CN103558299A - 利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法，包括如下步骤：(1)在生物检材中加入有机溶剂，离心，分离有机相，将有机相浓缩至干，再溶解，过有机微孔滤膜后得提取液；(2)提取液进凝胶渗透色谱净化柱，淋洗，收集淋洗液，在浓缩仪上吹干，溶解后得到待测液；(3)利用气相色谱仪对待测液进行检测。本发明将凝胶渗透色谱技术应用到毒物分析领域，针对拟除虫菊酯类农药，建立生物检材中简单、快速、灵敏度和回收率高的前处理技术，缩短前处理时间、减少分析成本、提高检测结果的可靠，以解决毒物分析中检材种类繁多、成分复杂的问题，为提高公安行业毒物分析检验工作的效率提供保障。

Description

利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法

技术领域

本发明涉及刑事侦查领域的药物、毒物检测方法，特别涉及一种利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法。 

背景技术

随着技术的进步，对药物、毒物分析检验的要求越来越高，包括高重现性、高回收率、低检出限和操作简单易行等，因而急需建立一种简单、快速、灵敏度和回收率高的前处理方法。目前现有的前处理技术主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取等，这几种前处理技术都是根据不同化合物的性质对其进行分离提取，存在操作步骤繁琐、容易出现漏检情况。在样品前处理技术中，凝胶渗透色谱技术作为一种新型的分析技术，仪器再生能力强，无可逆吸附，对所有样品都能够完全洗脱等优点己显现了其潜在的应用前景。 

凝胶渗透色谱的理论、试验技术、仪器性能尤其是高效填充柱等方面的快速发展，其应用范围逐渐从生物化学和高分子化学扩展到工业、农业、医药、卫生等领域。目前国内外的凝胶渗透色谱研究多集中于对植物性产品如蔬菜、水果、谷物等的处理。由于血液、尿液和肝组织等生物检材中含有的蛋白质及油脂等大分子杂质难以去除，因此还没有针对血液、尿液和肝组织等生物检材中某类毒物的系统检验方法。在国内公安系统的毒物分析检测中，凝胶渗透色谱的应用还处于起步阶段，尚缺少有效可行的方法。因而建立血液、尿液和肝组织等生物检材中常见药物、毒物的凝胶渗透色谱处理技术， 并应用于实际办案中是当前的一项关键任务。 

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法，提高对生物检材中蛋白以及油脂等大分子杂质的去除效率，使得对生物检材中的拟除虫菊酯类农药进行检测时分离效果好、灵敏度高。 

本发明的技术方案是这样实现的：利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法，包括如下步骤： 

(1)在含有拟除虫菊酯类农药的生物检材中加入有机溶剂A，离心，分离有机相，将得到的有机相浓缩至干，再用有机溶剂A溶解，过有机微孔滤膜后得提取液； 

(2)提取液进凝胶渗透色谱净化柱，用有机溶剂B淋洗，收集淋洗液，在浓缩仪上吹干，用有机溶剂C溶解后得到待测液；凝胶渗透色谱净化柱的填充相为苯乙烯-二乙烯苯共聚物； 

(3)利用气相色谱仪对待测液进行检测。 

本发明的有益效果是：本发明将凝胶渗透色谱技术应用到毒物分析领域，建立血液、尿液和肝组织中简单、快速、灵敏度和回收率高的前处理技术，缩短前处理时间、减少分析成本、提高检测结果的可靠，以解决毒物分析中检材种类繁多、成分复杂的问题，为提高公安行业毒物分析检验工作的效率提供保障。 

本发明优选了提取溶剂，采用凝胶渗透色谱净化，气相色谱检测，建立了一种快速、准确、灵敏地测定血液、尿液、肝组织中5种拟除虫菊酯类农 药的较理想的方法，具有以下几个优点： 

1简单、高效、自动化的样品前处理方法。 

利用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液、乙腈、丙酮和环己烷的混合溶液或异戊醚和环己酮的混合溶液作为血液、尿液和肝组织中5种拟除虫菊酯类农药的提取溶剂，采用体积比为1∶1的环己烷和乙酸乙酯混合溶液作为流动相，使用凝胶渗透色谱对提取液进行净化；能够有效地净化血液、尿液、肝组织提取液中的蛋白、油脂、色素等大分子杂质，实现分离并富集拟除虫菊酯类农药。 

2毛细管气相色谱电子捕获检测器测定生物检材中5种拟除虫菊酯类农药。该法检测生物样品中5种拟除虫菊酯类农药的最小检出质量比范围30～80ng/mL，精密度1.2％～9.1％，不同添加浓度的平均回收率60.4～94.2％。当使用异戊醚和环己酮的混合溶液、环庚烷和丁酸丙酯的混合溶液或环己醇和乙二醇二乙醚的混合溶液作为提取溶剂时，能够更加有效地将血液、尿液和肝组织中的拟除虫菊酯类农药提取出来，并且提取液中的蛋白、油脂、色素等大分子杂质含量较少，有利于凝胶渗透色谱系统更加彻底地对提取液进行净化。通过GC/MS对5种拟除虫菊酯类农药进行确证，空白样品中未检出5种拟除虫菊酯类农药。 

3对凝胶渗透色谱净化条件进行了优化、对外标法定量、添加回收率以及GC-ECD检测进行了研究，建立了一种快速有效的检测血液、尿液和肝组织中拟除虫菊酯类农药的较为理想的方法。优选使用异戊醚和环己酮的混合溶液作为提取溶剂，并且使用凝胶渗透色谱净化技术，能够提高对血液、尿液和肝组织中蛋白以及油脂等大分子杂质的去除效率，并且采用GC-ECD检测5 种拟除虫菊酯类农药，使得本发明具有分离效果好、灵敏度高等优点。 

附图说明

图1为5种常见拟除虫菊酯类农药标准品GC-ECD色谱图(从左到右分别是甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯)； 

图2空白血中添加5种常见拟除虫菊酯类农药标准品GC-ECD色谱图； 

图3空白尿中添加5种常见拟除虫菊酯类农药标准品GC-ECD色谱图； 

图4空白肝脏中添加5种常见拟除虫菊酯类农药标准品GC-ECD色谱图； 

图5A～图5L空白血液、空白尿液、空白肝组织中添加拟除虫菊酯标准品在不同常温下放置一定时间，经提取溶剂提取，GPC净化前和净化后效果比较的GC-ECD色谱图(黑色：GPC净化前；紫色：GPC净化后)，其中：图5A为血中添加拟除虫菊酯标准品在4℃放置1周；图5B为血中添加拟除虫菊酯标准品在常温放置1周；图5C为血中添加拟除虫菊酯标准品在4℃放置2周；图5D为血中添加拟除虫菊酯标准品在常温放置2周；图5E为尿中添加拟除虫菊酯标准品在4℃放置1周；图5F为尿中添加拟除虫菊酯标准品在常温放置1周；图5G为尿中添加拟除虫菊酯标准品在4℃放置2周；图5H为尿中添加拟除虫菊酯标准品在常温放置2周；图5I为肝中添加拟除虫菊酯标准品在4℃放置2周；图5J为肝中添加拟除虫菊酯标准品在常温放置2周；图5K为肝中添加拟除虫菊酯标准品在4℃放置1周；图5L为肝中添加拟除虫菊酯标准品在常温放置1周； 

图6空白血液的GPC流出规律图(ECD)【横坐标为时间，单位：分钟】； 

图7空白尿液的GPC流出规律图(ECD)【横坐标为时间，单位：分钟】； 

图8空白肝脏的GPC流出规律图(ECD)【横坐标为时间，单位：分钟】； 

图9A～图9E为5种拟除虫菊酯类农药单标GPC色谱图，其中：图9A为氯氰菊酯的GPC色谱图；图9B为溴氰菊酯的GPC色谱图；图9C为甲氰菊酯的GPC色谱图；图9D为高效氯氟氰菊酯的GPC色谱图；图9E为氰戊菊酯的GPC色谱图； 

图10为5种拟除虫菊酯类农药的GPC流出规律图【横坐标为时间，单位：分钟】。 

具体实施方式

实施例1 

一、生物样品的准备 

空白血液和空白尿液均采自一周内未服用任何药物的健康志愿者；空白肝组织采自于一周内未服用任何药物的生猪。氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯，均购于国家标准物质研究中心。 

二、实验条件 

2.1标准溶液的配制 

标准储备液的配制：分别称取氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯标准品各10mg，分别置于10mL容量瓶中，分别加少量甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成1mg/mL的氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯标准品储备液，4℃冰箱中保存，备用。 

分别移取一定量的单个标准品储备液配制拟除虫菊酯类农药混合标准溶液(即：拟除虫菊酯类农药混合标准溶液中的溶质为氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯)。 

标准工作液的配制：分别取配制好的标准品储备液，稀释为所需浓度的 工作溶液，于4℃冰箱中保存，备用。 

2.2色谱条件 

2.2.1凝胶渗透色谱条件 

净化柱：300mm×20mm，内装苯乙烯-二乙烯苯共聚物(Bio-Beads SX-3)填料；流动相：乙酸乙酯-环己烷(二者体积比为1∶1)；流速：4.7mL/min；进样量：5mL；检测波长为254nm；开始收集时间：8min；结束收集时间：14min；在线浓缩温度和真空度：1区：：42℃30.0KPa；2区：51℃24.0KPa；3区：52℃22.0KPa。 

2.2.2气相色谱条件(GC/ECD) 

2010气相色谱仪(GC/ECD)条件：DB-1(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱，载气为高纯氮气(99.99％)，流量1.0mL/min，柱温200℃保持1min、然后以每分钟10℃升温至280℃、保持15min；进样口温度280℃，分流进样；电子捕获检测器温度300℃。 

2.2.3气相色谱-质谱条件(GC/MS) 

2010气相色谱一质谱仪(GC/MS)条件：DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，载气高纯氮气(99.99％)，流量1.0mL/min，柱温80℃保持2min、然后以每分钟30℃升温至280℃、保持15min；传输线温度230℃；进样口温度280℃，分流进样。质谱条件：NCI电离源，电子能量70eV，离子源温度200℃。调谐方式为自动调谐，倍增电压1102V，发射电流100μA。全扫描定性分析，扫描起始时间3min，扫描范围40amu～450amu。 

2.3实验方法 

2.3.1样品制备 

取新鲜猪肝组织在自动匀浆机内匀浆后放入洁净的密闭容器中低温保存。 

2.3.2空白生物样品提取液的制备 

2.3.2.1取1mL空白血液【注：本发明中的空白血液是指不含有拟除虫菊酯类农药的血液，同理：本发明中的空白尿液和空白肝组织分别指不含有拟除虫菊酯类农药的尿液和肝组织】，放入15mL离心管中，混匀振荡，放置30min。在离心管中加入10mL乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)，振荡10min，8000rpm离心10min，分离有机相后，置于50℃快速浓缩仪上浓缩至干，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)定容至8mL，过0.45μm有机滤膜，得空白血液的提取液。 

2.3.2.2取1mL空白尿液，其余步骤同步骤2.3.2.1，得空白尿液的提取液。 

2.3.2.3取匀浆后的1g空白肝组织，混匀振荡，放置30min。在离心管中加入10mL乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)，振荡10min，8000rpm离心10min，分离有机相后，剩余残渣再加入10mL乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)，振荡10min，8000rpm离心10min，分离有机相。合并两次有机相，置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)定容至8mL，过0.45μm有机滤膜，得空白肝组织的提取液。 

2.3.3、含拟除虫菊酯类农药标准品的生物样品的提取液的制备 

2.3.3.1、添加拟除虫菊酯类农药标准品的血液的提取液 

取1mL添加拟除虫菊酯类农药标准品的血液，提取拟除虫菊酯类农药，操作步骤同2.3.2.1，得到添加拟除虫菊酯类农药标准品的血液的提取液。 

2.3.3.2、添加拟除虫菊酯类农药标准品的尿液的提取液 

取1mL添加拟除虫菊酯类农药标准品的尿液，提取拟除虫菊酯类农药，操作步骤同2.3.2.2，得到添加拟除虫菊酯类农药标准品的尿液的提取液。 

2.3.3.3、添加拟除虫菊酯类农药标准品的肝组织的提取液 

取1g添加拟除虫菊酯类农药标准品的匀浆后的肝组织，提取拟除虫菊酯类农药，操作步骤同2.3.2.3，得到添加拟除虫菊酯类农药标准品的肝组织的提取液。 

2.3.4凝胶渗透色谱净化条件， 

进4.8mL每种拟除虫菊酯类农药浓度为1μg/mL的拟除虫菊酯类农药混合标准溶液到GPC净化系统，采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者体积比为1∶1)作为流动相进行淋洗，流量为5mL/min，检测波长为254nm。每1min收集于一个试管中，收集20个，分别浓缩仪上浓缩至干，分别用色谱纯甲醇定容至0.1mL，得到待测液1。 

空白血液、空白尿液、空白肝组织的提取液分别进GPC上做空白洗脱曲线，得到待测液2、3和4。 

添加拟除虫菊酯类农药的血液、尿液、肝组织的提取液进GPC净化系统，收集第7min～16min流出物，于J2-Scientific在线浓缩系统下将流出液浓缩至干，用色谱纯甲醇定容至0.1mL，得到待测液5、6和7，进行5种拟除虫菊酯类农药的分析。 

2.3.5气相色谱定性、定量分析5种常见拟除虫菊酯类农药 

2.3.5.1气相色谱定性、定量分析 

待测液1采用气相色谱检测(ECD检测器)各段流出液中农药的含量，绘制出拟除虫菊酯类农药在凝胶渗透色谱上的流出曲线(参见图1)，从而可以确定淋洗溶剂的体积以及收集体积。待测液5、6和7在气相色谱检测(ECD检测器)上进行检测(参见图2～4)，可以取得精密度以及回收率实验数据，并且可以通过外标法进行定量。 

2.3.5.2GC-MS(气相色谱仪-质谱联用仪)确证 

表2-25种拟除虫菊酯类农药的碎片离子 

2.3.6腐败生物检材的净化 

分别取2mL空白血、2mL空白尿、5g空白肝组织，分别放入15mL离心管中，分别加入拟除虫菊酯类农药混合标准溶液，然后均在4℃和常温条件下放置1周和2周后，分别参照“步骤2.3.3含拟除虫菊酯类农药标准品的生物样品的提取液的制备中2.3.3.1、2.3.3.2和2.3.3.3”中提取液的制备方法制备腐败生物样品提取液，进行GPC净化，GC-ECD检测(检测结果参见图5A～5L)。 

三、结果与讨论 

3.1提取溶剂的选择 

拟除虫菊酯农药多为弱极性或中等极性化合物，用于拟除虫菊酯农药提 取的溶剂主要有正己烷、环己烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙腈和甲苯等。其中正己烷和石油醚极性太弱，提取菊酯回收率严重偏低；乙腈对大多数菊酯提取效果都较好，但对极性很弱的菊酯，如溴氰菊酯的回收率偏低；甲苯毒性太大，一般不选择；丙酮和乙酸乙酯则避免了前面溶剂的缺点。但由于5种菊酯极性差异很大，用单一溶剂很难对5种菊酯的提取都达到较好的回收率，选择乙酸乙酯和环己烷的混合溶剂(二者体积比为1∶1)，效果较单一溶剂好，且与GPC流动相相同，以利于下一步分析。选择异戊醚和环己酮的混合溶液(二者体积比为1∶8)、环庚烷和丁酸丙酯的混合溶液中环庚烷和丁酸丙酯的体积比为1∶3、环己醇和乙二醇二乙醚的混合溶液中环己醇和乙二醇二乙醚的体积比为2∶7作为提取溶剂，回收率依次升高，唯一缺点是与GPC流动相不相同。 

3.2凝胶渗透色谱的检测波长的选择 

为了满足分离杂质和农药的需要，利用全波段UV-可见分析仪器进行检测，找出拟除虫菊酯类农药的最大吸收波长，经过反复试验，发现在254nm时，5拟除虫菊酯类农药都有较大的吸收，能满足检测的要求，所以把凝胶渗透色谱检测波长定为254nm。 

3.3凝胶色谱流动相的选择 

为确保拟除虫菊酯类农药农药和杂质能够最大程度的分离，而且分析周期短，且不干扰拟除虫菊酯类农药农药和杂质分离的检测，发现乙酸乙酯、环己烷在254nm时吸收较小，分别对乙酸乙酯和环己烷的体积比做了多种配比试验，结果表明当乙酸乙酯和环己烷的体积比为50：50作为流动相时，能满足上述要求，基线平直，分离效果较好。 

3.4GPC净化效果 

3.4.1空白血液、空白尿液、空白肝组织添加的净化效果 

研究GPC凝胶柱对空白血液、空白尿液、空白肝组织添加拟除虫菊酯类农药的分离、净化效果进行如下实验：5种拟除虫菊酯类农药标准品色谱图见图1；待测液5、6和7经GC-ECD检测，色谱图见图2、3和4。 

3.4.2腐败血液、尿液、肝组织中添加拟除虫菊酯类农药的净化效果 

将分别于4℃和常温放置1周、2周的添加拟除虫菊酯类农药的生物样品的提取液，经GPC净化，GC-ECD检测，得到色谱图(图5A～5L)。 

3.5空白血液、尿液、肝脏样品的GPC流出规律 

将空白血液、空白尿液、空白肝组织的待测液2、3和4分别进GC-ECD检测出各段流出液杂质的含量，结果见图6、7和8。空白血液提取液中的杂质(油脂、色素、蛋白质等)在凝胶渗透色谱柱上是在第3min～10min时流出，而在6min～9min流出75％的杂质。空白尿液提取液中的杂质(色素、蛋白质等)在凝胶渗透色谱柱上是在第3min～14min时流出，而在5min～10min流出75％的杂质。空白肝脏提取液中的杂质(油脂、色素、蛋白质等)在凝胶渗透色谱柱上是在第4min～12min时流出，而在5min～10min流出75％的杂质。 

3.65种拟除虫菊酯类农药的GPC流出规律 

分别将浓度为50μg/mL的5种拟除虫菊酯类农药单标(氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯)5mL，进样GPC净化系统【采用环己烷-乙酸乙酯(50∶50，v/v)复溶混匀，定容至8mL后进样】，进样量为5mL，采用环己烷一乙酸乙酯(1∶1，v/v)作为流动相进行淋洗，流量为 4.7mL/min，检测波长为254nm，记录每种农药的色谱参数。5种拟除虫菊酯类农药单标GPC色谱图见图9A～图9E。 

将农药标准待测液1分别用GC-ECD检测出各段流液中拟除虫菊酯类农药的含量，结果见图10所示。从图10中看出，5种拟除虫菊酯类农药在凝胶渗透色谱柱上都是在第8min～14min时流出。在样品过凝胶渗透色谱柱净化时，为了最大限度的去除油脂和其他色素、蛋白质等大分子的干扰，而且对血液、尿液、肝脏等样品中的拟除虫菊酯类农药有较高的回收，只需收集8min～14min流出液，回收率基本在60％～94％。 

3.75种拟除虫菊酯类农药的标准工作曲线和检出限 

分别移取氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯的标准储备液，用甲醇依次稀释终浓度范围在200～5000ng/mL，按照GC-ECD仪器条件对标准品进行分析，用目标物的峰面积(Y)对标准浓度(X)进行线性回归，从而得到一系列的标准工作曲线，见表2-4。在此色谱条件下，以信噪比S/N=3计，计算得到检出限。5种拟除虫菊酯类农药在200～5000ng/mL浓度范围内有良好的线性关系。 

表2-45种拟除虫菊酯类农药的标准工作曲线和最小检出限 

3.85种拟除虫菊酯类农药的添加回收率 

GPC净化氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯 的浓度分别为1.0、0.5、0.1μg/mL的添加血液、尿液以及浓度为1.0、0.5、0.1μg/g的肝脏组织，GC-ECD测定，添加回收率见表2-5、2-6和2-7。从表中可以看出：采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者的体积比为1∶1)为提取溶剂，并采用凝胶渗透色谱净化5种拟除虫菊酯类农药的回收率均在60％以上，且精密度(RSD)小于10％。 

表2-5血液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-6尿液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-7肝脏中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

3.95种拟除虫菊酯类农药的方法线性范围与提取检测限 

取空白血液1mL、空白尿液1mL、空白肝组织1g，分别添加氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯，浓度范围在200-5000ng/mL，经过提取和GPC净化后，分别参照“2.3、实验方法中2.3.3.1、2.3.3.2和2.3.3.3”中提取液的制备方法制备相应的提取液，经GPC净化系统净化，100μL甲醇定容，GC-ECD分析检测，建立5个点，以药物浓度为横坐标，样品峰面积比为纵坐标得到线性回归方程。由此可见，GPC净化后GC-ECD检测5种拟除虫菊酯类农药在200-5000ng/mL范围内线性良好，分别见表2-8、2-9和2-10。取空白血1mL、空白尿1mL、空白肝组织1g，分别添加氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯的浓度范围在10～200ng/mL，分别参照“2.3、实验方法中2.3.3.1、2.3.3.2和2.3.3.3”中提取液的制备方法制备相应的提取液，经GPC净化系统净化，经检测，得GC-ECD和GC-MS分析最低提取检测限(S/N=3/1)分别如表2-8、2-9和2-10所示。 

表2-8血液中添加5种拟除虫菊酯类农药的方法线性方程和最小检出限 

表2-9尿液中添加5种拟除虫菊酯类农药的方法线性方程和最小检出限 

表2-10肝组织中添加5种拟除虫菊酯类农药的方法线性方程和最小检出限 

实施例2 

本实施例与实施例1的区别在于：提取溶剂(即有机溶剂A)为异戊醚和环己酮的混合溶液，混合溶液中异戊醚和环己酮二者体积比为1∶8；其余实验条件均相同；以异戊醚和环己酮的混合溶液作为提取溶剂，5种拟除虫菊酯类农药的添加回收率和精密度如表2-11～2-13所示。 

表2-11血液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-12尿液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-13肝脏中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

从表2-11～2-13中可以看出，以异戊醚和环己酮的混合溶液作为提起溶剂，采用凝胶渗透色谱净化含有5种拟除虫菊酯类农药生物样品的回收率均在75％以上，且精密度(RSD)小于5％。 

实施例3 

本实施例与实施例1的区别在于：提取溶剂(即有机溶剂A)为环庚烷和丁酸丙酯的混合溶液，混合溶液中环庚烷和丁酸丙酯的体积比为1∶3；其余实验条件均相同；以环庚烷和丁酸丙酯的混合溶液作为提取溶剂，5种拟 除虫菊酯类农药的添加回收率和精密度如表2-14～2-16所示。 

表2-14血液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-15尿液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-16肝脏中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

从表2-14～2-16中可以看出，以环庚烷和丁酸丙酯的混合溶液作为提起溶剂，采用凝胶渗透色谱净化含有5种拟除虫菊酯类农药生物样品的回收率 均在80％以上，且精密度(RSD)小于5％。 

实施例4 

本实施例与实施例1的区别在于：提取溶剂(即有机溶剂A)为环己醇和乙二醇二乙醚的混合溶液，混合溶液中环己醇和乙二醇二乙醚的体积比为2∶7；其余实验条件均相同；以环己醇和乙二醇二乙醚的混合溶液作为提取溶剂，5种拟除虫菊酯类农药的添加回收率和精密度如表2-17～2-19所示。 

表2-17血液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-18尿液中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

表2-19肝脏中5种拟除虫菊酯类农药经GPC净化后的添加回收率和精密度 

从表2-17～2-19中可以看出，以环己醇和乙二醇二乙醚的混合溶液作为提起溶剂，采用凝胶渗透色谱净化含有5种拟除虫菊酯类农药生物样品的回收率均在90％以上，且精密度(RSD)小于5％。 

Claims (4)

1.利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在含有拟除虫菊酯类农药的生物检材中加入有机溶剂A，离心，分离有机相，将得到的有机相浓缩至干，再用有机溶剂A溶解，过有机微孔滤膜后得提取液；

(2)提取液进凝胶渗透色谱净化柱，用有机溶剂B淋洗，收集淋洗液，在浓缩仪上吹干，用有机溶剂C溶解后得到待测液；凝胶渗透色谱净化柱的填充相为苯乙烯-二乙烯苯共聚物；

(3)利用气相色谱仪对待测液进行检测。

2.根据权利要求1所述的利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法，其特征在于，在步骤(1)中，生物检材为血液、尿液或肝组织，拟除虫菊酯类农药为氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯和高效氯氟氰菊酯中的一种或多种；有机微孔滤膜的孔径为0.35～0.55μm；在步骤(2)中，有机溶剂B为乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液进行淋洗；有机溶剂C为色谱纯甲醇。

3.根据权利要求2所述的利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别将含有拟除虫菊酯类农药的血液样品、含有拟除虫菊酯类农药的尿液样品和含有拟除虫菊酯类农药的匀浆肝样品加入到离心管中，混匀振荡，放置，向离心管中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液、乙腈、丙酮和环己烷的混合溶液或异戊醚和环己酮的混合溶液，振荡，离心，分离有机相，再向离心管中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液、乙腈、丙酮和环己烷的混合溶液、异戊醚和环己酮的混合溶液、环庚烷和丁酸丙酯的混合溶液、环己醇和乙二醇二乙醚的混合溶液，振荡，离心，分离有机相，合并两次获得的有机相，置于浓缩仪上浓缩至干，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液溶解，过有机微孔滤膜，得到提取液；

(2)提取液进凝胶渗透色谱净化柱，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液淋洗，收集淋洗液，在浓缩仪上吹干，色谱纯甲醇溶解后得到待测液；

凝胶色谱条件：凝胶渗透色谱净化柱：300mm×20mm，凝胶渗透色谱净化柱的填充相为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，流动相：乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，流速：4.7mL/min，进样量：5mL，检测波长为254nm，开始收集时间：8min，结束收集时间：14min，在线浓缩温度和真空度：1区：42℃、30.0KPa，2区：51℃、24.0KPa，3区：52℃、22.0KPa；

(3)利用带电子捕获检测器的气相色谱仪对待测液进行检测，气相色谱条件：30m×0.25mm×0.25μm的DB-1石英毛细管柱，载气为纯度为99.99％的氮气，流量1.0mL/min，柱温200℃保持1min、然后以每分钟10℃升温至280℃、保持15min；进样口温度280℃，分流进样，电子捕获检测器温度300℃；

并利用气相色谱仪-质谱联用仪进行拟除虫菊酯类农药的确证，气相色谱一质谱联用仪条件：30m×0.25mm×0.25μm的DB-5MS毛细管柱，载气为纯度为99.99％的氮气，流量1.0mL/min，柱温80℃保持2min、然后以每分钟30℃升温至280℃、保持15min；传输线温度230℃；进样口温度280℃，分流进样；质谱条件：NCI电离源，电子能量70eV，离子源温度200℃；调谐方式为自动调谐，倍增电压1102V，发射电流100μA；全扫描定性分析，扫描起始时间3min，扫描范围40amu～450amu。

4.根据权利要求3所述的利用凝胶渗透色谱处理生物检材的拟除虫菊酯类农药检验方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)中：乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷体积比为1∶1；在步骤(1)中：丙酮和环己烷的混合溶液中丙酮和环己烷体积比为1∶1，异戊醚和环己酮的混合溶液中异戊醚和环己酮体积比为1∶8，环庚烷和丁酸丙酯的混合溶液中环庚烷和丁酸丙酯的体积比为1∶3，环己醇和乙二醇二乙醚的混合溶液中环己醇和乙二醇二乙醚的体积比为2∶7。

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