CN103547173A - 包含牛乳中存在的可溶性寡糖级分并具有低单糖水平的用于婴儿配方产品的牛乳寡糖-低聚半乳糖组合物以及生产该组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了易于喷雾干燥的得自牛乳的寡糖混合物，其包含(a)与存在于牛乳中的可溶性寡糖相同的可溶性寡糖群和(b)通过β-半乳糖苷酶作用于乳糖和牛乳寡糖而形成的β-低聚半乳糖。该混合物的总单糖含量低于5%w/v并且乳糖:寡糖比低于20。还公开了获得所述混合物的方法，该方法包括纳滤步骤。还公开了包含所述寡糖混合物的营养组合物，尤其是婴儿配方产品。

Description

包含牛乳中存在的可溶性寡糖级分并具有低单糖水平的用于婴儿配方产品的牛乳寡糖-低聚半乳糖组合物以及生产该组合物的方法
发明领域
本发明涉及得自牛乳的寡糖混合物以及包含所述寡糖(OS)混合物的食品、特别是婴儿配方产品，以及生产所述寡糖混合物的方法。
发明背景
人类的结肠留驻有多种细菌，所述细菌对消化道生理具有正面和负面的双重作用，并且具有其它系统性的影响。结肠中所发现的细菌的优势类群包括拟杆菌属(Bacteroides)物种，尤其是双歧杆菌属(Bifidobacteria)、真细菌属(Eubacteria)、梭菌属(Clostridia)和乳杆菌属(Lactobacilli)。这些细菌响应于结肠中的底物可用性、氧化还原电位、pH、O2张力及其分布而具有变化的活性。通常，肠内的细菌可分为对其宿主发挥潜在危害作用或有益作用的物种。致病作用(其可能由例如梭菌属或拟杆菌属引起)包括腹泻、感染、肝脏损害、致癌作用和肠腐烂。健康促进作用可通过有害细菌的生长抑制、免疫功能的刺激、增强必需营养成分的消化和吸收以及维生素的合成而引起。可具有健康促进作用的细菌类群(例如双歧杆菌属和乳杆菌属)在数量和/或活性上的增加是合乎需要的。对其宿主具有有益作用的“好的细菌”被称为“益生菌”。益生菌包括多种类型的细菌，但通常选自四类细菌:嗜酸乳杆菌(Lactobacilllus acidophilus)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、乳球菌属(Lactococcus)和片球菌属(Pediococcus)。
与益生菌例如乳杆菌或双歧杆菌有关的健康益处包括全身细胞免疫应答的增强，例如，增强的抗体生成和白细胞吞噬(吞食或杀伤)活性。某些益生菌菌株与增强免疫系统从而预防感染或减轻感染程度有关。某些益生菌与预防过敏以及降低过敏严重程度有关。某些菌株据称可以有效改善肠疾病、特别是腹泻。
对于婴儿这一特殊情况，在临出生前，婴儿的胃肠道被认为是无菌的。在出生的过程中，其遭遇来自母亲的消化道和皮肤的细菌并开始驻留有细菌。响应于婴儿的喂养情况，在消化道微生物群的组成方面存在很大差异。母乳喂养的婴儿的粪便菌丛包含可观数量的双歧杆菌群并含有一些乳杆菌属，而配方奶喂养的婴儿具有更为复杂的微生物群，通常存在双歧杆菌属和拟杆菌属、梭菌属和链球菌属。断奶后，开始建立与成人消化道微生物群分布相类似的微生物群分布。
对于所有的婴儿均建议使用母乳。但是，在一些情况下，出于医学原因，或者由于母亲选择不用母乳喂养，母乳喂养是不充分或不成功的。针对这些情况开发了婴儿配方产品。
为了建立与母乳喂养的婴儿类似的健康的肠道菌群，可能需要在婴儿配方产品中添加益生菌。目前用于婴儿配方产品的益生菌的例子包括可以得自芬兰的Valio Oy的商标名为LGG的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)ATCC53103、鼠李糖乳杆菌CGMCC1.3724、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CNCM I-2116、由BioGaia A.B以商标名Reuteri销售的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、约氏乳酸杆菌(Lactobacillusjohnsonii)CNCM I-1225、由新西兰的BLIS Technologies Limited以标号KI2销售的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)DSM13084、由丹麦的Christian Hansen公司以商标名Bb12销售的乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)CNCM1-3446、由日本的Morinaga Milk Industry Co.Ltd.以商标名BB536销售的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ATCC BAA-999、由Danisco以商标名Bb-03销售的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、由Morinaga以商标名M-16V销售的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、由Procter&GambIe Co.以商标名Bifantis销售的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和由Institut Rosell(Lallemand)以商标名R0070销售的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)。
为了健康地维持肠道微生物群，可将这些益生菌以每天约10亿至约200亿菌落形成单位(CFU)的量施用，优选每天施用约50亿至约100亿活菌。
影响健康肠道菌群的另一个因素是肠道中益生元的存在。益生元是一种不能消化的食品成分，其选择性地刺激结肠中益生菌的生长和/或活性，从而增进宿主健康。益生元是不能消化的意思是指，其在胃或小肠中不能被分解和吸收，从而可以完整的通过并到达结肠并在此处选择性地由有益细菌进行发酵。益生元的实例包括某些寡糖，例如低聚果糖(FOS)和低聚半乳糖(GOS)。
已知人乳比大多数其它动物乳含有更大量的不能消化的寡糖。事实上，不能消化的寡糖代表了母乳中第三大固体成分(次于乳糖和脂质)，其在初乳中存在的浓度是12-15g/l，在成熟乳汁中为5-8g/l。人乳寡糖(HMO)高度耐受酶水解，表明这些寡糖可以显示出与其热值不直接相关的重要功能。
因此，益生元与益生菌协同性地起作用，为婴儿提供重要的健康益处。益生元不仅选择性地促进添加到婴儿配方产品中的益生菌的生长，而且还可促进能够与添加的益生菌协同起作用的内源性益生菌的生长。
因此，益生元的存在可以增强由以上所述的益生菌所提供的健康益处。因此，随着对人乳组成的了解的增加，已经建议将益生元添加到婴儿配方产品中。这些益生元通常以足以正性刺激消化道中的健康菌群并引起这些“好的”细菌繁殖的量施用。常用量为每次约1至约10克，或推荐的婴儿每日膳食纤维的约5%至约40%。
因此，可以购买到各种添加了益生元例如低聚果糖和低聚半乳糖的混合物的婴儿配方产品。
但是，此类混合物仅提供近似人乳中存在的寡糖混合物。在人乳中已经检测到100种以上不同的寡糖成分，其中一些在动物乳如牛乳中尚未检测到或仅检测到少量。一些唾液酸化的寡糖和岩藻糖基化的寡糖存在于牛乳和初乳中，但是仅以非常小的量存在。
EP0975235B1描述了包含一种或多种人乳寡糖的合成营养组合物，其中组合物中的HMO选自一组8种HMO(3-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖(fucopentaose)III、乳糖-N-岩藻五糖II、二岩藻糖基乳糖、2’-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖I、乳糖-N-新四糖(neotetraose)和乳糖-N-岩藻五糖V)，该欧洲专利指出，一般而言，寡糖保护婴儿免受呼吸道、胃肠道以及泌尿生殖道的病毒和细菌感染。
美国专利申请2003/0129278记载了基于由一种或多种动物乳生产的寡糖的寡糖混合物，其特征在于其包含至少两种寡糖级分，所述寡糖级分均由至少两种不同的寡糖组成。寡糖混合物中的寡糖组成不同于提取出该寡糖级分的动物乳或动物乳混合物。
EP0458358涉及生产包含10-15%重量的低聚半乳糖的脱脂奶粉的方法，该方法包括:
(i)浓缩脱脂乳以获得固体含量为20-50%重量的浓缩乳，
(ii)向浓缩乳中加入β-半乳糖苷酶以引发酶反应，
(iii)将形成的混合物加热至70-85℃达30秒至15分钟以终止酶反应，并且
(iv)将反应已终止的混合物喷雾干燥。
在本发明人的申请WO2006/087391中，公开了得自动物乳的寡糖混合物以及生产所述寡糖混合物的方法。该寡糖混合物可有效地作为益生元，特别是在人的消化道中，并且其寡糖图谱比低聚果糖和低聚半乳糖混合物更接近人乳。
为了开发益生元婴儿配方产品，希望提供其寡糖图谱与源乳的寡糖图谱尽可能接近的(至少从定性方面是尽可能接近的)寡糖混合物。寡糖的相对量可以变化。这意味着寡糖混合物应含有乳中存在的全部寡糖可溶性级分。“可溶性级分”是指在乳中可溶的所有不同的寡糖。不同的可溶性寡糖在源乳中的相对量无需在寡糖混合物中保留。
此外，希望保持低的乳糖/寡糖比例，以避免引入不需要的、高含量的乳糖，并且降低为获得婴儿配方产品所需的寡糖水平而额外添加的OS的量。此外，寡糖混合物的蛋白含量应当非常低，从而不会显著影响婴儿配方产品的氨基酸组成。
本发明的一个目的是提供一种寡糖混合物，其可有效地作为益生元，特别是在人消化道中，并且其寡糖图谱比低聚果糖和低聚半乳糖混合物更接近人乳，并且单糖的浓度非常低。因此，本发明的目的是提供一种包含用于制备寡糖混合物的乳中所存在的寡糖可溶性级分的寡糖混合物。在本发明的上下文中，“得自牛乳的寡糖混合物”是指从牛乳获得的寡糖。因此，存在于原乳中的不同的可溶性寡糖也存在于本发明的最终的寡糖混合物中，尽管它们的比例不一定相同。
本发明的另一个目的是提供具有相对高的寡糖浓度(通常为20-50%w/w)的寡糖混合物。
需要有助于保护正常的免疫或炎症状态或减弱或减轻食物过敏的影响的食品，特别是用于幼儿、婴儿和/或新生儿的食品。
需要提供可有效地作为益生元、特别是在人消化道中作为益生元的食品。
需要能够提供上述益处并且保持个体中平衡的正常代谢的食品。
需要通过适用于脆弱的个体例如婴幼儿的非药物干预来改善人消化道的状态。
需要能够提供对变态反应原口服耐受的食品。
需要蛋白含量非常低的乳寡糖成分，其可以以糖浆或粉末的形式加入到婴儿配方产品中而无需任何载体。
发明概述
本发明涉及得自牛乳的寡糖混合物，其包含
a.包含存在于牛乳中的可溶性寡糖级分(牛乳寡糖或CMOS)的可溶性寡糖群;
b.通过β-半乳糖苷酶作用于牛乳寡糖中存在的乳糖以及任选地作用于其它牛乳寡糖而形成的β-低聚半乳糖，
该混合物的总的单糖含量低于5%w/v，优选低于3%，并且乳糖:总寡糖比低于10，优选低于3。
该混合物具有如下单糖、二糖和寡糖组成，以干物质百分比表示：
c.乳糖30-60%
d.葡萄糖0.5-2.5%
e.半乳糖0.5-2.5%
f.寡糖和β-低聚半乳糖20-50%
g.唾液酸基乳糖0.2-2%。
本发明的另一方面是生产OS混合物的方法。其步骤包括
a)浓缩去蛋白的牛乳原料至50-75%总固体(TS);
b)将浓缩的牛乳原料进行去除乳糖的步骤以制备乳糖:寡糖比低于100的液体;
c)任选地澄清所述的液体;
d)将任选澄清的液体用β-半乳糖苷酶处理以制备包含β-低聚半乳糖的液体;
e)任选地通过例如将液体通过弱阳离子柱和任选的混合床柱和/或阴离子交换柱进行脱盐;
f)进行纳滤步骤，其可在任选的脱盐步骤之前或之后进行，但必需在用
β-半乳糖苷酶处理之后或处理的同时进行。
另一方面，本发明提供了可通过本发明的方法获得的产品。
本发明的OS混合物具有有利的特性。当所述混合物的水分含量为2.5%时，其玻璃转化温度(Tg)在70-85℃的范围内。该物理特性使得该混合物在不存在载体的情况下易于喷雾干燥而不会结块或发粘。此外，与未经纳滤的含GOS的OS混合物相比，本发明的OS混合物不太倾向于发生美拉德反应。在该水分含量下的相对高的Tg提供了在存放期间的更好的物理稳定性。
本发明的OS混合物可以掺入到营养组合物中，例如一阶段婴儿配方产品、婴儿配方产品、幼儿食品、婴儿谷物组合物、后续配方食品或成长乳，优选一阶段婴儿配方产品。
因此，所述营养组合物是本发明的一个目的。
本发明的另一个目的是包含本发明的OS混合物的营养组合物用于增强免疫保护和/或降低感染的风险和/或降低食物过敏的发生以及相关的食品过敏对健康的影响的用途。
附图概述
图1:在实施例1的方法过程中的三个点的牛乳寡糖(CMOS)和牛乳寡糖/β-低聚半乳糖(CMOS-GOS)混合物中的总可溶性寡糖级分通过HPLC测定。HPLC色谱图对应于从如下样品获得的数据：(1)通过结晶除去部分乳糖并且脱盐了的OS粉，(2)通过用β-半乳糖苷酶水解产生GOS而生成的OS-GOS，和(3)经纳滤的OS-GOS(相当于实施例2的Nano OS-GOS)。因此，可以在相同的图示比例上近似地读取色谱图，样品(2)OS-GOS和(3)经纳滤的OS-GOS分别稀释20和10倍。
图2:测定含30%麦芽糊精载体的CMOS-GOS(黑色)、含30%乳糖的CMOS-GOS(虚线)和本发明的经纳滤的CMOS-GOS混合物(灰色)粉末的玻璃转化温度(Tg)。样品的水分含量用卡尔-费休法测定。由于在不添加载体的情况下无法将样品干燥至所需的湿度水平，因此无法获得不含载体的CMOS-GOS的玻璃转化温度。但是，数据似乎显示，在不含载体的情况下，未经纳滤的CMOS-GOS的Tg值为大约35-40℃。Tg测量通过差示扫描量热法(DSC)进行。
图3:测定了在表2中详细描述的三种婴儿配方产品的封闭赖氨酸(由美拉德反应引起)的百分比。测定在喷雾干燥之前(灰色)以及之后(黑色)进行。喷雾干燥于92℃进行。在图中，柱“CMOS Vivinal”表示在其中添加了未经纳滤的GOS级分(
Figure BDA0000417072560000081
GOS，来自FrieslandCampina)和未经纳滤的CMOS级分(参见表2)的液体浓缩物(灰色)和粉末(黑色)婴儿配方产品的数据。柱“Nano-CMOS-GOS湿法添加”表示以湿混合物的形式向其中添加了本发明的经纳滤的CMOS-GOS混合物的婴儿配方产品的数据(液体浓缩物和粉末)。柱“Nano-CMOS-GOS干法添加”表示以干粉形式向其中添加了本发明的经纳滤的CMOS-GOS混合物的婴儿配方产品的数据。
发明详述
定义:
本文使用的下列术语具有如下含义。
术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的儿童。
术语“幼儿”是指年龄在1至3岁的儿童。
术语“婴儿配方产品”意指预期用于在生命前四个至六个月期间的婴儿的特定营养用途、且本身满足此类人的营养要求的食品(2006年12月22日关于婴儿配方产品及后续配方产品的欧洲委员会指令(EuropeanCommission Directive)2006/141/EC第2条)。
术语“后续配方产品”意指预期用于年龄超过四个月的婴儿的特定营养用途、且构成此类人的逐渐多样化饮食的主要液体元素的食品。
术语“一阶段婴儿配方产品”意指预期用于在生命前四个月期间的婴儿的特定营养用途的食品。
术语“幼儿食物”意指预期用于婴儿在生命最初几年期间的特定营养用途的食品。
术语“婴儿谷类组合物”意指预期用于婴儿在生命最初几年期间的特定营养用途的食品。
术语“成长乳”意指适合年幼儿童特定营养需要的乳基饮料。
术语“增强对变态反应原的口服耐受”意指当口服时降低对变态反应原的敏感性。
术语“营养组合物”意指向个体提供营养的组合物。该营养组合物通常经口服或静脉内服用，并且其通常包括脂质或脂肪源以及蛋白质源。
术语“合成组合物”意指通过化学和/或生物(例如酶)方式获得的组合物，其化学上与哺乳动物乳中天然存在的混合物相同。
术语“低变应原性组合物”意指不太可能引起变态反应的组合物。
术语“寡糖”意指含有少量(通常是2至10个)组成单糖的糖聚合物。
术语“唾液酸化的寡糖”意指具有唾液酸残基的寡糖。
术语“益生元”意指不可消化的碳水化合物，其通过选择性地刺激人结肠中健康的细菌如双歧杆菌属的生长和/或活性来有益地影响宿主(GibsonGR,Roberfroid MB.Dietary modulation of the human colonic microbiota:introducing the concept of prebiotics.J Nutr.1995;125:1401-12)。
术语“益生菌”意指对宿主健康或保持良好状态具有有益作用的微生物细胞制剂或微生物细胞组分。(Salminen S,Ouwehand A.Benno Y.等“Probiotics:how should they be defined”Trends Food Sci.Technol.1999:10107-10)。
“变态反应”是已由医师检测到并可以以不定期或以更持久的方式治疗的变态反应。“食物变态反应”是对营养组合物的变态反应。
术语“寡糖图谱”表示寡糖组成的特性。
除非另有说明，所有百分比均以重量计。
寡糖:
寡糖(OS)在此定义为那些在动物乳中天然存在的并且聚合度(DP)在3至20范围内的寡糖。这些寡糖可溶于乳中。若无相反说明，在本文中所有其它对寡糖的提及均指(在乳中)可溶的寡糖。本发明提供了得自牛乳的寡糖混合物，其中混合物的乳糖(DP=2):寡糖比低于20，更优选低于10，优选在8至1.25之间。这相当于寡糖混合物中的乳糖含量比原始牛乳中降低了4至200倍，其等于寡糖和乳糖之间的比增加了4至200倍。因此，该混合物具有与用于制备该混合物的乳(即，该混合物源于该乳)中的寡糖图谱(即，总可溶性寡糖级分)相同的寡糖图谱，但寡糖的浓缩程度更高。
本发明的寡糖混合物还包含β-低聚半乳糖(GOS)，其是在β-半乳糖苷酶的作用下生成的，所述β-半乳糖苷酶主要作用于乳糖，并且也任选地作用于一些牛乳中存在的可溶性寡糖(牛乳寡糖，或CMOS)，但程度小得多。因此，在一个实施方案中，β-低聚半乳糖是由β-半乳糖苷酶作用于乳糖和牛乳寡糖所生成的。将酶在生产寡糖混合物的过程中加入。酶对CMOS作用的确切程度或者说作用到了什么程度，本发明人没有测定。因此，本发明的寡糖混合物中不同寡糖的相对比例可能与用于制备混合物的牛乳中的不同。β-半乳糖苷酶具有双重活性:一，将乳糖降解成单糖，即半乳糖和葡萄糖，以及，第二，通过转移酶活性，催化随后的低聚半乳糖(GOS)的形成。这些寡糖由葡萄糖和半乳糖单体组成，DP为3至10，并且已知具有益生元活性。
在本发明的寡糖混合物中存在超过20种不同的GOS结构。
寡糖图谱可以通过HPLC、质谱和其它方法来表征。根据一种优选的HPLC方法，将样品中存在的寡糖提取到70℃的水中。将提取的OS通过与2-氨基苯甲酸反应(65℃下2小时)形成希夫碱进行荧光标记。然后通过与氰基硼氢化钠反应将双键还原得到稳定的寡糖氨基benzide(OS-AB)衍生物。将标记的提取物用乙腈稀释，然后注射到安装有捕集柱的HPLC-荧光仪上。在Amide-803μm,4.6x150mm柱上进行分离，标记的OS在荧光计上在如下条件下检测:Ex330nm,Em420nm。不同OS的定量通过校准OS-2AB与麦芽三糖外标的响应来进行，用昆布三糖作为内标。
图1显示在实施例1的生产OS混合物的三个连续步骤的混合物中通过上述HPLC方法测定的总可溶性寡糖级分:(1)通过结晶除去部分乳糖并脱盐了的CMOS、(2)通过用β-半乳糖苷酶水解产生GOS后和(3)经纳滤后(相当于实施例2的Nano CMOS-GOS)。其为寡糖图谱。因此，可以在相同的图示比例上近似地读取三个色谱图，样品(2)CMOS-GOS和(3)经纳滤的CMOS-GOS分别稀释20和10倍。
从HPLC数据确定的寡糖的列表如表1所示。没有鉴定全部的寡糖，但三张图谱的图形非常类似。这证实原始牛乳中的CMOS种群确实存在于本发明的OS混合物中。发明人注意到3’SL峰(相当于唾液酸基寡糖3'唾液酸基乳糖)主要在图谱(1)中可见，在图谱(2)和(3)中不可见。确信在CMOS的β-半乳糖苷酶水解步骤中，所生成的GOS之一的保留时间与3’SL的非常接近，因此干扰了3’SL峰的分离。发明人证实，在32.29分钟(1)和32.20分钟(2)的峰不是3’SL，而是代表了GOS结构(数据未示出)。
由于对CMOS-GOS样品的稀释，图谱(1)中的与唾液酸基寡糖6’L(Neu5Ac(α2-6)Gal(β1-4)Glc)有关的峰在图谱(2)中不再能够观察到。
表1
Figure BDA0000417072560000111
Figure BDA0000417072560000121
Figure BDA0000417072560000131
Hex=己糖
Hex2-6=相当于二糖、三糖、四糖、五糖、六糖的己糖的数量
本发明的OS混合物的总单糖含量低于5%w/v，优选低于3%w/v。
可将该混合物掺入到婴儿或成人食品中并起到益生元、免疫调节和保护的作用。
虽然本发明的寡糖混合物是得自牛乳，但该乳也可得自任何种类的动物，特别是牛、山羊、水牛、马、大象、骆驼或绵羊。
生产寡糖混合物的方法:
原料:
在生产本发明的寡糖混合物的方法中所用的原料是去蛋白乳，例如从其中去除了蛋白质的乳、或乳清或任何从其中去除了乳清蛋白的制备的或改性的乳清材料。所述材料包括酸乳清和甜乳清。优选的原料是乳的超滤渗透液和乳清超滤渗透液。或者，原料可以是复溶的粉末，例如粉末化的超滤渗透液。
原料必需是去蛋白的产品，因为在浓缩过程中存在蛋白会导致不希望的美拉德反应和焦化。可以通过任何已知的方法使原料去蛋白，例如，酸沉淀、热处理、离子交换。但是，优选通过超滤除去蛋白质，这也可以除去原料中的脂质。
原料的pH可以在3至7.5之间，但优选5至6的pH范围，以防止寡糖水解(例如唾液酸基乳糖的去唾液酸化)，并有助于减轻焦化反应。
a)原料的浓缩
将去蛋白的乳原料通过任何已知的方法浓缩至50至75%总固体(TS)，优选55至60%TS，条件是温度不上升至会使寡糖水解(例如，去唾液酸化)的程度。浓缩优选在50至90℃下进行，更优选50至75℃。蒸发是一项优选的技术，其在80至200毫巴的压力下进行。在该方法中，温度不超过60℃，其确保寡糖不会受到不利的影响。或者，如果原料是粉末，浓缩至所需的水平可以通过将粉末适当的复溶来完成。
b)去除乳糖
优选地，去除乳糖的步骤通过形成结晶并除去乳糖结晶来完成。例如，乳糖结晶的形成可以在浓缩的原料中、通过将浓缩的原料冷却(添加或不添加晶种)来完成。然后通过任何已知的方法、例如离心、过滤和/或滗析除去乳糖结晶。另一种从寡糖中分离乳糖的方法是利用溶解度的差异。将原料喷雾干燥，然后加入水以溶解寡糖而留下结晶形式的乳糖。
得到的液体高度富集寡糖，寡糖:乳糖的比例比用于制备该液体的乳中的比例高2至200倍。
可将该液体按照以上描述再次浓缩并可再次进行除去乳糖的步骤。该过程可以根据需要重复多次。最终的乳糖:寡糖比低于250，优选低于125，更优选低于100，仍更优选低于20，最优选低于10。
该步骤可以根据已知的方法进行。
c)液体的澄清
该步骤是任选的，并且可以通过技术人员已知的任何方法、例如离心来完成。
d)用β-半乳糖苷酶处理去蛋白液体以制备包含β-低聚半乳糖(GOS)的液体
相应的，可在浓缩乳原料(步骤(a))之前和/或在一次或多次乳糖去除步骤(步骤b))之后将液体用β-半乳糖苷酶处理。优选在乳糖去除步骤完成之后进行。优选地，所用的β-半乳糖苷酶来自米曲霉(Aspergillus oryzae)。该酶可以以乳糖酶F从Amano(日本)购买到，或以Enzeco Fungal Lactase浓缩物从Enzyme Development Corporation(EDC),New York,USA购买到。酶活性按照FCCIV法测定，在1,000至30,000U/kg乳糖之间。酶处理可以在3至7的pH范围内、在4至70℃的温度下在乳糖浓度为5至70g/100g总固体(TS)的原料上以0.5-10g/kg寡糖混合物的酶浓度进行。
优选地，每公斤干的寡糖混合物使用约1.5g酶，保温时间为在20-70℃下1至8小时。在使用后可以通过加热使酶灭活。
将TS浓度为25-50%并且乳糖浓度为约15-40%的液体用0.5至6mgβ-半乳糖苷酶/g TS处理后，形成的溶液可含有约1-4%寡糖，约9-25%GOS，约15-30%乳糖，约5-15%半乳糖和约2-15%葡萄糖。寡糖:β–低聚半乳糖(GOS)的比优选在1:2至1:25、更优选1:5至1:20的范围内。
e)脱盐步骤:
该步骤是任选的。可将液体通过任何已知的方法脱盐，例如，离子交换、电渗析、超滤或这些方法的组合。例如，可将原料通过弱阳离子柱和混合床柱和/或阴离子柱，然后进行电渗滤或纳滤。该脱盐步骤可在中性或酸性pH下进行。其可在水解步骤(d)之前或之后进行。其还可以一部分在水解前进行、一部分在水解后进行。
f)纳滤步骤:
该步骤对于本发明的方法是非常重要的。将液体纳滤除去了单价阳离子和阴离子以及单糖。从混合物中除去单糖是有利的，因此(i)它们不具备益生元活性，并且(ii)当将益生元成分用于生产婴儿配方产品时，它们会引起与蛋白质的不希望的反应。例如，单糖可以引起美拉德反应，使得蛋白质的赖氨酸残基被封闭，从而降低了婴儿配方产品的营养品质。赖氨酸是必需在食物中提供的必需氨基酸，而封闭的赖氨酸无法被机体利用。因此，需要减少在婴儿配方产品的生产过程中发生的美拉德反应的量。
此外，混合物中单糖的浓度越低，寡糖的浓度就可以越高。
出人意料地，本发明人还发现较低的单糖水平允许将寡糖混合物直接干燥而无需添加载体。通常，CMOS-GOS混合物需要存在25至35%的载体(例如麦芽糊精或乳糖)以形成粉末。在形成粉末时不需要载体，这在本发明的CMOS-GOS混合物的生产和使用中是非常有利的。
经纳滤后，形成的液体应具有低于5%w/v、优选低于3%w/v的单糖浓度和优选低于20、优选低于10的乳糖:寡糖比。
纳滤通过将液体通过孔径小到足以保留寡糖但又大到足以使单糖通过的膜来进行。为此，可以使用本领域已知的分子量截止值在200-1000道尔顿范围内的市售的膜。此外，可以采用的其它膜的非限制性实例是NadyrDS NP030和MMS-LD-3838。
纳滤步骤可以在任选的脱盐步骤之前或之后进行。但是，纳滤步骤也可以用来使液体脱盐。纳滤步骤必需在水解步骤之后进行或与水解步骤同时进行。如果纳滤步骤与水解步骤同时进行，则β-半乳糖苷酶可以游离地溶解于保留液罐中或固定在纳滤膜上。
纳滤步骤可以与渗滤步骤结合以达到所需的单糖含量。在渗滤步骤过程中，将纳滤的保留液用等体积的去离子水洗涤数次并再次用纳滤膜过滤。通常，渗滤步骤用1-5体积、优选3-5体积的水重复进行。
纳滤步骤后，保留液可包含约15-30%TS，其中的40-60%是乳糖，0.5-2.5%是葡萄糖，0.5-2.5%是半乳糖，约10-50%是寡糖。纳滤步骤没有引起寡糖与β-低聚半乳糖(GOS)的比的明显改变。
得到的纳滤后的液体是糖浆形式的，并且可以直接以糖浆的形式使用，或者可以将其通过蒸发浓缩至60-85%TS、优选74-85%TS、更优选74-80%TS以使其在存放时稳定，或者可以随后将其干燥(例如，通过喷雾干燥)以得到粉末。可以采用本领域已知的喷雾干燥法。优选在干燥步骤中向混合物中加入低于5%的载体，更优选0%载体。
本发明的OS混合物的性质:
如上所示，本发明人发现，上述方法生产出了可以在没有载体的情况下喷雾干燥的寡糖混合物。当水分含量为2.5%时(卡尔-费休法测定)，本发明的OS混合物的玻璃转化温度在70-85℃的范围内。包含GOS的寡糖混合物在该湿度水平下通常具有低得多的玻璃转化温度，明显低于50℃(参见图2)。通常，在水分含量为约2.5%时其Tg在50℃左右或更低的寡糖混合物需要添加显著量的载体(通常为15-30%)以使得混合物能够进行喷雾干燥。否则，将会发生结块或发粘。例如，粉末可能会粘附在喷雾干燥塔的壁上，从而使干燥机堵塞。因此，为了形成粉末，通常需要加入载体分子例如蛋白质、右旋糖酐、麦芽糊精、阿拉伯胶、蜡质淀粉和葡萄糖或乳糖糖浆。
因此，在本发明的经纳滤的CMOS-GOS混合物中所观察到的Tg的升高使得这些混合物可以在不存在所述载体的情况下成功地被喷雾干燥而不会发生结块。
此外，对于给定的水分含量，Tg的升高具有改善粉末在存放期间的物理稳定性的优点。
因此，本发明的OS混合物的一个关键的优点在于其可以容易地被喷雾干燥而无需添加载体。因此，可以增加最终的婴儿配方产品中寡糖的量而不引入不需要量的载体分子。这使得制造厂可以根据其设备而灵活地选择以液体或粉末形式来提供配料。粉末生产过程被简化。
本发明人用市售的低聚半乳糖混合物进行了类似的用纳滤方法除去单糖的测试。该试验表明(数据未示出)，对于GOS混合物的干燥性能有类似的改善。因此，在进行了纳滤和渗滤后，本身无法进行喷雾干燥的市售的GOS糖浆被成功地喷雾干燥。
因此，本发明的寡糖混合物可以是另外包含低于5%的载体分子或者甚至不包含载体分子的粉末的形式。
此外，本发明的寡糖使美拉德反应的反应性显著降低。在图3(实施例3)中证实了这一点，该图显示了与包含(a)未经纳滤的乳寡糖级分和(b)市售低聚半乳糖成分(
Figure BDA0000417072560000181
GOS，由FrieslandCampina提供)的牛乳寡糖混合物相比，本发明的液体浓缩物和粉末的封闭赖氨酸水平。所测试的配方如表2所示(实施例3)。未经纳滤的混合物在最终的喷雾干燥的婴儿配方产品中引起了非常明显的赖氨酸封闭。相反，如果在添加到配方产品中之前对CMOS GOS级分进行了纳滤，则无论以任何方式加入到湿或干混合物中，赖氨酸封闭均要低得多。这是由于除去了很大比例的会引起美拉德反应的单糖。
在喷雾干燥后，所得到的粉末含有约50%的乳糖，其余的为寡糖混合物(约20至40%，包括唾液酸化的寡糖)、低于3%的单糖，例如葡萄糖和半乳糖、约10%非蛋白含氮化合物、3%残余蛋白和一些残余的盐。
本发明的OS混合物的应用:
在本发明的一个优选的方面，将上述寡糖混合物加至食品中。在本发明的上下文中，术语“食品”意图涵盖任何可消耗的物质。因此，其可以是预期用于由人消耗的产品，尤其是婴儿配方产品、脱水奶粉(包括成长乳)或谷类混合物中。
可以以任何适合的方式制备婴儿配方产品。例如，婴儿配方产品可通过将蛋白质源与除乳糖以外的任何碳水化合物以及脂肪源以适当的比例掺混在一起来制备。如需要可加入乳化剂。可在此时加入维生素和矿物质，但通常稍后加入以避免热降解。可在掺混之前将任何亲脂性维生素、乳化剂等溶入脂肪源。然后可混入水、优选已进行反渗透的水，来形成液体混合物。
然后，可将液体混合物热处理，以减少细菌载量。例如，可将液体混合物快速加热至约80℃至约110℃的温度，持续约5秒至约5分钟。这可通过蒸汽注射的方式或通过换热器、例如板式换热器进行。
然后，可将液体混合物冷却至约60℃至约85℃，例如瞬时冷却。然后可均质化液体混合物，例如分两个阶段，在第一阶段约7MPa至约40MPa，在第二阶段约2MPa至约14MPa。然后可进一步冷却均质化的混合物以加入任何热敏成分，例如维生素和矿物质。此时方便地标准化均质化混合物的pH和总固体(TS)含量。
将均质化的混合物转移至合适的干燥装置如喷雾干燥机或冷冻干燥机中将其转变为粉末。该粉末的含水量应低于约5%重量。
本发明的寡糖混合物可通过湿法混合在生产过程的适宜阶段或通过干法混合物加至婴儿配方产品或其它食品中，但优选在临进行热处理和蒸发之前通过湿法混合加入。但是，对本领域技术人员显而易见的是，婴儿配方产品中碳水化合物的量将需要调节，以考虑由寡糖混合物提供的额外的碳水化合物。幼儿或婴儿食品或配方中寡糖混合物的最终浓度优选为2至20g/l，更优选约5g/l所食用的配方产品。但是，不应将这些量认为是限定性的，并且这些量应当针对目标群体、例如基于幼儿或婴儿的体重和年龄或健康进行调整。优选地，在每次喂食时将含有本发明的寡糖混合物的配方产品喂给婴儿。
或者，可将寡糖混合物通过干法混合加至婴儿或成人食品中。可将所述混合物以约1至15g寡糖/100g干配方产品的浓度加至幼儿或婴儿配方产品中而不会给配方产品带来不自然的高含量的乳糖。但是，不应当将这些量认为是限定性的，并且这些量应当针对目标群体、例如基于幼儿或婴儿的体重和年龄或特定群体的健康进行调整。
尽管优选补充特别以婴儿或幼儿营养为目标的食品，但是补充无特别目标或针对成人群体的食品也可能是有益的。例如，可将本发明的寡糖混合物加至用于老人的保健营养产品和营养产品中。此类食品可包括奶、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、乳基发酵产品、冰淇淋、发酵谷类产品或乳类产品等。
营养组合物
本发明的营养组合物包含寡糖混合物。优选其还包含益生菌，更优选其中的寡糖混合物促进所述益生菌在消化道或肠道中的生长和繁殖。
营养组合物优选是一阶段婴儿配方产品、婴儿配方产品、幼儿食品、婴儿谷物组合物、后续配方食品或成长乳，优选一阶段婴儿配方产品。
现参照以下实施例对本发明进行进一步的描述。
实施例1
制备本发明的CMOS-GOS混合物的方法:
将207,000kg乳清超滤渗透液预浓缩至29%(w/w)总固体(TS)，在约75℃巴氏消毒约30秒，然后在60℃蒸发浓缩以达到58%(w/w)的TS。将液体分装到3个结晶器中并将每个结晶器以2℃/小时的速率冷却24小时以结晶乳糖。洗涤结晶的乳糖，然后使用挤水机将其除去。将剩余的液体经滗析器澄清。
将由澄清器所得的114,000kg23%TS的物质通过弱阳离子柱和混合床柱的组合以本身已知的方式进行脱盐，得到109,000kg14.4%TS的90%脱盐化液体。
将5,400kg脱盐的寡糖混合物通过蒸发浓缩至52%TS。然后将其在标准的罐中在5.5至6.5的pH下加热至60℃。测定混合物中乳糖、葡萄糖、半乳糖、低聚半乳糖和其它寡糖的浓度。每公斤TS加入0.5g Enzeco FungalLactase浓缩物(Enzyme Development Corporation,New York,USA)并将混合物保持在60℃下直至葡萄糖浓度达到15%。然后通过直接蒸汽注射将温度升温至90℃达30秒以使酶灭活。
将1500kg52.4%TS的水解的寡糖混合物用软水稀释得到25%TS溶液。将溶液标准化至pH2.5-6.5并在装配有标称截止值为300道尔顿的MMS-LD-3838膜的36.25m2纳滤线上在10-50℃和25-30巴下进行纳滤。将纳滤的保留液用1至5倍于其体积的软水渗滤。
将经过纳滤的具有22%TS的含GOS寡糖混合物在108℃热处理5秒钟并蒸发至55%TS。将浓缩物在Egron塔中用本领域已知的条件喷雾干燥。
在第二种方法中，将同样的经过纳滤的含GOS寡糖混合物在108℃热处理5秒钟但蒸发至74%TS以达到水活度(aw)低于0.86，这使得浓缩产品的保存期可以为至少3个月。
浓缩产品在74%TS时的粘性以及可以通过蒸发轻松获得如此高的浓度水平表明可以达到更高的浓度。
重新测定混合物中乳糖、葡萄糖、半乳糖、低聚半乳糖和其它寡糖的浓度，结果如以下实施例2中所示。
实施例2
该实施例显示了在本发明的实施例1的过程中总固体寡糖、单糖、灰份、乳酸和柠檬酸的评估。CMOS对应于水解步骤d)之前的混合物，CMOS-GOS对应于水解步骤d)之后的混合物，Nano CMOS-GOS对应于纳滤步骤f)之后的混合物。这些样品还用于生成图1中的HPLC图谱(1)、(2)和(3)以及表1中的数据。
Figure BDA0000417072560000221
实施例3
纳滤后美拉德反应活性的降低:
配制下表2的婴儿配方产品并测试其美拉德反应活性。表中，MSW表示改性甜乳清，是一种从其中除去了酪蛋白糖巨肽(CGMP)的甜乳清。对包含本发明的CMOS-GOS混合物(其以液体浓缩物的形式或干粉的形式加入)的婴儿配方产品与包含未经纳滤的CMOS和市售GOS(
Figure BDA0000417072560000233
GOS)的婴儿配方产品相比进行测试。采用标准反应条件来测试美拉德反应活性。结果如图3所示。本发明的寡糖混合物，无论是以液体还是以粉末形式加入到婴儿配方产品中，导致了最终的喷雾干燥产品中美拉德反应活性的显著降低。
表2
Figure BDA0000417072560000231
1长链多不饱和脂肪酸
2实施例1
由FrieslandCampina(NL)提供的GOS
实施例4
含有本发明的寡糖混合物的婴儿配方产品的实例如下。该实例基于优质的高乳清婴儿配方产品(来自Nestlé,瑞士)，向其中加入下述量的本发明的特定寡糖。
Figure BDA0000417072560000241
Figure BDA0000417072560000251
*RE是视黄醇当量  **TE维生素E当量
***本发明的寡糖混合物

Claims (21)

1.得自牛乳的寡糖混合物，其包含
a.包含存在于牛乳中的可溶性寡糖级分的可溶性寡糖群;
b.通过β-半乳糖苷酶作用于牛乳寡糖中存在的乳糖而形成的β-低聚半乳糖，
该混合物的总的单糖含量低于5%w/v，并且乳糖:总寡糖比低于10。
2.权利要求1所述的寡糖混合物，其中该混合物的总的单糖含量低于3%w/v。
3.权利要求1或2所述的寡糖混合物，其中该混合物的乳糖:总寡糖比低于3。
4.权利要求1、2或3任意一项所述的寡糖混合物，其中该混合物具有如下单糖、二糖和寡糖组成，以干物质百分比表示:
a.乳糖30-60%
b.葡萄糖0.5-2.5%
c.半乳糖0.5-2.5%
d.寡糖和β-低聚半乳糖20-50%
e.唾液酸基乳糖0.2-2%。
5.权利要求1-3任意一项所述的寡糖混合物，其中当所述混合物的水分含量为2.5%时，该混合物的玻璃转化温度(Tg)在70-85℃的范围内。
6.权利要求1-3任意一项所述的寡糖混合物，其特征在于其为粉末的形式并且还包含低于5%的载体分子。
7.权利要求1-3任意一项所述的寡糖混合物，其特征在于其为浓缩糖浆的形式，其具有60-85%的总固体(TS)，优选大于74%TS。
8.包含前述权利要求任意一项所述的寡糖混合物的营养组合物。
9.权利要求9所述的营养组合物，其进一步包含益生菌，优选其中所述寡糖混合物促进所述益生菌在消化道或肠道中的生长或繁殖。
10.权利要求8或9所述的营养组合物，其是一阶段婴儿配方产品、婴儿配方产品、幼儿食品、婴儿谷物组合物、后续配方食品或成长乳，优选一阶段婴儿配方产品。
11.权利要求8、9或10所述的营养组合物用于增强免疫保护和/或降低感染的风险和/或降低食物过敏的发生以及相关的食品过敏对健康的影响的用途。
12.生产得自牛乳的寡糖混合物的方法，其包括如下步骤
a)浓缩去蛋白的牛乳原料至50-75%总固体(TS);
b)将浓缩的牛乳原料进行去除乳糖的步骤以制备乳糖:寡糖比低于100的液体;
c)任选地澄清所述的液体;
d)将任选澄清的液体用β-半乳糖苷酶处理以制备包含β-低聚半乳糖的液体;
e)任选地通过例如将液体通过弱阳离子柱和任选的混合床柱和/或阴离子交换柱进行脱盐;
f)进行纳滤步骤，其可在任选的脱盐步骤之前或之后进行，但必需在用β-半乳糖苷酶处理之后或处理的同时进行。
13.权利要求12的方法，其中步骤b)包括乳糖结晶步骤和去除乳糖结晶并制得乳糖:寡糖比低于100的液体的浓缩步骤，如果需要，这些步骤反复进行。
14.权利要求12或13的方法，其中对步骤a)至f)进行适应性修改以获得总单糖含量低于5%w/v，优选低于3%w/v并且乳糖:寡糖比低于20，优选低于10的混合物。
15.权利要求12至14任意一项所述的方法，其中所述方法适于获得权利要求1至7任意一项所述的混合物。
16.权利要求12至15任意一项所述的方法，其中所述去蛋白的牛乳原料是乳超滤渗透液或乳清超滤渗透液。
17.权利要求12至17任意一项所述的方法，其中所用的β-半乳糖苷酶得自米曲霉。
18.权利要求12至18任意一项所述的方法，其中的纳滤步骤与1-5个渗滤步骤相组合。
19.权利要求12至19任意一项所述的方法，还包括将液体产物喷雾干燥以得到粉末的步骤。
20.权利要求20所述的方法，其中在喷雾干燥步骤中向混合物中添加低于5%的载体，优选0%的载体。
21.可通过权利要求12至20任意一项所述的方法获得的产品。
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