CN103539787B - 异穿心莲内酯光亲和标记分子探针、制备方法及其药物组合物 - Google Patents

异穿心莲内酯光亲和标记分子探针、制备方法及其药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异穿心莲内酯光亲和标记分子探针，其结构如式(I)所示，其中，n1＝1-5，n2＝0-2。本发明还公开了本发明的异穿心莲内酯光亲和标记分子探针的制备方法和其药物组合物。该类化合物具有较好的TNF-α抑制活性，可用于研究、发现异穿心莲内酯对巨噬细胞功能调节作用的靶蛋白，并作为工具药用于该靶蛋白的诊断试剂及其调节剂的药物开发。

Description

异穿心莲内酯光亲和标记分子探针、制备方法及其药物组合物
技术领域
本发明涉及一种异穿心莲内酯光亲和标记分子探针，它们的合成方法，及含有它们的药物组合物。
技术背景
近数十年来，由于计算机科学、生命科学、化学等学科的交叉渗透，新药研发的模式和方法也发生了巨大变化，产生了一系列新的理论、方法和技术。当今创新药物的发现越来越依赖于靶点的发现以及靶点与活性化合物作用模式的确定，而目前基因水平上的生物技术还不能解决哪种蛋白质是针对某种疾病的小分子药物的靶点，因此针对药物发现研究的技术重心由基因组转向了蛋白质组。而最近几十年发展起来的小分子探针标记技术在药物靶点发现过程中有着无可比拟的优势，极大的促进了药物研发的进程。
光亲和标记小分子探针是一种活性基于蛋白谱技术，结合现代分子生物学、细胞生物学和有机化学等多学科的优势，用于包括靶点发现在内的蛋白质功能研究的高选择性的分子探针。该探针主要包括四个功能部位：活性基团、光亲和标记基团、连接基团和报告基团或潜在的报告基团(可以与连有叠氮基团的生物素等发生“click”反应引入报告基团)。光亲和标记基团的作用是在探针分子与靶点蛋白形成复合物后经紫外光照射，光亲和标记基团分解产生很活泼的反应中间体卡宾或氮宾，该中间体含有自由电子对，可以将探针分子以共价键结合的方式稳固地标记在靶点蛋白的活性部位，然后再利用潜在的报告基团进行分离、纯化、检测等操作。因此光亲和标记技术是研究分子水平上配体与靶标间相互作用的重要方法。
开展小分子探针标记技术研究对于已知药理活性而靶点不明确的活性分子具有重要意义。比如新的药物靶点的发现，或者对一个已知蛋白的功能作新的阐述，这对于从分子水平阐明疾病的发生、发展及治疗的意义是不言而喻的。这些靶点可被发展为高效、快速的高通量筛选模型，并在短时间内随机筛选大量的小分子化合物，发现一些更高活性的小分子化合物作为先导物用于进一步的新药开发研究。这样，从一个小分子探针为起点，其母体化合物或许在类药性、有效性，甚至代谢稳定性等方面存在问题，但新发现的化合物则不受原有结构的限制，有更宽的改造空间。
异穿心莲内酯是一种穿心莲二萜内酯化合物，其分子结构为：
异穿心莲内酯主要存在于穿心莲的地上部分，但由于含量较少，通常以穿心莲内酯为起始原料，采用半合成的方式得到。近年来的研究表明异穿心莲内酯具有诸多的药理活性，如抗炎抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、清热解毒、抗心血管疾病、增强免疫功能等。河南大学天然药物研究所韩光等报道了异穿心莲内酯对人体HL-60细胞具有较高强度的抑制活性(IC50＝7.15μmol·L-1)，他们还测试了异穿心莲内酯对于H22肝癌皮下移植肿瘤的模型动物小鼠具有非常显著的抗肿瘤活性，筛选剂量为100mg·kg-1时，发现异穿心莲内酯的抑制率为61.2％，并且对小鼠免疫功能无影响。
巨噬细胞为一类参与炎症和免疫反应的重要细胞，存在着复杂的信号传导和调控网络，调控巨噬细胞的活化与功能对败血症等失控性炎症反应，免疫缺陷和自身免疫性疾病的防治具有重要意义。我们的研究发现异穿心莲内酯对巨噬细胞活化及功能状态具有双向调节作用，且至少部分是通过对巨噬细胞内的信号传导通路调节来实现的，但其靶蛋白及其作用机制尚未完全阐明。设计、制备异穿心莲内酯光亲和标记分子探针可用于寻找和揭示它们在巨噬细胞信号传导通路及调控网络中的靶蛋白，发现新的药物靶点，提取它们与靶点相互作用的结构信息，获取构效关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种异穿心莲内酯光亲和标记分子探针。该化学小分子探针可用于研究、发现异穿心莲内酯对巨噬细胞功能调节作用的靶蛋白、其与靶蛋白的作用模式、活性位点的结构信息，为相关药物的研发提供重要信息；该化合物还可作为工具药用于该靶蛋白异常的诊断试剂及其调节剂的药物研发。
本发明的目的还在于提供一种异穿心莲内酯光亲和标记分子探针的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种含有异穿心莲内酯光亲和标记分子探针的药物组合物。
详细发明内容如下：
本发明合成了一系列异穿心莲内酯光亲和标记分子探针(I)，该分子探针的特征在于包括四个功能部位：活性基团、光亲和标记基团、潜在的报告基团和连接基团，其分子结构为：
其中，n1＝1-5，n2＝0-2。
部分化合物的结构为：
通式I化合物制备方法，方法如下：
以穿心莲内酯为起始原料，在浓盐酸作用下异化，得到异穿心莲内酯II，II与溴乙酰溴经酯化反应得到化合物III，III与经修饰的光亲和标记基团IV经酯化反应得到化合物V，V与溴乙酰溴经酯化反应得到化合物VI，再经醚化反应依次连接连接基团VII和带有潜在报告基团的片段VIII得到目标产物异穿心莲内酯光亲和标记小分子探针I。
具体反应步骤为：
其中，化合物IV的制备为参考文献方法获得(Zhang LY，Zhang YX，Dong JZ，et al.Designand synthesis of novel photoaffinity probes for study of the target proteins of oleanolic acid[J].Bioorg.Med.Chem.Let.，2012，22，1036-1039)；化合物VII和VIII直接由市售购得。
以下是本发明部分化合物的药理学实验数据：
1、化合物对小鼠巨噬细胞中正常TNF-α和脂多糖(LPS)诱导的TNF-α表达的调控作用
TNF-α的酶联免疫吸附实验分析(ELISA)：取小鼠J774A.1的巨噬细胞，加入20μM的待试化合物、异穿心莲内酯、溶剂对照孵化24h。收集培养基，离心5min(14000rpm)。取上清液分组于-70℃保存。以小鼠TNF-α的ELISA试剂盒检测培养基中TNF-α的含量。活细胞组的蛋白总浓度用Bio-Rad蛋白分析试剂测定。根据蛋白总量得培养基中TNF-α的总量。化合物对小鼠巨噬细胞中正常TNF-α表达和LPS诱导的TNF-α表达的调控作用如表1。结果表明化合物均对LPS诱导的巨噬细胞中TNF-α的过量表达有抑制作用，而对生理状态下巨噬细胞中TNF-α的表达则表现为促进或弱抑制的作用，表现为双向调控作用，且部分化合物的调控作用与异穿心莲内酯类似。
表1.化合物对小鼠巨噬细胞中正常TNF-α表达和LPS诱导的TNF-α表达的抑制作用
上述药理学数据表明，本发明通式(I)化合物对巨噬细胞的生物活性与异穿心莲内酯类似，可以作为巨噬细胞功能的调节剂，也可以用于异穿心莲内酯在巨噬细胞中靶标蛋白的研究。
2.化合物I1对小鼠巨噬细胞蛋白提取液的标记实验
J774A.1细胞培养在直径为10cm的培养皿中，待培养至80％左右密度时，以含0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶消化，细胞经预冷PBS漂洗3次，离心收集在1.5mL的离心管中，加入450μL裂解液(含蛋白酶抑制剂)反复吹打。冰浴中超声破碎仪超声处理，超声时间为5s，间歇时间为10s，功率100W，超声处理至溶液清澈无粘稠物为止。4℃下离心45min(100000g)，取上清考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，PBS液稀释为终浓度2.0mg/mL溶液，-80℃贮存备用。
在上述细胞蛋白组液中加入不同浓度的化合物I1(终浓度为0.10μM)，4℃孵育8h。UV照射进行光亲和反应(220V，6W，365nm，30min)，加入生物素片段，进行“Click”反应10min。反应混合物离心10min(48000g)，移去上清液，沉淀重悬于裂解液中(urea 480mg/L，chaps 40mg/L，Tris-base 4.8mg/L，DTT 10mg/L，Ampholate 50mL/L，bromophenol blue 0.002％)，于4℃孵育1h，离心2h(18000g)。
取上清液在SDS-PAGE胶上进行电泳，电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用PBS液(含1％BSA和0.05％吐温20)封闭1h，PBS液(含0.05％吐温20)漂洗2次，每次5min。加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(streptavidin-HRP，Sigma Cat.S2438)(1∶10000PBS稀释，0.05％吐温20)室温孵育1h，PBS液洗6次，每次5min。最后，用增强化学发光检测试剂(EnhancedChemiLuminescence，Amersham产品)对该膜检测。
与生物素结合的蛋白将被标记，与空白对照组相比，即可检测出与探针结合的靶标蛋白，得到其表观分子量。
本实验中，化合物I1作用的蛋白组在SDS-PAGE胶上出现一个特殊条带。其中一个条带经分离、鉴定为NF-κB，且可以被异穿心莲内酯竞争结合。已有文献报道穿心莲内酯可以共价键与p50亚单位结合，抑制NF-κB活化，阻断NF-κB与DNA的结合，从而减少巨噬细胞中多种炎症因子基因的表达(Xia YF，Ye BQ，Li YD，et al.Andrographolide attenuatesinflammation by inhibition of NF-κB activation through covalent modification of reduced cysteine62 of p50[J].J.Immunol.，2004，173，4201-4217；Chao WW，Kuo YH，Lin BF.Anti-inflammatoryactivity of new compounds from andrographis paniculata by NF-κB transactivation inhibition[J].J.Agr.Food Chem.，2010，58，2505-2512.)。本实验的研究结果进一步证明了穿心莲内酯类化合物可通过作用于NF-κB信号通路发挥抗炎活性。此外，本实验中发现的另一个作用靶点蛋白为约70kDa的受体蛋白，还有待进一步研究。
以上蛋白标记结果显示，本发明通式(I)化合物可以作为工具药用于NF-κB等靶标蛋白异常的诊断试剂及其调节剂的药物研发。
本发明还包括药物制剂，该制剂包含作为活性剂的通式(I)化合物及药学上可接受的载体。
具体实施方式：
现结合实例详细说明本发明的技术方案。所有的实例都严格按照上述的制备方法的操作步骤进行操作。
实施例1
异穿心莲内酯II的制备
5.0g穿心莲内酯溶于80mL浓盐酸，室温下磁力搅拌至完全溶解，放置过夜。反应毕，将反应液倾入装有冰冷200mL饱和食盐水的烧杯中，搅拌下缓慢加入饱和碳酸钠溶液至pH约为7.0。乙酸乙酯(100mL×8)萃取，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，粗品用无水乙醇重结晶得到3.0g白色固体，收率60％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.29(1H，overlapped signal，H-14)，4.82(2H，s，H-15)，4.71(1H，t，J＝20.0Hz，H-12)，4.27(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，3.47(1H，dd，J＝4.0Hz，8.0Hz，H-3)，3.38(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，2.48～2.42(4H，-OH，11)，2.25～2.19(2H，7a，9)，2.07～1.99(1H，H-7b)，1.88～1.69(3H，H-2a，6)，1.58～1.43(4H，H-1，2b，5)，1.27(3H，s，H-17)，1.12(3H，s，H-18)，0.96(3H，overlapped-signal，H-20).
实施例2
化合物III1的制备
1.0g II溶于130mL二氯甲烷，加入0.515g K2CO3，室温磁力搅拌30min，再缓慢滴加0.638g溴乙酰溴，室温反应3h。反应毕，饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水硫酸镁干燥，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到1.145g化合物III1，收率85％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.29(1H，overlapped signal，H-14)，4.83(2H，s.H-15)，4.73(1H，t，J＝20.0Hz，H-12)，4.56(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.26(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.86(2H，s，19-COCH 2 Br)，3.36(1H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，H-3)，2.51～2.45(1H，H-11a)，2.26～2.19(5H，-OH，7a，9，11b)，2.08～2.02(1H，H-7b)，1.83～1.50(7H，H-1，2，5，6)，1.23(3H，s，H-17)，1.13(3H，overlapped-signal，H-18)，1.00(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物III2的制备
参照III1的制备方法，由化合物II与氯丙酰溴制得III2，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到白色固体，收率为80％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.27(1H，overlapped signal，H-14)，4.81(2H，s，H-15)，4.73(1H，t，J＝20.0Hz，H-12)，4.56(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.30(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.45(2H，s，19-COCH2 CH 2 Br)，3.36(1H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，H-3)，2.51～2.45(1H，H-11a)，2.26～2.17(7H，-OH，7a，9，11b，19-COCH 2 )，2.08～2.02(1H，H-7b)，1.83～1.49(7H，H-1，2，5，6)，1.23(3H，s，H-17)，1.10(3H，overlapped-signal，H-18)，0.97(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物III3的制备
参照III1的制备方法，由化合物II与氯丁酰溴制得III3，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到白色固体，收率为80％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.27(1H，overlapped signal，H-14)，4.80(2H，s，H-15)，4.68(1H，t，J＝20.0Hz，H-12)，4.56(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.26(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.36(1H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，H-3)，3.28(2H，s，19-CO(CH2)2 CH 2 Br)，2.53～2.45(1H，H-11a)，2.24～2.15(7H，-OH，7a，9，11b，19-COCH 2 )，2.08～2.01(3H，H-7b，19-COCH2 CH 2 )，1.83～1.50(7H，H-1，2，5，6)，1.23(3H，s，H-17)，1.13(3H，overlapped-signal，H-18)，0.97(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物III4的制备
参照III1的制备方法，由化合物II与氯戊酰溴制得III4，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到白色固体，收率为80％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.29(1H，overlapped signal，H-14)，4.79(2H，s，H-15)，4.73(1H，t，J＝20.0Hz，H-12)，4.56(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.26(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.37(1H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，H-3)，3.26(2H，s，19-CO(CH2)3 CH 2 Br)，2.51～2.45(1H，H-11a)，2.24～2.19(5H，-OH，7a，9，11b)，2.08～2.02(3H，H-7b，19-COCH 2 )，1.83～1.49(11H，H-1，2，5，6，19-COCH2 (CH 2 ) 2 )，1.21(3H，s，H-17)，1.15(3H，overlapped-signal，H-18)，0.99(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物III5的制备
参照III1的制备方法，由化合物II与氯己酰溴制得III5，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到白色固体，收率为80％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：7.31(1H，overlapped signal，H-14)，4.88(2H，s，H-15)，4.75(1H，t，J＝20.0Hz，H-12)，4.58(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.27(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.36(1H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，H-3)，3.21(2H，s，19-CO(CH2)4 CH 2 Br)，2.51～2.40(1H，H-11a)，2.26～2.19(5H，-OH，7a，9，11b)，2.10～2.02(3H，H-7b，19-COCH 2 )，1.83～1.32(13H，H-1，2，5，6，19-COCH2 (CH 2 ) 3 CH2)，1.26(3H，s，H-17)，1.19(3H，overlapped-signal，H-18)，1.03(3H，overlapped-signal，H-20).
实施例3
化合物V1的制备
0.5g化合物III1溶于50mL丙酮，加入0.2g K2CO3，室温磁力搅拌30min，再逐渐加入0.31g光亲和标记基团IV，室温磁力搅拌4h。反应毕，将反应液倾入装有100mL饱和碳酸氢钠溶液的烧杯中，二氯甲烷(100mL×3)萃取，依次采用饱和碳酸氢钠溶液(100mL×3)、饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸镁干燥，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到0.610g化合物V1，收率91％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.17(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.76(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.69(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.27(1H，overlapped-signal，H-14)，6.68(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，4.88(2H，d，J＝2.5Hz，19-COCH 2 )，4.79(2H，s，H-15)，4.69(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.61(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.25(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.3l(1H，t，J＝16.0Hz，H-3)，2.46～1.98(4H，-OH，11)，1.79～1.43(7H，2，6，7，9)，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.15(3H，s，H-17)，1.08(3H，overlapped-signal，H-18)，0.97(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物V2的制备
参照V1的制备方法，由化合物III2与光亲和标记基团IV制得V2，硅胶柱层析分离(V石 油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得淡黄色固体，收率为90％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.15(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.76(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.63(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.28(1H，overlapped-signal，H-14)，6.68(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，4.79(2H，s，H-15)，4.69(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.61(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.55(2H，d，J＝2.5Hz，19-COCH2 CH 2 )，4.25(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.31(1H，t，J＝16.0Hz，H-3)，2.46～1.94(6H，-OH，11，19-COCH 2 )，1.79～1.42(7H，2，6，7，9)，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.15(3H，s，H-17)，1.09(3H，overlapped-signal，H-18)，0.96(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物V3的制备
参照V1的制备方法，由化合物III3与光亲和标记基团IV制得V3，硅胶柱层析分离(V石 油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得黄色固体，收率为90％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.19(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.74(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.69(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.27(1H，overlapped-signal，H-14)，6.68(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，4.79(2H，s，H-15)，4.69(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.61(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.25(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.15(2H，d，J＝2.5Hz，19-CO(CH2)2 CH 2 )，3.31(1H，t，J＝16.0Hz，H-3)，2.48～2.01(8H，-OH，11，19-CO(CH 2 ) 2 )，1.79～1.43(7H，2，6，7，9)，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.15(3H，s，H-17)，1.10(3H，overlapped-signal，H-18)，0.96(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物V4的制备
参照V1的制备方法，由化合物III4与光亲和标记基团IV制得V4，硅胶柱层析分离(V石 油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得黄色固体，收率为90％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.20(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.79(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.69(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.27(1H，overlapped-signal，H-14)，6.71(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，4.79(2H，s，H-15)，4.69(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.61(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.25(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.17(2H，d，J＝2.5Hz，19-CO CH2(CH2)2 CH 2 )，3.31(1H，t，J＝16.0Hz，H-3)，2.46～1.98(6H，-OH，11，19-COCH 2 )，1.79～1.39(11H，2，6，7，9，19-COCH2 (CH 2 ) 2 )，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.15(3H，s，H-17)，1.09(3H，overlapped-signal，H-18)，0.97(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物V5的制备
参照V1的制备方法，由化合物III5与光亲和标记基团IV制得V5，硅胶柱层析分离(V石 油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得黄色固体，收率为90％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.15(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.78(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.69(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.29(1H，overlapped-signal，H-14)，6.68(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，4.79(2H，s，H-15)，4.69(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.61(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.25(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.15(2H，d，J＝2.5Hz，19-CO(CH2)4 CH 2 )，3.31(1H，t，J＝16.0Hz，H-3)，2.46～1.98(4H，-OH，11，19-COCH 2 )，1.79～1.43(11H，2，6，7，9，19-COCH2 CH 2 CH2 CH 2 )，1.30～1.24(5H，H-1，5，19-COCH2CH2 CH 2 CH2)，1.15(3H，s，H-17)，1.05(3H，overlapped-signal，H-18)，0.97(3H，overlapped-signal，H-20).
实施例4
化合物IV的制备
5.0g对硝基苯甲酰氯溶于50mL甲苯，分批加入5.04g无水AlCl3，室温磁力搅拌24h。反应毕，加入50mL蒸馏水，室温磁力搅拌30min，依次用饱和碳酸氢钠溶液(30mL×3)，饱和食盐水(30mL×3)洗涤，无水硫酸镁干燥。蒸去溶剂，残余物用二氯甲烷溶解，缓慢滴加石油醚直至有晶体析出，置于冰箱，过滤，干燥，得5.2g淡黄色固体。
将产物溶于42mL乙酸，分批加入7.04g三氧化铬，再缓慢滴加7.3mL浓硫酸，室温磁力搅拌8h。反应毕，将反应液倒入100mL冰水中，用乙酸乙酯(50mL×4)萃取，再用饱和食盐水洗涤至pH大约为6.0，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸去溶剂，残余物用无水乙醇重结晶，得到5.06g淡蓝色固体。
将1.0g产物溶于180mL无水乙醇，50℃下磁力搅拌1h，再加入3.22g氯化亚锡，在氮气保护，50℃条件下，磁力搅拌18h。反应毕，过滤，滤液倒入200mL饱和食盐水，用二氯甲烷(100mL×4)萃取，滤液用饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸去溶剂，得到0.73g淡桔黄色固体，收率58.5％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：13.22(1H，s，-COOH)，8.07(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.69(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.55(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，6.64(2H，d，J＝12.0Hz，ph)，6.25(2H，s，-NH2).
实施例5
化合物VI1的制备
0.5g V1溶于100mL二氯甲烷，加入0.141g K2CO3，室温磁力搅拌15min，再加入70μL溴乙酰溴。室温磁力搅拌1h后，升温至50℃，磁力搅拌4h。反应毕，二氯甲烷200mL稀释，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸镁干燥，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到0.51g淡黄色油状物，收率85.6％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.11(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.74～7.66(6H，ph)，7.22(1H，overlapped-signal，H-14)，4.82(2H，d，J＝2.5Hz，19-COCH 2 )，4.74(2H，s，H-15)，4.60(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.52(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.21(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.94(2H，s，H-ph-NHCOCH 2 )，3.24(1H，t，J＝12.0Hz，H-3)，2.46～1.98(4H，-OH，11)，1.79～1.43(7H，2，6，7，9)，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.08(3H，s，H-17)，1.01(3H，overlapped-signal，H-18)，0.89(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物VI2的制备
参照VI1的制备方法，由化合物V2与溴乙酰溴制得VI2，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到0.49g淡黄色油状物，收率82.5％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.13(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.76～7.65(6H，ph)，7.21(1H，overlapped-signal，H-14)，4.75(2H，s，H-15)，4.60(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.55(2H，d，J＝2.5Hz，19-COCH2 CH 2 )，4.51(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.21(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，3.95(2H，s，H-ph-NHCOCH 2 )，3.24(1H，t，J＝12.0Hz，H-3)，2.46～1.98(6H，-OH，11，19-COCH 2 )，1.79～1.43(7H，2，6，7，9)，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.09(3H，s，H-17)，1.01(3H，overlapped-signal，H-18)，0.86(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物VI3的制备
参照VI1的制备方法，由化合物V3与溴乙酰溴制得VI3，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙 酯＝1∶1)，得到0.53g淡黄色油状物，收率89.5％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.11(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.75～7.67(6H，ph)，7.23(1H，overlapped-signal，H-14)，4.74(2H，s，H-15)，4.60(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.51(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.21(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.15(2H，d，J＝2.5Hz，19-CO(CH 2 ) 2 CH 2 )，3.95(2H，s，H-ph-NHCOCH 2 )，3.24(1H，t，J＝12.0Hz，H-3)，2.48～1.98(8H，-OH，11，19-CO(CH 2 ) 2 )，1.79～1.43(7H，2，6，7，9)，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.11(3H，s，H-17)，1.01(3H，overlapped-signal，H-18)，0.91(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物VI4的制备
参照VI1的制备方法，由化合物V4与溴乙酰溴制得VI4，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到0.50g淡黄色油状物，收率84.8％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.11(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.75～7.67(6H，ph)，7.23(1H，overlapped-signal，H-14)，4.74(2H，s，H-15)，4.60(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.51(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.21(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.17(2H，d，J＝2.5Hz，19-CO CH2(CH2)2 CH 2 )，3.95(2H，s，H-ph-NHCOCH 2 )，3.24(1H，t，J＝12.0Hz，H-3)，2.45～1.98(6H，-OH，11，19-CO CH 2 )，1.79～1.39(11H，2，6，7，9，19-CO CH2 (CH 2 ) 2 )，1.30～1.24(3H，H-1，5)，1.18(3H，s，H-17)，1.05(3H，overlapped-signal，H-18)，0.97(3H，overlapped-signal，H-20).
化合物VI5的制备
参照VI1的制备方法，由化合物V2与溴乙酰溴制得VI2，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶1)，得到0.49g淡黄色油状物，收率83.1％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.15(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.78～7.68(6H，ph)，7.21(1H，overlapped-signal，H-14)，4.76(2H，s，H-15)，4.61(1H，t，J＝16.0Hz，H-12)，4.50(1H，d，J＝12.0Hz，H-19a)，4.23(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.15(2H，d，J＝2.5Hz，19-CO(CH2)4 CH 2 )，3.98(2H，s，H-ph-NHCOCH 2 )，3.31(1H，t，J＝12.0Hz，H-3)，2.47～1.98(6H，-OH，11，19-CO CH 2 )，1.79～1.39(11H，2，6，7，9，19-CO CH2 CH 2 CH2 CH 2 )，1.30～1.24(5H，H-1，5，19-COCH2CH2 CH 2 CH2)，1.15(3H，s，H-17)，1.05(3H，overlapped-signal，H-18)，0.94(3H，overlapped-signal，H-20).
实施例6
化合物I1的制备
0.1g化合物VII1溶于25mL THF中，冰浴下缓慢加入0.07gNaH，室温磁力搅拌0.5h，再逐渐滴加960μL化合物VIII，室温磁力搅拌3h。反应毕，过滤，蒸去溶剂。硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝1∶2)得到0.09g无色油状物。
称取0.15g Boc-甘氨酸溶于15mL二氯甲烷中，加入适量DMAP，将产物溶于反应液中，冰浴条件下加入122μL DIC，室温磁力搅拌5h。反应毕，将反应液过滤，蒸去溶剂，硅胶柱层析(V石油醚∶V乙酸乙酯＝2∶1)，得到0.133g淡黄色油状物。再将产物溶于5mL 1M HCl乙酸乙酯溶液中，室温磁力搅拌4h，反应毕，蒸去溶剂，采用无水乙醇重结晶，得到0.075g白色固体。
再将所得产物溶于10mL乙腈中，加入0.068g K2CO3，室温磁力搅拌30min，再加入0.30g化合物V1，室温磁力搅拌10h。反应毕，过滤，蒸去溶剂，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝2∶1)，得到0.26g化合物I1，收率78％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.44(1H，s，ph-NH)，8.21(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.82(4H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，ph)，7.71(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.28(1H，overlapped-signal，H-14)，4.91(2H，d，J＝8.0Hz，19-COCH 2 )，4.83(2H，s，H-15)，4.68(2H，dd，J＝12.0Hz，8.0Hz，H-12，19a)，4.43(2H，ph-NHCOCH2NHCH2COOCH 2 )，4.27(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.18(2H，-OCH 2 CCH)，3.76(2H，ph-NHCOCH2NHCH2COOCH2 CH 2 )，3.30(1H，m，J＝16.0Hz，H-3)，2.83(4H，ph-NHCOCH 2 NHCH 2 )，2.46～1.98(3H，11，-CCH)，1.83～1.60(9H，-OH，2，5，6，7，9)，1.28～1.19(2H，H-1)，1.10(6H，d，H-17，18)，0.96(3H，s，H-20).
化合物I2的制备
参照I1的制备方法，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝2∶1)，得到0.24g化合物I2，收率72％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.45(1H，s，ph-NH)，8.20(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.84(4H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，ph)，7.71(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.27(1H，overlapped-signal，H-14)，4.93(2H，d，J＝8.0Hz，19-COCH 2 )，4.81(2H，s，H-15)，4.68(2H，dd，J＝12.0Hz，8.0Hz，H-12，19a)，4.41(2H，ph-NHCOCH2NHCH2COOCH 2 )，4.27(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.18(2H，-OCH 2 CCH)，3.77(2H，ph-NHCOCH2NHCH2COOCH2 CH 2 )，3.67(4H，-O(CH 2 ) 2 OCH2CCH)，3.31(1H，m，J＝12.0Hz，H-3)，2.81(4H，ph-NHCOCH 2 NHCH 2 )，2.46～2.01(4H，-OH，11，-CCH)，1.83～1.55(9H，-OH，2，5，6，7，9)，1.28～1.20(2H，H-1)，1.09(6H，d，H-17，18)，1.01(3H，s，H-20).
化合物I3的制备
参照I1的制备方法，硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯＝2∶1)，得到0.21g化合物I2，收率70％。1H-NMR(CDCl3，400MHz)δ：8.47(1H，s，ph-NH)，8.25(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.84(4H，dd，J＝8.0Hz，4.0Hz，ph)，7.73(2H，d，J＝8.0Hz，ph)，7.27(1H，overlapped-signal，H-14)，4.93(2H，d，J＝8.0Hz，19-COCH 2 )，4.81(2H，s，H-15)，4.68(2H，dd，J＝12.0Hz，8.0Hz，H-12，19a)，4.39(2H，ph-NHCOCH2NHCH2COOCH 2 )，4.27(1H，d，J＝12.0Hz，H-19b)，4.18(2H，-OCH 2 CCH)，3.80(2H，ph-NHCOCH2NHCH2COOCH2 CH 2 )，3.57～3.50(8H，-O(CH 2 ) 2 O(CH 2 ) 2 OCH2CCH)，3.36(1H，m，J＝12.0Hz，H-3)，2.80(4H，ph-NHCOCH 2 NHCH 2 )，2.46～2.01(4H，-OH，11，-CCH)，1.83～1.55(9H，-OH，2，5，6，7，9)，1.28～1.20(2H，H-1)，1.13(6H，d，H-17，18)，1.00(3H，s，H-20).

Claims (4)

1.一种异穿心莲内酯光亲和标记分子探针(I)，其特征在于包括四个功能部位：活性基团、光亲和标记基团、潜在的报告基团和连接基团，其分子结构为：
其中，n1＝1-5，n2＝0-2。
2.根据权利要求1所述化合物，其中化合物可以是下列任一化合物：
3.一种权利要求1的化合物的制备方法，其包括：以穿心莲内酯为起始原料，在浓盐酸作用下异化，得到异穿心莲内酯II，II与溴乙酰氯经酯化反应得到化合物III，III与经修饰的光亲和标记基团IV经酯化反应得到化合物V，V与溴乙酰溴经酯化反应得到化合物VI，再经醚化反应依次链接连接基团VII和带有潜在报告基团的片段VIII得到目标产物异穿心莲内酯光亲和标记小分子探针I，其合成路线如下：
4.一种药物组合物，其中含有治疗或诊断有效量的权利要求1所述的式(I)化合物及药学上可接受的载体。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN101028260A (zh) * 2007-02-06 2007-09-05 中国药科大学 取代的异穿心莲内酯衍生物的用途
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CN100999520A (zh) * 2007-01-05 2007-07-18 郑州大学 异穿心莲内酯类似物及其制备方法
CN101028260A (zh) * 2007-02-06 2007-09-05 中国药科大学 取代的异穿心莲内酯衍生物的用途
CN101029046A (zh) * 2007-02-06 2007-09-05 中国药科大学 取代的异穿心莲内酯衍生物、制备方法及其药物组合物

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