于：(a)从处于低温(定义为2℃～6℃)的所有配料溶液开始，并且(b)也在低温下将它们按正确的顺序和体积比混合，(c)将悬浮液加热至室温(定义为18℃～25℃)。配料溶液为白蛋白溶液、低浓度戊二醛溶液和含有戊二醛的醇溶液，该醇溶液所含的戊二醛的浓度能够使构成纳米球的分子完全交联，使得纳米球在进一步处理时不会再溶解。

(2)根据本发明已经发现，可以使用上面的方法(1)通过在纳米球已经对在室温下重新溶解而言稳定之后加入纤维蛋白原溶液来制造纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球的悬浮液。

(3)根据本发明已经发现，方法(1)和方法(2)能够使加入和混合大量的配料溶液的时间充足，而没有导致形成比所需更大的团块、聚集体或球的不良混合条件的问题。容易实现的生产量足以产生4000瓶最终产品/天，每瓶具有100ml的球，每毫升最终产品含8毫克球。

(4)根据本发明已经发现，可以修改方法(1)和方法(2)，使得只有白蛋白溶液首先平衡至室温，但是低浓度戊二醛溶液和醇溶液(含有较高浓度的戊二醛)最初平衡至低温。将在低温下完成该溶液的加入和混合，使得纳米球(尚不稳定)在低温下形成。随后加热混浊的悬浮液以使球稳定。

(5)根据本发明已经发现，产品(即，根据方法(1)形成的悬浮液中的球群体)将具有与在配料溶液全部都在室温或更高温度下加入、混合并孵育的情况下形成的球群体相比更均匀的尺寸分布。

(6)通过本发明已经发现，由(a)方法(1)和方法(2)的组合以及(b)方法(4)和方法(2)的组合的方法得到的产品，即，所产生的纤维蛋白原包覆的纳米球(不考虑白蛋白溶液的初始温度是低温还是室温)：该球在外科手术(包括在活体动物中对肝脏的外科手术切割)期间减少出血时间和减少失血量方面有效。

(7)通过本发明已经发现，将经历涉及易于出血的软组织和器官的外科手术的非血小板减少的(正常的血小板计数)外科手术患者可以在外科手术之前用纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球进行静脉内治疗，使得他们出血较少。

(8)由本发明预期，接受涉及骨的外科手术的非血小板减少的患者可以得益于施用本发明，包括术前静脉内施用纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球，使得他们术中和术后的出血较少。骨外科手术包括骨折的修复或用人工关节(例如，膝关节或髋关节)替代天然关节。由于吸盘常常从外科手术部位附接至排出管，因此可以准确地测量失血量。

(9)通过本发明已经发现，由本发明产生的对出血的控制不仅包括出血时间减少或外科手术期间的失血量减少，而且还包括使外科手术区域更清洁并且被血液浸染的更少，使得外科医生承受更小的压力并且能够更快地完成外科手术。

(10)通过本发明已经发现，用本发明制成的纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球的悬浮液可以进一步加工，即，通过向悬浮液中加入赋形剂，然后将悬浮液冻干成固体，以增加其室温贮藏期限。赋形剂可以包括任何数量的带负电的化合物，包括但不限于pH大于其pI的甘氨酸(对于pI为5.9的甘氨酸而言，悬浮液的pH必须高于pH 5.9)。

(11)通过本发明已经发现，包括干燥的纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球、山梨糖醇和甘氨酸的冻干固体可以用水进行重构，并且形成了没有聚集体的尺寸相似的纳米球的悬浮液。

(12)通过本发明由初始稳定性测试已经发现，包括干燥的纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球、山梨糖醇和甘氨酸的冻干固体可能可以具有在室温下贮存超过10年的贮藏期限。

本发明是大规模生产白蛋白纳米球的悬浮液并仍保持纳米球的尺寸分布窄的新方法。该新方法利用颗粒形成期间的低温效应。随后，纳米球可以由纤维蛋白原包覆。通过该方法生产的纤维蛋白原包覆的纳米球在控制在外科手术期间非血小板减少的受试者的出血方面(包括减少出血时间和肝脏裂伤造成的失血量)有效。悬浮液可以冻干，从而使得在室温下贮存的贮藏期限长。

试验

试验1：在低温下生产大量纳米球

目的：

为了评价低温对悬浮液中的球的形成和尺寸分布的影响。

一些中间试验中已经发现，所形成的球的尺寸受容器的尺寸影响，即，容器越大，球越大。这表明温度可能是需要控制的因素。已知醇与水混合产生热量(放热反应)。理所当然，在为了生产大批量球而混合大量溶液时，只能使用大容器。然而，与在小管中混合的小体积相比，大容器难以散热；在室温下摇晃该管以混合配料时，小管可以容易散热。在一些中间试验中，首先使制备白蛋白球所需的若干配料溶液平衡至低于室温(定义为18℃～25℃)的温度，但是在加入并且充分混合其他溶液以产生球之前，白蛋白溶液一直保持处于室温。该试验评价了低温的影响，特别是在白蛋白溶液也可以首先平衡至低温(定义为2℃～6℃)时。在获得数据之前，将白蛋白溶液冷却至低温既不清楚也不明显会使球的产生或球的尺寸分布产生任何显著差异。

材料和方法：

人血清白蛋白(25％)可以购自任何商业供应商，并且在不进行透析或加入任何表面活性剂或洗涤剂的情况下直接使用；它用去离子水稀释至“初始白蛋白浓度”。初始白蛋白浓度被定义为在加入设计用于使溶解的白蛋白分子从溶解状态去溶解而形成球的任何其他溶液之前的白蛋白在溶液中的浓度。

在Yen所公开的大部分现有技术中，所有配料溶液(包括白蛋白溶液、戊二醛溶液、醇溶液)都在室温下混合，并且没有教导温度控制的重要性，特别是当要生产大量时。

首先通过用水将25％白蛋白溶液稀释至6％(w/v)来制备白蛋白溶液。将戊二醛溶液用水从10％溶液稀释至0.15mg/ml；在该浓度下，戊二醛没有浓缩至足以使球完全交联(球将在加入醇的下一个步骤中形成)，或者在悬浮液中的醇浓度减小时没有浓缩至球能够抵抗溶解的程度。然而，首先将白蛋白溶液与低浓度的戊二醛溶液混合的这一步骤将使球的尺寸比不使用该步骤时的情况更均匀。

醇溶液是还含有0.5mg/ml的交联浓度的戊二醛的乙醇(水中稀释为75％)。醇溶液通常以两部分加入：一步加入所有醇溶液常常会导致白蛋白分子随机沉淀成无用的糊(对于球的形成而言无用)。将醇溶液的总量分成两部分允许首先将白蛋白-戊二醛混合物与第一部分醇充分混合。混合白蛋白溶液加上戊二醛加上第一部分醇的结果是仍然澄清的微黄色溶液，这表明尚未形成球。

该体积的第一部分醇的存在将具有将“初始白蛋白浓度”降低至更低浓度的效果，这取决于至此所加入的每一种配料溶液的实际体积。球仅在加入第二部分醇溶液时才形成。球的性质将主要由所加入的第二部分醇相对于“降低的”白蛋白浓度(由于已经加入的戊二醛溶液和第一部分醇溶液的体积，与“初始白蛋白浓度”相比降低)的量(醇的体积和浓度)来决定。在该试验中，温度的影响将被证实。

使用4个15ml的聚丙烯管在四种条件下制备球。通过在水浴中或冰水桶内平衡来获得配料溶液的(即，混合之前)初始温度。配料溶液的温度直接用数字温度计测量。下表1概括了加入两部分醇溶液之后的最初2小时期间、接下来2小时的环境温度，以评估温度对球的形成的影响。

表1

具体而言，管Y和管Z中6％的白蛋白溶液初始温度分别为2.9℃和2.5℃。“室温”水浴的温度为23.3℃(这也是管W和管X中的白蛋白溶液的温度)。戊二醛溶液的温度(在加入所有4个管之前)为4.0℃。醇溶液的初始温度(在加入4个管中的所有溶液之前，总为两等分)为5.3℃。

管内白蛋白溶液的体积为2ml。在0时刻，向管中加入1ml戊二醛溶液(处于4℃)，并且通过盖上管并将管倒置3次来使混合物完全混合。在等于60秒(增减5秒)的时刻，加入(2.6ml)第一等分的醇(在5.3℃下)，并且立即彻底混合该内容物。在等于150秒(加或减5秒)的时刻，加入(4.2ml)第二等分的醇(在5.3℃下)，在该时刻前面澄清的溶液变成混浊的悬浮液，这表明形成了球。在0～150秒的时间期间，对于管W和管X，将它们置于设定为室温的水浴中；对于管Y和管Z，将它们放回冰水桶中以在该短的时间间隔期间保持低温。之后，将管W和管Y置于室温水浴中，并且将管X和Z置于低温环境中。

在混浊出现之后两小时，从每个管中取出混浊的悬浮液样品(100微升)，并且在标记为W2、X2、Y2和Z2的独立的管中用900微升水进行稀释。在前面的所有试验中(由于Yen的首次公开白蛋白球的制造)，此时球会通过戊二醛的交联作用而稳定下来，并且球不会重新溶解；并且稀释的悬浮液会保持混浊。然而，这并非下面的结果部分中所观察到的全部情况。

结果：

下表2总结了在球的四种制造条件下在四个管中所获得的结果。

表2

测量最初出现混浊时的悬浮液温度。并不令人吃惊的是，在管W和管X的情况下，在将两体积的处于室温的白蛋白与总共7.8体积的冷溶液(1体积的戊二醛、6.8体积的醇溶液)混合，所得到的悬浮液为21.2℃～21.7℃，而不是在更接近“低温”的温度。这是因为醇溶液与水溶液混合时产生热量。

这进一步得到了形成球时的悬浮液的温度、管Y和管Z中的温度的证实。包括白蛋白在内的所有溶液最初都处于低温，而由于将醇溶液加入白蛋白-戊二醛溶液混合物中时的放热反应，混合物分别变成17.8℃和17.1℃。

尽管如悬浮液的同样混浊的外观所证明的，4个管中都形成了球，但是管X和Z中的球不稳定。在低温下孵育2小时之后用水进行稀释时(通过稀释降低醇浓度)，球仍然重新溶解，并且混浊立即消失。这在之前从未被观察到过并且在之前从未被报道过。结果完全出人意料。

然而，在将接下来的2小时(第3小时和第4小时)，将管X和管Z转移到室温，球由于戊二醛的作用而变得稳定。对悬浮液中的球的观察显示没有聚集体，并且管X和管Z中的尺寸分布似乎比管W和管Y中的球的尺寸分布更窄，即，在室温下在第3小时和第4小时期间缓慢稳定时，球的尺寸更均匀。

在第二小时和第四小时之后从每个管中取出悬浮液样品。如果球不稳定，用水对样品进一步稀释(10倍稀释)以允许重新溶解，然后测定稀释样品中球的量。

下表3示出了在悬浮液中形成球之后120分钟和240分钟时反应中的球的产率。

表3

该数据显示了用室温来使球稳定的重要性，其与球形成的温度无关并且与配料溶液的初始温度无关。

管W和管Y中的球在球形成之后的两小时内达到稳定，从而得到高产率(所有白蛋白分子中的89％形成了球，剩下的11％仍为可溶性蛋白)。在室温下进一步孵育2小时并没有显著提高反应产率。管W中的产率从89％下降到86％可能是由于测定技术不准确。

尽管与管W和管Y中存在的相比戊二醛的浓度相同(足以实现稳定)，但是管X和管Z中的球在低温下的两个小时期间未达到稳定。应注意的是，在本发明中，在已经形成球的冷悬浮液中存在高浓度的戊二醛分子。这与现有技术的教导形成强烈的对比，在现有技术中认为可以向根本不存在戊二醛的完全未交联的球的悬浮液中加入戊二醛来使球在形成球之后稳定。

作为球在低温下未达到稳定的证明，观察到用水稀释会导致大部分球重新溶解，在用水进行稀释之后，仅得到球形式的初始质量为3％～5％的白蛋白分子。然而，如第4小时之后的显微镜观察所示，不稳定的球在该低温孵育期间或在加热至室温期间不聚集。在室温下第3小时和第4小时期间，球变得稳定并且产率变得与管W和管Y中的产率相当。

评论：

发现球的稳定延迟(即，通过首先在低温下形成球，随后缓慢加热至室温)将对大规模生产有用的球悬浮液具有巨大影响。

在几乎所有的Yen的在先试验中，白蛋白溶液的初始温度几乎总是处于室温，因为配料溶液的加入和混合不能在任何其他温度下容易地进行。容器不是隔热或隔冷的。很难使醇溶液单独平衡至0～18℃的一个具体温度。最初出现混浊时悬浮液的温度也根据混合配料溶液的容器的形状和尺寸而变化：由于大容器中散热难。

戊二醛的作用快速。通过通常在加入醇溶液(每毫升醇溶液含有0.5毫克戊二醛)的10分钟内使用传统方法(Yen的现有技术)，白蛋白分子连接在一起并且一些球会变得足够稳定以抵抗重新溶解。球可能由于在10分钟的时间点之前部分溶解会而体积变小，但是在醇浓度降低时球不会全部重新溶解。因此，必须在60秒内完成全部体积的第二部分醇溶液的加入。然而，在大规模生产中，完成最后一步耗费时间，该最后一步是将第二部分醇溶液完全排空到“反应容器”(现在含有白蛋白溶液、戊二醛溶液和第一等分的醇溶液的混合物)中。从倾倒开始到第二等分的醇的最后一滴到达反应容器，可能需要超过60秒才将全部体积都倒入反应容器中的混合物中。另外，全部体积(白蛋白溶液、戊二醛溶液和两等分的醇溶液的体积之和)必须在数秒内彻底混合。这带来了挑战，因为在大规模生产中，常常需要超过60秒来将第二等分的醇溶液完全倒入反应容器中。溶液的不适当混合或延迟混合会形成醇过量或不足的区域，由此导致球聚集或产率低。

该试验表明，当所有配料溶液最初平衡至低温并随后在低温下混合时，虽然形成了球，但是只要悬浮液保持在低温下，它们就不聚集成团块或改变尺寸。这表明，大规模生产中，可以在低温下完成配料溶液的全部加入及它们的混合。然后，可以使含有待稳定的球的反应容器达到室温以实现球的稳定，而不形成不希望的团块或聚集体。

根据该试验不清楚低温下(即使在有限的程度上)获得的白蛋白球上的连接部位是否与完全在室温下形成的白蛋白球的连接部位相同。尽管戊二醛分子与氨基酸的反应可预测，但是在不同温度下戊二醛分子可能在白蛋白分子上的不同部位进行不同的反应。因此，在低温(并且然后加热至室温)下形成的产物(球)可能与完全在室温下或高于室温下形成的产物在分子水平或球水平上不同。

球在室温下的形成可如下所见：在最初60秒内，在低浓度戊二醛溶液与白蛋白溶液混合时，会发生白蛋白分子的一定程度的交联。然而，直到加入第二部分的醇(含有另外浓度的戊二醛)，球才形成。之后，球会在大约10分钟内开始对于重新溶解而言稳定。

相比之下，在本发明中球(最初在低温下并随后在室温下)的形成在以下意义上不同：戊二醛分子的存在(无论是由低浓度戊二醛溶液供应还是来自醇溶液)在球在低温下孵育的时间内不会导致白蛋白分子的任何实质交联。然而，毫无疑问，在加入第二等分的醇溶液之后形成了球，因为悬浮液是混浊的并且在显微镜下可以看到模糊的图像。只有在悬浮液被转移到室温时才发生稳定化。这提供了比根据现有技术在室温下进行生产时混合第二部分醇所需的60秒长得多的窗口。换言之，尽管混合这些溶液所需的时间会超过60秒(例如，在本例中，在低温下窗口为2小时)，但是大量配料溶液可以在低温下混合在一起，而不会有任何问题。仅在球形成之后，在这段时间它们会形成聚集体或变得更大或更小，然后使反应混合物缓慢到室温。

在显微镜下对球尺寸的观察表明，在管W和管Y中球直径小于1微米，但是有些(可能大约1％)直径大于1微米。管X和管Z中的球直径也小于1微米，但是没有观察到直径大于1微米的球。因此，最初在低温下并随后在室温下孵育而形成的球的尺寸分布似乎在尺寸上更均匀。

试验2：纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球(FAS)在外科手术期间控制出血的功效

目的：

为了测量进行肝脏外科手术的FAS处理的大鼠与盐水处理的对照大鼠的出血时间和出血量。

在安全带广泛使用之前，肝裂伤是汽车事故的常见结果。在碰撞时，腹部对肝脏软组织提供的保护小，如果前排座椅中存在尖锐或坚硬的物体，肝脏软组织可能会受到钝器创伤或裂伤。例如，如果FAS可以在救护车中快速施用，患者可能会得益于不太严重的内出血情况。

在Yen的现有技术公开中，FAS的使用针对血小板减少的受试者。由于出血时间已经是“正常的”，因此难以证实在非血小板减少的受试者中的功效。在本试验中，目的是找出FAS是否在控制在外科手术环境中的出血方面，甚至是在控制非血小板减少的受试者(即，正常血小板计数)中的出血方面有效。

在Yen的现有技术公开中，预期在外科手术环境中使用FAS。但是，该预期的用途是针对因大失血而预计会变成血小板减少的患者。在一些大失血的情况下，外科手术团队仅输注红细胞，而不输注血小板，这导致了被称为“稀释性血小板减少症”的状况。本试验不同于前面描述的那些情况，因为在评估时患者具有正常的凝血因子和血小板计数值并而没有预期的大失血。在评估FAS在该动物模型中的功效时，受试者的止血功能是正常的。

材料和方法：

除了使用较大量的配料溶液来形成3升空白白蛋白纳米球悬浮液之外，使用管W的条件来制备包含纤维蛋白原包覆的纳米球的悬浮液。在第4小时，在室温下加入1升纤维蛋白原溶液(1.8mg纤维蛋白原溶解在每毫升含有1mg十四烷基硫酸钠的溶液中)，以包覆球。之后，在无菌条件下通过一种方法(将在另一专利申请中公开)来减少醇，并且加入其他赋形剂。最终悬浮液含有8mg球/ml悬浮液、不超过5％的乙醇、不超过5％的山梨糖醇和每克蛋白13.3毫克十四烷基硫酸钠(不论是球的形式还是可溶性蛋白的形式)。将悬浮液分配到100ml的瓶中。在将瓶加盖并密封之后，在60℃下对内容物进行终端巴氏灭菌10小时。

给大鼠的静脉内施用剂量为16mg/kg。对于对照，也静脉内施用2ml/kg生理盐水。

使用6～8周龄的幼龄Sprague Dawley雄性大鼠。研究设计如下：1、10只大鼠从尾静脉注射接受16mg FAS剂量/kg动物体重(每ml产品含有8mg产品；即，2ml/kg大鼠重量)。等待4小时。2、10只大鼠从尾静脉注射接受2ml生理盐水/kg动物体重的剂量。等待4小时。3、在通过异氟烷全身麻醉之后，应用无菌外科手术以产生大约长5mm和深2mm的单个裂伤(中央叶的切口)。使血液自由流动。不对切口施加压力。4、记录下无干预情况下从外科手术切割到“自发止血”的时间。该以秒为单位测得的时间称为“出血时间”。5、通过预先称量的棉花收集并测量失血量。6、对所有动物进行录像记录外科手术和裂伤后的出血。

结果：

下表4示出了在大鼠肝脏中切割之后的出血时间和出血量。

表4

1.1.裂伤的出血时间

如图1所示，与盐水注射的对照组相比，试验(FAS)组中平均出血大约快24秒。由于盐水注射的对照组内变化大(约95％)，关于该参数，两组之间没有检测到统计显著性。更大的样本量应该可以修正该问题。

1.2.失血量

如图2所示，与盐水注射的对照组相比，测试组中的平均失血量显著更低。FAS处理组中的失血重量为盐水处理的对照组中的失血重量的45.5％。

结论

在裂伤前4小时注射的试验化合物有效且显著地减少了失血量。尽管盐水注射的对照组的变化阻止了统计显著性，但试验化合物也减少了出血时间。

评论：

尽管这里使用的是16mg球/kg的剂量，但认为8mg球/kg动物体重的标准剂量同样有效。

该方法灵敏到足以证明悬浮液在包括高温、低温或室温的各种条件下贮存1年或2年之后的稳定性。在产品的长期贮存期间，人们预计：无论量多么少，随着时间的推移纤维蛋白原也会与球发生一些分离。为了了解纤维蛋白原含量(定义为每毫克球所附着的纤维蛋白原的毫克)的这种微小程度的下降是否有临床意义，贮存期之后的产品或条件需要在出血模型中进行评估。这种肝脏裂伤模型容易建立，因为不需要产生血小板减少状况。即使每组10只大鼠，出血量差异也在统计学上高度显著。因此，贮存期之后获得的出血量将是该贮存期之后功效的良好指示，特别是两种剂量(8mg/kg和16mg/kg)在每个评估时间点都评价时。

尽管本试验使用在管W的条件下产生、随后用纤维蛋白原包覆的球，但是预计在管X、管Y和管Z的条件下产生、随后在室温下用纤维蛋白原包覆的球同样有效。

预计对整个叶被移除或切除(如右肝叶被移除的活供体中那样)的情况下对出血进行的控制良好。

还预计本发明在使肝脏的正常组织发生了畸变(使其比在正常肝脏中进行外科手术时更容易出血)的肝癌的情况下对出血进行的控制良好。

允许FAS从注射部位(任何静脉)向肝脏的循环进行4小时。可能需要更少的时间。由于颗粒的尺寸小，预计FAS在内皮附近的循环系统内循环，而不是在血管中心循环。这样，FAS的大部分不容易到达肝脏(就像其他可溶性药物一样被大部分血液携带，持续流入肝脏以进行代谢)。甚至有可能FAS在肝脏被撕裂或切割之后施用时也有效。

对外科手术切口观察至少15分钟以查看该部位是否再出血。该数据示出没有再出血，这表明在FAS处理的存在下形成的血块不比没有FAS所形成的血块更弱。

试验3：纳米球悬浮液的冻干和冻干的固体的重构以形成功能悬浮液

目的：

为了找出纳米球不会聚集并且固体中的纳米球在室温贮存期间具有长贮藏期限的冻干条件

理由：

已知的公开内容例如Zee(1995年在中国申请的“用于促进从外科手术和医疗治疗痊愈的新型装置、其用途及生产方法”；1995年在中国申请的“用于促进从外科手术和医疗治疗痊愈的方法、其用途及生产方法”(ANovel Device for Promoting Healing FromSurgical and Medical Treatment，Its Use and Method of Production″，appliedforin China 1995；“A Method for Promoting Healing From Surgical and MedicalTreatment，Its Use and Method of Production”，applied for in China 1995))几乎没有细节提及包括纤维蛋白原包覆的微球的冻干产品的制造。然而，现在已知冻干开始时的悬浮液包括高浓度的赋形剂，包括：2.8％甘氨酸、2.4％乳糖、2.4％麦芽糖(总共7.6％，w/v)，但是没有山梨糖醇。该公开中的球的中值尺寸大于1微米，其将在贮存期间容易沉降。

在题目为“用于治疗血小板减少的患者的纤维蛋白原包覆的白蛋白球的即用型悬浮液的大规模生产”(美国专利申请，公开号20140030347，2014年6月30日)的Yen现有技术中，充分描述了适合用作人造血小板的白蛋白球的特定类型。然而，生产方法包括加入表面活性剂(例如，十四烷基硫酸钠或吐温80)，以确保球不形成直径大于7微米的可能堵塞血管的聚集体。Zee还公开了由其方法制成的产品需要冻干，以进行长时间贮存。尽管Zee声称通过其方法制成的产品的“平均”尺寸小于1微米，但是显然该产品包含大于1微米的一些大球。大于1微米的球因水分子的布朗运动而不能长时间保持悬浮。无论这些大球所占的比例如何，这些大于1微米的球将快速沉降到容器底部。不可能仅通过摇晃容器而将这样的沉降物分离回到单个球。如果静脉内施用于患者，沉降层中团块的存在可能造成血管堵塞。结果，Zee的产品在整个制造过程中必须在其一合成之后就冻干，并且干燥的粉末需要就在施用于患者之前的时间通过用液体重构而转化回到悬浮液。由Zee制造的重构悬浮液内的球将在8小时内沉降为用肉眼可见的底层。

这里，用含有至少3％～5％的山梨糖醇的悬浮液开始冻干过程，同时加入一系列低浓度阴性化合物，包括但不限于甘氨酸。目的不是为了解决球沉降到容器底部，形成不能并且一定不可以静脉内施用于患者的“饼状物”的问题。这里的目的仅仅是为了提供长的贮藏期限。这里的球是纳米尺寸，并且，无论冻干还是不冻干，在冻干的产品重构之前和之后，贮存时都不容易沉降到容器底部。

根据定义，氨基酸至少具有带正电的氨基末端和带负电的酸末端。总负电荷与总正电荷相同的溶液(净零电荷)的pH称为pI，在该pH下，氨基酸不会在电场中迁移(因为它在这种情况下具有净零电荷)。甘氨酸的pI为5.9。在高于pH 5.9的缓冲液中，甘氨酸分子上的净电荷将是负的。人血清白蛋白溶液(例如25％)的天然总pH为大约6.9+0.5。发现纤维蛋白原包覆的白蛋白纳米球的悬浮液也具有大约6.9的天然(未被其他缓冲剂缓冲)pH。因此，知道在白蛋白球的悬浮液中甘氨酸溶液的总电荷将为负，这将有助于球表面上的负电荷彼此相撞(排斥)，而不是结合在一起(相互吸引以形成聚集体)。

材料和方法：

试验1描述了使用以不同温度开始的溶液的四种方法；但在室温下孵育之后，形成纳米尺寸的白蛋白球，而没有聚集体。评价来自四种方法的所有四种产品，用下面这些步骤来制备它们用于冻干。所有四种制剂产生类似的结果。

步骤为：在获得稳定的纳米球悬浮液之后，通过用水透析除去过量的醇直到醇含量低于3％(v/v)。之后，加入山梨糖醇(USP级)至最终浓度为3％～5％，以实现悬浮液的克分子渗透压浓度为至少300mOsm。这将称为“含有山梨糖醇的悬浮液”。在该步骤之后，将悬浮液填充到无菌的医用级小瓶，加盖并且进行“终端巴氏灭菌”(在60℃下加热10小时)。这将是“即用型”悬浮液，每毫升悬浮液含有8毫克球。

然而，无论有或没有“终端灭菌”的步骤，都发现含有山梨糖醇的悬浮液可以进一步用如下的冻干步骤处理：1、向每个装有100ml的含有山梨糖醇的悬浮液的6个瓶中加入5ml水(对照制剂)或5ml甘氨酸溶液，以形成每瓶还含有0mg、50mg、100mg、200mg、300mg、500mg甘氨酸的含有山梨糖醇的悬浮液。2、在下述条件下使用市售冻干机将悬浮液冻干：(a)冷冻时间4小时，下降至-40°F，然后再加热(以提供使冻结冰升华的能量)至160°F，进行超过6小时；(b)用新鲜制剂重复，然后：冷冻时间2小时，下降至-40°F，然后再加热(以便于水逸出)至160°F，进行超过6小时。

结果：

所得产物为岩石状固体(并且不是粉末形式)。其具有硬糖的质地。为了测试该固体是否可以重构，加入100ml水。发现固体立即融化并且在加入液体的数秒内重构成混浊悬浮液。

发现，在上述条件(a)下，当在相差显微镜下观察重构的悬浮液时，对照瓶显示大的聚集体。然而，在甘氨酸的加入范围内(0.5mg/ml～5mg/ml)，所有其他制剂(在重构之后)都含有与冻干之前相同尺寸范围的球，而没有任何聚集体。

发现，在上述条件(b)下，包括对照瓶的所有瓶在重构悬浮液中都没有显示出聚集体，并且该悬浮液含有与冻干步骤之前相同尺寸范围的球。

评论：

已知硬糖可以在不改变味道或质地的情况下贮存数十年，并且它们在室温下的贮藏期限容易超过10年。因此，预计本发明的冻干产品将具有类似的长贮藏期限。

现有技术教导了，需要高浓度的甘氨酸和糖(例如，乳糖和麦芽糖)的组合来获得粉末状冻干产品。令人惊讶的是，在山梨糖醇的存在下，低浓度的氨基酸(例如，0.5mg/ml的甘氨酸)可以使球在冻干步骤期间就抗聚集而言稳定。虽然每毫升球悬浮液中低于0.5毫克甘氨酸的浓度尚未被评估出，但是在为球提供在冻干期间免受聚集的保护而言潜在可能仍有效。高于每毫升5毫克甘氨酸的浓度也未被评估出，但应该是有效的。

尽管在本试验中仅使用了甘氨酸，但是任何数量的带负电的氨基酸都可以潜在增加球的表面负电荷，以有助于它们彼此排斥，这在冻干步骤期间特别重要。

不清楚为什么冻干循环期间的冷冻时间从4小时减少至2小时在重构之后在一种情况下(例如条件(b))产生有用的球；而在另一种情况下(例如条件(a))产生无用的产品。将需要额外的试验来解决这个难题。

将固体完全重构成有用的悬浮液所需的时间仅为大约1分钟。流体可以是任何相容的流体，包括水、盐水或乳酸林格溶液。这些常用的溶液不会引起球在重构的悬浮液中聚集。

与即用型悬浮液相比，冻干产品具有若干优点：(a)贮藏期限更长；(b)产品重量仅仅是球和山梨糖醇和甘氨酸的重量，而没有水；因此约800mg球、3～5g山梨糖醇和不超过500mg干燥的甘氨酸。相比之下，即用型瓶的内容物的重量超过100g。冻干可以在无菌的双轴取向的聚对苯二甲酸乙二酯袋中进行(例如但不限于Mylar.RTM.)并且可能节省大量运输成本。

本发明的要点

本发明是一种包括白蛋白球的悬浮液的产品，该白蛋白球的悬浮液如下形成：最初在低温下使白蛋白分子与醇分子之间平衡，而即使存在足够浓度的交联剂在相邻的白蛋白分子之间也不形成稳定交联，随后有效交联进行一段时间，形成尺寸分布窄的稳定的球的悬浮液，之后将该悬浮液施用于患者，使得适当控制在外科手术之前、期间和之后的出血。

本发明是生产白蛋白球的悬浮液的方法，其包括下述步骤：(a)将配料溶液冷却至2℃～6℃的温度，其中配料溶液由白蛋白溶液、亚稳定浓度的戊二醛溶液和也含有稳定浓度的戊二醛的醇溶液构成；(b)在2℃～6℃的温度下混合该配料溶液，以产生对于重新溶解而言不稳定的球；(c)将球的悬浮液的温度保持在2℃～6℃下；以及(d)将球的悬浮液加热至18℃～25℃的温度，由此该悬浮液可以经进一步处理并且静脉内施用于外科手术患者，使得适当控制在外科手术之前、期间和之后的出血。

本发明预期另一步骤，加入纤维蛋白原溶液，以在球对于重新溶解已经稳定之后纤维蛋白原分子包覆球。

本发明还预期另一步骤，通过向大约3％～5％的山梨糖醇的悬浮液中加入低浓度的甘氨酸来将球的悬浮液冻干，从而形成贮藏期限超过十年的固体。

本发明是一种在外科手术过程之前、期间和之后对非血小板减少的外科手术患者进行治疗以适当控制出血，从而使失血量较少并且外科手术时间较短的方法。

本发明是一种在不能有效地施加缝合线来止血的组织或器官中进行外科手术切割的外科手术期间控制出血的方法。

Claims (16)

1.一种白蛋白纳米球制剂，用于施用于患者以控制在外科手术之前、期间和之后的出血，所述白蛋白纳米球制剂包括白蛋白球的悬浮液，所述白蛋白球的悬浮液如下形成：最初在2℃～6℃的温度下在相邻的白蛋白分子之间没有形成稳定交联的情况下使白蛋白分子和醇分子之间平衡，随后在18℃～25℃的温度下有效交联进行一段时间，从而产生具有预定的尺寸分布的稳定的所述白蛋白球的悬浮液。

2.一种生产白蛋白球的悬浮液的方法，所述白蛋白球的悬浮液用于施用于患者以控制在外科手术之前、期间和之后的出血，所述方法包括下述步骤：

(a)将白蛋白溶液、亚稳定浓度的戊二醛溶液和含有稳定浓度的戊二醛的醇溶液冷却至2℃～6℃的温度；

(b)在2℃～6℃的温度下混合所述白蛋白溶液、所述亚稳定浓度的戊二醛溶液和所述醇溶液，以在悬浮液中产生对于重新溶解而言不稳定的球；

(c)将包含所述球的悬浮液的温度保持在2℃～6℃下；以及

(d)将包含所述球的悬浮液加热至18℃～25℃的温度。

3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括另一步骤：在加热所述悬浮液的步骤之后，向所述悬浮液中加入含有纤维蛋白原的溶液，使得在所述球对于重新溶解而言已经稳定之后纤维蛋白原分子包覆所述球。

4.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括另一步骤：通过加入至少一种氨基酸和至少一种糖醇来将所述悬浮液冻干。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述氨基酸是带负电的氨基酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述氨基酸是甘氨酸，并且所述糖醇是山梨糖醇。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述山梨糖醇在所述悬浮液中的浓度为3％～5％。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，在由双轴取向的聚对苯二甲酸乙二酯制成的无菌袋中对所述悬浮液进行所述冻干。

9.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括另一步骤：通过用水透析来除去至少一部分所述醇溶液直到所述悬浮液中的醇含量小于3％(v/v)。

10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括另一步骤：加入山梨糖醇至最终浓度为3％～5％，以实现所述悬浮液的克分子渗透压浓度为300mOsm。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法包括另一步骤：向含有所述山梨糖醇的悬浮液中加入带负电的氨基酸。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述带负电的氨基酸为甘氨酸。

13.根据权利要求12所述的方法，所述方法包括冻干所述悬浮液的另一步骤，包括下述步骤：

在第一温度下将所述悬浮液冷冻第一段时间；

在第二温度下将所述悬浮液再加热第二段时间；

向所述悬浮液中加入额外的山梨糖醇和甘氨酸；在第三温度下将所述悬浮液冷冻第三段时间；以及

在第四温度下将所述悬浮液再加热第四段时间。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第二温度和所述第二段时间足以提供使冻结冰升华的能量，并且所述第四温度和所述第四段时间足以使所述悬浮液中的水逸出。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述第一温度为-40°F并且所述第一段时间为4小时，所述第二温度为160°F并且所述第二段时间为至少6小时，所述第三温度为-40°F并且第三段时间为2小时，并且所述第四温度为160°F并且所述第四段时间为至少6小时。

16.一种使用根据权利要求1所述的白蛋白纳米球制剂的方法，所述白蛋白球的悬浮液用于施用于非血小板减少的患者以控制在外科手术之前、期间和之后的出血，所述方法包括下述步骤：

a)制备所述白蛋白球的悬浮液，所述白蛋白球能够控制非血小板减少的患者的出血；以及

b)将预定量的所述白蛋白纳米颗粒悬浮液施用于所述非血小板减少的患者；以及

c)通过所述白蛋白球控制所述非血小板减少的患者的出血，实现失血量减少和外科手术时间减少中的至少一种。