CN103551567A - 一种铈纳米颗粒表面修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种铈纳米颗粒（CNPs）表面修饰方法，包括用微乳液法或高温热分解法分别合成了双（2-乙己基）磺基丁二酸包被的铈纳米颗粒及油胺包被的铈纳米颗粒；然后通过化学反应将双磷酸化合物同聚乙二醇共价结合得到修饰配体；最后通过配体交换将修饰配体结合到纳米颗粒表面，得到表面修饰的铈纳米颗粒，该铈纳米颗粒具有分散性好、稳定性高、酶学活性可控等特征。该修饰铈纳米颗粒可用于生物医药、化工等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医药化学领域，具体涉及一种铈纳米颗粒表面修饰方法，具体地说是涉及一种将BP类小分子同PEG共价结合后用于对不同方法合成的CNPs进行表面修饰的方法，特别涉及对微乳液法和高温热分解法合成的CNPs进行表面修饰。
背景技术
铈纳米颗粒，在本发明中将“铈纳米颗粒”又称为“CNPs”，由于其表面Ce3+/Ce4+共存从而表现出类似超氧化物歧化酶（Chem.Commun.2007,1056–1058）、氧化酶（Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,2308–2312）和过氧化氢酶（Chem.Commun.2010,46,2736–2738）的酶学活性，使其在再生医学（J.Mater.Chem.2010,20,8912-8919;Biomaterials2013,34,2194-2201）、清除自由基（Nanoscale2011,3,1411-1420;Chem.Soc.Rev.2010,39,4422-4432）及相关疾病治疗（Nat.Nanotechnol.2006,1,142-150;Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,11039-11043）等方向都具有十分广阔的应用前景。尽管应用前景较好，但现有研究大多致力于CNPs生物学效应研究，而忽略了CNPs表面修饰，因此绝大多数现有研究所使用的CNPs均未经表面修饰（Adv.Funct.Mater.2010,20,1617-162;Biomaterials2012,33,8771-8781;Nano Lett.2005,5,2573-2577;Biomaterials2007,28,1918-1925;ACS Nano2013,7,4855-4868）。
未经表面修饰的纳米颗粒进入体内后很快发生团聚，从而导致纳米颗粒非特异性的吸附生物大分子，由此形成的纳米颗粒-生物大分子复合物很快被体内单核吞噬系统所识别并捕获，纳米颗粒无法到达靶标位点；此外，纳米颗粒团聚还必然使其活性降低。这些局限可严重削弱纳米颗粒的生物利用度，因此对其表面进行适当修饰极为必要。在纳米颗粒表面修饰PEG是提高纳米颗粒稳定性，减少单核吞噬系统捕获纳米颗粒的有效手段之一（Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,1980-1994;Nanomedicine2011,6,715-728），因此过往研究曾尝试在CNPs表面修饰PEG，如A.S.Karakoti（J.Am.Chem.Soc.2009,131,14144-14145）等直接在PEG溶液中合成CNPs，但这种方法会有大尺寸纳米颗粒生成，并且纳米颗粒表面并无可进一步反应的活性功能团，难以进一步同其他功能分子连接，另外该报道未就CNPs在生理条件下的稳定性等进行研究。除此之外，L.Qi（ACS Nano2008,2,879-888）等与A.Cimini（Acta Biomater.2012,8,2056-2067）等也尝试了用小分子作为PEG的锚定基团对CNPs进行PEG化研究，这些研究并未对PEG化后纳米颗粒的稳定性、单核吞噬系统的捕获等进行系统研究，因此其有效性还不能确定；最近C.K.Kim等（Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,11039-11043）将磷脂修饰到PEG上，通过磷脂同CNPs表面原有保护分子油胺之间的疏水性相互作用对纳米颗粒进行PEG化，该研究虽然得到了较为稳定的PEG化的CNPs，但该方法未将纳米颗粒表面原有的油胺去除，油胺为有毒物质，其进入体内后可产生不可预知的毒副作用。
双磷酸（简称“BP”）化合物具有稳定性高，以及容易同钙、铜、铁、铀、镁等金属或金属氧化物能形成二齿甚至是多齿配体的特点（J.Control.Release.2013,167,175–188），目前已有文献报道BP化合物用于铁（Chem.Commun.2008,2553-2555;ACS Nano2013,7,500–512）、磷酸钙（J.Control.Release.2011,150,87–93）等纳米颗粒表面修饰，但尚未见用BP化合物用于CNPs表面修饰的文献报道，更未见用其作为锚定分子对CNPs进行PEG化研究的报道。
针对现有CNPs表面修饰方法存在的局限，本发明用BP化合物作为锚定基团，成功实现了CNPs表面PEG化。本发明所得到的PEG化的CNPs可在生理条件下，即高离子强度、高蛋白质浓度条件下长期稳定，并且PEG化后的CNPs被巨噬细胞识别的几率大大降低。
发明内容
本发明针对未经表面修饰的CNPs容易团聚和非特异性吸附生物大分子的关键问题，提供了一种铈纳米颗粒表面修饰方法。本发明的修饰方法获得的表面修饰CNPs具有分散性好、稳定性高和酶学活性可控等特点，可用于生物医学、能源、化工等领域。
本发明的一种铈纳米颗粒表面修饰方法，包括以下步骤：
1）制备铈纳米颗粒（CNPs）,包括以下方法之一：①微乳液法，将双（2-乙己基）磺基丁二酸（简称“AOT”）溶于甲苯中，在双氧水的存在下与硝酸铈反应，反应后静置过夜分散在甲苯中，得到铈纳米颗粒，简称“MCNPs”，其粒径为3-5nm；②高温热分解法，将硝酸铈溶于油胺和1-十八烯中，在氩气保护下加热回流反应，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液（60-100mL），离心分离沉淀，然后将沉淀分散在正己烷中得到粒径为3-5nm的铈纳米颗粒，简称“TCNPs”；
2)制备纳米颗粒表面修饰配体：将式I所示的PEG、1乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在二氯甲烷中反应，然后旋蒸除掉二氯甲烷，然后加入将式II所示的BP化合物和碳酸钠的水溶液，室温反应得到纳米颗粒表面修饰配体，简称“BP-PEG”，
式I中，R1、R2可以相同也可以不同的独立代表-OH、-COOH或-NH2，其重均分子量为200-10000；式II中，R3代表H、-OH、-CH3，R4代表-(CH2)nNH2、-(CH2)nOH、-(CH2)nCOOH，n=1～5；
（3）纳米颗粒表面配体交换：将MCNPs分散于甲苯中或将TCNPs分散于四氢呋喃中，然后加入含有碳酸钠和BP-PEG的溶液、混合，在60-100℃条件下搅拌12-24h，冷却至室温后离心分层，取水层用氯仿萃取三次，向水层加入丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24-48h，得到表面PEG修饰的铈纳米颗粒，分别简称为“MCNPs-BP-PEG”或“TCNPs-BP-PEG”。
术语，MCNPs代表微乳液法制备的铈纳米颗粒，即由AOT包被的铈纳米颗粒；TCNPs代表由高温热分解法制备的铈纳米颗粒，即由油酸包被的铈纳米颗粒；MCNPs-BP-PEG代表由微乳液法制备的铈纳米颗粒，其表面经双磷酸PEG修饰的铈纳米颗粒；TCNPs-BP-PEG代表由高温热分解法制备的铈纳米颗粒，其表面经双磷酸PEG修饰的铈纳米颗粒；
在一具体实施方案中，一种铈纳米颗粒表面修饰方法，包括以下步骤：
（1）铈纳米颗粒的制备，选自下列方法之一，①微乳液法，将双（2-乙己基）磺基丁二酸（AOT）溶于50mL甲苯后加入硝酸铈，搅拌45min后用蠕动泵以1-5r/min的速度将双氧水（30%）滴加到上述溶液，室温反应0.45-1h后静置过夜后分散在甲苯中得到MCNPs，其粒径为3-5nm；②高温热分解法，将硝酸铈溶于70%的油胺和90%的1-十八烯中，搅拌混匀后3min内升温至80℃，氩气保护下反应20-40min，在冷凝回流及通氩气条件下8min内升温至260℃反应1-3h，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液（60-100mL），离心分离沉淀后用相同溶液清洗多次，最后将其分散在正己烷中得到粒径为3-5nm的TCNPs，分散于四氢呋喃中用于下步配体交换反应；
（2）纳米颗粒表面修饰配体的合成：将式I所示的PEG、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于2-4mL二氯甲烷中，室温反应4-8h后旋蒸除掉二氯甲烷；然后将II所示的BP化合物和碳酸钠溶入4mL水溶液后加入到上述产物中，室温反应12-24h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG；
式I中，R1、R2可以相同也可以不同的独立代表-OH、-COOH或-NH2，其重均分子量为200-10000；式II中，R3代表H、-OH、-CH3，R4代表-(CH2)nNH2、-(CH2)nOH、-(CH2)nCOOH，n=1～5；
（3）纳米颗粒的表面配体交换，包括：①将碳酸钠加入4mL BP-PEG溶液中，取8-16mL步骤（1）的MCNPs甲苯分散液或TCNPs四氢呋喃分散液与其混合，密闭温度在60-100℃条件下搅拌12-24h，冷却至室温后离心分层，取水层用10-20mL氯仿萃取三次，向水层加入20-50mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24-48h，得到表面PEG修饰后的铈纳米颗粒MCNPs-BP-PEG或②TCNPs-BP-PEG。
在上述具体实施方案中，本发明的铈纳米颗粒表面修饰方法，步骤（1）所述微乳液法合成CNPs时AOT用量为0.75-1.5g、硝酸铈用量为2.5mL（0.1mol/L）、双氧水用量为4-6mL；所述高温分解法合成CNPs时硝酸铈用量为0.434g、油胺用量为0.800-1.00g、1-十八稀用量为3-5g；所述丙酮-无水乙醇混合液中丙酮与无水乙醇体积比为1:1-0.25。
在上述具体实施方案中，本发明的铈纳米颗粒表面修饰方法，步骤（2）所述碳酸钠用量为50mg；所述R-PEG-R:EDC·HCl:NHS:BP摩尔比为2-5:2-4:2-4:1-2；步骤（3）所述MCNPs和TCNPs浓度均为0.5-1.0mg/mL；所述配体交换反应体系中水相与有机相的体积比为1:1-3；步骤（1）、（2）、（3）中所述室温范围为10-30℃。
在上述本发明的铈纳米颗粒表面修饰方法中，所述双磷酸化合物选自阿仑膦酸、帕米膦酸和奈立膦酸或它们的钠盐，所述式I的PEG为PEG二羧酸（如式III的HOOC-PEG-COOH），其重均分子量为600－2000。
与现有CNPs表面修饰技术相比，本发明有着极大的原创性和显著的技术进步，具体表现为：纳米颗粒稳定性大幅提高，本发明制备的MCNPs-BP-PEG和TCNPs-BP-PEG可在生理条件下稳定30天以上；纳米颗粒催化活性大幅增强，本发明制备的MCNPs-BP-PEG清除活性氧自由基的能力及催化氧化能力远远高于未修饰的MCNPs，并可通过表面修饰的PEG链长度实现酶学活性的强弱控制；纳米颗粒与生物大分子间非特异性相互作用大幅降低，具体表现为MCNPs-BP-PEG和TCNPs-BP-PEG的巨噬细胞吞噬量明显降低。这类表面修饰后的CNPs可在生物医学、能源、化工等方面发挥重要作用。
附图说明
图1本发明方法中的CNPs表面配体交换示意图；
图2按本发明所述制备的修饰前后CNPs TEM照片；
图3按本发明所述制备的CNPs XRD谱图；
图4按本发明所述制备的修饰前后CNPs红外谱图；
图5按本发明所述制备的修饰后CNPs热重曲线；
图6按本发明所述制备的修饰前后CNPs XPS元素分析谱图；
图7按本发明所述制备的修饰后CNPs稳定性分析图；
图8按本发明所述制备的修饰后CNPs模拟氧化酶活性分析图；
图9按本发明所述制备的修饰后CNPs模拟超氧化物岐化酶活性分析图；
图10按本发明所述制备的CNPs抑制巨噬细胞吞噬分析图。
具体实施方式
以下实施例对本发明做进一步详细说明，但并不能限制本发明的范围，在本发明的构思前提下，对本发明修饰方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1MCNPs-BP-PEG600的合成（其中BP为阿仑膦酸钠、PEG600为分子量为600的PEG二羧酸）
（1）MCNPs的合成：将0.75g AOT溶于50mL甲苯后加入2.5mL浓度为0.1mol/L的硝酸铈，搅拌45min后用蠕动泵以5r/min的速度将双氧水（30%）滴加到上述溶液，室温反应45min后静置过夜后得到分散在甲苯中的MCNPs，其直径为3-5nm；
（2）BP-PEG600的合成：将147mg PEG二羧酸、30mg EDC·HCl和15mg NHS溶于2mL二氯甲烷中，室温反应6h后旋蒸除掉二氯甲烷；将20mg阿仑膦酸钠三水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应12h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG600；
（3）MCNPs-BP-PEG600的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG600溶液中，取8mL第（1）步合成的MCNPs(Ce浓度为0.70mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用10mL氯仿萃取三次，向水层加入20mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24h，得到表面修饰后的纳米颗粒MCNPs-BP-PEG600，可根据需要将MCNPs-BP-PEG600颗粒冻干成固体。
为了更好地理解反应过程，将配体交换及阿伦磷酸钠中双磷酸基团与MCNPs表面结合画出示意图表示，见图1。
采用透射电镜拍照测试未经修饰和经修饰颗粒大小和它们的分散性，结果见图2中的a和b，图2(a)显示未修饰的MCNPs在水相中严重团聚从而形成大颗粒，图2（b）显示经修饰的MCNPs-BP-PEG600具有良好的分散性，粒径大小为3-5nm。
将制得的MCNPs颗粒经冻干成固体后，以铜靶为射线源测定其X射线衍射图（XRD），结果见图3（a），其峰型宽且平，表面呈现粗糙多孔结构。
分别对相应的材料进行了红外（IR）及热重(GA）分析测试,结果分别见图4及图5，图4中的（a）、（b）、（c）、（e）及图5中的（f）、（g）、（e）、（a）分别表示阿仑膦酸钠,单一阿伦磷酸修饰后的CNPs,MCNPs-BP-PEG600,分子量为600的PEG二羧酸的红外（IR）及热重（TGA）曲线，IR分析表明MCNPs-BP-PEG600具有PEG二羧酸在846cm-1，952cm-1，1250cm-1，1352cm-1，2870cm-1处特征峰，TGA分析MCNPs-BP-PEG600表面BP-PEG600配体含量为51.7%。
同时，对修饰前后铈纳米颗粒进行了相应的XPS元素分析测试,结果见图6，TCNPs,TCNPs-BP-PEG600的X PS元素分析测试[见图6(f)，图6(d)]表明后者表面有磷元素（P）存在而前者并无P存在，说明在MCNPs表面成功实现了基于阿仑膦酸钠分子的PEG化修饰。
稳定性测试：将表面修饰后的铈纳米颗粒分别放入PBS、PBS+10%FBS溶液中，分别在1、2、3、4、5、6、14、21、30天用激光粒度仪(DLS)测试其粒径大小变化，结果见图7。图7说明MCNPs-BP-PEG600分别在PBS、PBS+10%FBS中的稳定性超过一个月，说明PEG化后的CNPs具有优良的稳定性。
酶学活性活性测试：
模拟氧化酶活性测试方法：通过不同铈纳米颗粒氧化底物(过氧化氢酶试剂盒的底物，碧云天)后的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-benzoquinonemonoimine)在520nm出的吸光度值变化，从而实现其模拟氧化酶酶学活性强弱分析.具体方法如下：取500mg/L修饰前后铈纳米颗粒150uL分别与50uL底物混合后于一小时内每3min对520nm处吸光度值进行测定，结果见图8。模拟超氧化物歧化酶活性测试方法：通过铈纳米颗粒抑制氧自由基(核黄素/光催化体系产生)对氯化硝基四氮唑蓝显色反应程度，分别对修饰前后的铈纳米颗粒模拟超氧化物歧化酶酶学活性进行分析测试，具体测试方法如下：取200ul0.1mol/L EDTA，75ul2.0mmol/L NBT，2.9mL磷酸缓冲液（10mmol/L,pH7.8）在37℃震荡5min后加入50uL1.2mmol/L核黄素配成检测液，浓度为0、2、5、50mg/L修饰前后铈纳米颗粒50uL分别与100uL以上检测液混匀后用27W荧光灯照射2min，根据560nm测定的吸光度值计算出其抑制百分率，结果见图9。图8及图9显示MCNPs-BP-PEG600相对于MCNPs具有更为优越的氧化酶、超氧化物歧化酶酶学活性；
巨噬细胞吞噬试验方法：将巨噬细胞RAW264.7接种于24孔板中，每孔细胞数量为20×104个，培养基为DMEM高糖，在37℃及5%CO2条件下培养24h后用PBS清洗一次，将纳米颗粒以0.1mg/mL的浓度加入细胞中，4h后用PBS清洗3次，向细胞中加入280μL浓硫酸，在60℃条件下裂解细胞和纳米颗粒，最后用ICP-MS测定细胞内铈的浓度，实验结果见图10，图10显示MCNPs-BP-PEG600比MCNPs及单一阿伦磷酸修饰后的CNPs更能避免巨噬细胞的吞噬，因此具有良好的生物学相容性及分散稳定性。
实施例2TCNPs-BP-PEG600的制备（其中BP为阿仑膦酸钠、PEG600为分子量为600的PEG二羧酸）
（1）将0.434g硝酸铈溶于0.802g油胺（70%）和4.0g1-十八烯（90%）中，搅拌混匀后3min内升温至80℃，氩气保护下反应30min，在冷凝回流及通氩气条件下8min内升温至260℃反应2h，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液（80mL），离心分离沉淀后用相同溶液清洗多次，最后将其分散在正己烷中得到直径为3-5nm的TCNPs，用时用丙酮沉淀后分散于四氢呋喃中用于配体交换反应；
（2）BP-PEG600的合成：将147mg PEG二羧酸、30mg EDC·HCl和15mg NHS溶于2mL二氯甲烷中，室温反应6h后旋蒸除掉二氯甲烷；将20mg阿仑膦酸钠三水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应12h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG600；
（3）TCNPs-BP-PEG600的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG600溶液中，取8mL第（1）步合成的TCNPs(Ce浓度为0.6mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用10mL氯仿萃取三次，向水层加入20mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24h，得到表面修饰后的纳米颗粒TCNPs-BP-PEG600。
TEM照片显示TCNPs在正己烷中分散性良好，见图2（c），配体交换得到的TCNPs-BP-PEG600在水相具有良好的分散性，粒径大小均为3-5nm，见图2（d）；将制备得到的TCNPs进行XRD测试，得到XRD图谱，见图3（b），与标准晶型（JCPDS card no.34-0394）具有高的吻合度；测试TCNPs-BP-PEG600的红外（IR），结果见图4（d），IR分析表明TCNPs-BP-PEG600具有PEG二羧酸在846cm-1,952cm-1,1250cm-1,1352cm-1,2870cm-1处特征峰；TCNPs-BP-PEG600热重分析[见图5(d)]表明其表面有PEG配体存在，且计算其表面BP-PEG600配体含量为64.2%；高于MCNPs-BP-PEG600；TCNPs,TCNPs-BP-PEG600的X PS元素分析[见图6(e)，图6(c)]发现后者表面有P元素存在而前者无P存在，上述说明在TCNPs表面成功实现了基于阿伦磷酸钠分子的PEG化修饰。
将TCNPs-BP-PEG600分别在高盐（PBS）、高盐+血清（PBS+10%FBS）中存放一个月以上，测定其粒径的变化（见图7），结果表明其稳定性超过一个月，说明PEG化后的铈纳米颗粒具有优良的稳定性；TCNPs-BP-PEG600的氧化酶、超氧化物歧化酶酶学活性相对MCNPs-BP-PEG600来说不是很明显（见图8、图9）；TCNPs-BP-PEG600能有效避免巨噬细胞的吞噬（见图10），因此具有良好的生物学相容性及分散稳定性。
实施例3MCNPs-BP-PEG2000的合成（其中BP为阿仑膦酸钠、PEG2000为分子量为2000的PEG二羧酸）
（1）MCNPs的合成：将0.75g AOT溶于50mL甲苯后加入2.5mL浓度为0.1mol/L的硝酸铈，搅拌45min后用蠕动泵以5r/min的速度将双氧水（30%）滴加到上述溶液，室温反应45min后静置过夜后得到分散在甲苯中的MCNPs，其直径为3-5nm；
（2）BP-PEG2000的合成：将392mg PEG二羧酸、40mg EDC·HCl和20mg NHS溶于4mL二氯甲烷中，室温反应8h后旋蒸除掉二氯甲烷；将40mg阿仑膦酸钠三水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应24h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG2000；
（3）MCNPs-BP-PEG2000的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG2000溶液中，取8mL第（1）步合成的MCNPs(Ce浓度为0.70mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用20mL氯仿萃取三次，向水层加入50mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析36h，得到表面修饰后的纳米颗粒MCNPs-BP-PEG2000。
MCNPs-BP-PEG2000热重分析[见图5(c)]表明其表面有PEG配体存在，且计算其表面BP-PEG2000配体含量为67.3%；MCNPs,MCNPs-BP-PEG2000的X PS元素分析[见图6(f)，图6(b)]发现后者表面有P元素存在而前者无P存在，上述说明在MCNPs表面成功实现了基于阿伦磷酸钠分子的PEG化修饰。
将MCNPs-BP-PEG2000分别在高盐（PBS）、高盐+血清（PBS+10%FBS）中存放一个月以上，测定其粒径的变化（见图7），结果表明其稳定性超过一个月，说明PEG化后的铈纳米颗粒具有优良的稳定性；MCNPs-BP-PEG2000的氧化酶、超氧化物歧化酶酶学活性相对MCNPs-BP-PEG600来说有所降低（见图8、图9），因为PEG的链长对纳米颗粒的酶学活性可能有一定的影响，可以通过PEG的链长来调控纳米颗粒的酶学活性；MCNPs-BP-PEG2000能有效避免巨噬细胞的吞噬（见图10），因此具有良好的生物学相容性及分散稳定性。
实施例4TCNPs-BP-PEG2000的制备（其中BP为阿仑膦酸钠、PEG2000为分子量为2000的PEG二羧酸）
（1）将0.434g硝酸铈溶于0.802g油胺（70%）和4.0g1-十八烯（90%）中，搅拌混匀后3min内升温至80℃，氩气保护下反应30min，在冷凝回流及通氩气条件下8min内升温至260℃反应2h，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液（80mL），离心分离沉淀后用相同溶液清洗多次，最后将其分散在正己烷中得到直径为3-5nm的TCNPs，用时用丙酮沉淀后分散于四氢呋喃中用于配体交换反应；
（2）BP-PEG2000的合成：将392mg PEG二羧酸、40mg EDC·HCl和20mg NHS溶于4mL二氯甲烷中，室温反应8h后旋蒸除掉二氯甲烷；将40mg阿仑膦酸钠三水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应24h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG2000；
（3）TCNPs-BP-PEG2000的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG2000溶液中，取8mL第（1）步合成的TCNPs(Ce浓度为0.60mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用20mL氯仿萃取三次，向水层加入50mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析36h，得到表面修饰后的纳米颗粒TCNPs-BP-PEG2000。
TCNPs-BP-PEG2000热重分析[见图5(b)]表明其表面有PEG配体存在，且计算其表面BP-PEG2000配体含量为80.0%，高于MCNPs-BP-PEG2000；TCNPs,TCNPs-BP-PEG2000的X PS元素分析[见图6(e)，图6(a)]发现后者表面有P元素存在而前者无P存在，上述说明在TCNPs表面成功实现了基于阿伦磷酸钠分子的PEG化修饰。
将TCNPs-BP-PEG2000分别在高盐（PBS）、高盐+血清（PBS+10%FBS）中存放一个月以上，测定其粒径的变化（见图7），结果表明其稳定性超过一个月，说明PEG化后的铈纳米颗粒具有优良的稳定性；TCNPs-BP-PEG2000的氧化酶、超氧化物歧化酶酶学活性相对MCNPs-BP-PEG2000来说不是很明显（见图8、图9），说明第一，修饰PEG链长短纳米颗粒的酶学活性具有一定的影响；第二，不同的铈纳米颗粒合成方法本身具有酶学活性差异性。TCNPs-BP-PEG2000能有效避免巨噬细胞的吞噬（见图10），因此具有良好的生物学相容性及分散稳定性。
实施例5MCNPs-BP-PEG600的合成（其中BP为帕米磷酸二钠、PEG600为分子量为600的PEG二羧酸）
（1）MCNPs的合成：将0.75g AOT溶于50mL甲苯后加入2.5mL浓度为0.1mol/L的硝酸铈，搅拌45min后用蠕动泵以5r/min的速度将双氧水（30%）滴加到上述溶液，室温反应45min后静置过夜后得到分散在甲苯中的MCNPs，其直径为3-5nm；
（2）BP-PEG600的合成：将147mg PEG二羧酸、30mg EDC·HCl和15mg NHS溶于2mL二氯甲烷中，室温反应6h后旋蒸除掉二氯甲烷；将22.6mg帕米磷酸钠五水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应12h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG600；
（3）MCNPs-BP-PEG600的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG600溶液中，取8mL第（1）步合成的MCNPs(Ce浓度为0.70mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用10mL氯仿萃取三次，向水层加入20mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24h，得到表面修饰后的纳米颗粒MCNPs-BP-PEG600。
实施例6TCNPs-BP-PEG600的制备（其中BP为帕米磷酸二钠、PEG600为分子量为600的PEG二羧酸）
（1）将0.434g硝酸铈溶于0.802g油胺（70%）和4.0g1-十八烯（90%）中，搅拌混匀后3min内升温至80℃，氩气保护下反应30min，在冷凝回流及通氩气条件下8min内升温至260℃反应2h，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液（80mL），离心分离沉淀后用相同溶液清洗多次，最后将其分散在正己烷中得到直径为3-5nm的TCNPs，用时用丙酮沉淀后分散于四氢呋喃中用于配体交换反应；
（2）BP-PEG600的合成：将147mg PEG二羧酸、30mg EDC·HCl和15mg NHS溶于2mL二氯甲烷中，室温反应6h后旋蒸除掉二氯甲烷；将22.6mg帕米磷酸钠五水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应12h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG600；
（3）TCNPs-BP-PEG600的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG600溶液中，取8mL第（1）步合成的TCNPs(Ce浓度为0.6mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用10mL氯仿萃取三次，向水层加入20mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24h，得到表面修饰后的纳米颗粒TCNPs-BP-PEG600。
实施例7MCNPs-BP-PEG1000的合成（其中BP为帕米磷酸二钠、PEG1000为分子量为1000的PEG二羧酸）
（1）MCNPs的合成：将0.75g AOT溶于50mL甲苯后加入2.5mL浓度为0.1mol/L的硝酸铈，搅拌45min后用蠕动泵以5r/min的速度将双氧水（30%）滴加到上述溶液，室温反应45min后静置过夜后得到分散在甲苯中的MCNPs，其直径为3-5nm；
（2）BP-PEG1000的合成：将73.5mg PEG二羧酸、30mg EDC·HCl和15mg NHS溶于2mL二氯甲烷中，室温反应6h后旋蒸除掉二氯甲烷；将22.6mg帕米磷酸钠五水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应12h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG1000；
（3）MCNPs-BP-PEG1000的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG1000溶液中，取8mL第（1）步合成的MCNPs(Ce浓度为0.70mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用15mL氯仿萃取三次，向水层加入30mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24h，得到表面修饰后的纳米颗粒MCNPs-BP-PEG1000。
实施例8TCNPs-BP-PEG1000的制备（其中BP为帕米磷酸二钠、PEG1000为分子量为1000的PEG二羧酸）
（1）将0.434g硝酸铈溶于0.802g油胺（70%）和4.0g1-十八烯（90%）中，搅拌混匀后3min内升温至80℃，氩气保护下反应30min，在冷凝回流及通氩气条件下8min内升温至260℃反应2h，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液（80mL），离心分离沉淀后用相同溶液清洗多次，最后将其分散在正己烷中得到直径为3-5nm的TCNPs，用时用丙酮沉淀后分散于四氢呋喃中用于配体交换反应；
（2）BP-PEG1000的合成：将73.5mg PEG二羧酸、30mg EDC·HCl和15mg NHS溶于2mL二氯甲烷中，室温反应6h后旋蒸除掉二氯甲烷；将22.6mg帕米磷酸钠五水合物和50mg碳酸钠溶于4mL去离子水后加入上述产物中，室温反应12h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG1000；
（3）TCNPs-BP-PEG1000的合成：将150mg碳酸钠加入4mL第（2）步中得到的BP-PEG1000溶液中，取8mL第（1）步合成的TCNPs(Ce浓度为0.6mg/mL)与其混合，密闭温度在80℃条件下搅拌12h，冷却至室温后离心分层，取水层用15mL氯仿萃取三次，向水层加入30mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24h，得到表面修饰后的纳米颗粒TCNPs-BP-PEG1000。
实施例5－8所得表面修饰后的纳米颗粒，经颗粒大小测试、XRD测试、IR测试、稳定性测试、酶活性和巨噬细胞的吞噬活性测试，结果表明均具有颗粒小，分散性好，稳定的特点，证明铈纳米颗粒表面有PEG配体存在，表面配体含量约为60－80%；并具有氧化酶、超氧化物歧化酶酶学活性；能有效避免巨噬细胞的吞噬，因此，具有良好的生物学相容性及分散稳定性。
Claims (9)
1.一种铈纳米颗粒表面修饰方法，包括以下步骤：
1）制备铈纳米颗粒,包括以下方法之一：①微乳液法，将AOT溶于甲苯中，在双氧水的存在下与硝酸铈反应，反应后静置过夜分散在甲苯中，得到铈纳米颗粒（MCNPs），其粒径为3-5nm；②高温热分解法，将硝酸铈溶于油胺和1-十八烯中，在氩气保护下加热回流反应，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液，离心分离沉淀，然后将沉淀分散在正己烷中得到粒径为3-5nm的铈纳米颗粒TCNPs；
2)制备纳米颗粒表面修饰配体：将式I所示的PEG、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺在二氯甲烷中反应，然后蒸发二氯甲烷，然后加入将式II所示的双磷酸化合物和碳酸钠的水溶液，室温反应得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG，
式I中，R1、R2可以相同也可以不同的独立代表-OH、-COOH或-NH2，其重均分子量为200-10000；式II中，R3代表H、-OH、-CH3，R4代表-(CH2)nNH2、-(CH2)nOH、-(CH2)nCOOH，n=1～5；
（3）纳米颗粒表面配体交换：将MCNPs分散于甲苯中或将TCNPs分散于四氢呋喃中，然后加入含有碳酸钠和BP-PEG的溶液、混合，在60-100℃条件下搅拌12-24h，冷却至室温后离心分层，取水层用氯仿萃取三次，向水层加入丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24-48h，得到表面PEG修饰的铈纳米颗粒。
2.如权利要求1的修饰方法，进一步包括以下步骤：
（1）铈纳米颗粒的制备，选自下列方法之一，①微乳液法，将AOT溶于50mL甲苯后加入硝酸铈，搅拌45min后用蠕动泵以1-5r/min的速度将30%的双氧水滴加到上述溶液，室温反应0.45-1h，静置过夜后分散在甲苯中得到铈纳米颗粒MCNPs，其粒径为3-5nm；②高温热分解法，将硝酸铈溶于70%的油胺和90%的1-十八烯中，搅拌混匀后3min内升温至80℃，氩气保护下反应20-40min，在冷凝回流及通氩气条件下8min内升温至260℃反应1-3h，冷却至室温后加入丙酮-无水乙醇混合溶液60-100mL，离心分离沉淀后用相同溶液清洗多次，最后将其分散在正己烷中得到粒径为3-5nm的铈纳米颗粒TCNPs，将铈纳米颗粒TCNPs分散于四氢呋喃中用于下步配体交换反应；
（2）纳米颗粒表面修饰配体的合成：将式I所示的PEG、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基） 碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于2-4mL二氯甲烷中，室温反应4-8h后旋蒸除掉二氯甲烷；然后将II所示的BP化合物和碳酸钠溶入4mL水溶液后加入到上述产物中，室温反应12-24h后得到纳米颗粒表面修饰配体BP-PEG；
式I中，R1、R2可以相同也可以不同的独立代表-OH、-COOH或-NH2，其重均分子量为200-10000；式II中，R3代表H、-OH、-CH3，R4代表-(CH2)nNH2、-(CH2)nOH、-(CH2)nCOOH，n=1～5；
（3）纳米颗粒的表面配体交换，包括：①将碳酸钠加入步骤（2）所述BP-PEG溶液中，取8-16mL步骤（1）的MCNPs甲苯分散液或TCNPs四氢呋喃分散液与其混合，密闭温度在60-100℃条件下搅拌12-24h，冷却至室温后离心分层，取水层用10-20mL氯仿萃取三次，向水层加入20-50mL丙酮沉淀纳米颗粒，分离沉淀后将纳米颗粒分散于水中，在截留分子量为10000的透析袋中透析24-48h，得到表面PEG修饰后的铈纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的修饰方法，其特征在于，步骤（1）中所述微乳液法中AOT用量为0.5-1.5g、硝酸铈用量为2.5mL（0.1mol/L）、双氧水用量为4-6mL；所述高温热分解法合成TCNPs中硝酸铈用量为0.434g、油胺用量为0.8-1.0g、1-十八稀用量为3-5g，所述丙酮-无水乙醇混合液中丙酮与无水乙醇体积比例为1:1-0.25。
4.根据权利要求2所述的修饰方法，其特征在于，步骤（2）中所述碳酸钠用量为50mg；所述式I的PEG:1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐：N-羟基琥珀酰亚胺:双磷酸化合物所用摩尔比为2-5:2-4:2-4:1-2。
5.根据权利要求2所述的修饰方法，其特征在于，步骤（3）中所述MCNPs和TCNPs浓度均为0.5-1.0mg/mL；所述配体交换反应中水相与有机相的体积比为1:1-3。
6.根据权利要求2所述的修饰方法，其特征在于，步骤（1）、（2）、（3）中所述室温范围为10-30℃。
7.根据权利要求1或2所述的修饰方法，所述双磷酸化合物选自阿仑膦酸、帕米膦酸和奈立膦酸或它们的钠盐。
8.根据权利要求1或2所述的修饰方法，所述式I的PEG为PEG二羧酸。
9.根据权利要求1或2所述的修饰方法，所述式I的PEG的重均分子量为600-2000。
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