CN103554220A - 一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，动物类药材制取方法领域。取珍珠母生品，加入蒸馏水，加热回流提取，滤过，滤液闪蒸浓缩至适量后，冻干成粉，即得珍珠母生品冻干粉。将其冻干粉经Sephadex LH-20和反相硅胶C8的两次柱层析的分离纯化及高效液相色谱的进一步纯化得到一个单体寡肽化合物。经现代质谱技术和肽键裂解规律得到分子量为302的寡肽。为首次从珍珠母中分离得到。本发明的珍珠母寡肽具有一定的抗氧化活性，并对珍珠母炮制前后抗氧化性和其所含的总肽及含糖量进行了测定，结果显示珍珠母炮制品的抗氧化活性强于生品，是生品抗氧化性的七倍。具有广泛推广的意义。
Description
技术领域
本发明属于动物类药材制取方法领域，特别是涉及到一种珍珠母炮制前后寡肽分离纯化的方法。
背景技术
动物药是我国医药学的重要组成部分，自古以来就广泛用于防病治病。早在3250到3350年前甲骨文就记载有动物药。《山海经》记载动物药58种，汉代《神农本草经》记载动物药67种，明代《本草纲目》记载440种，《本草纲目拾遗》又增收动物药160种，历代本草中的动物药总数已达600多种，最多收载动物药《中药大辞典》达740种之多。在我国数千年的发展过程中，我们的祖先在同疾病的斗争中，积累了极其丰富的利用动物药防病治病的经验。从动物药中寻找生理活性成分，经广泛的药理筛选和研究开发成新药，可以大大缩短新药开发的周期，降低成本，从而扩大药源。
珍珠母为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteriamartensii(Dunker)的贝壳，为常用中药。主要分布于我国江苏、浙江、湖北、安徽等地。本品始载于《开宝本草》“真珠”项下。现收载于《中国药典》2010版一部，具有平肝潜阳，定惊明目，用于头痛眩晕，烦躁失眠，肝热目赤，肝虚目昏。搜集国内外文献可知，国内外学者主要对珍珠母的微结构和晶体的形成做了研究，对其文石和方解石的研究比较多，但对珍珠母中的化学成分研究并不深入。据国内有关珍珠母化学成分的报道，珍珠母的主要成分是碳酸钙，含有少量的微量元素和氨基酸等，对其化学成分研究还不完全，对其活性方面的研究也鲜见报道，这无疑阻碍珍珠母的进一步开发和利用。因此，为了能够更好的应用珍珠母动物药资源，阐明其药效的化学依据，有必要对其化学成分和活性进行系统的研究。经过实验研究，基本确定了珍珠母中含有寡肽类化学成分，而寡肽类化学成分正是当今社会上的研究热点，本发明把研究珍珠母中寡肽类化学成分及其活性作为主要研究内容。据文献报道，珍珠母的应用多为炮制品，但珍珠母炮制前后在化学成分上，特别是有效成分上的变化，却少有报道。所以本发明对珍珠母炮制前后的活性及相应活性成分的变化做了对比分析，从而确定珍珠母炮制前后的有效成分的变化，阐述珍珠母炮制的意义。
2011年2月15日出版的《食品科学》中“合浦珠母贝肉寡肽的制备及其抗氧化活性研究”一文详细阐述了现有技术当中以合浦珠母贝肉为原料,通过酶解技术及超滤、凝胶层析、反相高效液相色谱等分离纯化技术制备具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉寡肽。同时也说明了现有技术当中存在的局限性。
珍珠母与珍珠来源于同一动物，其成分极其相似，功效相同，炮制方法也相同。但珍珠价格昂贵，用它做药源成本太高。珍珠母是一种廉价易得的药材。据报道珍珠母与珍珠在有效成分上是相同的，我们可以用珍珠母代替珍珠作为中药使用，从而节约成本，扩大药源。本发明对珍珠母中寡肽类化学成分进行了分离纯化和抗氧化活性研究，为今后充分利用及合理开发珍珠母动物药资源提供了一定的科学依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种珍珠母炮制前后寡肽分离纯化的方法。
一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征在于：
步骤一、取珍珠母超微粉100目～200目生品，即准备用来进行炮制的样品，加入蒸馏水,分数比为超微粉：蒸馏水=1:10，加热至90℃回流提取，滤过，滤液闪蒸浓缩至浓度为65%后，冻干成粉，得到炮制后的珍珠母生品冻干粉；
步骤二、将珍珠母生品冻干粉进行SephadexLH-20凝胶柱分离，检测得到30个流分；分别对30个流分进行薄层分析，分析结果为流分Fr.5～Fr.13的薄层显色是相同的，将薄层显色相同的流分Fr.5～Fr.13合并，将合并后的流分冻干成粉；
步骤三、将步骤二中得到的冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作，并采用自动流分收集器收集，收集到波长为220nm、流速为3mL/min、5mL/管的自动接样流分，总共收集到55个流分，色谱图显示有三个一样高的小峰，对该三个一样高的小峰进行薄层分析，分析结果显示为阳性的流分与色谱图相对应，为Pe-30～Pe-35，将Pe-30～Pe-35的流分合并，并将合并后的流分冻干成粉；
步骤四、对步骤三中得到的冻干粉通过反相HPLC色谱分离系统进一步分离纯化,以1‰甲酸乙腈洗脱，选用VenusilASB-C18反相柱，在210nm下检测，经反相HPLC色谱分离，选取时间为5.940min时的色谱峰，该色谱峰为寡肽1即得到珍珠母寡肽1，收集并保留寡肽1样品，将寡肽1样品冷冻干燥，得到寡肽1冻干粉；
步骤五、为了鉴定珍珠母寡肽1的结构，将步骤四中制得的珍珠母寡肽1冻干品用甲醇溶解后过膜，将过膜后的珍珠母寡肽1放进液质联用仪内，通过一级质谱图和二级质谱图及肽类裂解规律得出该寡肽1分子量为302，系由丙氨酸、缬氨酸和天冬酰胺三个氨基酸组成的三肽，化学式为H2N-Ala-Val-Asn-COOH，这是首次从珍珠母中分离得到的。
所述的步骤五中制得的珍珠母寡肽1，对其寡肽类化学成分HPLC-MS(n)进行对比分析，其中珍珠母生品和珍珠母炮制品均有分子量为231、302和373的三个寡肽化合物，其化学式为COOH-Asn-Val-NH2、COOH-Asn-Val-Ala-NH2、COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2，其中珍珠母炮制品中分子量为217，化学式为COOH-Lys-Ala-NH2，在对珍珠母炮制过程中高温使肽键断裂，由于热震荡致使分子中的二肽消失。
所述的步骤四中VenusilASB-C18反相柱的柱温为30℃。
所述的步骤三中冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作，在冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作前采用10%的甲醇-水系统溶解过膜。
所述的步骤二中分别对30个流分进行薄层分析，该薄层分析采用的展开剂比例为正丁醇：乙醇：冰醋酸：水=4：1：1：2，喷茚三酮为显色剂，放入105℃烘箱中烘烤至斑点出现。
所述的步骤一中冻干成粉，得到炮制后的珍珠母生品冻干粉是采用-80℃的冰箱，持续冷冻12个小时。
所述的珍珠母寡肽1采用羟基自由基清除方式，当其浓度为0.3700g/mL时，羟基自由基清除率为76.60%。
所述的珍珠母寡肽1采用双缩脲试剂和苯酚试剂，对其总肽类化学成分含量和含糖量的进行测定，得到总肽含量为0.085%，糖含量为0.0001088%。
所述的对珍珠母寡肽1总肽类化学成分含量和含糖量进行测定，采用紫外分光光度计于540nm下测定，温度为20℃～25℃，时间为15分钟。
所述的羟基自由基清除采用的试剂为邻二氮菲、硫酸亚铁于37℃水浴60min。
通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：本发明是的分离纯化方法是经SephadexLH-20和反相硅胶C8的两次柱层析的分离纯化及高效液相色谱的进一步纯化得到1个单体寡肽化合物，再经现代质谱技术和肽键裂解规律得到分子量为302，化学式为H2N-Ala-Val-Asn-COOH的寡肽。为首次从珍珠母中分离得到。而对比文件是通过酶解技术及超滤、凝胶层析、反相高效液相色谱等分离纯化技术制备。分离纯化方法上有所区别。
在其抗氧化活性方面：本发明对珍珠母炮制前后抗氧化性和其所含的总肽及含糖量进行了测定，结果显示珍珠母炮制品的抗氧化活性强于生品，是生品抗氧化性的七倍，且与炮制品的含肽的种类不同有关，为进一步明确其抗氧化活性的物质基础提供了依据。而对比文件仅对合浦珠母贝的生品分离得到的一些寡肽进行了抗氧化活性的研究。
珍珠母与珍珠来源于同一动物，其成分极其相似，功效相同，炮制方法也相同。但珍珠价格昂贵，用它做药源成本太高。珍珠母是一种廉价易得的药材。据报道珍珠母与珍珠在有效成分上是相同的，我们可以用珍珠母代替珍珠作为中药使用，从而节约成本，扩大药源。本发明对珍珠母中寡肽类化学成分进行了分离纯化和抗氧化活性研究，为今后充分利用及合理开发珍珠母动物药资源提供了一定的科学依据。而对比文件只是对其化学成分和活性进行了研究，这在动物药资源上没有太明显的意义。
本发明采用羟基自由基清除法对珍珠母生品和炮制品总肽类化学成分的抗氧化能力进行了研究，当珍珠母生品和炮制品生药浓度为0.3700g/mL时，生品的清除率为10.96%，炮制品的清除率为76.60%。结果表明，珍珠母生品和炮制品均具有一定的抗氧化能力，炮制品的抗氧化能力明显强于生品。因此，珍珠母炮制品可以作为天然抗氧化剂的应用和开发，并具有一定的价值，这为进一步研究珍珠母抗氧化活性的物质基础指明了方向。
采用双缩脲试剂和苯酚试剂法分别对珍珠母生品和炮制品总肽类化学成分含量和含糖量的进行测定，结果表明,珍珠母生品水提物中总肽含量为0.0895%，糖含量为0.000478%；珍珠母炮制品水提物中总肽含量为0.085%，糖含量为0.0001088%。结果显示珍珠母炮制品的抗氧化活性强于生品，是生品抗氧化能力的七倍。与炮制品的含肽的种类不同有关，为进一步明确其抗氧化活性的物质基础提供了依据，并为今后进一步开发利用珍珠母资源指明了方向。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：
图1为珍珠母生品冻干粉经Sephadex LH-20的各个流分的薄层图。
图2为珍珠母生品中Pe上反相C8柱的色谱图。
图3为珍珠母生品寡肽Op-3的液相图。
图4为珍珠母生品寡肽Op-3的一级质谱图。
图5为珍珠母生品寡肽Op-3的二级质谱图。
图6为珍珠母生品和炮制品的清除率曲线。
图7为牛血清白蛋白的标准曲线。
图8为葡萄糖标准曲线。
图9为珍珠母生品中寡肽类化学成分的总离子流图。
图10为珍珠母炮制品中寡肽类化学成分的总离子流图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1珍珠母生品和炮制品中寡肽类化学成分的提取的制备
称取珍珠母生品1Kg～3Kg，加入蒸馏水3L～10L，加热回流提取两次，每次两小时，滤过，合并滤液，闪蒸浓缩至适量后，置200mL冻干瓶中于-80℃冰箱中，冷冻12小时，冻干成粉，即得珍珠母生品冻干粉。
珍珠母炮制品中寡肽类化学成分制备方法同上，即得珍珠母炮制品的冻干粉。
实施例2凝胶色谱法对珍珠母寡肽化学成分的分离
取珍珠母生品冻干粉粉末50mg，加水溶解，过0.45μｍ水膜，将滤过液上SephadexLH-20凝胶柱，用娃哈哈纯净水洗脱，分别用自动收集器收集，得30个流分点于同一薄层板GF-254上，以正丁醇：乙醇：冰醋酸：水(4：1：1：2)为展开剂展开，喷茚三酮显色剂，放入105℃烘箱中烘烤至斑点出现，看出流分Fr.5～Fr.13的薄层显色是相同的，且茚三酮显色成阳性，合并，冻干成粉，命名为Pe。
实施例3反相硅胶C8柱色谱对Pe的纯化
将从凝胶柱分离下来命名为Pe的肽类化学成分冻干粉，用10%的甲醇-水系统溶解过膜，上C8反相柱，洗脱，自动流分收集器收集。波长220nm，流速3，自动接样流分5mL/管，得55个流分。色谱图上显示了三个高度基本相同的小峰。将其流分点于同一薄层板上，显色后，显阳性的流分与色谱图相对应，为Pe-30～Pe-35，将其合并，冻干成粉，命名为Op。
实施例4HPLC对Op的纯化
色谱条件：
流动相：1‰甲酸乙腈；1‰甲酸（1：99）
色谱柱：VenusilASB-C18
反相柱（5μm，
，4.6×250mm）
流速：0.6mL/min
检测波长：210nm
进样量：20uL
柱温：30℃
检测图为高效液相图。经薄层层析鉴定及液质指认为分子量为302，化学式为COOH-Asn-Val-Ala-NH2的寡肽类化合物。
实施例5珍珠母生品和炮制品总肽类化学成分供试液羟基自由基的抗氧化能力的测定
取0.80mmol/L邻二氮菲1mL于试管中依次加入2mLPBS（0.2mol/L，pH7.37）和1mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.75mmol/L硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）1mL，混匀后，加入0.01%双氧水（H2O2）1mL，于37℃水浴60min，在510nm测其吸光度值，所测得的数据为损伤管的吸光度值A（损）。未损伤管以1mL蒸馏水代替损伤管中的1mL0.01%的双氧水（H2O2），操作方法同损伤管，可测得510nm未损伤管的吸光度值A（未）。样品管以已经补足至1mL的样品代替损伤管中的1mL蒸馏水，操作方法损伤管，可测得510nm样品管的吸光度值A（样）。各样品管中加入的溶剂如下：
A(损)：邻（1mL）+PBS(2mL)+H2O（1mL）+FeSO4·7H2O（1mL）+H2O2（1mL）
A(未)：邻（1mL）+PBS(2mL)+H2O（1mL）+FeSO4·7H2O（1mL）+H2O2（1mL）
A(样)：邻（1mL）+PBS(2mL)+样品（1mL）+FeSO4·7H2O（1mL）+H2O2（1mL）
数据处理：羟自由基清除率D（%）=[A(样)-A(损)]/[A(未)-A(损)]×100%
得到珍珠母生品和炮制品的清除率曲线。
实施例6珍珠母生品和炮制品总肽类化学成分含量的测定
精密称取牛血清白蛋白0.14429g至25mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，则标准蛋白浓度为5.7716mg/mL。分别吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL牛血清白蛋白溶液置试管中，用蒸馏水定容至1.2mL，分别向试管中加入双缩脲试剂4mL，振荡混匀，放置室温（20℃～25℃）15分钟后，用紫外分光光度计于540nm下测定，空白相用1.2mL蒸馏水代替样品溶液。经紫外分光光度计测定以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线，回归方程为Y=0.0585X-0.0086。牛血清白蛋白溶液在0.9619mg/mL～5.7714mg/mL的浓度范围内，吸光度与其浓度呈线性关系。
供试品制备：准确称量珍珠母生品冻干粉（炮制品）1.00g置25mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，其浓度为0.04g/mL，精密吸取0.6mL置刻度管中，加蒸馏水补足至1.2mL，由此得到珍珠母生品（炮制品）的供试液。将其按上述方法进行紫外A540测定，珍珠母生品测得的A值为0.1613，炮制品测定的A值为0.1779，代入方程Y=0.0585X-0.0086，其在0.9619mg/mL～5.7714mg/mL的浓度范围内。计算得珍珠母中含有的总肽含量分别为生品中肽含量占0.0895%，即3.485mg；炮制品中肽含量占0.085%，即3.8256mg。
实施例7珍珠母生品和炮制品总糖类化学成分含量的测定
取50mg的葡萄糖，干燥至恒重，置于50mL容量瓶中，用水定容至50mL，摇匀，分别吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀，他们浓度分别为：0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mg/mL，再分别取1mL至具塞试管中，加入5%苯酚1mL，振荡混匀，匀速加入5mL浓硫酸，振荡混匀，至沸水浴保温15分钟，取出立即用冷水冷却至室温。以空白试剂调零，在490nm处测定吸光值，得到标准曲线，线性方程为：Y=7.37X+0.2989。说明葡萄糖浓度在0.02mg/mL～0.10mg/mL之间呈线性关系。
供试品制备：准确称量珍珠母生品（炮制品）冻干粉2.00g置25mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，其浓度为0.08g/mL，精密吸取0.05mL置刻度管中，加蒸馏水补足至1.0mL，由此得到珍珠母生品（炮制品）的供试液。按上述方法进行紫外A490测定，珍珠母生品测得的A值为0.6783，炮制品测定的A值为0.5996，都在0.02mg/mL～0.10mg/mL的浓度范围内。计算得珍珠母糖含量分别为生品中含糖量占0.000478%，即0.002575mg；炮制品中含糖量占0.0001088%，即0.00204mg。
实施例8珍珠母生品中寡肽类化学成分的LC-MS(n)分析
色谱条件
色谱柱：VenusilASB-C18(5μm，
，4.6×250mm)
流动相：1‰甲酸乙腈：1‰甲酸（1：99）
流速：0.3mL/min
柱温：30℃
供试品进样量：10μl
检测时间：20min
质谱条件
电离源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式：正离子检测；扫描范围：m/z50～1200；
干燥气温度：350℃；干燥气流量：11.0L/min；雾化气压强：45.0psi；毛细管电压：4kV。
得到四个峰。分别为峰1：分子量为217，化学式为COOH-Lys-Ala-NH2。峰2：分子量为231，化学式为COOH-Asn-Val-NH2。峰3：分子量为302，化学式为COOH-Asn-Val-Ala-NH2。峰4：分子量为373，化学式为COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2。
实施例9珍珠母炮制品中寡肽类化学成分的LC-MS(n)分析
色谱条件
色谱柱：VenusilASB-C18(5μm，
，4.6×250mm)
流动相：1‰甲酸乙腈：1‰甲酸（1：99）
流速0.3mL/min
柱温：30℃
供试品进样量：10μl
检测时间：20min
质谱条件
电离源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式：正离子检测；扫描范围：m/z50～1200；
干燥气温度：350℃；干燥气流量：11.0L/min；雾化气压强：45.0psi；毛细管电压：4kV。
得到三个峰。分别为峰1：分子量为231，化学式为COOH-Asn-Val-NH2。峰2：分子量为302，化学式为COOH-Asn-Val-Ala-NH2。峰3：分子量为373，化学式为COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2。
Claims (10)
1.一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征在于：
步骤一、取珍珠母超微粉100目～200目生品，即准备用来进行炮制的样品，加入蒸馏水,分数比为超微粉：蒸馏水=1:10，加热至90℃回流提取，滤过，滤液闪蒸浓缩至浓度为65%后，冻干成粉，得到炮制后的珍珠母生品冻干粉；
步骤二、将珍珠母生品冻干粉进行SephadexLH-20凝胶柱分离，检测得到30个流分；分别对30个流分进行薄层分析，分析结果为流分Fr.5～Fr.13的薄层显色是相同的，将薄层显色相同的流分Fr.5～Fr.13合并，将合并后的流分冻干成粉；
步骤三、将步骤二中得到的冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作，并采用自动流分收集器收集，收集到波长为220nm、流速为3mL/min、5mL/管的自动接样流分，总共收集到55个流分，色谱图显示有三个一样高的小峰，对该三个一样高的小峰进行薄层分析，分析结果显示为阳性的流分与色谱图相对应，为Pe-30～Pe-35，将Pe-30～Pe-35的流分合并，并将合并后的流分冻干成粉；
步骤四、对步骤三中得到的冻干粉通过反相HPLC色谱分离系统进一步分离纯化,以1‰甲酸乙腈洗脱，选用VenusilASB-C18反相柱，在210nm下检测，经反相HPLC色谱分离，选取时间为5.940min时的色谱峰，该色谱峰为寡肽1即得到珍珠母寡肽1，收集并保留寡肽1样品，将寡肽1样品冷冻干燥，得到寡肽1冻干粉；
步骤五、为了鉴定珍珠母寡肽1的结构，将步骤四中制得的珍珠母寡肽1冻干品用甲醇溶解后过膜，将过膜后的珍珠母寡肽1放进液质联用仪内，通过一级质谱图和二级质谱图及肽类裂解规律得出该寡肽1分子量为302，系由丙氨酸、缬氨酸和天冬酰胺三个氨基酸组成的三肽，化学式为H2N-Ala-Val-Asn-COOH，这是首次从珍珠母中分离得到的。
2.根据权利要求1所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的步骤五中制得的珍珠母寡肽1，对其寡肽类化学成分HPLC-MS(n)进行对比分析，其中珍珠母生品和珍珠母炮制品均有分子量为231、302和373的三个寡肽化合物，其化学式为COOH-Asn-Val-NH2、COOH-Asn-Val-Ala-NH2、COOH-Asn-Val-Ala-Ala-NH2，其中珍珠母炮制品中分子量为217，化学式为COOH-Lys-Ala-NH2，在对珍珠母炮制过程中高温使肽键断裂，由于热震荡致使分子中的二肽消失。
3.根据权利要求1所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的步骤四中VenusilASB-C18反相柱的柱温为30℃。
4.根据权利要求1所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的步骤三中冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作，在冻干粉上C8反相柱进行洗脱操作前采用10%的甲醇-水系统溶解过膜。
5.根据权利要求1所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的步骤二中分别对30个流分进行薄层分析，该薄层分析采用的展开剂比例为正丁醇：乙醇：冰醋酸：水=4：1：1：2，喷茚三酮为显色剂，放入105℃烘箱中烘烤至斑点出现。
6.根据权利要求1所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的步骤一中冻干成粉，得到炮制后的珍珠母生品冻干粉是采用-80℃的冰箱，持续冷冻12个小时。
7.根据权利要求1所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的珍珠母寡肽1采用羟基自由基清除方式，当其浓度为0.3700g/mL时，羟基自由基清除率为76.60%。
8.根据权利要求1所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的珍珠母寡肽1采用双缩脲试剂和苯酚试剂，对其总肽类化学成分含量和含糖量的进行测定，得到总肽含量为0.085%，糖含量为0.0001088%。
9.根据权利要求8所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的对珍珠母寡肽1总肽类化学成分含量和含糖量进行测定，采用紫外分光光度计于540nm下测定，温度为20℃～25℃，时间为15分钟。
10.根据权利要求7所述的一种珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化方法，其特征是：所述的羟基自由基清除采用的试剂为邻二氮菲、硫酸亚铁于37℃水浴60min。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103554220A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104215590A (zh) * | 2014-08-20 | 2014-12-17 | 青岛贝尔特生物科技有限公司 | 一种低聚肽含量快速检测的方法 |
| CN109283025A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-29 | 苏州太湖美药业有限公司 | 一种珍珠粉中所含多肽种类的检测方法 |
-
2013
- 2013-11-18 CN CN201310581487.2A patent/CN103554220A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李梅: "珍珠母炮制前后寡肽的分离纯化与活性对比研究", 《长春中医药大学 硕士学位论文》 * |
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|---|---|---|---|---|
| CN104215590A (zh) * | 2014-08-20 | 2014-12-17 | 青岛贝尔特生物科技有限公司 | 一种低聚肽含量快速检测的方法 |
| CN109283025A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-29 | 苏州太湖美药业有限公司 | 一种珍珠粉中所含多肽种类的检测方法 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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