CN103558298B - 利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法，包括如下步骤：(1)在生物检材中加入有机溶剂A，离心，分离有机相，将得到的有机相浓缩至干，再用有机溶剂A溶解，过有机微孔滤膜后得提取液；(2)提取液进凝胶渗透色谱净化柱，用有机溶剂B淋洗，收集淋洗液，在浓缩仪上吹干，用有机溶剂C溶解后得到待测液；凝胶渗透色谱净化柱的填充相为苯乙烯-二乙烯苯共聚物；(3)利用气相色谱仪对待测液进行检测。本发明将凝胶渗透色谱技术应用到毒物分析领域，针对有机磷农药，建立生物检材中简单、快速、灵敏度和回收率高的前处理技术，缩短前处理时间、减少分析成本、提高检测结果的可靠，以解决毒物分析中检材种类繁多、成分复杂的问题，为提高公安行业毒物分析检验工作的效率提供保障。
Description
技术领域
本发明涉及刑事侦查领域的药物、毒物检测方法，特别涉及一种利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法。
背景技术
随着技术的进步，对药物、毒物分析检验的要求越来越高，包括高重现性、高回收率、低检出限和操作简单易行等，因而急需建立一种简单、快速、灵敏度和回收率高的前处理方法。目前现有的前处理技术主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取等，这几种前处理技术都是根据不同化合物的性质对其进行分离提取，存在操作步骤繁琐、容易出现漏检情况。
目前国内外的凝胶渗透色谱研究多集中于对植物性产品如蔬菜、水果、谷物等的处理。由于血液、尿液和肝组织等生物检材中含有的蛋白质及油脂等大分子杂质难以去除，因此还没有针对血液、尿液和肝组织等生物检材中某类毒物的系统检验方法。在国内公安系统的毒物分析检测中，凝胶渗透色谱的应用还处于起步阶段，尚缺少有效可行的方法。因而建立血液、尿液和肝组织等生物检材中常见药物、毒物的凝胶渗透色谱处理技术，并应用于实际办案中是当前的一项关键任务。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法，提高对生物检材中蛋白以及油脂等大分子杂质的去除效率，使得对生物检材中的有机磷农药进行检测时分离效果好、灵敏度高。
本发明的技术方案是这样实现的：利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法，包括如下步骤：(1)在生物检材中加入有机溶剂A，离心，分离有机相，将得到的有机相浓缩至干，再用有机溶剂A溶解，过有机微孔滤膜后得提取液；(2)提取液进凝胶渗透色谱净化柱，用有机溶剂B淋洗，收集淋洗液，在浓缩仪上吹干，用有机溶剂C溶解后得到待测液；凝胶渗透色谱净化柱的填充相为苯乙烯-二乙烯苯共聚物；(3)利用气相色谱仪对待测液进行检测。
本发明的有益效果是：本发明将凝胶渗透色谱技术应用到毒物分析领域，建立血液、尿液和肝组织中简单、快速、灵敏度和回收率高的前处理技术，缩短前处理时间、减少分析成本、提高检测结果的可靠，以解决毒物分析中检材种类繁多、成分复杂的问题，为提高公安行业毒物分析检验工作的效率提供保障。
本发明优选了提取溶剂，采用凝胶渗透色谱净化，气相色谱检测，建立了一种快速、准确、灵敏地测定血液、尿液、肝组织中8种有机磷农药的理想的方法，具有以下几个优点：
1、简单、高效、自动化的样品前处理方法。
利用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液、正己烷和丙酮的混合溶液、乙腈或环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液作为血液、尿液和肝组织中8种有机磷农药的提取溶剂，采用体积比为1∶1的环己烷和乙酸乙酯的混合溶液作为流动相，使用凝胶渗透色谱对提取液进行净化；能够有效地净化血液、尿液、肝组织提取液中的蛋白、油脂、色素等大分子杂质，实现分离并富集有机磷农药。
2、毛细管气相色谱火焰光度检测器测定生物检材中8种常见有机磷农药。该法检测8种有机磷农药的最小检出质量比范围10～50ng/mL；当使用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液作为提取溶剂时，精密度2.1％～9.9％，不同添加浓度的平均回收率60.2～96.2％；当使用环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液作为提取溶剂时，能够更加有效地将血液、尿液和肝组织中的有机磷农药提取出来，并且提取液中的蛋白、油脂、色素等大分子杂质含量较少，有利于凝胶渗透色谱系统更加彻底地对提取液进行净化，精密度2.1％～6.4％，不同添加浓度的平均回收率70.1～97.5％。通过GC/MS对8种常见的有机磷农药进行确证，空白样品中未检出8种有机磷农药。
3、对凝胶渗透色谱净化条件进行了优化、对外标法定量、添加回收率以及GC-FPD检测进行了研究，建立了一种快速有效的检测血液、尿液和肝组织中有机磷农药的较为理想的方法。优选乙酸乙酯和环己烷的混合溶液、环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液、环己醇和环己酮的混合溶液或异戊醚和丁酸丙酯的混合溶液作为提取溶剂，并且使用凝胶渗透色谱净化技术，能够提高对血液、尿液和肝组织中蛋白以及油脂等大分子杂质的去除效率，并且采用GC-FPD检测8种有机磷农药，使得本发明具有分离效果好、灵敏度高等优点。
附图说明
图1-1空白血液样品GC-FPD色谱图；图1-2空白尿液样品GC-FPD色谱图；图1-3空白肝组织样品GC-FPD色谱图；
图1-4为8种有机磷农药标准品GC-FPD色谱图(从左到右分别是氧乐果、甲拌磷、乐果、乙拌磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、倍硫磷、乙基对硫磷)；
图1-5空白血中添加8种有机磷农药标准品GC-FPD色谱图；
图1-6空白血中添加8种有机磷农药标准品GC-FPD色谱图；
图1-7空白肝组织中添加8种有机磷农药标准品GC-FPD色谱图；
图1-8A～图1-8M空白血液、空白尿液、空白肝组织在不同温度下放置一定时间，经提取溶剂提取，GPC净化系统净化前和净化后效果比较的GC-FPD色谱图(黑色：GPC净化系统净化前；紫色：GPC净化系统净化后)；其中：
图1-8A：空白血在4℃放置24h；图1-8B：空白血在4℃放置4天；图1-8C：空白血在4℃放置1星期；图1-8D：空白血在4℃放置2星期；图1-8E：空白尿在4℃放置24h；图1-8F：空白尿在4℃放置4天；图1-8G：空白尿在4℃放置1星期；图1-8H：空白尿在4℃放置2星期；图1-8I：空白肝在4℃放置24h；图1-8J：空白肝在4℃放置4天；图1-8K：空白肝在4℃放置1星期；图1-8L：空白肝在4℃放置2星期；图1-8M空白肝在常温放置2星期；
图1-9A～图1-9B为有机磷农药混合标准品溶液一、二的GC-FPD色谱图；图1-9A：有机磷农药混合标准品溶液一的GC-FPD色谱图；图1-9B：有机磷农药混合标准品溶液二的GC-FPD色谱图；
图1-10A～图1-10L空白血液、空白尿液、空白肝组织中添加有机磷标准品在不同常温下放置一定时间，经提取溶剂提取，GPC净化系统净化前和净化后效果比较的GC-FPD色谱图(黑色：GPC净化前；紫色：GPC净化后)：
图1-10A：添加有机磷农药混合标准品溶液一的血液在4℃放置1星期；图1-10B：添加有机磷农药混合标准品溶液二的血液在4℃放置1星期；图1-10C：添加有机磷农药混合标准品溶液一的血液在常温放置1星期；图1-10D：添加有机磷农药混合标准品溶液二的血液在常温放置1星期；图1-10E：添加有机磷农药混合标准品溶液一的尿液在4℃放置1星期；图1-10F：添加有机磷农药混合标准品溶液二的尿液在4℃放置1星期；图1-10G：添加有机磷农药混合标准品溶液一的尿液在常温放置1星期；图1-10H：添加有机磷农药混合标准品溶液二的尿液在常温放置1星期；图1-10I：添加有机磷农药混合标准品溶液一的肝组织在4℃放置1星期；图1-10J：添加有机磷农药混合标准品溶液二的肝组织在4℃放置1星期；图1-10K：添加有机磷农药混合标准品溶液一的肝组织在常温放置1星期；图1-10L：添加有机磷农药混合标准品溶液二的肝组织在常温放置1星期；
图1-11空白血液的GPC流出规律图(FPD)【横坐标为时间，单位：分钟】；图1-12空白尿液的GPC流出规律图(FPD)【横坐标为时间，单位：分钟】；图1-13空白肝脏的GPC流出规律图(FPD)【横坐标为时间，单位：分钟】；
图1-14A～图1-14H为8种有机磷单标GPC流出规律图(FPD)，其中：
图1-14A：甲拌磷的GPC流出规律图(FPD)；图1-14B：乙拌磷的GPC流出规律图(FPD)；图1-14C：倍硫磷的GPC流出规律图(FPD)；图1-14D：乐果的GPC流出规律图(FPD)；图1-14E：氧乐果的GPC流出规律图(FPD)；图1-14F：马拉硫磷的GPC流出规律图(FPD)；图1-14G：乙基对硫磷的GPC流出规律图(FPD)；图1-14H：甲基对硫磷的GPC流出规律图(FPD)；
图1-15为8种有机磷农药的GPC流出规律图(FPD)【横坐标为时间，单位：分钟】。
具体实施方式
以下实施例中：空白血液和空白尿液均采自一周内未服用任何药物的健康志愿者；空白肝组织采自于一周内未服用任何药物的生猪。乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷，均购于国家标准物质研究中心。
实施例1：一、标准溶液的配制
1、标准储备液的配制：分别称取乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷标准品各10mg，分别置于10mL容量瓶中，分别加少量正己烷溶解并定容至刻度，分别配制成浓度为1mg/mL的乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷的标准品储备液，4℃冰箱中保存，备用。
分别移取一定量的单个标准品储备液配制8种有机磷农药混合标准品溶液(即8种有机磷农药混合标准品溶液中的溶质为乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷)。
分别移取一定量氧乐果、乐果、甲基对硫磷和倍硫磷的单个标准品储备液，配制有机磷农药混合标准品溶液一(即有机磷农药混合标准品溶液一中的溶质为氧乐果、乐果、甲基对硫磷和倍硫磷)。
移取一定量甲拌磷、乙拌磷、马拉硫磷和乙基对硫磷单个标准品储备液，配制有机磷农药混合标准品溶液二(即有机磷农药混合标准品溶液二中的溶质为甲拌磷、乙拌磷、马拉硫磷和乙基对硫磷)。
2、标准工作液的配制：分别取配制好的标准品储备液，稀释为所需浓度的工作溶液，于4℃冰箱中保存，备用。
二、色谱条件：2.1、凝胶渗透色谱条件
净化柱：300mm×20mm，内装苯乙烯-二乙烯苯共聚物(Bio-Beads SX-3)填料；流动相：乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(体积比为1∶1)；流速：4.7mL/min；进样量：5mL；检测波长为254nm；开始收集时间：9min；结束收集时间：15min；在线浓缩温度和真空度：1区：40℃、30.0KPa；2区：50℃、25.0KPa；3区：50℃、22.0KPa。
2.2、气相色谱条件(GC/FPD)：2010气相色谱仪(GC/FPD)条件：DB-5(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛细管柱，载气为高纯氮气(99.99％)，流量1.0mL/min，柱温：120℃保持1min、然后以每分钟8℃升温到260℃、保持1min、再以每分钟30℃升温到280℃、保持3min；进样口温度260℃，分流进样；检测器温度300℃。
2.3、气相色谱-质谱条件(GC/MS)：2010气相色谱-质谱仪(GC/MS)条件：DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱，载气高纯氮气(氮气纯度为99.99％)，流量1.0mL/min，柱温：100℃保持2min、然后以每分钟30℃升温到280℃、保持17min；传输线温度230℃；进样口温度250℃，分流进样。质谱条件：EI电离源，电子能量70eV，离子源温度200℃。调谐方式为自动调谐，倍增电压1.1kV，发射电流100μA。全扫描定性分析，扫描起始时间3min，扫描范围40amu～450amu。
三、实验方法：3.1、样品制备：取新鲜猪肝组织在自动匀浆机内匀浆后放入洁净的密闭容器中低温保存。
3.2、提取有机磷农药
3.2.1、空白提取液的制备
3.2.1.1、取1mL空白血液【注：本发明中的空白血液是指不含有有机磷农药的血液，同理：本发明中的空白尿液和空白肝组织分别指不含有有机磷农药的尿液和肝组织】，放入15mL离心管中，混匀振荡，放置30min。在离心管中加入10mL乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)，振荡10min，8000rpm离心10min，分离有机相后，再加入10mL乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)进行第二次提取，合并两次提取液，置于50℃快速浓缩仪上浓缩至干，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)定容至8mL，过0.45μm有机滤膜，得到空白血提取液。
3.2.1.2、取1mL空白尿液，其余步骤同上述步骤3.2.1.1，得到空白尿提取液。
3.2.1.3、取匀浆后的1g空白肝组织，混匀振荡，放置30min。在离心管中加入10mL乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)，振荡10min，8000rpm离心10min，分离有机相后，剩余残渣再加入10mL乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)，振荡10min，8000rpm离心10min，分离有机相。合并两次有机相，置于35℃快速浓缩仪上浓缩至干，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)定容至8mL，过0.45μm有机滤膜，得到空白肝组织提取液。
3.2.2、含有机磷农药标准品的生物检材的提取液的制备
3.2.2.1、添加有机磷农药标准品的血液的提取液
取1mL添加有机磷农药标准品的血液，提取有机磷农药，操作步骤同3.2.1.1，得到添加有机磷农药标准品的血液的提取液。
3.2.2.2、添加有机磷农药标准品的尿液的提取液
取1mL添加有机磷农药标准品的尿液，提取有机磷农药，操作步骤同3.2.1.2，得到添加有机磷农药标准品的尿液的提取液。
3.2.2.3、添加有机磷农药标准品的肝组织的提取液
取1g添加有机磷农药标准品的匀浆后的肝组织，提取有机磷农药，操作步骤同3.2.1.3，得到添加有机磷农药标准品的肝组织的提取液。
3.2.3、凝胶渗透色谱净化条件
进4.8mL每种有机磷农药浓度为1μg/mL的8种有机磷农药混合标准品溶液进入到GPC【本发明中的GPC是指凝胶渗透色谱】净化系统，采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者在混合溶液中的体积比为1∶1)作为流动相进行淋洗，流量为5mL/min，检测波长为254nm。每1min收集于一个试管中，收集20个，分别在浓缩仪上吹干，分别用色谱纯甲醇定容至0.1mL，得到待测液1。空白血液、空白尿液、空白肝组织的提取液分别进GPC净化系统上做空白洗脱曲线，分别得到待测液2、待测液3和待测液4。添加有机磷农药标准品的血液的提取液、有机磷农药标准品的尿液的提取液、有机磷农药标准品的肝组织的提取液分别进GPC净化系统，收集第7min～16min流出物，于J2-Scientific在线浓缩系统下将流出液浓缩浓缩至干，用色谱纯甲醇定容至0.1mL，分别得到待测液5、待测液6和待测液7，进行8种常见有机磷农药的分析检验。
3.2.4、气相色谱定性、定量分析8种有机磷农药
3.2.4.1气相色谱定性、定量分析：待测液1采用气相色谱检测(FPD检测器)各段流出液中农药的含量，绘制出有机磷农药在凝胶渗透色谱上的流出曲线(参见图1-4)，从而可以确定淋洗溶剂的体积以及收集体积。待测液5、6和7在气相色谱检测(FPD检测器)上进行检测(色谱图参见图1-5～图1-7)，可以取得精密度以及回收率实验数据，并且可以通过外标法进行定量。
3.2.4.2GC-MS(气相色谱仪-质谱联用仪)确证
表1-2 8种有机磷农药的碎片离子
3.2.5腐败生物检材的净化：取2mL空白血、2mL空白尿、5g空白肝组织，放入15mL离心管中，然后分别在4℃条件下放置24h、4天、1周和2周，分别参照“三、实验方法中3.2.1.1、3.2.1.2和3.2.1.3”中提取液的制备方法制备腐败生物检材提取液，经GPC净化系统净化，GC-FPD检测(参见图1-8A～图1-8L)。同时，取5g空白肝组织在常温下放置2周，参照“三、实验方法中3.2.1.3”中提取液的制备方法制备腐败生物检材提取液，经GPC净化系统净化，GC-FPD检测(参见图1-8M)。
分别取2mL空白血、2mL空白尿和5g空白肝组织，分别放入15mL离心管中，分别加入有机磷农药混合标准品溶液一和有机磷农药混合标准品溶液二；然后分别在4℃条件下放置1周，再分别参照“三、实验方法中3.2.2.1、3.2.2.2和3.2.2.3”中提取液的制备方法制备腐败生物检材提取液，经GPC净化系统净化，GC-FPD检测(参见图1-10A、10B、10E、10F、10I、10J)。有机磷农药混合标准品溶液一经GC-FPD检测的标准色谱图参见图1-9A，有机磷农药混合标准品溶液二经GC-FPD检测的标准色谱图参见图1-9B。
取2mL空白血、2mL空白尿、5g空白肝组织，分别放入15mL离心管中，分别加入有机磷农药混合标准品溶液一和有机磷农药混合标准品溶液二；然后分别在常温条件下放置1周，再分别参照“三、实验方法中3.2.2.1、3.2.2.2和3.2.2.3”中提取液的制备方法制备腐败生物检材提取液，经GPC净化系统净化，GC-FPD检测(参见图1-10C、10D、10G、10H、10K、10L)。
四、实验结果：4.1提取溶剂的选择
在溶剂选择方面，血液、肝脏等样品中均含有一定量的油脂、类脂化合物，选择乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者的体积比为1∶1)、正己烷和丙酮的混合溶液(二者的体积比为1∶1)、乙腈、环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液(二者体积比为18∶3)、环己醇和环己酮的混合溶液(二者体积比为1∶6)，异戊醚和丁酸丙酯的混合溶液(二者体积比为1∶2.5)作为提取溶剂，进行添加回收率对比实验。实验发现：采用乙腈、正己烷和丙酮的混合溶液(二者的体积比为1∶1)作为提取溶剂时，匀浆过程中肝脏组织的分散度不够，匀浆所需时间较长；以乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者的体积比为1∶1)或环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液(二者体积比为18∶3)为提取溶剂产生杂质峰比较少，造成的基质干扰影响小；通过回收率实验发现：采用乙腈提取的回收率最低，采用环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液(二者体积比为18∶3)、环己醇和环己酮的混合溶液(二者体积比为1∶6)、异戊醚和丁酸丙酯的混合溶液为提取溶剂时的回收率依次升高。本实施例采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者的体积比为1∶1)为提取溶剂，操作步骤简单，基质干扰小，回收率数据也比较理想。
4.2凝胶渗透色谱的检测波长的选择：为了满足分离杂质和农药的需要，利用全波段UV-可见分析仪器进行检测，找出有机磷农药的最大吸收波长，经过反复试验，发现在254nm时，8种有机磷农药都有较大的吸收，能满足检测的要求，所以把凝胶渗透色谱检测波长定为254nm。
4.3凝胶色谱流动相的选择：为确保有机磷农药和杂质能够最大程度的分离，而且分析周期短，且不干扰有机磷农药和杂质分离的检测，发现乙酸乙酯和环己烷在254nm时吸收较小，分别对乙酸乙酯和环己烷的体积比做了多种配比试验，结果表明当乙酸乙酯和环己烷的体积比为1∶1作为流动相时，能满足上述要求，基线平直，分离效果较好。
4.4、GPC净化系统的净化效果：4.4.1、空白血液、空白尿液、空白肝组织，以及添加8种有机磷农药的空白血液、空白尿液、空白肝组织的净化效果：待测液2用GC-FPD测定，色谱图见图1-1；待测液3用GC-FPD测定，色谱图见图1-2；待测液4用GC-FPD测定，色谱图见图1-3。8种有机磷标准品色谱图见图1-4。待测液5用GC-FPD测定，色谱图见图1-5；待测液6用GC-FPD测定，色谱图见图1-6；待测液7用GC-FPD测定，色谱图见图1-7。
4.4.2腐败血液、腐败尿液、腐败肝组织以及腐败生物检材中添加有机磷农药的净化效果，GC-FPD色谱图参见图1-8A～图1-8M以及图1-10A～图1-10L。在本实施例中，为便于更好地对添加中有机磷标准品进行定性定量分析，将8种有机磷农药混合标准品分为两组进行添加，其中有机磷农药混合标准品溶液一和有机磷农药混合标准品溶液二的标准色谱图见图1-9A和图1-9B。本实施例中采用FPD检测器进行分析检测，FPD检测器是用于测定含硫、磷化合物的选择性检测器，它在富氢条件下燃烧促使一些物质产生化学发光、生成激发态的硫、磷化合物碎片，再通过信号放大取得数据。由图1-8A～图1-8M以及图1-10A～图1-10L中可以看出：经过GPC净化系统净化后，可以除去一些明显的干扰，样品在经FPD检测后，目标物质峰更容易检测。这表明了凝胶渗透色谱起到了对样品中含硫和含磷化合物的净化作用，降低了试验中的干扰，使待测样品取得了较为理想的净化效果。
4.4.3、空白血液、尿液、肝脏样品的GPC流出规律
将待测液2、3和4分别进GC-FPD检测出各段流出液杂质的含量，结果见图1-11、1-12和1-13。空白血液提取液中的杂质(油脂、色素、蛋白质等)在凝胶渗透色谱柱上是在第5min～11min时流出，而在7min～10min流出75％的杂质。空白尿液提取液中的杂质(色素、蛋白质等)在凝胶渗透色谱柱上是在第5min～11min时流出，而在7min～10min流出75％的杂质。空白肝脏提取液中的杂质(油脂、色素、蛋白质等)在凝胶渗透色谱柱上是在第5min～14min时流出，而在7min～11min流出75％的杂质。
4.4.4、8种有机磷农药的GPC流出规律：分别将浓度为50μg/mL的8种有机磷农药单标(乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷的标准溶液)5mL进样GPC净化系统【采用环己烷-乙酸乙酯(50∶50，v/v)复溶混匀，定容至8mL后进样】，进样量为5mL，采用环己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v)作为流动相进行淋洗，流量为4.7mL/min，检测波长为254nm，记录每种农药的色谱参数。8种有机磷农药单标GPC色谱图见图1-14A～1-14H。将待测液1用GC-FPD检测出各段流出液中有机磷农药的含量，结果见图1-15所示。从图1-15中看出，8种有机磷农药在凝胶渗透色谱柱上都是在第8min～15min时流出。在样品过凝胶渗透色谱柱净化时，为了最大限度的去除油脂和其他色素、蛋白质等大分子的干扰，而且对血液、尿液、肝脏等样品中的有机磷农药有较高的回收，只需收集9min～15min流出液，回收率在60.2～96.2％。对比实验表明：仅采用SPE柱或相应SPE的组合柱或氧化铝小柱很难将血液、尿液和肝组织中的脂肪除净，而在发明中采用合适的提取溶剂以及GPC净化系统净化已经可以满足仪器对血液、尿液和肝组织净化条件的要求；GPC净化系统净化后不需要再采用SPE柱净化，降低了实验成本，而且还能够避免个别目标检测物回收率的损失。另外，GPC净化系统净化是一种“纯物理”的净化方式，不会受到各种目标检测物化学性质的影响，非常适合性质差异很大、相对分子质量相差不大的各类有机磷农药共同净化。
4.4.5、8种有机磷农药的标准工作曲线和检出限
分别移取乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷的标准储备液，用甲醇依次稀释终浓度范围在100～5000ng/mL，按照GC-FPD仪器条件对标准品进行分析，用目标物的峰面积(Y)对标准浓度(X)进行线性回归，从而得到一系列的标准工作曲线，见表1-3。在此色谱条件下，以信噪比S/N＝3计，计算得到检出限。8种有机磷农药在100～5000ng/mL浓度范围内均有良好的线性关系。
表1-3 8种有机磷农药的标准工作曲线和最小检出限
4.4.6、8种有机磷农药的添加回收率：GPC净化系统净化乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷的浓度分别为1.0、0.5、0.1μg/mL的添加血液、添加尿液以及浓度为1.0、0.5、0.1μg/g的添加肝组织，GC-FPD测定，添加回收率见表1-4、1-5和1-6。从表中可以看出：采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液(二者的体积比为1∶1)为提取溶剂，并采用凝胶渗透色谱净化8种有机磷农药的回收率均在65％以上，且精密度(RSD)小于10％。
表1-4 血液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-5 尿液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-6 肝脏中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
4.4.7、8种有机磷农药的方法线性范围与提取检测限
取空白血液1mL、尿液1mL、肝组织1g，分别添加乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷，浓度范围在100-5000ng/mL，分别参照“三、实验方法中3.2.1.1、3.2.1.2和3.2.1.3”中提取液的制备方法制备相应的提取液，经GPC净化系统净化，100μL甲醇定容，GC-FPD分析检测，建立5个点，以药物浓度为横坐标，样品峰面积比为纵坐标得到线性回归方程。由此可见，GPC净化后GC-FPD检测8种有机磷农药在100-5000ng/mL范围内线性良好，分别见表1-7、1-8和1-9。取空白血1mL、空白尿1mL、肝组织1g，分别添加乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷的浓度范围在10～100ng/mL，分别参照“三、实验方法中3.2.1.1、3.2.1.2和3.2.1.3”中提取液的制备方法制备相应的提取液，经GPC净化系统净化，经检测，得GC-FPD和GC-MS分析最低提取检测限(S/N＝3/1)分别如表1-7、1-8和1-9所示。
表1-7 血液中添加8种有机磷农药的方法线性方程和最小检出限
表1-8 尿液中添加8种有机磷农药的方法线性方程和最小检出限
表1-9 肝组织中添加8种有机磷农药的方法线性方程和最小检出限
实施例2：本实施例与实施例1的区别在于：提取溶剂(即有机溶剂A)为环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液，其中环庚烷和乙二醇二乙醚的体积比为18∶3；其余实验条件均相同；以环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液作为提取溶剂时，8种有机磷农药的添加回收率和精密度如表1-10～1-12所示。
表1-10 血液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-11 尿液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-12 肝脏中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
从表1-10～1-11中可以看出，以环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液作为提起溶剂，采用凝胶渗透色谱净化8种有机磷农药的回收率均在70％以上，且精密度(RSD)小于等于6％。
实施例3：本实施例与实施例1的区别在于：提取溶剂(即有机溶剂A)为异戊醚和丁酸丙酯的混合溶液，其中异戊醚和丁酸丙酯的体积比为1∶2.5；其余实验条件均相同；以异戊醚和丁酸丙酯的混合溶液作为提取溶剂时，8种有机磷农药的添加回收率和精密度如表1-13～1-15所示。
表1-13 血液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-14 尿液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-15 肝脏中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
从表1-13～1-15中可以看出，以异戊醚和丁酸丙酯的混合溶液作为提起溶剂，采用凝胶渗透色谱净化8种有机磷农药的回收率均在80％以上，且精密度(RSD)小于等于6％。
实施例4：本实施例与实施例1的区别在于：提取溶剂(即有机溶剂A)为环己醇和环己酮的混合溶液，其中环己醇和环己酮的体积比为1∶6；其余实验条件均相同；以环己醇和环己酮的混合溶液作为提取溶剂时，8种有机磷农药的添加回收率和精密度如表1-16～1-18所示。
表1-16 血液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-17 尿液中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
表1-18 肝脏中8种有机磷农药经GPC净化后的添加回收率和精密度
从表1-16～1-18中可以看出，以环己醇和环己酮的混合溶液作为提起溶剂，采用凝胶渗透色谱净化8种有机磷农药的回收率均在90％以上，且精密度(RSD)小于等于6％。
Claims (3)
1.利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将含有有机磷农药的生物检材加入到离心管中，混匀振荡，放置，向离心管中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液、正己烷和丙酮的混合溶液、乙腈、环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液、环己醇和环己酮的混合溶液或异戊醚和丁酸丙酯的混合溶液，振荡，离心，分离有机相，再向离心管中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液、正己烷和丙酮的混合溶液、乙腈或环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液，振荡，离心，分离有机相，合并两次获得的有机相，置于浓缩仪上浓缩至干，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液溶解，过有机微孔滤膜，得到提取液；
(2)提取液进凝胶渗透色谱净化柱，用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液淋洗，收集淋洗液，在浓缩仪上吹干，色谱纯甲醇溶解后得到待测液；
凝胶渗透色谱条件：凝胶渗透色谱净化柱：300mm×20mm，凝胶渗透色谱净化柱的填充相为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，流动相：乙酸乙酯和环己烷的混合溶液，流速：4.7mL/min，进样量：5mL，检测波长为254nm，开始收集时间：9min，结束收集时间：15min，在线浓缩温度和真空度：1区：40℃、30.0KPa，2区：50℃、25.0KPa，3区：50℃、22.0KPa；
(3)利用带火焰光度检测器的气相色谱仪对待测液进行检测，气相色谱条件：30m×0.25mm×0.25μm的DB-5石英毛细管柱，载气为纯度为99.99％的氮气，流量1.0mL/min，柱温：120℃保持1min、然后以每分钟8℃升温到260℃、保持1min、再以每分钟30℃升温到280℃、保持3min；进样口温度260℃，分流进样，火焰光度检测器温度300℃；
并利用气相色谱仪-质谱联用仪进行有机磷农药的确证，气相色谱-质谱联用仪条件：30m×0.25mm×0.25μm的DB-5MS毛细管柱，载气为纯度为99.99％的氮气，流量1.0mL/min，柱温：100℃保持2min、然后以每分钟30℃升温到280℃、保持17min；传输线温度230℃；进样口温度250℃，分流进样；质谱条件：EI电离源，电子能量70eV，离子源温度200℃；调谐方式为自动调谐，倍增电压1.1kV，发射电流100μA；全扫描定性分析，扫描起始时间3min，扫描范围40amu～450amu。
2.根据权利要求1所述的利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法，其特征在于，在步骤(1)中，生物检材为血液、尿液或肝组织，有机磷农药为乐果、氧乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、倍硫磷和乙拌磷中的一种或多种；有机微孔滤膜的孔径为0.35～0.55μm。
3.根据权利要求1所述的利用凝胶渗透色谱处理生物检材的有机磷农药检验方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(2)中：乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中乙酸乙酯和环己烷体积比为1∶1；在步骤(1)中：正己烷和丙酮的混合溶液中正己烷和丙酮的体积比为1∶1，环庚烷和乙二醇二乙醚的混合溶液中环庚烷和乙二醇二乙醚的体积比为18∶3，环己醇和环己酮的体积比为1∶6，异戊醚和丁酸丙酯的体积比为1∶2.5。
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