CN105517586A - 适于治疗急性皮肤创伤的水凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗创伤(特别是减少或预防瘢痕形成，特别是肥厚型瘢痕或疤痕瘤形成)的组合物和方法。因此，本发明还提供了治疗方法，包括用于肥厚型瘢痕或疤痕瘤修复的方法以及预防性瘢痕抑制方法。

Description

适于治疗急性皮肤创伤的水凝胶

发明领域

本发明涉及适于治疗真皮(dermal)创伤的组合物、用于该治疗的方法以及制备该组合物的方法。特别是，所述组合物可通过水凝胶稳定因子定义，根据该水凝胶稳定因子，所述组合物可对用于皮肤创伤特别有效，优选以有效促进愈合且减少结疤(特别是疤痕瘤形成)的方式。

发明背景

在医学中存在许多创伤不能恰当愈合的情况，诸如延迟或阻止伤口消退(resolution)的受损(compromised)创伤愈合。然而，还存在能限制所致功能或美观的其它创伤愈合事件。示例性的不理想结果包括产生大面积结疤的增生反应、疤痕瘤或危害功能和活动度(mobility)的创伤挛缩。

当身体过度产生胶原时会发生肥厚型瘢痕，这导致瘢痕高出周围皮肤(skin)。肥厚型瘢痕经常表现为皮肤上红色凸起肿块的形式，并且通常在伴有过高张力和/或其它外伤性皮肤损伤的创伤感染或创伤闭合之后4-8周的时间发生。疤痕瘤形成尤其是非常有挑战性的创伤愈合问题。疤痕瘤被定义为引起软组织肿瘤的良性纤维(纤维母细胞或肌纤维母细胞)增生。疤痕瘤中致密纤维组织的良性过度增生性生长由异常愈合反应发展到真皮损伤，并且不同于正常创伤愈合和结疤，包括肥厚型结疤。这些区别主要体现在细胞过程、胶原产生和沉积、原始创伤边界外的继续生长和切除后的高复发率。与正常瘢痕或肥厚型瘢痕不同，疤痕瘤包含纤维母细胞，其过度产生I型前胶原、VEGF、TGFβ1/β2、PDGF-α受体，并且具有降低的生长因子需求，伴有较低的细胞凋亡率或下调的细胞凋亡基因(Robles,etal.,ClinicsinDermatology,2007)。这些异常的纤维母细胞过程已经证实了在体外和体内的胶原和细胞外基质的生产增加。正常型、肥厚型和疤痕瘤型瘢痕的X-射线衍射检验显示了不同于与瘢痕线平行(正常瘢痕)或稍微与瘢痕线对齐的胶原纤维(肥厚型瘢痕)，疤痕瘤型瘢痕的胶原纤维根本不显示特定的胶原取向(Kooninetaal.,S.A.MedicalJournal1964)。另外，这种胶原已被命名为“疤痕瘤胶原”，这是因为沉积规律、胶原混合物类型(更多的III型随后被I型所替换)以及过剩与其它组织或瘢痕类型不同(Chengetal.AfricanJournalofBiotechnology2011)。最后，与正常瘢痕或肥厚型瘢痕不同，疤痕瘤型瘢痕中的复发倾向已被报道为45-100％，且疤痕瘤对用于瘢痕或肥厚型瘢痕的已知治疗具有抗性(Robles,etal.,ClinicsinDermatology2007)。

已描述了使用胶原(身体的主要结构蛋白)来促进创伤愈合的组合物。特别是，胶原与粘多糖(身体的结构多糖)组合的组合物也已被描述为促进创伤愈合或用作创伤修复的组织模板。例如，美国专利号4,837,024描述了通过将创伤表面与胶原和粘多糖的颗粒悬浮液接触促进创伤愈合。美国专利号4,280,954描述了包含胶原和黏多糖(粘多糖，其可用作诸如人造皮肤的可降解外科手术假体)的复合材料。使用变性(denatured)胶原的组合物也已被描述在含有多糖的创伤愈合组合物中。美国专利号6,261,587和美国专利号6,713,079描述了用于刺激血管形成和促进创伤愈合的明胶与葡聚糖或肝素的组合物。仍然需要可用于皮肤创伤治疗(尤其是急性皮肤创伤治疗)、特别是解决疤痕瘤和肥厚型真皮愈合的方法和组合物。

发明内容

本发明提供了可用于创伤治疗以促进愈合、特别是涉及以减少或限制肥厚型创伤愈合和/或瘢痕形成的方式促进愈合的稳定的水凝胶组合物。本发明还提供了针对相分离和结构重置(structuralrearrangement)稳定化的水凝胶组合物的形成方法、该组合物的使用方法和加入该组合物的制品。本发明的方法和组合物特别可用于减少或限制结疤，包括但不限于外科手术后瘢痕、肥厚型瘢痕、因外伤或烧伤所致的瘢痕以及疤痕瘤。

在多个实施方式中，本公开涉及制备稳定的水凝胶组合物的方法。在例示实施方式中，所述方法可包括将明胶和聚合碳水化合物(polymericcarbohydrate)在水性介质中于第一温度混合以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多。所述方法还包括在恒速混合下将液体水凝胶组合物冷却到低于第一温度且高于凝胶化温度的保持温度，其中在所述凝胶化温度下液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物)。所述方法还可包括将液体水凝胶组合物进一步冷却到凝胶化温度以将液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物。

进行混合的第一温度可为，例如，约45℃或更高，更具体为约46℃至约70℃。保持温度可比第一温度低至少约5℃。在另外的实施方式中，保持温度可在凝胶化温度的约7℃内。凝胶化温度例如可低于约35℃。在一些实施方式中，进一步冷却到凝胶化温度可在少于约2小时的时间内进行。进一步冷却具体可包括将稳定的固体或半固体水凝胶组合物冷却至储存温度。储存温度可为约1℃至约12℃。另外，所述方法还可包括将稳定的水凝胶组合物冻干。

在特定实施方式中，用于形成水凝胶的水性介质可通过其盐浓度定义。例如，用于形成水凝胶的水性介质的渗透压可低于约400mOsm/kg。在另外的实施方式中，所述水性介质的渗透压可为约25mOsm/kg至约375mOsm/kg。在其它实施方式中，所述水性介质的磷酸根离子浓度可不高于约20mM。类似地，所述水性介质的碳酸根离子浓度可不高于约20mM。在一些实施方式中，所述水性介质可包括介质199。

根据以上方法形成的水凝胶组合物的特征还可在于其组成和性质。例如，所述稳定的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度可为约50mg/mL至约400mg/mL。

在特定实施方式中，根据以上方法形成的稳定的水凝胶组合物可通过其相对于相分离和结构重置的固有稳定性定义，所述固有稳定性已被发现起因于水凝胶组合物的具体制备方法。这种固有稳定性可相对于超声评价来表征，其显示水凝胶对抗相分离和结构重置的能力。因此，所述稳定的水凝胶可根据显示超声波衰减水凝胶稳定因子来鉴定。例如，根据本公开的稳定的水凝胶组合物当于35℃和2-8MHz频率测试时可在至少500分钟上显示0.4的超声波衰减(UA)水凝胶稳定因子。该稳定因子显示在测试条件下，受测试的水凝胶的超声波衰减在测试时间段上变化少于40％。在另外的实施方式中，所述稳定的水凝胶组合物当于35℃和2-8MHz频率测试时可在至少600分钟上显示0.5的U_A水凝胶稳定因子。在另外的实施方式中，所述稳定的水凝胶组合物可通过以下中的一项或多项定义：当在35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.3；当在35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.4；当在35℃温度和5.1MHz频率测量测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.2；当在35℃温度和在5.1MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.3；当在35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.35；和当在35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.5。

在另外的实施方式中，本公开提供了稳定的水凝胶组合物。所述稳定的水凝胶组合物优选为根据本文所述方法制备的水凝胶，且这样的水凝胶组合物可通过它的其它性质表征。例如，所述稳定的水凝胶组合物当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下在35℃至39℃温度时从注射器中迫出时其流速可为约10μL/s或更高。所述稳定的水凝胶组合物的粘度在35℃至39℃温度时可为约1.5Pa-s或更低。所述稳定的水凝胶组合物的纤连蛋白结合活性可为约3nmol/mg或更高。所述稳定的水凝胶组合物在哺乳动物皮或皮下组织中的停留时间可为约3天或更长。

在仍然另外的实施方式中，本公开可涉及已从冻干形式重构(reconstituted)的水凝胶组合物。尽管冻干材料在本领域中是已知的，但迄今尚未意识到会难以重构适合用于注射(特别是通过小号针)并且能迅速容易重构为可流动形式的包括明胶和聚合碳水化合物的冻干水凝胶基质(hydrogelmatrix)。

在示例性实施方式中，本公开因此可提供包括明胶和聚合碳水化合物的可流动注射组合物，所述组合物是从冻干形式重构的水凝胶，并且还包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。优选地，所述明胶占重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多。在另外的实施方式中，所述可流动注射重构组合物当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下在35℃至39℃温度时从注射器中迫出时的流速为约25μL/s或更高。

所述两种或更多种添加剂具体可包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；和iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。在特定实施方式中，所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)聚山梨醇酯和多元醇；ii)聚山梨醇酯和盐；iii)聚山梨醇酯和糖；iv)多元醇和糖；v)盐和糖；vi)聚山梨醇酯、多元醇和糖；和vii)聚山梨醇酯、盐和糖。在另外的实施方式中，所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)吐温和甘油；ii)吐温和NaCl；iii)吐温和二糖；iv)甘油和二糖；v)NaCl和二糖；vi)吐温、甘油和二糖；和vii)吐温、NaCl和二糖。所述两种或更多种添加剂特别可包括比率为约1:20至约20:1的表面活性剂和吸湿辅料。所述两种或更多种添加剂还可包括比率为约1:40至约10:1的表面活性剂和膨胀剂。所述两种或更多种添加剂还包括比率为约1:10至约10:1的吸湿辅料和膨胀剂。

优选地，所述可流动注射重构组合物的粘度在35℃至39℃温度时为约1.5Pa-s或更低。所述可流动注射重构组合物可适于在低于35℃或更高的温度转化为固体或半固体。优选地，所述固体或半固体重构组合物在皮或皮下组织中的停留时间为约3天或更长。

在另外的实施方式中，本公开可提供预防或减少源于皮肤创伤的皮肤结疤或其影响的方法。特别是，所述方法可包括将本文所述的组合物施用于皮肤创伤。所述方法还可包括用选自以下的封闭物(closure)闭合创伤：缝合线、卡钉(staples)、胶料(glue)及其组合。施用步骤可包括将所述可流动注射液组合物注入皮肤创伤附近的皮或皮下组织中。在特定实施方式中，所述皮肤创伤可为外科手术创伤，例如在切除先前存在的瘢痕(其可为疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕)的至少一部分之后留下的创伤。所述施用步骤可包括基质组合物的局部施用。优选地，使用本发明方法预防或减少了疤痕瘤形成或肥厚型结疤的形成。例如，可被预防或减少的结疤影响可包括疼痛、瘙痒、变色、异常硬度、异常厚度、表面不规则及其组合。在具体实施方式中，所述施用步骤可包括在每2.5cm创伤边缘上施用约0.1mL至约10mL的基质组合物。

根据本公开的制备水凝胶组合物的其它方法可包括将冻干形式的水凝胶重构以形成如本文所述的重构组合物。在示例性实施方式中，制备水凝胶组合物的方法可包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，并且将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂，并且使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。在具体实施方式中，与所述冻干组合物接触的水性重构液可包括约0.01％至约4wt％的表面活性剂。进一步地，与所述冻干组合物接触的水性重构液可包括约0.01％至约4wt％的吸湿辅料。仍然进一步地，与所述冻干组合物接触的水性重构液可包括约0.01％至约4wt％的膨胀剂。另外，与所述冻干组合物接触的水性重构液可包括总计约0.05％至约6wt％的添加剂。

在多个实施方式中，所述两种或更多种添加剂可包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；和iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。在其它实施方式中，所述两种或更多种添加剂可包括以下中的任何种：i)聚山梨醇酯和多元醇；ii)聚山梨醇酯和盐；iii)聚山梨醇酯和糖；iv)多元醇和糖；v)盐和糖；vi)聚山梨醇酯、多元醇和糖；和vii)聚山梨醇酯、盐和糖。进一步地，所述两种或更多种添加剂可包括以下中的任何种：i)吐温和甘油；ii)吐温和NaCl；iii)吐温和二糖；iv)甘油和二糖；v)NaCl和二糖；vi)吐温、甘油和二糖；和vii)吐温、NaCl和二糖。特别是所述两种或更多种添加剂可包括表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1；所述两种或更多种添加剂可包括表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1；和/或所述两种或更多种添加剂可包括吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

在其它实施方式中，本公开还涉及可提供一种或多种用于形成如本文所述的水凝胶组合物的组分的制品，诸如试剂盒。在示例性实施方式中，试剂盒可包括：收纳包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物的第一容器，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；收纳重构材料的第二容器；和合并第一容器与第二容器的内容物以形成用于治疗急性皮肤创伤的重构水凝胶组合物的用法说明。特别是，所合并的第一容器和第二容器的内容物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。

在另外的实施方式中，所述第一容器可包括添加剂中的至少一种。所述第二容器可包括两种或更多种添加剂。所述第二容器可包括水性重构液。所述水性重构液可包括两种或更多种添加剂。在多个实施方式中，所述水性重构液可包括约0.01％至约4wt％的表面活性剂；所述水性重构液可包括约0.01％至约4wt％的吸湿辅料；所述水性重构液可包括约0.01％至约4wt％的膨胀剂；和/或所述水性重构液可包括约0.05％至约6wt％的添加剂。

在另外的实施方式中，所述两种或更多种添加剂可包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；和iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。所述两种或更多种添加剂可包括以下中的任何种：i)聚山梨醇酯和多元醇；ii)聚山梨醇酯和盐；iii)聚山梨醇酯和糖；iv)多元醇和糖；v)盐和糖；vi)聚山梨醇酯、多元醇和糖；和vii)聚山梨醇酯、盐和糖。所述两种或更多种添加剂可包括以下中的任何种：i)吐温和甘油；ii)吐温和NaCl；iii)吐温和二糖；iv)甘油和二糖；v)NaCl和二糖；vi)吐温、甘油和二糖；和vii)吐温、NaCl和二糖。所述两种或更多种添加剂可包括表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1。所述两种或更多种添加剂可包括表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1。所述两种或更多种添加剂可包括吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

试剂盒还可包括用于形成或递送水凝胶组合物的其它组分。例如，所述试剂盒还可包括适于以下中的一项或两项的连接器：第一容器内容物向第二容器中的无菌传递和第二容器内容物向第一容器中的无菌传递。第一容器和第二容器中的至少一个可为注射器。所述试剂盒还可包括适于连接到注射器的针。特别是，所述针可为23号到27号针。

本发明包括但不限于以下实施方式：

实施方式1：制备稳定的水凝胶组合物的方法，所述方法包括：将明胶和聚合碳水化合物在水性介质中于第一温度混合以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；将所述液体水凝胶组合物在恒速混合下冷却至保持温度，所述保持温度比第一温度低至少约5℃并高于凝胶化温度，在所述凝胶化温度下所述液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物，所述保持温度在凝胶化温度的约7℃内；和将所述液体水凝胶组合物进一步冷却至凝胶化温度以将所述液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物。

实施方式2：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述稳定的水凝胶组合物当于35℃温度和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.4的超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子，或者其中所述稳定的水凝胶组合物当于35℃温度和2-8MHz频率测试时在至少600分钟上显示0.5的U_A水凝胶稳定因子为0.5。

实施方式3：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述稳定的水凝胶组合物通过以下中的一项或多项定义：当在35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.3；当在35℃温度和2.7MHz频率测试时U_A在至少600分钟上水凝胶稳定因子为0.4；当在35℃温度和在5.1MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.2；当在35℃温度和在5.1MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.3；当在35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.35；和当在35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.5。

实施方式4：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中第一温度为约45℃或更高。

实施方式5：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中凝胶化温度为约35℃。

实施方式6：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中进一步冷却至凝胶化温度在少于约2小时的时间内进行。

实施方式7：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述进一步冷却包括将所述稳定的固体或半固体水凝胶组合物冷却至约1℃至约12℃的储存温度。

实施方式8：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述水性介质的渗透压低于约400mOsm/kg。

实施方式9：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述水性介质的渗透压为约25mOsm/kg至约375mOsm/kg。

实施方式10：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述水性介质具有以下中的一项或两项：磷酸根离子浓度不高于约20mM和碳酸根离子浓度不高于约20mM。

实施方式11：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述水性介质包括介质199。

实施方式12：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，其中所述稳定的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

实施方式13：制备如任何前述或后述实施方式的稳定的水凝胶组合物的方法，还包括冻干所述稳定的水凝胶组合物。

实施方式14：根据任何前述实施方式的方法制备的稳定的水凝胶组合物，其中所述稳定的水凝胶组合物显示以下中的一项或多项：当于35℃温度和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子为0.4；当于35℃温度和2-8MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.5；当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下在35℃至39℃温度时从注射器中迫出时流速为约10μL/s或更高；在35℃至39℃温度时粘度为约1.5Pa-s或更低；纤连蛋白结合活性为约3nmol/mg或更高；和在哺乳动物皮或皮下组织中的停留时间为约3天或更长。

实施方式15：包括明胶和聚合碳水化合物的可流动注射组合物，所述组合物是从冻干形式重构的水凝胶，并且还包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；其中所述明胶占重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多。

实施方式16：根据任何前述或后述实施方式的组合物，其中所述可流动注射重构组合物当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下在35℃至39℃温度时从注射器中迫出时具有的流速为约25μL/s或更高。

实施方式17：根据任何前述或后述实施方式的组合物，其中所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；v)聚山梨醇酯和多元醇；vi)聚山梨醇酯和盐；vii)聚山梨醇酯和糖；viii)多元醇和糖；ix)盐和糖；x)聚山梨醇酯、多元醇和糖；xi)聚山梨醇酯、盐和糖；xii)吐温和甘油；xiii)吐温和NaCl；xiv)吐温和二糖；xv)甘油和二糖；xvi)NaCl和二糖；xvii)吐温、甘油和二糖；和xviii)吐温、NaCl和二糖。

实施方式18：根据任何前述或后述实施方式的组合物，其中所述两种或更多种添加剂包括：表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1；表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1；或吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

实施方式19：根据任何前述或后述实施方式的组合物，其中所述可流动注射重构组合物的粘度在35℃至39℃温度时为约1.5Pa-s或更低。

实施方式20：根据任何前述或后述实施方式的组合物，其中所述可流动注射重构组合物构建为在低于35℃的温度转化为固体或半固体。

实施方式21：根据任何前述或后述实施方式的组合物，其中所述固体或半固体重构组合物在皮或皮下组织中的停留时间为约3天或更长。

实施方式22：制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂，并且使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

实施方式23：根据任何前述或后述实施方式的制备水凝胶组合物的方法，其中满足以下条件中的一种或多种：与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的表面活性剂；与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的吸湿辅料；和与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的膨胀剂。

实施方式24：根据任何前述或后述实施方式的制备水凝胶组合物的方法，其中与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.05％至约6wt％的添加剂。

实施方式25：根据任何前述或后述实施方式的制备水凝胶组合物的方法，其中所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；v)聚山梨醇酯和多元醇；vi)聚山梨醇酯和盐；vii)聚山梨醇酯和糖；viii)多元醇和糖；ix)盐和糖；x)聚山梨醇酯、多元醇和糖；xi)聚山梨醇酯、盐和糖；xii)吐温和甘油；xiii)吐温和NaCl；xiv)吐温和二糖；xv)甘油和二糖；xvi)NaCl和二糖；xvii)吐温、甘油和二糖；和xviii)吐温、NaCl和二糖。

实施方式26：根据任何前述或后述实施方式的制备水凝胶组合物的方法，其中所述两种或更多种添加剂包括：表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1；表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1；或吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

实施方式27：试剂盒，包括：收纳包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物的第一容器，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；收纳重构材料的第二容器；和将第一容器和第二容器的内容物合并以形成用于治疗急性皮肤创伤的重构水凝胶组合物的用法说明；其中合并的第一容器和第二容器的内容物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。

实施方式28：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中所述第一容器包括所述添加剂中的至少一种。

实施方式29：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中所述第二容器包括所述两种或更多种添加剂。

实施方式30：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中所述第二容器包括水性重构液。

实施方式31：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中所述水性重构液包括所述两种或更多种添加剂。

实施方式32：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中满足以下条件中的一种或多种：所述水性重构液包括约0.01％至约4wt％的表面活性剂；所述水性重构液包括约0.01％至约4wt％的吸湿辅料；和所述水性重构液包括约0.01％至约4wt％的膨胀剂。

实施方式33：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中所述水性重构液包括约0.05％至约6wt％的添加剂。

实施方式34：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；v)聚山梨醇酯和多元醇；vi)聚山梨醇酯和盐；vii)聚山梨醇酯和糖；viii)多元醇和糖；ix)盐和糖；x)聚山梨醇酯、多元醇和糖；xi)聚山梨醇酯、盐和糖；xii)吐温和甘油；xiii)吐温和NaCl；xiv)吐温和二糖；xv)甘油和二糖；xvi)NaCl和二糖；xvii)吐温、甘油和二糖；和xviii)吐温、NaCl和二糖。

实施方式35：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中所述两种或更多种添加剂包括：表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1；表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1；或吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

实施方式36：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，还包括适于以下中的一项或两项的连接器：第一容器内容物向第二容器中的无菌转移和第二容器内容物向第一容器中的无菌转移。

实施方式37：根据任何前述或后述实施方式的试剂盒，其中第一容器和第二容器中的至少一个是注射器，且其中所述试剂盒任选包括适于连接到注射器的23号到27号针。

本公开的这些和其它特征、方面和优点将通过阅读以下详细说明以及在下文中简述的附图而明显可见。本发明包括上述实施方式中两个、三个、四个或更多个的任何组合以及本公开中所阐述的任何两个、三个、四个或更多个特征或要素的组合，无论这样的特征或要素是否在本文的具体实施方式描述中明确组合。除非在上下文中明确表示相反，本公开意图被整体阅读以便使所公开的发明的任何单独特征或要素在其多个方面中应视为意图为可结合的。

附图说明

图1是显示根据本公开的示例性组合物的差示扫描量热曲线的图表；

图2是显示根据本公开的示例性组合物的物理性质的图表；

图3是显示根据本公开其它实施方式的组合物的物理性质相对于该组合物的明胶浓度的图表；

图4是显示根据本发明实施例1的方法在三种不同频率下制备的水凝胶组合物以水为参比的相对超声波衰减的图表；

图5是显示根据本发明实施例2的方法在三种不同频率下制备的水凝胶组合物的相对超声波衰减的图表；

图6是显示根据本发明实施例1的方法制备的水凝胶组合物和根据实施例2制备的水凝胶组合物的相对超声速的图表；

图7图解了根据本公开的示例性实施方式的包括多个容器的试剂盒，所述多个容器每个均包含用于制备水凝胶组合物的组分；

图8a是显示根据本公开的实施方式制备的组合物当于40℃温度温育24小时的时间时的相变的图表；

图8b是显示根据本公开的实施方式制备的水凝胶组合物当于40℃温度温育24小时的时间时的相变的图表；

图8c是显示不使用中间冷却步骤制备的组合物当于40℃温度温育24小时的时间时的相变的图表；

图8d是显示不使用中间冷却步骤制备的另一种组合物当于40℃温度温育24小时的时间时的相变的图表；

图9a是显示根据本公开的实施方式制备的组合物当于50℃温度温育24小时的时间时的相变的图表；

图9b是显示根据本公开的实施方式制备的另一种组合物当于50℃温度温育24小时的时间时的相变的图表；

图9c是显示不使用中间冷却步骤制备的组合物当于50℃温度温育24小时的时间时的相变的图表；和

图9d是显示不使用中间冷却步骤制备的另一种组合物当于50℃温度温育24小时的时间时的相变的图表。

具体实施方式

本发明现在将参考其示例性实施方式在下文中更完整地描述。这些示例性实施方式被描述为使得本公开为透彻和完整的，并且将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。实际上，本发明可以多种不同形式实施，并且不应被解释为受限于本文所阐述的实施方式；而是，这些实施方式被提供以使得本公开完全满足适用法律要求。除非上下文中明确表示相反，说明书中和后附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个/一种”、“该/所述”包括复数个指代物。

本公开涉及可有利地用于治疗创伤、特别是皮肤(skin)(即，真皮(dermis))创伤的组合物。尽管人的平均核心体温(averagecorebodytemperature)为37℃(+/-0.5℃)，皮肤温度可显著较低并通常在约33℃(+/-1℃)范围内。本公开描述了由明胶和聚合碳水化合物形成的组合物，其可以多种形式提供并且因此特别可用于治疗皮肤创伤。更具体地，明胶和聚合碳水化合物可被组合以便使明胶与碳水化合物互相作用而在大致等于或低于平均皮肤温度的温度形成固体或半固体凝胶基质组合物。如下文更完整讨论的，所述组合物在低于35℃的温度可为固体或半固体材料。

在皮或皮下组织中，所述组合物基本为固体或半固体凝胶基质形式，其通过其物理存在以及创伤愈合和创伤成熟(woundmaturation)过程中明胶和聚合碳水化合物的可能的相互作用来调节创伤愈合。本公开的组合物生物降解和/或被植入的基质组合物周围的组织生理性再吸收。因此，所述固体或半固体基质组合物具有确定的停留时间，在此期间内该组合物改善创伤愈合并缓慢降解。如本文中进一步所述的，所述组合物具有如下的水凝胶稳定因子：其定义了组合物保持水凝胶结构的能力，这种能力起因于明胶与聚合碳水化合物的相互作用。这与先前的水凝胶不同，后者在皮肤条件下分离为构成组分，因此缺少以根据本公开可行的方式调节创伤愈合的必要特质。所述组合物可有利地以干燥(例如，粉末)形式提供，这种形式特别可用于组合物的长期储存。这样的粉末组合物可使用多种生理可接受的溶剂和添加剂重构。

尽管本发明不受限于特定机理，相信结合的明胶和聚合碳水化合物提供了类似于自然创伤愈合环境的环境(例如，在胶原和粘多糖存在下)。这样的环境可减少或限制肥厚型创伤愈合，包括肥厚型瘢痕形成和疤痕瘤形成。

本公开的组合物提供了在仅略高于平均皮肤温度的温度时为可流动(且可注射)的液体的优点，因此可在没有热伤害的情况下注射到界面组织。然而，所述组合物还提供了在大致平均皮肤温度时转化为固体或半固体凝胶基质并在较长时间段内保持水凝胶结构的优点。因此，本发明的组合物可在皮肤创伤附近显示足够的持续性从而在创伤愈合过程中具有有益效果，相信这在迄今已知的水凝胶组合物中是不会发生的。优选地，所述组合物可降解但在急性创伤愈合期(例如，约2周)内可存留，然而可存留较长时间段以有利于胶原成熟和创伤改变(remodelling)。所述组合物还特别可用于治疗急性皮肤创伤。所述组合物还可用于治疗疤痕瘤型瘢痕、肥厚型瘢痕、烧伤相关瘢痕或用于外科手术创伤的预防性治疗(尤其是在有瘢痕形成倾向的患者中)。落入此类的患者可根据瘢痕形成过往史来鉴定–例如，肥厚型结疤或疤痕瘤形成。另外，患者可根据本领域中被认为具有较高疤痕瘤形成风险的组别的特征来鉴定(即，暗色皮肤)。例如，与较浅肤色的人相比，在很深肤色的人中有高出15倍的疤痕瘤发生频率。更具体地，非洲血统的人被认为具有较高的疤痕瘤发生风险。

本公开的组合物可针对其特定性质具体表征。例如，在明胶制造过程中，使用多种化学过程以降解胶原，其也可降低所得明胶的纤连蛋白和聚合碳水化合物结合性质。为具有所需性质，所述组合物优选包含具有完整纤连蛋白结合活性的明胶。为此目的，可优选使用定义分子量的明胶。具体而言，明胶可具有如下平均分子量：约75,000或更高、约80,000Da或更高、约100,000Da或更高或者约110,000Da或更高。在特定实施方式中，明胶可具有如下平均分子量：约75,000Da至约250,000Da、约90,000Da至约225,000Da、约100,000Da至约200,000Da或约120,000Da至约180,000Da。在特定实施方式中，可特别优选具有约140,000Da至约160,000Da的分子量的明胶。

分子量可表达为重均分子量(M_w)或数均分子量(M_n)。这两种表达均基于包含大分子溶质的溶液表征为具有平均分子数(n_i)和每个分子的摩尔质量(M_i)。因此，数均分子量由下式1定义。

$M_n=\frac{{\mathrm{\Σn}}_i{M}_i}{{\mathrm{\Σn}}_i}---\left(1\right)$

重均分子量(也称为平均分子量)可使用光散射方法直接测量，并且由下式2定义。

$M_w=\frac{{\mathrm{\Σn}}_i{M}_i^2}{{\mathrm{\Σn}}_i{M}_i}---\left(2\right)$

分子量也可表达为Z-平均分子量(M_z)，其中所述计算的重点更多在于具有大分子量的分子上。Z-平均分子量由下式3定义。

$M_z=\frac{{\mathrm{\Σn}}_i{M}_i^3}{{\mathrm{\Σn}}_i{M}_i^2}---\left(3\right)$

除非另外指明，分子量在本文中表达为重均分子量。

根据本发明所用的明胶可源自多种可用来源，诸如通过将源自动物皮肤、结缔组织或骨的胶原至少部分水解获得。或者可选地，明胶可来自体外合成，诸如来自细胞培养，其可以是人源的，或者可以是合成的。可使用A型明胶(即，源自酸处理前体)或B型明胶(即，源自碱处理前体)。另外，明胶可使用化学水解和/或热水解使胶原变性而获得。

所述组合物的聚合碳水化合物可以是天然碳水化合物，诸如粘多糖，或者可以是合成碳水化合物。为具有所需性质以在明胶的所需温度形成固体或半固体凝胶基质，可优选分子量为约10,000至1,000,000Da的碳水化合物(例如，葡聚糖)。分子量在该范围较高端的碳水化合物可提供更好的基质物理性质和稳定性。

聚合碳水化合物可包括多种多糖，诸如粘多糖或者黏多糖，以及合成碳水化合物。可使用的聚合碳水化合物的具体的、非限制性的例子包括琼脂糖、藻酸盐、支链淀粉、直链淀粉、角叉菜胶、纤维素、壳质、壳聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、糖原、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、透明质酸、硫酸角质素和淀粉。

明胶和聚合碳水化合物的化学计量可优选根据两种聚合物组分在生理pH下的互补离子电荷以所需范围配制。由于所需的物理和潜在的生理性质源自聚合物组分(明胶+聚合碳水化合物)，优选的化学计量范围为明胶最少占聚合物重量的60％以提供如实施例中所述的合适性质。因此，明胶组分可占明胶与聚合碳水化合物组合的约60wt％或更高。在另外的实施方式中，明胶组分可占明胶与聚合碳水化合物组合的约62wt％或更高，约65wt％或更高，约67wt％或更高，或约70wt％或更高。在另外的实施方式中，明胶可占全部组合物中明胶与聚合碳水化合物组合的约60wt％至约95wt％，约65wt％至约90wt％，或约70wt％至约85wt％。

如上面已提到的，包括水性成分在内的形成本发明组合物的材料的总体组合可提供用于形成具有相对窄相变温度范围的材料。具体而言，组合物的聚合物材料与其它组分之间的相互作用可形成相可控的水凝胶基质，其在大致等于平均皮肤温度或以下的温度时为固体或半固体，并且可通过加热到略高于平均皮肤温度的温度而被转化为可流动的液体组合物。换言之，本文所公开的组合物可提供令人惊讶的窄相控制。具体而言，本发明的组合物可被调整(tailored)为具有非常窄和具体的转化温度范围，由此使得，例如，仅约0.5℃至约3℃、约0.8℃至约2.5℃或约1℃至约2℃的差异可有效引起从可流动的可注射液体到固体或半固体的相变(诸如在注入皮组织中之后)，反之亦然。在某些实施方式中，如通过差示扫描量热法(DSC)所测定的，本文所公开的水合组合物可在35℃或更高的温度时为可流动液体。更具体地，本文所公开的组合物在35℃或更高、约36℃(+/0.5℃)或更高或者约37℃(+/-0.5℃)或更高的温度时可为可流动的液体。在其它实施方式中，本文所公开的组合物在低于35℃的温度时可为固体或半固体凝胶基质。

明胶和聚合碳水化合物的总聚合物浓度可在约50mg/mL至约400mg/mL、约75mg/mL至约350mg/mL或约100mg/mL至约300mg/mL的范围内。所述组合物可被滴定至接近生理pH以使得两种聚合物组分发生离子相互作用从而形成凝胶。可使用缓冲液以促使适宜的pH在约6至约8的范围内。其它组分(诸如生理盐和氨基酸)可被加入到组合物中以提供对参与创伤愈合的细胞的支持环境。可使用的示例性氨基酸包括谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和丙氨酰-谷氨酰胺。可使用氨基酸的特定异构体，诸如L-异构体。示例性的可用盐包括乙二胺四乙酸二钠和诸如以下的金属盐：锌盐(例如，硫酸锌)、钙盐、镁盐、钠盐和钾盐。

本公开的组合物特别可用于以下情况：当其被加热至略高于平均人皮肤温度(即，35℃或更高)的温度时，所述组合物从固体或半固体材料转换为可流动的液体。优选地，所述可流动液体组合物显示合适的物理性质以允许将组合物注真皮和皮下组织中，诸如围绕皮肤创伤的那些。在特定实施方式中，所述物理性质使得该可流动液体组合物适于通过相对小号的针注入。例如，所述可流动液体组合物可通过具有约0.2mm或更高、约0.25mm或更高或者约0.3mm或更高的标称内径的针或类似器械注入。所述可流动液体组合物还可适于通过具有约0.2mm至约0.4mm或约0.25mm至约0.35mm的标称直径的针或类似器械注入。可用的针规格的例子包括18号到27号针、23号到27号针或23号到25号针。由于相对小号的针需要将组合物注入相对小的目标中，诸如皮组织所呈递者，可注射组合物必须显示充分低的粘性。同样，可注射组合物必须将胶质或不溶颗粒限制为具有小于注射针标称内径的尺寸范围的那些。因此，有益的可以是胶质或不溶颗粒具有注射针标称内径的约1/5或更少、约1/6或更少或者约1/8或更少的平均尺寸。更具体地，所述胶质或不溶颗粒可具有注射针标称内径的约1/5至1/10的平均尺寸。这样的尺寸可允许注入组合物而不会堵塞针孔。

类似地，总固含量能对本发明组合物的流动性和可注射性有不利影响。优选地，当处于可流动液体形式时，对于组合物来说理想的可以是具有低于某个阈值的总固含量，特别是提供适于通过小号针注射的粘度者。例如，对于总固含量来说有益的可以是约0.5g/mL或更低、约0.4g/mL或更低、约0.3g/mL或更低、约0.2g/mL或更低或者约0.1g/mL或更低。在另外的实施方式中，所述可流动注射液组合物的总固含量可为约0.01g/mL至约0.5g/mL、约0.025g/mL至约0.45g/mL、约0.05g/mL至约0.4g/mL或者约0.1g/mL至约0.3g/mL。

仍然进一步地，根据本公开的可流动液体组合物的粘度可与材料—例如，通过小号针的可注射性相关。更具体地，显著高的粘度能限制通过手持注射器注入该组合物的能力。优选地，当处于可流动的液体形式时，对于组合物来说理想的可以是具有如下粘度：约2Pa-s或更低、约1.5Pa-s或更低、约1.25Pa-s或更低、约1.1Pa-s或更低、约1Pa-s或更低、约0.75Pa-s或更低、约0.5Pa-s或更低或者约0.25Pa-s或更低。在另外的实施方式中，所述可流动的液体组合物可具有如下粘度：约0.01Pa-s至约2Pa-s、约0.025Pa-s至约1.75Pa-s、约0.05Pa-s至约1.5Pa-s、约0.1Pa-s至约1.25Pa-s或约0.2Pa-s至约1.1Pa-s。评价粘度的一种方法在下文中在实施例4中描述，且粘度值可涉及约39℃的测试温度范围。

水合液体组合物的可流动性可经由该组合物通过针的压力和流速来表征。例如，流速可通过使用已知的液体分配系统来评价，诸如可得自Nordson/EFD的那些。在具体测试中，可将1mL测试流体置于1mL针筒中，并且可施加5牛顿(N)的注射器柱塞力以将该流体通过16mm(5/8英寸)长的25号针(0.26mm标称内径)迫出针筒外。这样的测试是依照ISO7886-1，但也可使用其它测试条件。当使用以上测试条件时，根据本公开的液体水化组合物可具有如下平均流速：约5μL/s或更高、约10μL/s或更高、约15μL/s或更高、约25μL/s或更高、约75μL/s或更高、约100μL/s或更高或者约200μL/s或更高。平均流速具体可为约10μL/s至约400μL/s、约12μL/s至约350μL/s或约15μL/s至约300μL/s。上述值可类似地应用于通过如本文另外所述的任何号针的可流动性。进一步地，这样的可流动性值可涉及约39℃的测试温度范围。

当处于固体或半固体状态时，本公开的组合物可通过材料的压缩强度来表征。评价机械强度的机械测试在下文中在实施例6中具体描述，并且这样的测试可使用工业中可行的材料和方法进行。在某些实施方式中，根据本公开的固体或半固体组合物可显示如下压缩模量：在环境条件为约15kPa或更高、约20kPa或更高或者约25kPa或更高。在其它实施方式中，压缩模量在环境条件下可为约15kPa至约50kPa、约20kPa至约45kPa或约20kPa至约40kPa。在某些其它实施方式中，压缩模量可表征为在环境条件下为至少约34kPa、至少约35kPa或至少约36kPa。在一些实施方式中，根据本发明的制备方法可制成具有相对高水平压缩模量的本发明的组合物，其可增强这类材料在某些创伤治疗中的性能。评价压缩模量的一种方法在实施例6中讨论。

当处于固体或半固体状态时，本公开的组合物还可通过材料的溶解性质来表征。评价本发明材料的溶解的测试在下文中在实施例6中具体描述，并且这种测试可使用工业中可行的材料和方法进行。在某些实施方式中，根据在如下条件下的视觉观察，形成为碟形的本发明组合物(尺寸为8mm直径和1.5mm高度)在磷酸缓冲盐水中于34℃在大于约45分钟内、大于约46分钟内、大于约47分钟或者大于约48分钟内可显示完全溶解。更大的抗溶解性通常与当在创伤部位处植入时增加的停留时间有关，这可增强本发明组合物的创伤愈合功能。

本公开的组合物可特别有益于其具体组分的保守活性(preservedactivity)。如上面所讨论的，使胶原变性的过程(例如，化学处理)可降低所得明胶的纤连蛋白和聚合碳水化合物结合性质。这可部分涉及胶原的α链的降解。然而，部分由于较高分子量胶原α链的保守性，本公开的组合物可显示高纤连蛋白结合活性(FBA)，特别是与其它包含变性胶原的组合物相比时。在某些实施方式中，根据本公开的组合物可显示如下的FBA：约3nmol/mg或更高、约4nmol/mg或更高或者约5nmol/mg或更高。这样的活性可作为明胶上纤连蛋白结合位点的浓度来测量，所述浓度被标准化(normalized)为组合物中的明胶浓度。测量纤连蛋白结合活性的一种方法在实施例5中描述。

如下文所进一步讨论的，本公开的组合物可具体用于治疗哺乳动物、特别是人的皮或皮下组织的治疗中。通常，可流动组合物可被注入皮或皮下组织的区域中，诸如新鲜、愈合或痊愈创伤的区域中。因此，所述组合物可通过皮或皮下组织中的完整组合物的停留时间来表征。这样的组合物停留时间也可被称为组合物的生物降解时间—即，从置入直到组合物的材料被周围组织和生理过程降解或生物吸收的时间量。在某些实施方式中，根据本公开的组合物在哺乳动物(诸如人)的皮或皮下组织中的停留时间可为约3天或更长、约4天或更长、约5天或更长、约6天或更长或者约7天或更长。在其它实施方式中，停留时间可为约3天至约60天、约4天至约45天、约5天至约40或约6天至约35天。

在本公开组合物的制备中，聚合物组分可与足够多的水(或其它溶剂)混合在一起以使得聚合物如本文所讨论地互相作用从而形成水凝胶基质。聚合物可被加入到混合容器中进行干燥随后在一起水化，或者制备各聚合物的单独溶液(例如，储备溶液，其可以多种浓度提供以稀释形成水凝胶组合物)并随后混合在一起。缓冲剂或滴定剂可被添加以调节pH和离子强度。组分的组合可随后在加热(例如，至高于本文所讨论的液体转化温度的温度)下被混合以形成均匀的水凝胶组合物。这种制备模式可实现适合用于其中治疗利益依赖于组合物构成部分的性质但不依赖于水凝胶自身的总体结构的某些用途中的水凝胶基质。特别是根据本公开已发现不使用本文所讨论的温度和混合详细说明以及盐浓度范围的水凝胶的形成能导致如下的热可逆材料：该热可逆材料能以固体或半固体状态存在，但其在生理条件下经历相分离。具体而言，明胶和聚合碳水化合物组分能显著分离从而水凝胶结构破坏，液体组分被周围组织迅速吸收，且单独的聚合物持续一段时间以提供脚手架样的结构。根据本公开进一步发现，尽管这样的生物聚合物脚手架可提供一些治疗利益，其不足以提供理想的皮肤创伤愈合，特别是急性皮肤创伤，具体而言伴有较轻的结疤以及疤痕瘤形成的减少或消除。然而，根据本公开这些目标可通过利用根据本文所定义的说明制备的水凝胶来实现。特别是，已发现所述的水凝胶组合物的制备方法对于水凝胶在皮条件的相稳定性具有意料不到的效果，因此本公开的水凝胶组合物可进一步通过水凝胶稳定因子来定义，后者可与组合物的制备方法直接相关。

在某些实施方式中，水凝胶稳定因子可通过水凝胶的超声评价来技术。可使用有效用于水凝胶性质的非破坏性分析的任何超声波谱仪，其利用在高超声频率下穿过样品的速度和声波传播衰减的高分辨率测量。如实施例13中所述，可使用HR-US102超声波谱仪(可得自SonasTechnologies,Ltd.,Dublin,Ireland)。超声速提供了水凝胶(或其它测试介质)的高频弹性的信息，其对样品的分子间相互作用、水合作用、微弹性、交联以及内部结构和组成极其敏感。超声波衰减通过穿过样品的超声衰减中的能量损失来确定，并且与高频粘度成正比。这样的评价可用于提供样品微观结构组织及其演变(例如，粒径、团聚和聚集)。因此超声测试根据本公开已被发现是评价热可逆水凝胶的皮稳定性和将这种皮稳定性与水凝胶组合物制备方法关联起来的可靠方式。

制备具有理想水凝胶稳定性的组合物的一种优选实施方式在实施例1中描述。在多个实施方式中，组合物的非聚合物组分的一部分可被混入水性介质(在实施例1中为介质199)中，并使其平衡。混合组分以形成液体水凝胶组合物优选于适于提高明胶上结合位点与聚合碳水化合物的相互作用的可行性的第一温度进行。在某些实施方式中，所述第一混合温度可为如下温度：约45℃或更高或者约50℃或更高(例如，约45℃至约80℃、约46℃至约70℃、约48℃至约65℃或约50℃至约60℃)。因此，聚合碳水化合物和明胶可被顺序或组合(包括干形式和储备聚合物溶液)添加到溶液中。一旦聚合物在溶液中，则可将水凝胶组合物的pH调节到所需范围。在从pH调整平衡之后，剩余的非聚合物组分可被搅拌进入液体水凝胶组合物中。其中所有水凝胶组分被水化或以其它方式形成液体溶液的水凝胶处理可在恒速混合或基本保持水凝胶组分在溶液中的类似搅拌下进行。例如，可使用搅拌棒或类似混合设备。在一些实施方式中，液体水凝胶组合物的形成可在恒速混合下于第一温度进行如下时间：约10分钟或更高、约30分钟或更高、约60分钟或更高或者约90分钟或更高(例如，约20分钟至约300分钟、约30分钟至约240分钟或约45分钟至约180分钟)。

根据本公开已发现水凝胶稳定性直接受制备方法的温度条件影响。尽管在上面限定的温度下混合用于组合物材料的溶解并且因此可用于液体水凝胶组合物的初始形成，但对于组合物来说有益的是在混合停止之前冷却到低于第一温度的保持温度。所述保持温度可针对第一温度和/或针对水凝胶组合物的凝胶化温度定义。在一些实施方式中，保持温度可比第一温度低至少约2℃、至少约5℃或至少约8℃。在另外的实施方式中，保持温度可在水凝胶组合物的凝胶化温度的约10℃、约7℃、约5℃或约2℃之内。凝胶化温度理解为如下温度：液体水凝胶组合物于该温度时转化为固体或半固体水凝胶组合物。在某些实施方式中，保持温度可为低于约45℃或低于约42℃(例如，约36℃至约44℃、约37℃至约43℃或约38℃至约42℃)。例如，约50℃下的平衡的液体水凝胶组合物可从混合容器被泵入到约40℃的保持容器(holdingvessel)中(在此期间可进行过滤灭菌)。一旦组合物组分如上所述地充分溶解形成液体水凝胶组合物，其可使用任何冷却方式冷却至保持温度。在优选实施方式中，所述保持容器可被主动冷却以使得进入该保持容器的液体水凝胶组合物被冷却至保持温度。冷却也可在过滤期间或通过其它方式进行。在一些实施方式中，可优选将形成的液体水凝胶在限定时间段内冷却至保持温度，诸如，例如，在少于约8小时、少于约4小时、少于约2小时或少于约1小时内。对于液体水凝胶组合物来说特别优选在冷却至保持温度的过程中经历恒速混合。对于液体水凝胶组合物还可优选的是在该液体水凝胶组合物被保持于保持温度的全部时间均经历恒速混合。在将液体组合物冷却至凝胶化温度之前应用恒速混合可表征为使液体水凝胶组合物保持为均匀的液体聚合物溶液。过早终止混合能导致液体聚合物溶液不均匀以致发生明胶和聚合碳水化合物的相分离，并且聚合物组分不能均匀地分散于整个液体组合物中以使得在凝胶化温度以下形成的固体或半固体水凝胶实现聚合物组分之间的必要结合。

处于保持温度的液体水凝胶组合物可被分配到所需包装或储存容器中或保持为体相组合物(bulkcomposition)。随后，所述液体水凝胶组合物可进一步冷却至低于组合物凝胶化温度的储存温度(即，其中所述组合物处于固体或半固体状态的温度)。在一些实施方式中，冷却至保持温度可使用第一种方法进行，且进一步冷却至凝胶化温度可使用第二种不同方法进行。例如，所述第一种方法可包括混合，且所述第二种方法可在不存在混合的情况下进行。作为进一步的例子，所述第一种方法可包括在第一时间量内冷却至所需温度，且所述第二种方法可包括在第二不同时间量内冷却至凝胶化温度。在一些实施方式中，水凝胶组合物的冷却可在最少时间内基本停止于保持温度。因此，显然冷却至保持温度的步骤和冷却至凝胶化温度的步骤是单独的不同步骤，并且当从第一温度直接冷却到凝胶化温度而不是到保持温度的第一冷却时，不能实现根据本公开的合适水凝胶。如上面所讨论的，由于保持温度相当接近凝胶化温度，冷却至储存温度可在不存在混合的情况下进行而不会对组合物有不理想的影响——即，不会存在水凝胶聚合均匀度的显著损失。当所述冷却通过凝胶化阶段转化组合物时形成的固体或半固体水凝胶组合物可表征为具有如下稳定形式：其中固体或半固体凝胶充分迅速地形成以避免均匀混合的液体组合物的显著相分离或结构重置。所述固体或半固体水凝胶组合物可在显著低于组合物凝胶化温度的温度储存，诸如在冷藏下，特别是在如下温度：低于约20℃、低于约15℃或低于约10℃(例如，于约1℃至约12℃、约2℃至约10℃或约2℃至约8℃的温度)。优选地，混合终止与凝胶化而形成固体或半固体水凝胶组合物之间的时间少于约2小时、少于约1小时或少于约30分钟。

用于制备水凝胶组合物的介质(例如水)的性质也能显著影响水凝胶稳定性。优选地，所述水凝胶介质可为去离子水，并且可被补充以一种或多种缓冲剂和/或防腐剂。然而，对于水凝胶介质来说进一步优选的是避免过高的盐浓度，特别是对于特定离子。在多个实施方式中，用于形成液体水凝胶组合物的水性介质可通过低于指定浓度的渗透压来定义。例如，水性介质的总盐浓度可低于约400mOsm/kg。在另外的实施方式中，水性介质的渗透压可低于约350mOsm/kg，低于约325mOsm/kg或低于约300mOsm/kg。特别是，水性介质的渗透压可为约10mOsm/kg至约400mOsm/kg、约25mOsm/kg至约375mOsm/kg或者约50mOsm/kg至约350mOsm/kg。尽管不希望受理论所限，据信以上渗透压条件足以模拟哺乳动物皮组织中胞外基质的性质，从而影响固体或半固体水凝胶组合物将其凝胶化结构保持足够停留时间以实现如本文所讨论的理想治疗效果的能力。因此，在某些实施方式中，本公开的水凝胶组合物可定义为具有如下渗透压：其比所治疗的组织的胞外基质的渗透压超出不多于约20％、不多于约18％或不多于约15％。

在另外的实施方式中，水性介质的性质也可就磷酸根离子浓度和/或碳酸根离子浓度来定义。例如，已发现磷酸缓冲盐水(PBS)提供了对于实现本公开的稳定水凝胶来说不能接受的高磷酸根浓度。这在所附实施例2中举例说明。优选地，根据本公开使用的水性介质具有如下磷酸根离子浓度：其不大于约25mM，不大于约20mM或不大于约15mM。类似地，根据本公开使用的水性介质具有如下碳酸根离子浓度：其不大于约25mM，不大于约20mM或不大于约15mM。另一方面，如所附实施例1中使用的介质199已被发现是具有足够低磷酸根离子浓度以提供形成高度稳定的水凝胶组合物的有用的水凝胶介质。

尽管以上用于稳定水凝胶组合物的制备的工艺参数被单独阐述，应理解根据本公开的方法可根据所提及的工艺参数之一或通过所提到的工艺参数的任何组合来定义。另外，各工艺参数可根据本文所提供的其进一步描述的任何方面来实施。例如，制备包含明胶和聚合碳水化合物的有用的稳定水凝胶组合物的方法可就任何以下参数定义：

如本文所述的于第一温度混合并冷却至保持温度；

如本文所述的保持混合同时冷却；

如本文所述的利用具有限定的磷酸根浓度的介质；

如本文所述的利用具有限定的碳酸根浓度的介质；

如本文所述的于第一温度混合并冷却至保持温度以及保持混合同时冷却；

如本文所述的于第一温度混合并冷却至保持温度以及利用具有限定的磷酸根浓度的介质；

如本文所述的于第一温度混合并冷却至保持温度以及利用具有限定的碳酸根浓度的介质；

如本文所述的于第一温度混合并冷却至保持温度以及保持混合同时冷却并且利用具有限定的磷酸根浓度的介质；

如本文所述的于第一温度混合并冷却至保持温度以及保持混合同时冷却并且利用具有限定的碳酸根浓度的介质；和

如本文所述的于第一温度混合并冷却至保持温度以及保持混合同时冷却，利用具有限定的磷酸根浓度的介质和利用具有限定的碳酸根浓度的介质。

考虑到以上内容，根据本公开有用的水凝胶组合物可被定义为具有一定成分组成的如下水凝胶：其在提供特定的水凝胶稳定因子的加工条件下形成。这种水凝胶稳定因子则可直接与水凝胶组合物有效治疗急性皮肤创伤(包括瘢痕修复)的能力相关联。在所附实施例中描述的测试已显示：甚至当相同的两种聚合物以相同量使用以形成主要仅区别在于所用的溶剂介质(例如，实施例1和2中的介质199对高磷酸盐PBS)的水凝胶基质时，制备水凝胶组合物的方法可显著改变组合物的水凝胶稳定性。具体而言，根据本公开具有较大稳定因子的水凝胶组合物被认为在皮组织中持续足够长的时间同时保持源于水凝胶聚合物的结合相互作用的水凝胶结构从而实现一定水平的治疗功效(例如，瘢痕减少)，所述水平显著和出乎意料地超过具有较低稳定因子的类似水凝胶的水平。具体而言，具有较低稳定因子的水凝胶可在不可接受的较短皮肤停留时间之后经历相分离和水凝胶重置，因此受所述组合物的水凝胶结构所促进的必要的创伤愈合机制不能以减少结疤(尤其是疤痕瘤形成)的方式进行。这种区别令人惊讶之处在于当稳定的固体或半固体水凝胶组合物形成时的本文所述的温度、混合和盐浓度参数的稳定作用会持续到水凝胶已液化用于注射并在皮组织中重新形成固体或半固体形式。

根据本公开的显示可用于急性皮肤创伤治疗的稳定性的水凝胶组合物还可通过如本文所述的超声检测来确认。本文所用的水凝胶稳定因子可定义为超声波衰减(U_A)在限定的频率或频率范围和限定的测试温度下的超声检测的最小限定时间内的百分比变化。例如，0.5的U_A水凝胶稳定因子对应于在限定时间间隔内低于50％的超声波衰减变化。

在例示实施方式中，根据本发明可用的水凝胶组合物可显示当于35℃和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.4。因此，水凝胶的超声波衰减在至少500分钟的时间在所述测试条件下将变化少于40％。在另一个例示实施方式中，根据本公开可用的水凝胶组合物可显示当于35℃和2-8MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.5。因此，水凝胶的超声波衰减在至少600分钟的时间在所述测试条件下将变化少于50％。较低的水凝胶稳定因子对应于更稳定的水凝胶，其在足够的皮肤停留时间内耐受相分离和结构重置，从而提供了有效的瘢痕减少治疗。

在一个实施方式中，根据本公开有用的水凝胶组合物可具有当在35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少500分钟上为0.3的U_A水凝胶稳定因子。在另一个实施方式中，有用的水凝胶组合物可具有当在35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少600分钟上为0.4的U_A水凝胶稳定因子。在另一个实施方式中，有用的水凝胶组合物可具有当在35℃温度和在5.1MHz频率测试时在至少500分钟上为0.2的U_A水凝胶稳定因子。在另一个实施方式中，有用的水凝胶组合物可具有当在35℃温度和在5.1MHz频率测试时在至少600分钟上为0.3的U_A水凝胶稳定因子。在另一个实施方式中，有用的水凝胶组合物可具有当在35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少500分钟上为0.35的U_A水凝胶稳定因子。在另一个实施方式中，有用的水凝胶组合物可具有当在35℃温度和7.8MHz测试时在至少600分钟上为0.5的U_A水凝胶稳定因子。

为进一步促进所得凝胶基质的稳定性，理想的可以是原位浓缩有助于最终组合物稳定性的聚合物部分。该方法可在组合物的生产中使用以去除每种聚合或混合组合物的溶解度最高的部分从而浓缩每种聚合物具有所需性质的部分。一种浓缩所需聚合物的方法可以为将聚合物缓慢溶解在一起并加热，并且倾析或去除溶解度最高的液体以浓缩剩余的聚合物混合物。另一种浓缩组合物的方法可以是洗涤每种聚合物或聚合物的混合物，同时在部分可溶条件下，诸如因与水/醇混合物或与高离子强度条件(诸如与氯化钠溶液)接触。这样的明胶洗涤技术可得到保有溶解度较低的组分的组合物，因此增强了组合物的物理性质并改进了在治疗部位中的持久性。特别有益的是浓缩组合物，同时将聚合物在理想pH范围内混合以允许在聚合物之间的离子相互作用和分馏以去除聚合物组合物中溶解度较高的部分。

本领域已知的大量分馏(Bulkfractionation)方法可用于浓缩如上所讨论的聚合物。例如，尺寸排阻色谱(例如，凝胶过滤色谱或凝胶渗透色谱)或Baker-Williams分馏。可用于制备本发明组合物的其它分馏方法可见于Francuskiewicz,PolymerFractionation,Springer-Verlag,1994，其公开内容通过引用以其整体并入本文。这样的分馏组合物被预期当处于固体或半固体状态时具有较高稳定性和改进的物理性质。

本公开的组合物组合物还可包括其它活性试剂以促进其使用或提高其对需要治疗的部位的有益效果。这样的活性试剂可包括止血剂(包括胶原或凝血酶)、抗微生物剂(包括抗生素)、杀菌剂或抑菌剂、生长因子(包括表皮生长因子、纤维母细胞生长因子、血小板源性生长因子或胰岛素样生长因子)或抗炎剂(诸如皮质类固醇或非甾体抗炎剂)。

为促进在周围条件下的运输和储存，组合物可被冻干为干燥状态并在使用前重构或复水。冻干组合物可提供改进的稳定性并允许在使用前室温储存。根据本发明可用的示例性冻干方法在以下中公开：美国专利号5,192,743；美国专利号7,666,413；美国专利号7,695,736；和美国专利公开号2008/0145404。前述所有文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。由于所述组合物的独特用途，用于冻干的制剂可被调整为能进行产品的迅速重构。例如，重构可基本在约30秒至约90分钟的时间内完成。在特定实施方式中，基本完成重构的时间可为约60分钟或更短、约30分钟或更短、约20分钟或更短、约15分钟或更短或者约10分钟或更短。重构时间具体可在如下范围内：约30秒至约90分钟、约60秒至约60分钟、约2分钟至约30分钟、约3分钟至约20分钟或约4分钟至约15分钟。加热可在重构过程中施加和/或用于重构的液体可被预热至特定温度。例如，加热至35℃或更高的温度能够是有益的。优选地，重构包括将水溶液添加到冻干组合物中并在不使用将需要开启包含组合物的容器和会使医务人员的使用复杂化的无菌处理的混合方法的条件下混合。促进重构的方式可包括将组合物配制为稀浓度以得到较低密度和更多孔的干燥材料。干燥材料随后可用制备用于冻干的组合物所需的较少的流体复水。

本发明组合物的优选重构时间可通过使用其它组分来促进。例如，表面活性剂可用于使冻干组合物内的可能会限制对于重构所必须的水渗透的疏水相互作用最小化。合适的表面活性剂的非限制性例子包括阴离子表面活性剂(例如，脂肪酸、脂肪酸盐和烷基硫酸盐(包括月桂基硫酸钠))、阳离子表面活性剂(例如，神经酰胺)、非离子表面活性剂(例如，多元醇酯、聚氧化烯烃酯和聚山梨醇酯，包括聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)以及两性或两性离子表面活性剂。作为进一步的例子，还可使用吸湿辅料，诸如聚乙二醇、多元醇(例如，甘油)、环糊精、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙和氯化锌。类似地，多种膨胀剂可用于制备初始水凝胶基质组合物和/或可在冻干组合物的重构过程中添加。尽管不希望受理论所限，据信添加这样的膨胀剂可得到能更容易地被用于重构的水或其它溶剂所渗透的冻干产品。可使用的示例性膨胀剂包括单糖和二糖(例如，诸如葡萄糖、蔗糖或海藻糖)以及糖醇(诸如甘露醇)。

如上所述，缓冲溶液可用于制备水凝胶基质组合物中，且合适的缓冲剂可在初始组合物的形成和/或冻干组合物的重构过程中添加。可使用的示例性缓冲剂包括三(羟甲基)氨基甲烷、柠檬酸盐、甘氨酸和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。进一步地，可添加防腐剂，其可用于在脱水或冻干过程中将组合物防腐。

在一些实施方式中，某些表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂(或其组合)可用于改进冻干条件，在冻干后促进防腐，和/或改进重构材料的性质。优选的重构添加剂可为如下那些：其不干扰组合物于较高温度形成可流动可注射流体和于皮肤(即，真皮和/或皮下)温度形成固体或半固体水凝胶基质的能力，特别是在窄的受控相变温度上。

在多个实施方式中，可使用重构添加剂的组合以提供如下水凝胶：其从冻干形式重构，在理想的迅速时间内重构，并且重构为具有理想的注射性质的流体形式。重构添加剂可在冻干前被包含在水凝胶中，由此重构添加剂残余物保留在冻干组合物中并提供了如本文所讨论的所需重构效果。重构添加剂可仅存在于用于重构所述冻干组合物的重构流体中。重构添加剂可在冻干之前被包含在水凝胶中以使得重构残余物存在于冻干组合物中并且还可被包含在重构流体中。具体而言，在重构之前包含的添加剂可不同于被包含在重构流体中的添加剂，或者预-冻干添加剂和包含在重构流体中的重构添加剂可具有一种或多种共同的材料。

重构组合物中存在的重构添加剂的量可通过重构添加剂材料相对于重构流体的浓度来限定(作为重构介质—例如去离子水—中的直接添加剂或作为冻干组合物中进入重构流体中的残余物)。在一些实施方式中，重构流体可包括至多约4％、至多约3％、至多约2％或至多约1wt％的任何一种表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。在其它实施方式中，重构流体可包括约0.01％至约4％、约0.015％至约3％、约0.02％至约2％或约0.025％至约1.5wt％的任何一种表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。总重构流体可包括至多约10％、至多约8％、至多约6％或至多约4wt％的总组合重构添加剂。在另外的实施方式中，总重构流体可包括约0.05％至约6％、约0.1％至约5％、约0.25％至约4％或约0.5％至约3wt％的总组合重构添加剂。重构添加剂在去离子水中提供。

在某些实施方式中，重构添加剂的组合可包括以下中的任何：i)表面活性剂和吸湿辅料，诸如聚山梨醇酯和多元醇(例如，吐温和甘油)或聚山梨醇酯和盐(例如，吐温和NaCl)；ii)表面活性剂和膨胀剂，诸如聚山梨醇酯和糖(例如，吐温和二糖，诸如葡萄糖)；iii)吸湿辅料和膨胀剂，诸如，多元醇和糖(例如，甘油和二糖，诸如葡萄糖)或盐和糖(例如，NaCl和二糖，诸如葡萄糖)；和iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂，诸如聚山梨醇酯、多元醇和糖(例如，吐温、甘油和二糖，诸如葡萄糖)或聚山梨醇酯、盐和糖(例如，吐温、NaCl和二糖，诸如葡萄糖)。可存在表面活性剂(诸如，聚山梨醇酯)和吸湿辅料(诸如，多元醇或盐)，比率为约1:20至约20:1。可存在表面活性剂(诸如，聚山梨醇酯)和膨胀剂(诸如，二糖，例如，葡萄糖)，比率为约1:40至约10:1。可存在吸湿辅料(诸如，多元醇或盐)和膨胀剂(诸如，二糖，例如，葡萄糖)，比率为约1:10至约10:1。

在一个实施方式中，重构流体可包括在去离子水中的约0.01％至约4wt％的表面活性剂和约0.01％至约4wt％的吸湿辅料。在另一个实施方式中，重构流体可包括在去离子水中的约0.01％至约4wt％的表面活性剂和约0.01％至约4wt％的膨胀剂。在进一步的实施方式中，重构流体可包括在去离子水中的约0.01％至约4wt％的吸湿辅料和约0.01％至约4wt％的膨胀剂。在仍然另一个实施方式中，重构流体可包括在去离子水中的约0.01％至约4wt％的表面活性剂、约0.01％至约4wt％的吸湿剂和约0.01％至约4wt％的膨胀剂。

本公开还提供了多种治疗方法，其中所述组合物可被应用于皮肤创伤，包括外科手术切口和切除部位，以改进创伤的愈合过程并由此预防或减少结疤(包括肥厚型结疤和疤痕瘤结疤)的发生和防止或减少结疤作用。本公开组合物的应用可根据治疗部位的性质而改变，并且可包括局部应用和注射，诸如注入创伤附近的皮或皮下组织中(即，沿创伤的一侧或部分或全部围绕创伤)。当使用注射时，所述组合物特别可用于通过小号针(例如，诸如，23号、25号或27号)注射，如上面已经讨论的。除了应用该组合物之外，所述方法还可包括闭合创伤，诸如使用选自缝合线、卡钉、胶料及其组合的封闭物。

在一些实施方式中，所述方法可包括应用于意外创伤(诸如皮肤的割伤或烧伤)或慢性创伤。在其它实施方式中，所述方法可包括应用于外科手术产生的创伤，诸如外科手术切口。具体而言，外科手术创伤可以是在切除先前存在的瘢痕(例如，肥厚型瘢痕、疤痕瘤瘢痕或烧伤相关瘢痕)之后留下的创伤。

在特定实施方式中，所公开的方法可包括修复皮肤疤痕瘤或肥厚型瘢痕(或其它类型瘢痕，包括烧伤相关瘢痕)的方法。肥厚型瘢痕可表征为因胶原过度产生所致的凸起瘢痕。疤痕瘤可表征为导致大增生块(hyperplasticmass)或软组织瘤的良性纤维增生。这样的修复方法可包括切除瘢痕组织的至少一部分从而形成切除部位(即，经外科手术方法已经去除组织的部位)。所述方法还可包括将本文所述的基质组合物应用于切除部位中和/或周围的皮或皮下组织。因此，所述组合物可直接应用于切除部位中的暴露组织和/或所述组合物可被注入周围组织中，如上文所述。

所应用的组合物的量可根据治疗区域的尺寸而变。在一些实施方式中，水合组合物可相对于创伤尺寸以一定体积应用。例如，相对体积可参考创伤边缘(即，切口的每侧)。在一些实施方式中，应用的总体积为如下量：约0.1mL至约100mL、约0.5mL至约75mL或约1mL至约50mL。在其它实施方式中，所述水合组合物可以如下相对体积应用：约0.1mL至约10mL/2.5cm创伤边缘、约0.2mL至约8mL/2.5cm创伤边缘、约0.25mL至约6mL/2.5cm创伤边缘或约0.5mL至约4mL/2.5cm创伤边缘。所述方法还可包括用一个或多个封闭物来闭合切除部位。所述封闭物，例如，可包括卡钉、缝合线和胶料。在多个实施方式中，组合物可在闭合之前和/或之后注入。

显著尺寸的瘢痕可导致疼痛或不适，并且可为社会性焦虑或窘迫的来源。根据本公开的外科手术瘢痕修复特别有益之处可在于：不仅能去除先前存在的瘢痕，并且还能预防或减少瘢痕的复发。在本领域中已意识到，先前已有倾向形成肥厚型结疤或疤痕瘤的患者甚至在修复外科手术之后很容易经历类似尺寸的瘢痕复发。研究已显示在至少50％的修复外科手术中见到复发，并且通常更多。本公开组合物与外科手术修复的组合使用能极大地减少这一问题。有益效果特别可见于在正常皮肤边界层之外形成的瘢痕组织的体积。瘢痕体积的评价在实施例12中具体讨论。在特定实施方式中，应用本公开的基质组合物者在修复外科手术之后12个月时存在的瘢痕组织体积相对于修复外科手术之前的瘢痕组织体积为约15％或更小。换言之，本文所述的修复方法能使外部瘢痕体积减少85％或更多。在另外的实施方式中，修复外科手术之后12个月时的相对外部瘢痕体积可为10％或更少、5％或更少或者2％或更少。

类似地，所公开的组合物的用途可预防或减少疤痕瘤形成的复发，因此在治疗之后12个月时该治疗得到测量不到的凸起瘢痕组织。例如，在治疗后12个月时的复发降低率可为经历测量不到的凸起瘢痕组织的治疗患者的20％或更低、15％或更低、10％或更低或者5％或更低。

根据本公开的治疗和组合物用途还可就结疤效果表征。因此，不仅所述组合物的使用和应用预防或减少结疤(包括肥厚型结疤和疤痕瘤形成)，该组合物的使用和应用还可预防或减少结疤效果，并由此预防或减少患者的与任何形成的瘢痕组织相关的不适和/或不满意。例如，可被预防或减少的瘢痕效果包括以下中的一种或多种：疼痛、瘙痒、瘢痕组织和/或周围组织变色、瘢痕组织或周围组织相对于受试者的正常皮肤组织的异常硬度、瘢痕组织或周围组织相对于受试者正常皮肤组织的异常厚度以及瘢痕组织或周围组织的表面不规则(例如，粗糙和不均匀)。

相信前述讨论与所附实施例的组合符合制备用于治疗创伤部位(慢性、外伤或外科手术)以减少或预防外科手术后结疤、肥厚型结疤、烧伤结疤和/或疤痕瘤形成的相可控基质组合物的必要公开要求。可与本公开组合使用的制备组合物的其它示例性材料和方法在以下中提供：美国专利号5,824,331；美国专利号6,231,881；美国专利号6,261,587；美国专利号6,352,707；美国专利号6,713,079；美国专利号6,992,062；美国专利号6,730,315；美国专利号7,303,814；美国专利号7,700,660；美国专利号7,799,767；美国专利号8,053,423；美国专利公开号2008/0145404；美国专利公开号2008/0145404；美国专利公开号2008/0199508；美国专利公开号2009/0123547；和美国专利公开号2009/0124552。前述所有文献的公开内容通过引用以其整体并入本文。

在另外的实施方式中，本公开还提供了适于提供用于形成水凝胶组合物的材料组合和/或使用水凝胶组合物治疗皮肤创伤(例如，急性皮肤创伤)(诸如瘢痕修复治疗或瘢痕预防治疗)的试剂盒或其它制品。在某些实施方式中，根据本发明的制品可包括适于容纳其中的多项物品的包装构件。示例性的包装构件可为盒、箱、热成型制品(例如，泡罩包装或泡沫包装)等。

根据本公开的制品还可包括包含用于形成水凝胶组合物的两种或更多种材料的第一容器和第二容器。例如，第一容器可包括如本文另外所述的冻干组合物。在例示实施方式中，冻干组合物可包括明胶和聚合碳水化合物以及来源于初始形成的水凝胶且被加工以提供该冻干组合物的的任何残余组分。

作为进一步的例子，第二容器可包括重构材料。这样的重构材料可包括在本文中另外讨论的可用于冻干水凝胶组合物的重构的任何材料。例如，重构材料可包括重构流体，特别是水性流体。重构材料可包括如本文所述的有益于改进冻干组合物的重构的一种或多种添加剂，诸如表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。一种或多种这样的添加剂中可作为冻干组合物的残余物存在于第一容器中。

所述制品还可包括与冻干组合物的重构相关的指示。这样的指示具体写给健康护理提供者，特别是外科医生，并且可限定第一和第二容器的内容物的混合方式从而得到在皮肤创伤治疗(特别是瘢痕修复和/或瘢痕预防或减少)中显示功效的重构水凝胶。指示可包括将水性流体(诸如去离子水)添加到第一和第二容器中之一或之二的细节，并且这样的去离子水可被或不被包含在各个试剂盒中。

所述制品还可包括适合用于以下之一或之二的连接器：第一容器内容物向第二容器的无菌转移，以及第二容器内容物向第一容器的无菌转移。在一些实施方式中，第一容器和第二容器中的至少一个可以是注射器。作为例子，可包含鲁尔接头(luerconnector)以将第一容器和第二容器彼此连接或与其它器件连接。在其它实施方式中，所述制品可包括适于连接到针筒的针。同样，容器的内容物可被合并形成水凝胶，后者随后可直接应用于皮肤创伤处而无需除所提供的制品或试剂盒之外的混合设备。在一些实施方式中，可使用尺寸制成特定用于皮肤治疗的针以限制组织外伤。例如，所述针可为23号到27号针。

在使用时，试剂盒中容器的内容物可被合并，诸如通过将水性流体在容器之间转移以溶解和水化非水性材料并由此形成水凝胶组合物。在例示实施方式中，两个容器可均为注射器，且针筒可通过鲁尔接头连接以使得一个针筒中的水性流体转移到另一个针筒中以实现其中材料的水化。转移可反复重复一段时间以确保均匀混合和重构，从而形成水凝胶组合物。最终包含重构水凝胶的针筒可随后配以合适的递送器件，诸如针，以将重构的水凝胶组合物应用到需要治疗的皮肤创伤处。

根据本公开的试剂盒的例示实施方式在图7中举例说明。如其中所见的，试剂盒10包括包装20、第一容器30、第二容器40、带有两个连接端(53和55)的连接器50、针60和指示组70，其可为手写或数字形式的。第一容器30是包含冻干水凝胶组合物35的注射器。第二容器40也是注射器，并且包含重构流体45，其可包括一种或多种重构添加剂，如本文所述。可包括其它容器。例如，第二容器40可包括重构流体45，且一种或多种重构添加剂可被包含在第三容器中。

本公开提供了由多种组分形成以实现具有限定规格的水凝胶组合物的组合物。尽管限定组合物的组分和规格可单独描述，但本公开意图涵盖材料及其实现的规格的多种组合。另外，多种组合物各自被认为可用于治疗皮肤创伤，特别是瘢痕预防和瘢痕修复，更具体而言，治疗或预防疤痕瘤。进一步地，具有限定规格的多种组合物及其有益用途可源于本文所公开的制备方法。下面提供了本发明的某些示例性实施方式，其举例说明了本发明组合物的用途、其制备方法及用其治疗的方法。这样的示例性的实施方式用于说明的目的，并且不应被视为限制可能被本文所提供的其它公开涵盖的其它组合物、限定规格、制备方法或治疗方法的范围。

在一个实施方式中，本公开提供了包含明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的稳定的水凝胶组合物，所述明胶和聚合碳水化合物组合为使得所述明胶占所述组合物中存在的明胶与聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，并且使得所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL，并且使得所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且在较低温度时为固体或半固体凝胶基质。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：当于35℃和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.4的超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子；更具体而言，在35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.3的U_A水凝胶稳定因子；当在35℃温度和在5.1MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.2的U_A水凝胶稳定因子；或者当在35℃温度和78MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.35的U_A水凝胶稳定因子。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下在35℃至39℃温度时从注射器中迫出时流速为约10μL/s或更高。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：在35℃至39℃温度时粘度为约1.5Pa-s或更低。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有低于约400mOsm/kg的总渗透压，更具体而言，约25mOsm/kg至约375mOsm/kg的总渗透压。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的磷酸根离子浓度。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的碳酸根离子浓度。

尽管稳定的水凝胶组合物的上述特征被单独阐述，应理解根据本发明有用的组合物可通过所提到的特征之一或所提到的特征的任何组合来定义。另外，单个特征可在本文中另外所述的任何数值范围内。例如，有用的包含明胶和聚合碳水化合物的稳定的水凝胶组合物(其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL，且所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质)可以如下任何形式表征：

通过如本文所述的超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子；

通过如本文所述的流速；

通过如本文所述的粘度；

通过如本文所述的总渗透压；

通过如本文所述的磷酸根离子浓度；

通过如本文所述的碳酸根离子浓度；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子和流速二者；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子和粘度二者；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子和总渗透压二者；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子和磷酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子和碳酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的流速和粘度二者；

通过如本文所述的流速和总渗透压二者；

通过如本文所述的流速和磷酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的流速和碳酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的粘度和总渗透压二者；

通过如本文所述的粘度和磷酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的粘度和碳酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的总渗透压和磷酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的总渗透压和碳酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度二者；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速和粘度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速和总渗透压中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、粘度和总渗透压中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、粘度和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、粘度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、总渗透压和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、总渗透压和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、粘度和总渗透压中的全部；

通过如本文所述的流速、粘度和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、粘度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、总渗透压和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、总渗透压和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的粘度、总渗透压和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的粘度、总渗透压和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的粘度、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、粘度和总渗透压中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、粘度和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、粘度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速和总渗透压和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、总渗透压和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、粘度、总渗透压和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、粘度、总渗透压和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、粘度、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、粘度、总渗透压和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、粘度、总渗透压和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、粘度、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的粘度、总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、粘度、总渗透压和磷酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、粘度、总渗透压和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、粘度、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、粘度、总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；

通过如本文所述的流速、粘度、总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部；和

通过如本文所述的U_A水凝胶稳定因子、流速、粘度、总渗透压、磷酸根离子浓度和碳酸根离子浓度中的全部。

在一个实施方式中，本公开提供了包含组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的稳定的水凝胶组合物，使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；和当于35℃和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.4的超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子。

在一个实施方式中，本公开提供了包含组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的稳定的水凝胶组合物，使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；并且具有低于约400mOsm/kg的总渗透压，更具体而言，约25mOsm/kg至约375mOsm/kg的总渗透压。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的磷酸根离子浓度。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的碳酸根离子浓度。

在一个实施方式中，本公开提供了包含组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的稳定的水凝胶组合物，使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；并且具有不高于约20mM的磷酸根离子浓度和不高于约20mM的碳酸根离子浓度。

在一个实施方式中，本公开提供了包含明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的可流动注射组合物，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)、吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下在35℃至39℃温度时从注射器中迫出时流速为约10μL/s或更高。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：在35℃至39℃温度时粘度为约1.5Pa-s或更低。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有低于约400mOsm/kg的总渗透压，更具体而言，约25mOsm/kg至约375mOsm/kg的总渗透压。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的磷酸根离子浓度。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的碳酸根离子浓度。

在一个实施方式中，本公开提供了包含明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的可流动注射组合物，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)和吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

在一个实施方式中，本公开提供了包含明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的可流动注射组合物，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

在一个实施方式中，本公开提供了包含明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的可流动注射组合物，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

在一个实施方式中，本公开提供了包含明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)的可流动注射组合物，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)、吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于所述皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；和当于35℃和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.4的超声波衰减(UA)水凝胶稳定因子。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法具体可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；并且具有低于约400mOsm/kg的总渗透压，更具体而言，约25mOsm/kg至约375mOsm/kg的总渗透压。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的磷酸根离子浓度。同一种稳定的水凝胶组合物可通过以下定义：具有不高于约20mM的碳酸根离子浓度。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法特别可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；并且具有不高于约20mM的磷酸根离子浓度和不高于约20mM的碳酸根离子浓度。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法特别可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)、吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法特别可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)和吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法特别可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法特别可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了预防或减少源于皮肤创伤的皮肤瘢痕或其影响的方法，所述方法包括将可流动水凝胶组合物应用于皮肤创伤，其中所述可流动水凝胶组合物包括明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且进一步包括表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)、吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)；其中所述明胶占所述重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，且其中所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。应用步骤可包括将所述水凝胶组合物注入皮或皮下组织。同一种方法特别可用于切除先前存在的瘢痕，特别是疤痕瘤、肥厚型瘢痕或烧伤相关瘢痕。

在一个实施方式中，本公开提供了修复疤痕瘤的方法，所述方法包括切除疤痕瘤的至少一部分并且将可流动水凝胶组合物应用到切除部位的至少一部分，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；和所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质。

在一个实施方式中，本公开提供了修复疤痕瘤的方法，所述方法包括切除疤痕瘤的至少一部分并且将可流动水凝胶组合物应用到切除部位的至少一部分，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；和所述组合物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如吐温)、吸湿辅料(例如，多元醇，诸如甘油；或者盐，诸如NaCl)和膨胀剂(例如，糖，特别是二糖，诸如葡萄糖)。

在一个实施方式中，本公开提供了修复疤痕瘤的方法，所述方法包括切除疤痕瘤的至少一部分并且将可流动水凝胶组合物应用到切除部位的至少一部分，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；和所述组合物当于35℃和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上显示超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子为0.4。

在一个实施方式中，本公开提供了修复疤痕瘤的方法，所述方法包括切除疤痕瘤的至少一部分并且将可流动水凝胶组合物应用到切除部位的至少一部分，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；和所述组合物具有低于约400mOsm/kg的总渗透压，更具体而言，约25mOsm/kg至约375mOsm/kg的总渗透压。

在一个实施方式中，本公开提供了修复疤痕瘤的方法，所述方法包括切除疤痕瘤的至少一部分并且将可流动水凝胶组合物应用到切除部位的至少一部分，其中所述可流动水凝胶组合物包括组合的明胶和聚合碳水化合物(例如，葡聚糖)，该组合使得：所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；所述组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；所述水凝胶组合物于35℃或更高的温度时为可流动可注射流体并且于较低温度时为固体或半固体凝胶基质；和所述组合物具有的磷酸根离子浓度不高于约20mM以及碳酸根离子浓度不高于约20mM。

在一个实施方式中，本公开提供了制备稳定的水凝胶组合物的方法，所述方法包括：在水性介质中于第一温度混合明胶和聚合碳水化合物以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；将所述液体水凝胶组合物在恒速混合下冷却至保持温度，所述保持温度低于第一温度并且高于液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物的凝胶化温度；和将所述液体水凝胶组合物进一步冷却至所述凝胶化温度以将所述液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物，所述稳定的固体或半固体水凝胶组合物当于35℃温度和2-8MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.4的超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子；或者当于35℃温度和2-8MHz频率测试时在至少600分钟上显示0.5的U_A水凝胶稳定因子为；或者当在35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.3的U_A水凝胶稳定因子；或者当在35℃温度和在5.1MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.2的U_A水凝胶稳定因子；或者当在35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少500分钟上显示0.35的U_A水凝胶稳定因子。

在一个实施方式中，本公开提供了制备稳定的水凝胶组合物的方法，所述方法包括：在水性介质中于第一温度混合明胶和聚合碳水化合物以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；将所述液体水凝胶组合物在恒速混合下冷却至保持温度，所述保持温度比所述第一温度低至少约5℃，并且在液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物的凝胶化温度的约7℃之内；并且将所述液体水凝胶组合物进一步冷却至凝胶化温度，以将所述液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物。

在一个实施方式中，本公开提供了制备稳定的水凝胶组合物的方法，所述方法包括：在水性介质中于第一温度混合明胶和聚合碳水化合物以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，并且其中所述稳定的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；将所述液体水凝胶组合物在恒速混合下冷却至保持温度，所述保持温度比所述第一温度低至少约5℃，并且在液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物的凝胶化温度的约7℃之内；并且将所述液体水凝胶组合物进一步冷却至凝胶化温度，以将所述液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物，其中进一步冷却至凝胶化温度在少于约2小时的时间内进行。

在一个实施方式中，本公开提供了制备稳定的水凝胶组合物的方法，所述方法包括：将明胶和聚合碳水化合物在具有低于约400mOsm/kg的渗透压(例如，约25mOsm/kg至约375mOsm/kg)的水性介质中于第一温度混合以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，并且其中所述稳定的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；将所述液体水凝胶组合物在恒速混合下冷却至保持温度，所述保持温度低于第一温度并且高于液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物的凝胶化温度；并且将所述液体水凝胶组合物进一步冷却至凝胶化温度，以将所述液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物。

在一个实施方式中，本公开提供了制备稳定的水凝胶组合物的方法，所述方法包括：将明胶和聚合碳水化合物在具有不高于约20mM的磷酸根离子浓度和不高于约20mM的碳酸根离子浓度的水性介质中于第一温度混合以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多，并且其中所述稳定的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；将所述液体水凝胶组合物在恒速混合下冷却至保持温度，所述保持温度低于第一温度并且高于液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物的凝胶化温度；并且将所述液体水凝胶组合物进一步冷却至凝胶化温度，以将所述液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物。

在一个实施方式中，本公开提供了制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；和将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂，并且使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；其中与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的表面活性剂。

在一个实施方式中，本公开提供了制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；和将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂，并且使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；其中与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的吸湿辅料。

在一个实施方式中，本公开提供了制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；和将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂，并且使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL；其中与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的膨胀剂。

在一个实施方式中，本公开提供了制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；和将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；和iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；并且使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

在一个实施方式中，本公开提供了制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；和将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括以下中的任何种：i)聚山梨醇酯和多元醇；ii)聚山梨醇酯和盐；iii)聚山梨醇酯和糖；iv)多元醇和糖；v)盐和糖；vi)聚山梨醇酯、多元醇和糖；和vii)聚山梨醇酯、盐和糖；并使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

在一个实施方式中，本公开提供了制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；和将所述冻干组合物用水性重构液重构以形成水凝胶组合物，使得所重构的水凝胶组合物包括以下中的任何种：i)吐温和甘油；ii)吐温和NaCl；iii)吐温和二糖；iv)甘油和二糖；v)NaCl和二糖；vi)吐温、甘油和二糖；和vii)吐温、NaCl和二糖；并使得所重构的水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

实施例

本发明通过以下实施例在下文中更完整地说明，所述实施例被阐述用于举例说明本发明的实施方式，并且不应被解释为对其的限制。

实施例1.制备明胶/葡聚糖组合物

根据本公开一个实施方式的组合物如下制备：于特定时间点在升高温度下顺序添加液体和粉末状原料(表1)，同时混合以保持液体均匀状态。随后将溶液无菌过滤，无菌分配到小瓶中，密封，并于冷藏温度保存。

表1

葡萄糖和介质199(磷酸根离子浓度为1.17mM)被测量和转移至预热的水夹套式(50℃)玻璃容器中并使用搅拌棒混合。使混合物平衡至50℃，随后将L-半胱氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-赖氨酸和EDTA二钠分配至含有介质199的容器中。在平衡时间之后，添加葡聚糖粉末，并混合组分。一旦葡聚糖显示进入溶液中，将明胶添加至容器并使其溶解。一旦明胶显示进入溶液，将pH调节至7.45+/-0.05。在从pH调节平衡之后，将剩余的L-谷氨酸、精氨酸和L-半胱氨酸与硫酸锌一起搅拌到溶液中。总混合时间为约2小时。

在于50℃平衡之后，将溶液通过如下方式过滤除菌：将溶液从混合容器经过加热的0.2μm带正电荷药品级尼龙过滤器泵送进入40℃搅拌容器中，以便在无菌灌装之前排队。过滤在约30分钟内进行。

在溶液过滤之后，将其无菌分配成12ml等分式样，装入小瓶，同时其继续混合并保持于40℃。随后将小瓶用塞子塞住，密封，压接(crimped)，视觉观察，加标签，并随后冷藏储存(2-8℃)。生产得到约150个小瓶。组合物的分配在约1小时内进行。

实施例2.制备含有磷酸盐缓冲剂的明胶/葡聚糖组合物

通过如下方式制备组合物：于升高温度顺序添加液体和粉末状原料(表2)，同时混合以保持液体均匀状态。

表2

与实施例1的组合物不同，本实施例的组合物制剂使用磷酸根离子浓度为65mM的磷酸缓冲盐水(PBS)制备。另外，在本实施例中不添加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或50％葡萄糖。具体而言，本实施例的组合物通过如下方式制备：首先将2,282mlPBS置于预热的水夹套式(50℃)玻璃容器中，并使用搅拌棒混合。使混合物平衡到50℃，随后将375μlL-半胱氨酸、6.9mlL-谷氨酸、13.8mlL-赖氨酸和24.2mlEDTA二钠分配至含有PBS的容器中。在平衡时间之后，添加137.5g葡聚糖粉末，并混合组分。一旦葡聚糖显示进入溶液，将330g明胶添加至容器，并使其溶解。一旦明胶显示进入溶液，添加10％氢氧化钠以将pH调节至7.45+/-0.05。在从pH调节平衡之后，将20.6mlL-谷氨酸、20.6ml精氨酸、13.8ml硫酸锌和6.5mlL-半胱氨酸搅拌入溶液中。随后将小瓶用塞子塞住，密封，压接，视觉观察，加标签，随后冷藏储存(2-8℃)。总混合时间为约2小时。

实施例3.组合物的热性质

通过差示扫描量热法(DSC)检验来自实施例1和实施例2的组合物的热性质。将来自实施例1和2的组合物的样品于5℃温育60分钟，并随后经历DSC测试，扫描速度为5℃/分钟，从5℃开始至45℃的最终温度。从各自的温谱图和热跃迁焓评价热性质。观察固体组合物到液体的熔体转变，转变峰在35-37℃范围内。组合物的代表性温谱图示于图1中。

实施例4.组合物的可流动性/可注射性

将60％明胶和40％葡聚糖的组合物在加热至50℃的Tris缓冲盐水中溶解至最终固体浓度为0.2g/ml。所得的组合物被分为4ml样品并置于20ml小瓶中，并将含有样品的小瓶储存于4℃。为评价可流动性，将一个小瓶的组合物从储存中取出并于室温放置。随后将小瓶置于39℃的加热器(实验室系多模块加热器(Lab-lineMultiblockHeater)并监测，直到组合物从固体转变为可流动液体。将液体组合物置于1ml针筒中并连接到设为5N柱塞压(根据单次使用无菌皮下注射针筒的国际指导，1ml针筒的推荐压力(参见，ISO7886-1))的流体分配系统(1500XL,Nordson/EFD)。连接长约16mm(5/8英寸)的25号针(0.26mm标称内径)，并记录1ml组合物通过该针的时间。通过该针的注射在约39℃的温度进行。组合物符合根据ISO7886-1(其明确了由塑料材料制成并意图用于吸入流体或用于在填充之后立即可注射流体的无菌单次使用皮下注射针筒的要求(包括性能))通过细计量注射针注射施用的条件。

为检验所述组合物的固含量评价通过小计量注射针的注射适用性，所述组合物中葡聚糖和明胶的总聚合物含量如表3中所述的变化。将聚合物在15ml圆锥管中于50℃溶解于10mlHEPES缓冲盐水(0.01MHEPES、0.138MNaCl和0.0027MKCl)中同时缓慢混合。

表3

在制备之后使样品冷却。使用上面所述的测试方法，将样品置于39℃加热锅中，并将1ml通过1英寸长(22.5mm)的25号和23号针注射。每个样品均通过每种针尺寸对其流速测试最少三次。如果最少0.5ml不能通过该针注入，则测试不成功，继续加热样品直到成功诸如。注射测试的结果在表4中阐述。

表4

测试可注射性的制剂以粘度表征以确定允许注射的最大粘度。测试可注射性的使用相同的明胶/葡聚糖比的样品制剂以如上所述的HEPES缓冲盐水中的不同总聚合物含量制备。样品于50℃预调节并装载到具有Couette几何形状的RheometricsScientificRFSII流变仪中进行测试。用新鲜装载的样品于39℃进行多次测量，直到粘度稳定为平衡测量值。测试至多为1000s^-1的剪切速率范围；然而，每个样品的剪切速率范围均被调节至流变仪的扭矩范围。对于高浓度样品来说，减小剪切速率范围。

190-380mg/mL总聚合物的样品显示了牛顿粘度反应。较高浓度的样品显示了轻微的非线性粘度反应，但适合通过标准线性回归分析表征。粘度结果总结于表5中。大于0.4565Pa-s的制剂粘度不适合通过25号针注射。至多1.1618Pa-s的粘度可通过23号针注射。

表5

实施例5.组合物的纤连蛋白结合活性

关于明胶的纤连蛋白结合活性，对实施例1的组合物进行评价。该试验遵循直接ELISA结合形式，其中测试材料被固定在微滴定板的孔表面上，以结合荧光标记的人血浆纤连蛋白从而能直接测量被捕获的标记纤连蛋白的荧光。在该试验中，实施例1的组合物被完全熔融(通过于39℃温育30分钟)，并用pH9.6缓冲剂稀释以得到1-10μg/mL范围内的最终明胶浓度，从而覆盖高度结合的不透明96-孔板的孔，其对于荧光测量最佳。所述组合物中使用的明胶通过将板于39℃温育1小时而被不可逆固定到孔表面上。去除过量的未结合材料和缓冲液，并且将板用包含1MNaCl的PBS(磷酸缓冲盐水)(清洗缓冲剂)清洗三次。将非特异性结合部位用在PBS中的3％牛奶(封阻剂)于室温封阻30分钟。去除过量的缓冲剂并如上面所进行地将板用清洗缓冲剂清洗三次。用封阻剂稀释至最终浓度45μg/mL且与1-5荧光素分子/纤连蛋白分子轭合的人血浆纤连蛋白随后被添加到板孔中。将板加盖并于室温温和旋转2小时以使得在黑暗中最大结合。去除过量的荧光标记纤连蛋白并如上面所进行地将板用清洗缓冲剂清洗三次。将PBS(100μL)添加到每个孔中，并通过读板器(platereader)记录荧光，使用485nm的激发波长和530nm的发射波长。将板读取数次并将数据平均。

样品和标准品一式两份进行测量。组合物中所用的明胶原料在7种浓度下测试(见表6)以生成标准曲线。组合物样品在4种稀释浓度下测试。每个样品中的明胶浓度通过线性回归从标准品范围内确定。

表6

为比较组合物的纤连蛋白结合含量，蛋白质含量也被测量并用于标准化每个样品的纤连蛋白结合位点的量。根据生产商的指示，蛋白质浓度通过比色二喹啉甲酸(BCA)法测量(PierceBiochemicalMicroBCAproteinassaykit,#23235)。简言之，明胶原料用PBS(pH7.4,SigmaP5368)制备为1.56-100μg/mL的2-倍稀释浓度。样品(通常起始浓度为在PBS中的5mg/mL)在PBS中稀释为25-50μg/ml(5-10μl的0.5mg/ml蛋白和90-95μLPBS)。反应在干净的96-孔板(用于紫外/可见光吸收测量最佳)中通过如下方式进行：将100μl样品与100μLBCA工作试剂(25:24:1，试剂MA:MB:MC)混合，并使板于37-39℃烘箱中温和旋转15-30分钟以显影指示蛋白质含量的紫色。随后通过分光光度板读数器(SpectramaxM5,MolecularDevices)记录每个反应于562nm处的吸收。样品和标准品的每个浓度均重复测量并平均。

表7显示了纤连蛋白结合位点的测量浓度，其通过如下方式标准化为蛋白质浓度：比较实施例1中所制备的组合物的小编号和大编号小瓶中纤连蛋白与mg/mL蛋白质之比。样品最初于39℃融化(1小时)，并用PBS稀释到5mg/mL。随后将样品于39℃融化30分钟以完全溶解明胶，随后将其用PBS进一步稀释到0.5mg/mL，以进行纤连蛋白结合和BCA蛋白检验。

表7

测试结果显示明胶原料显示了显著的纤连蛋白结合活性。纤连蛋白结合性质保留在来自在制备过程中早期收集的小瓶(#8小瓶)和在接近制备结束时收集的小瓶(#144)的本公开组合物中。

实施例6.组合物的物理性质

溶解试验用于测量组合物对因溶解(solubilization或dissolution)于生理溶液中所致的完整性损失的抗性，其是在创伤中停留时间的量度。该实验基于标准溶解测试/美国药典(USP)XXIII,1995:1791–1793，针对在模拟皮环境中的小体积测试进行修改。该试验测量了组合物样品盘于34℃的皮肤温度时在下组限定条件下完全溶解的总时间(以分钟计)：一个盘/3mLPBS(pH7.4)，在20-mL小瓶中，在34℃烘箱中温和旋转(200–250rpm)。

为形成浇铸盘(castdisks)，将来自实施例1的组合物的小瓶于35℃熔融1.5小时，通过将小瓶颠倒并旋转10-15次混合。将熔融的组合物以1mL等分式样取出并填满聚丙烯模具的6–12个圆形孔(8mm直径和1.5mm高度的盘)，用薄橡胶垫牢固密封到金属平板上。将盘于室温在30分钟内冷却并形成凝胶，随后将其从模具中去除并储存在预先称重的带盖管中。测定盘重(通常在70–100mg范围)以用于鉴定。在对盘进行测试之前将其于室温固化总共1–2小时。对于每个小瓶的组合物，选择3个具有最少气泡的盘用于完全溶解测试。将每个盘添加到于34℃预热的3mLPBS中，并置于34℃烘箱中的旋转台上。对于每个测试，每5-15分钟通过视觉观察同时监测小瓶。观察样品为完整的盘，其在测试过程中慢慢变小，因为表面处的材料溶解。对样品的观察迅速进行以最小化这些样品中的温度变化。记录每个盘完全溶解的时间(见图2)。

组合物的压缩强度也可通过对来自该组合物的圆柱形测试样品铸件的机械测试来检验。测试基于如下方法中所述的压缩机械测试：ASTMD575-91(2007)压缩中橡胶性质的测试方法，针对小水凝胶样品的测试进行修改。为形成浇铸样品圆柱，将组合物的小瓶于35℃熔融1.5小时，并且通过将小瓶颠倒并旋转10–15次来混合。将熔融的组合物以1-mL等分试样取出以完全填充而不是过量填充15-孔Delrin模具的每个圆柱形孔(直径1cm且高度1cm的圆柱)，用薄橡胶垫将其牢固密封在金属平板上。从每个小瓶浇铸5个圆柱。

使模具于室温固化1.5小时，并将样品从模具中温和取出。将圆柱称重(范围＝0.7–1g)以进行鉴定，并使其在测试前于室温固化总共1–4小时。随后将每个圆柱置于塑料圆柱形固定器(1.5cm直径和1.5cm高度)中，并通过扁销(头部直径1cm，高度10mm)压缩、牢固地夹在机械测试仪(InstronModel5542)的传感器上。通过Instron测量压缩模量，使用5牛顿测压元件，速度为3mm/min。通过Instron计算的压缩每个圆柱的模量值被报告为自动模量值(以kPa单位计)。对于每个小瓶，测量3–4个圆柱。对于每个圆柱，平均3–4个连续一致的值。最大压缩负荷(gf)和最大压缩负荷时的抗压应力(kPa)值也通过Instron设备测量。来自实施例1的组合物的小瓶的测试结果显示了在分批方法中较晚生产的大编号小瓶的物理性质更好，如图2中所示。

实施例7.组合物的化学计量

为检验合适的配方化学计量，将不同量的明胶(GelitaUSA,Inc.,A型猪明胶)和葡聚糖(SigmaAldrich，葡聚糖，500,000MW)称重，在5mL弹扣盖管中合并，并添加2mLPBS(pH7.4)。制备并测试总聚合物重(明胶+葡聚糖)为200mg/ml和230mg/ml的样品。将样品短暂地涡流混合，随后温育过夜。将所有样品以8rpm于50℃的烘箱中温和旋转过夜约19个小时。此时，样品呈现均匀的可流动组合物。将样品倾倒入用于溶解测试的模具中，对每个组合物浇铸6–9个圆盘，并使其于室温固化30分钟。将脱模的圆盘(每个组合物三个)于室温再固化1.5小时。将样品圆盘于溶解试验中测试其物理完整性，如实施例6中所述，对于每个组合物而言使用三个圆盘样品，每个圆盘与3mLPBS接触，同时于34℃温和旋转。每15分钟监测圆盘样品的物理完整性。

表8中的溶解结果显示对于两种聚合物浓度而言，具有60wt％明胶或更少的样品缺乏物理完整性。具有大于60wt％明胶的样品当在生理pH和离子强度下测试时显示大致相同量的溶解抗性。

表8

在第二个试验中，前一试验的明胶和葡聚糖在PBS中配制，总聚合物浓度为170mg/ml，含有60％、70％、80％、90％和100％明胶。加热五种不同明胶/葡聚糖比的制剂，以液化该材料和浇铸圆盘样品，后者用于使用实施例6的方法表征物理性质。结果显示了具有大于60％明胶的制剂的溶解抗性，类似于前一试验。制剂的压缩测试也显示了具有大于60％明胶的制剂的物理性质显著升高。测试结果如图3中所示。

实施例8.组合物的冻干和重构使用

将实施例2的组合物冷冻并冻干。将该组合物以约0.05℃/min的冷却速度冷冻至约-30℃，并于-30℃保持约12小时。对冷冻的组合物于-30℃施加真空约24小时。随后，将温度以约0.25℃/min的速度渐增地升高至约-10℃。随后将组合物在真空下于-10℃保持至少12小时，随后将温度以约0.05℃/min的速度进一步升高至约20℃。随后将冻干组合物称重并置于小瓶中。

将包含冻干组合物的小瓶用去离子水重构以形成适合对创伤施用的可流动组合物。将1g冻干组合物与5ml水在小瓶中混合以得到0.2g/mL的最终浓度。将小瓶于39℃加热1小时并通过漩涡混合15分钟和30分钟。结果是如上所讨论的适合注入皮和皮下组织中的可流动的液体组合物。

使用实施例5和6的方法检验冻干组合物的纤连蛋白结合、溶解时间和压缩模量。重构组合物显示了纤连蛋白结合为5.13-5.88nmol/mg，溶解时间在30-45分钟范围内，且压缩模量在17-29kPa范围内。当向重构流体添加1％甘油和0.1％吐温20时，重构组合物显示了溶解时间为33分钟，且压缩模量为34kPa。当向重构流体添加0.15MNaCl和1％吐温20时，重构组合物显示了溶解时间为30分钟，且压缩模量为33kPa。

实施例9.用于注入创伤/组织中的冻干组合物的重构

根据实施例8的组合物的重构在不同条件下检验。将冻干组合物的小瓶与预热至39℃的5ml重构流体混合以得到0.2g/mL的固含量。将小瓶置于39℃的块加热器中并于5分钟之后观察和漩涡混合。随后每1-2分钟视觉观察小瓶并漩涡混合，直到观察到可流动的均匀液体。随后通过在实施例4所述的条件下用1ml针筒通过25号针注射来测试重构组合物的流动能力。

如果能注入0.5ml流体，则认为液体组合物是可注射的。如果在注入小于0.5ml体积的过程中观察到针堵塞，则继续加热和混合直到成功注入。结果总结于比表9中，其中组分百分比以wt％提供，除非另外述及。

表9

结果显示了所述产品的冻干组合物被重构为能通过细计量针注射的流体的能力。包括吸湿辅料、膨胀剂和表面活性剂的重构添加剂显示了减少将冻干组合物重构为可注射流体的时间和/或减少在标准5N注射压力下注射该组合物的时间的能力。

实施例10.组合物在动物皮模型中的组织反应

将实施例1的组合物的样品于38℃加热至形成适于注射的可流动液体组合物。将该组合物注入44只被麻醉的成年雌性Sprague-Dawley大鼠的腹部真皮中。每日监测所述动物，直到在注射后第1、3、6、9、12、15、18、21、24、27和28天每次对4只动物进行尸检。收获注射部位的组织样品并进行组织学检查准备。检查来自注射部位的组织的H&E组织病理学以获知细胞反应和注入组合物的存在。

组织病理学显示了组合物残留于皮下腔中作为单一的轻微染色材料的物质，且嗜酸纤维的薄纤丝(thinfibrils)遍布其中均匀分散。所述组合物显示多形核白细胞(PMNs)在第1天对组合物和周围组织的轻度浸润，并且在第3天细胞浸润量升高。组合物的量在第3天显示降低。第6天植入体显示了组合物的渐进式减少。第9天显示了动物中有2只不存在组合物，以及炎性细胞存在的相应减少。在第12天、15天和18天的组织中少量组合物有证据存在于一只动物中。在第21天的组织中没有发现组合物的证据。在第24天从2只动物的组织中发现了少量组合物。在第27天和28天的组织中没有发现组合物的证据。在植入材料不再显示之后，注入部位的组织显示了PMN的最小存在，没有巨噬细胞的显著存在，并且没有新胶原沉积或瘢痕形成的证据，这显示了非常良性的组织反应。随后的组织病理学确定了不存在与组合物相关的胶原沉积或血管新生。

实施例11.施用实施例1的组合物以治疗外科手术创伤

聘请100位年龄在18-60岁之间且经历过妇科剖腹或腹腔镜手术的女性受试者参与前瞻性随机的同一瘢痕控制实验，以通过在用实施例1的组合物进行单一治疗之后的瘢痕形成的迹象和症状来评价创伤愈合改进。90位受试者通过注射治疗，10位受试者通过导管(catheter)治疗。

受试者的外科手术切口被分为两半，在即将用缝合线闭合切口之前，一半随机指定为用所述组合物“治疗”，而另一半指定为“对照”(无治疗)。患者在治疗后整个12个月内接受随访以评价所述外科手术切口的两半。

在通过注射治疗的90位受试者的创伤闭合时，将组合物于39℃(+/-2℃)加热以形成可流动的可注射液体。医师使用注射器和18-25号针将组合物注入创伤边缘。针被插入足够深以致进入皮-皮下界面并尽可能平行于切口创伤边缘。针迹(needletrack)和周围组织用足够量的组合物灌注，以便使围绕和包含针迹的区域被供给约1-2ml组合物/2.5cm创伤边缘。借助有效瘢痕评估量表(其利用观察者(外科医生)和患者对瘢痕特性的评估)来评价有效性——即，锚点式视觉模拟量表(AnchoredVisualAnalogScales(AVAS))，其基于先前验证过的视觉模拟量表(VisualAnalogScale(VAS))以及患者及观察者瘢痕评分量表(PatientandObserverScarAssessmentScale(POSAS))。

标准VAS评价使用100mm水平视觉模拟美容量表(horizontalvisualanalogcosmeticscale)，其左侧标为“最差可能瘢痕”，且右侧标为“最佳可能瘢痕”。要求评价者沿显示瘢痕总体美学外观的水平量表做标记。通过测量从量表低端到评价者标记的水平距离并四舍五入为最接近的毫米数来计算数字分数。AVAS量表使用水平视觉模拟美容量表，该量表允许评价者选择最差瘢痕半侧作为量表左端锚点，而在量表右端使用正常皮肤。要求评价者在两端之间沿显示较佳瘢痕半侧的总体美学外观的水平量表做记号。通过测量从量表低端到评价者标记的水平距离并四舍五入到最接近的厘米数来计算数字评分。

将整个12个月内观察者和患者的AVAS分数使用广义评估方程(generalizedestimatingequations，GEE)分析，后者为分析纵向数据的方法，其考虑了观察中对同一受试者的预期校正。采用自回归结构进行AVAS分析。GEE分析用于获得总体治疗之间(对比侧–治疗侧)的估计平均差，并且用于AVAS分数的个体表征，以及进行统计学显著的双侧常态近似值测试。

通过注射组合物治疗的90位受试者由外科医生观察者和被治疗的受试者使用锚点式视觉模拟量表(AVAS)评价。在第一批30位受试者的治疗之后，将协议修改为包括AVAS量表。对于登记的第一批30位受试者，仅在第9和12个月随访时从观察者和患者收集AVAS分数。接下来登记的60位受试者具有在所有随访时间点从观察者和患者收集的AVAS数据。当评价治疗组对对照组的AVAS时，在整个12个月中观察者和患者评价的总体评估AVAS差异分别为7.49mm(p＝0.0018)和9.86mm(p＝0.0009)，有利于治疗侧。观察者和患者AVAS的结果在表10中呈现。

表10

组合物的功效也通过如上所述的GEE用有效POSAS瘢痕评价量表来评价，使用观察者(医师/研究员)和患者现场评估瘢痕特性。POSAS的观察者量表由以下组成：五项创伤愈合特性，其用数字打分为1-10，其中1为最佳且10为最差。观察者量表的总分数由五项中每项的分数加和(范围5-50)组成。最低分(5)反应正常皮肤。结果在表11和表12中显示。当评价治疗组对对比组的观察者POSAS分数时，在整个12个月中的总体评估差异为0.98(p＝0.0051)，有利于治疗侧，且个体观察者评价特性的评估POSAS差异在0.20-0.26范围内，并且全部显著有利于接受治疗的瘢痕半侧。当评价治疗组对对照组的患者POSAS分数时，在整个12个月中的总体评估差异为1.19(p＝0.0012)，有利于治疗侧，且个体患者评价特性的评估POSAS差异在0.09-0.36范围内，并且全部显著有利于接受治疗的瘢痕半侧。

表11

表12

实施例12.实施例1的组合物对于疤痕瘤外科手术修复的效果

进行研究以评价与现有文献中报道的复发率相比所述组合物在通过切除疤痕瘤组织而经历疤痕瘤型瘢痕的外科手术修复的受试者中减少与疤痕瘤结疤相关的体积、外观和/或症状中的用途。

90位带有26个耳部疤痕瘤的受试者在研究中登记。研究受试者耳部的疤痕瘤通过外科手术去除，并且鉴定切口的创伤边缘。将实施例1的组合物在注射前于39℃(+/-2℃)加热最少60分钟。将25号针插入足够深入组织以便进入皮/皮下界面并尽可能平行切口创伤边缘。研究者注入组合物以使其在抽针时分散入注入针迹和周围组织。针迹和创伤边缘中的周围组织被灌注以足量组合物，在每侧创伤边缘上每增加2.5cm切口长度则平均灌注1.48ml。在注射过程中研究者还通过视觉和触觉反馈引导，诸如，注射所致的皮肤张紧、组合物从针流动的容易性、组织的变白以及组织容纳组合物的物理能力。所有切口位置(即，右耳、左耳和/或双儿)以相同方式闭合。

使用齿科藻酸盐压痕的疤痕瘤体积测量规则用于测量病灶体积大小。通过用水填充藻酸盐压痕并在校正量尺上衡量该体积来测量疤痕瘤的体积。这允许获得病灶体积的数字值。压痕必须仅由那些能经受藻酸盐压痕的病灶形成。制成藻酸盐压痕并对于每个受试者计算基线体积。在12个月随访中，5只耳朵(19.2％)根据临床检验被鉴定为具有复发。对每只耳朵浇铸模具。外科手术前的体积和模具的12个月体积包含在下表13中。另外，针对每个12个月模具计算外科手术前体积的百分比。在用组合物治疗的5例复发中，2例复发在12个月时显示了5％或更大的临床显著的病灶尺寸。

表13

针对外科手术切除后疤痕瘤复发的文献表明，同步治疗(例如，外科手术切除/皮质类固醇注射)已成为护理标准。下表14中包含的是与在仅外科手术切除之后疤痕瘤复发最相关的文献。

表14

研究	年份	切除	#患者	复发％
					Nason	1942	手术刀	12	83％
Arnold	1959	手术刀	14	86％
					Conway	1960	手术刀	28	45％
Cosman	1961	手术刀	25	54％
					Cosman	1972	手术刀	7	57％
Cosman	1974	手术刀	20	73％
					Ramakrishnan	1974	手术刀	108	80％
Oluwasanmi	1974	手术刀	41	93％
					Apfelberg	1989	激光	9	89％
Stern	1989	激光	23	74％
					Berman	1997	手术刀	43	51％
Kim	2004	手术刀	9	44％

复发在文献中表明为44-93％。Berman等的研究(BermanB.,FloresF.“Recurrenceratesofexcisedkeloidstreatedwithpostoperativetriamcinoloneacetonideinjectionsorinterferonalfa-2binjections”,JAMAcadDermatol.1997；37:755-7)已被视为最佳的现有文献对比，因为该公开出版物包括了大量受试者的数据组。当具体考虑耳垂疤痕瘤的外科手术切除时，Berman等研究了43位仅经历外科手术切除的患者(86％具有耳垂或耳部螺旋疤痕瘤)，51.2％的疤痕瘤于平均6.5个月内复发。进行分析，以比较使用所述组合物的治疗结果与Berman等的结果(1997)。

使用2x2列联表，将使用本发明组合物(如上所述)的治疗结果与Berman等的公开相比较。使用费希尔精确检验(Fisher’sexacttest)进行的分析显示了0.011的双尾p值，表明统计学显著的差异。当在12个月评价时，对于预防疤痕瘤复发来说，发现所述组合物显著优于所报道的仅外科手术切除。所述组合物显示了当在疤痕瘤修复外科手术过程中通过用小号针注射到皮和皮下组织来施用时预防和最小化疤痕瘤复发的能力。

实施例13.实施例1和2的组合物的稳定性比较

使用如实施例1和实施例2中所述制备的明胶/葡聚糖组合物进行对比超声分析。将先前制备的测试样品储存于2-8℃，直到测试。将包含固体凝胶样品的玻璃小瓶置于40℃水浴中以熔融凝胶样品。使用离心机以3,000rpm将熔融的凝胶样品在塑料针管中迅速脱气并装载到于40℃预平衡的HR-US102超声波谱仪的样品室中。将参比超声室装满脱气的去离子水。使用带有硅酮/PFT隔膜的螺旋式盖将两个样品室牢固封闭。熔融(即，可流动液体)组合物的超声曲线(超声速度和衰减)的比较于2-12MHz的频率范围连续测量，使用如下温度斜坡：i)于40℃保持40分钟；ii)经10分钟的时间冷却至35℃；iii)于35℃保持700分钟+。样品中的超声速度和衰减以动态模式连续测量。

超声评价显著和令人惊讶地显示了实施例1和实施例2的样品在其温度和时间曲线中的不同行为。这在图4-6中显示，其图示了当从40℃迅速冷却至35℃并且于35℃长时间等温状态之后凝胶样品随时间的相对超声波衰减(图4为实施例1组合物，且图5为实施例2组合物)和超声速度(图6)的演变。

最初，在图4-6中可看到实施例2的样品于40℃与实施例1的样品相比具有较高的超声波衰减和超声速度。两个样品均显示与从40℃到35℃的迅速冷却相关的超声波衰减和超声速度的急剧升高；然而，实施例2的样品与实施例1的样品相比确实显示了可测量的更大升高。在起始超声波衰减和超声速度值上的差异显示如此形成的水凝胶已显示了不同的聚合物结构/构象状态。特别是超声波衰减上的差异显示实施例1的样品和实施例2的样品在超声频率下显示不同的弛豫动力学。

当测试持续保持于35℃时，样品水凝胶稳定性上的差异变得更加明显。如图4和图6中所见，实施例1的样品显示了超声波衰减和超声波速度随时间的小但是连续的升高。这显示尽管发生了水凝胶重构(这对于帮助水凝胶组分的最终生理吸收是理想的)，实施例1的水凝胶的重构过程是温和的。如表15中进一步所见的，实施例1的水凝胶显示了超过测试持续时间的稳定性。实施例2的样品在第一个400分钟测试中显示了类似的曲线。然而，随后，实施例2的样品显示了超声波衰减的迅速显著升高(图5)和超声速度的降低(图6)，这是实施例2的水凝胶大量重构的指征。尽管不希望受理论限制，相信这样的重构对应于明胶和聚合碳水化合物(在这些实施例中为葡聚糖)的相分离——即，损失了各聚合物之间保持水凝胶结构的离子和氢键结合。水凝胶的处理对其稳定性的效果的证据还在于，相信实施例2的样品(即，使用具有高磷酸根离子浓度的PBS形成的)的不同的盐含量导致水凝胶的脱水，这也能对应于聚合物的结构重置。表15提供了实施例1的水凝胶的两个样品(N1和N2)以及实施例2的水凝胶的两个样品(N3和N4)的重构转变时间，这进一步说明了样品结构稳定性上的差异。实施例2的样品与实施例1的样品(N1和N2)相比显示了在转变脱离水凝胶状态方面的显著降低的水凝胶稳定性。

表15

样品(N)	组合物	转变时间(min)
			1	实施例1	950(+/-50)
2	实施例1	>1,500
			3	实施例2	750(+/-20)
4	实施例2	590(+/-50)

实施例14.实施例2的组合物对瘢痕的外科手术修复的效果

使用实施例2的组合物进行类似于上面在实施例11和12中所述的研究。该研究是前瞻性、随机、单盲法、相同瘢痕、安慰剂-对比的可行性研究，其评价了如实施例2中所述制备的组合物在经历瘢痕外科手术修复的受试者中改进外观和减少结疤迹象、症状和复发中的安全性和效力。该测试涵盖14位选择在参与中心经历瘢痕修复操作的患者。在瘢痕修复操作过程中，将切口分为两半，且每侧随机接受实施例2的组合物或安慰剂(盐水)注射。根据护理标准和外科医生的惯例提供术后护理，方案中的操作部分所排除的除外。

如在实施例11中，也使用患者和观察者瘢痕评价量尺(POSAS)评价实施例2的组合物的效力。POSAS评价加入了患者和观察者评价，其中观察者评价是基于患者的直接观察。患者评价疼痛、瘙痒、颜色、硬度、厚度和不规则的创伤愈合特性，每项在10-点式量表上，其中“1”为最佳，“10”为最差。观察者使用同样的10点式量表来评价血管化、色素沉积、厚度、缓解和柔软性。分别汇总患者和观察者的单独分数，较高分数代表较差结果而较低分数代表瘢痕更近似于正常皮肤。总分数平均差异(对照组减治疗组)在表16中呈现。负数代表对照侧被评价为优于治疗侧。

表16

患者POSAS

观察者POSAS

*并非所有患者均接受所有随访

如表16中可见的，POSAS评价显示实施例1的水凝胶与实施例2的水凝胶相比提供了显著较好的瘢痕修复结果。令人惊讶地发现不仅水凝胶的制备方法显著影响水凝胶的稳定性，而且其还显著影响水凝胶在所评价的皮肤创伤模型中的临床功效。特别意料不到的是发现实施例2的水凝胶主要评价为表现得比安慰剂更差，而所有实施例1的水凝胶评级都非常好，并且在每种情况中均表现得优于安慰剂。

实施例15.预先制备和凝胶化的组合物的相分离研究

进行研究以评价使用不同冷却方案制备的水凝胶组合物的稳定性。测试在四组不同的根据实施例1的配方的水凝胶组合物上进行。在每种情况中，水凝胶以液体状态形成，冷却至凝胶化，并于2-8℃冷藏储存。如本文所述通过以下方式制备0017-4组和0017-188组的水凝胶：于50℃混合以形成液体水凝胶，冷却至低于50℃并高于液体至固体或半固体的转变温度的保持温度，随后将组合物进一步冷却至低于转变温度。还通过以下方式制备FG-13-0049组和FG-13-0075组的水凝胶：于50℃混合以形成液体水凝胶，但保持于50℃，直到直接冷却到低于转变温度。

对于测试，将两个水浴于40℃和50℃的温度平衡最少60分钟。将来自四组中每个的小瓶从2-8℃储存中取出并放入40℃水浴中。还将来自四组中每个的小瓶从2-8℃储存中取出并放入50℃水浴中。在7小时内检测两个不同温度的样品的相分离，并使其于指定温度温育约24小时。对40℃和50℃小瓶观察到的相分离的总结分别提供于表17和18中。测试结果分别图表显示于图8a-d和图9a-d中。

表17

40℃的相分离

表18

50℃的相分离

如上面和所提到的附图中可见，通过包括冷却到低于初始混合温度但高于相转变温度的温度的中间冷却步骤制备的组合物保持相完整性的时间至少是不使用中间冷却步骤且其中组合物较长时间保持较高温度而制备的组合物的两倍长。这表明如本文所述的使用中间冷却步骤制备的组合物显示在治疗条件下的凝胶结构的更大稳定性和对相分离的抵抗性。

实施例16.预先制备和凝胶化的组合物的相分离研究

进行进一步的试验，以评价本公开的组合物在通过切除疤痕瘤组织经历疤痕瘤型瘢痕的外科手术修复的受试者中减少与疤痕瘤结疤相关的体积、外观和/或症状中的用途。

具有总共65个耳部疤痕瘤的受试者在研究中登记。疤痕瘤去除和外科手术部位治疗使用如上面实施例12中所述的方案进行。注射到外科手术部位处的水凝胶组合物的量平均为2.8ml(根据外科手术部位的尺寸，在低至0.4ml到高至9.5ml的范围内)。每2.5cm切口注射的水凝胶组合物的平均量为1.29ml(在低至0.5ml/cm到高至1.6ml/cm的范围内)。

如实施例12中所述的使用齿科藻酸盐压痕的疤痕瘤体积测量方案用于本测试中以测量病灶体积大小。外科手术前体积和模的随访体积包含在下表19中。本测试的主要效力端点基于患有切除后疤痕瘤瘢痕复发的患者的比例，并且定义为体积大于0.3cm³(0.3g)的瘢痕组织的存在。效力还可基于观察者和患者评价的POSAS分数来评价，其分别提供于表20和表21中。

参考表19，在接受治疗的最初65个疤痕瘤中，仅9例在外科手术程序后显示可测量的病灶(于治疗后第1个月、三个月和6个月评价)。如表19中可见的，在6个月时可测量的病灶体积中没有一个符合疤痕瘤复发的标准(即，存在体积大于0.3cm³的瘢痕组织)。因此，6个月复发率在本研究中根据方案定义为0％，并且显示在评价外科手术切除之后的疤痕瘤复发率时在统计学上优于科学文献(见表14和上文中的相关讨论)。在表19中，受试者01-20-PM在3个月随访时显示了未知原因的耳部整体肿胀，这解释了所测量的体积。未知原因的肿胀未进行治疗即已解决，并且在6个月评价时不存在可测量的病灶。

表19

受试者	外科手术前体积	1个月体积	3个月体积	6个月体积
					01-01-MB-L	0.519g	N/A	N/A	0.096g
01-04-KH	3.87g	N/A	N/A	0.042g
					01-05-JB	4.4g	N/A	0.084g	0.198g
01-11-ML	0.478g	N/A	N/A	0.083g
					01-13-LM	3.91g	N/A	0.08g	N/A
01-20-PM	0.467g	N/A	0.564g	N/A
					08-01-OW	0.858g	N/A	N/A	0.012g
11-01-AS	1.378g	N/A	N/A	0.082g
					11-09-LT	0.958g	N/A	0.012g	0.183g

参考表20，受试者考虑了疼痛、瘙痒、色差、硬度、厚度、不规则和总体观点。每类打分为1-10分，其中1为最佳，10为最差。平均分数在表20中显示。如所见的，受试者平均认为所治疗的部位在治疗后显著改善。

参考表21，各研究人员考虑了血管分布、色素沉积、厚度、缓解、柔软性、表面积和总体观点。每类打分为1-10分，其中1为最佳，10为最差。平均分数在表21中显示。如所见的，研究人员平均认为所治疗的部分在治疗后显著改善。

表20.受试者POSAS评价分数

表21.研究人员POSAS评价分数

本发明所属领域技术人员将想到具有前述说明和相关附图中所阐述的教导的利益的许多修改和其它实施方式。因此，应理解本发明不受限于本文所公开的具体实施方式，且修改和其它实施方式也意图包含在所附权利要求的范围内。尽管在本文中采用了具体术语，它们以广义和解释性意义使用，而不是为了限制的目的。

Claims (37)

1.制备稳定的水凝胶组合物的方法，所述方法包括：

将明胶和聚合碳水化合物在水性介质中于第一温度混合以形成液体水凝胶组合物，其中所述明胶占所述组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；

将所述液体水凝胶组合物在恒速混合下冷却至保持温度，所述保持温度比所述第一温度低至少约5℃且高于凝胶化温度，在所述凝胶化温度所述液体水凝胶组合物转化为固体或半固体水凝胶组合物，所述保持温度在所述凝胶化温度的约7℃之内；和

将所述液体水凝胶组合物进一步冷却至所述凝胶化温度，以将所述液体水凝胶组合物转化为稳定的固体或半固体水凝胶组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中当于35℃温度和2-8MHz频率测试时所述稳定的水凝胶组合物在至少500分钟上显示0.4的超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子，或者其中当于35℃和2-8MHz频率测试时所述稳定的水凝胶组合物在至少600分钟上显示0.5的U_A水凝胶稳定因子。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述稳定的水凝胶组合物通过以下一个或更多个定义：当于35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.3；当于35℃温度和2.7MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.4；当于35℃温度和5.1MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.2；当于35℃温度和5.1MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.3；当于35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少500分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.35；和当于35℃温度和7.8MHz频率测试时在至少600分钟上U_A水凝胶稳定因子为0.5。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第一温度为约45℃或更高。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述凝胶化温度为约35℃。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中进一步冷却至所述凝胶化温度在少于约2小时的时间内进行。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述进一步冷却包括将所述稳定的固体或半固体水凝胶组合物冷却至约1℃至约12℃的储存温度。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述水性介质的渗透压低于约400mOsm/kg。

9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述水性介质的渗透压为约25mOsm/kg至约375mOsm/kg。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述水性介质具有以下中的一或两项：磷酸根离子浓度不高于约20mM和碳酸根离子浓度不高于约20mM。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述水性介质包括介质199。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述稳定的水凝胶组合物中的明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，还包括冻干所述稳定的水凝胶组合物。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法制备的稳定的水凝胶组合物，其中所述稳定的水凝胶组合物显示以下中的一项或更多项：

当于35温度和2-8MHz频率测试时，在至少500分钟上超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子为0.4；

当于35℃温度和2-8MHz频率测试时，在至少600分钟上超声波衰减(U_A)水凝胶稳定因子为0.5；

当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下于35℃至39℃从注射器迫出时，流速为约10μL/s或更高；

在35℃至39℃温度时，粘度为约1.5Pa-s或更低；

纤连蛋白结合活性为约3nmol/mg或更高；和

在哺乳动物皮或皮下组织中的停留时间为约3天或更长。

15.包括明胶和聚合碳水化合物的可流动注射组合物，所述组合物为从冻干形式重构的水凝胶，并且还包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；其中所述明胶占重构组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述可流动注射重构组合物当通过5/8英寸长的25号针在5N的注射器柱塞压下在35℃至39℃温度时从注射器中迫出时的流速为约25μL/s或更高。

17.如权利要求15或权利要求16所述的组合物，其中所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；v)聚山梨醇酯和多元醇；vi)聚山梨醇酯和盐；vii)聚山梨醇酯和糖；viii)多元醇和糖；ix)盐和糖；x)聚山梨醇酯、多元醇和糖；xi)聚山梨醇酯、盐和糖；xii)吐温和甘油；xiii)吐温和NaCl；xiv)吐温和二糖；xv)甘油和二糖；xvi)NaCl和二糖；xvii)吐温、甘油和二糖；和xviii)吐温、NaCl和二糖。

18.如权利要求15-17中任一项所述的组合物，其中所述两种或更多种添加剂包括：

表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1；

表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1；或

吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

19.如权利要求15-18中任一项所述的组合物，其中所述可流动注射重构组合物的粘度在35℃至39℃温度时为约1.5Pa-s或更低。

20.如权利要求15-19中任一项所述的组合物，其中所述可流动注射重构组合物被构建为在低于35℃的温度转化为固体或半固体。

21.如权利要求20所述的组合物，其中所述固体或半固体重构组合物在皮或皮下组织中的停留时间为约3天或更长。

22.制备水凝胶组合物的方法，所述方法包括：

提供包括明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；

用水性重构液重构所述冻干组合物以形成水凝胶组合物，使得所述重构水凝胶组合物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂，并且使得所述重构水凝胶组合物中明胶和聚合碳水化合物的总浓度为约50mg/mL至约400mg/mL。

23.如权利要求22所述的方法，其中满足以下条件中的一种或更多种：

与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的表面活性剂；

与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的吸湿辅料；和

与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.01％至约4wt％的膨胀剂。

24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中与所述冻干组合物接触的水性重构液包括约0.05％至约6wt％的添加剂。

25.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；v)聚山梨醇酯和多元醇；vi)聚山梨醇酯和盐；vii)聚山梨醇酯和糖；viii)多元醇和糖；ix)盐和糖；x)聚山梨醇酯、多元醇和糖；xi)聚山梨醇酯、盐和糖；xii)吐温和甘油；xiii)吐温和NaCl；xiv)吐温和二糖；xv)甘油和二糖；xvi)NaCl和二糖；xvii)吐温、甘油和二糖；和xviii)吐温、NaCl和二糖。

26.如权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种添加剂包括：

表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1；

表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1；或

吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

27.试剂盒，包括：

第一容器，其收纳包含明胶和聚合碳水化合物的冻干组合物，所述明胶占所述冻干组合物中存在的明胶和聚合碳水化合物组合总重的约60wt％或更多；

第二容器，其收纳重构材料；和

用法说明，用于合并所述第一容器和所述第二容器中的内容物，以形成用于治疗急性皮肤创伤的重构水凝胶组合物；

其中合并的所述第一容器和所述第二容器的内容物包括选自以下的两种或更多种添加剂：表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂。

28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述第一容器包括所述添加剂中的至少一种。

29.如权利要求27或权利要求28所述的试剂盒，其中所述第二容器包括所述两种或更多种添加剂。

30.如权利要求27-29中任一项所述的试剂盒，其中所述第二容器包括水性重构液。

31.如权利要求27-30中任一项所述的试剂盒，其中所述水性重构液包括所述两种或更多种添加剂。

32.如权利要求31所述的试剂盒，其中满足以下条件中的一种或多种：

所述水性重构液包括约0.01％至约4wt％的表面活性剂；

所述水性重构液包括约0.01％至约4wt％的吸湿辅料；和

所述水性重构液包括约0.01％至约4wt％的膨胀剂。

33.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述水性重构液包括约0.05％至约6wt％的添加剂。

34.如权利要求27-33中任一项所述的试剂盒，其中所述两种或更多种添加剂包括以下中的任何种：i)表面活性剂和吸湿辅料；ii)表面活性剂和膨胀剂；iii)吸湿辅料和膨胀剂；iv)表面活性剂、吸湿辅料和膨胀剂；v)聚山梨醇酯和多元醇；vi)聚山梨醇酯和盐；vii)聚山梨醇酯和糖；viii)多元醇和糖；ix)盐和糖；x)聚山梨醇酯、多元醇和糖；xi)聚山梨醇酯、盐和糖；xii)吐温和甘油；xiii)吐温和NaCl；xiv)吐温和二糖；xv)甘油和二糖；xvi)NaCl和二糖；xvii)吐温、甘油和二糖；和xviii)吐温、NaCl和二糖。

35.如权利要求27-34中任一项所述的试剂盒，其中所述两种或更多种添加剂包括：

表面活性剂和吸湿辅料，比率为约1:20至约20:1；

表面活性剂和膨胀剂，比率为约1:40至约10:1；或

吸湿辅料和膨胀剂，比率为约1:10至约10:1。

36.如权利要求27-35中任一项所述的试剂盒，还包括适于以下中的一项或两项的连接器：将所述第一容器内容物向所述第二容器中的无菌转移和将所述第二容器内容物向所述第一容器中的无菌转移。

37.如权利要求27-36中任一项所述的试剂盒，其中所述第一容器和所述第二容器中的至少一个是注射器，且其中所述试剂盒任选包括适于连接到所述注射器的23号至27号针。