CN103534629A

CN103534629A - 显微镜系统

Info

Publication number: CN103534629A
Application number: CN201280021356.2A
Authority: CN
Inventors: 福武直树; 矢泽洋纪; 中山繁; 中岛伸一
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2011-05-18
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2032-01-25
Also published as: US9261690B2; TWI525343B; US20120293644A1; JP5804441B2; EP2710424A1; WO2012157295A1; CN103534629B; TW201250287A; JP2012242532A

Abstract

一种相位对比显微镜系统，该系统包含：照明光学系统，其采用来自光源的照明光照明样本；成像光学系统，其从来自样本的光形成样本的图像;第一空间调制元件，其布置在成像光学系统的光瞳位置处并且改变来自样本的光振幅透射率分布；图像传感器，其检测由成像光学系统所形成的样本的图像并且输出图片信号；计算部件，其基于由图像传感器检测到的输出数据以及由第一空间调制元件形成的来自样本的光振幅透射率分布来计算适合用于观察样本的来自样本的光振幅透射率分布。

Description

显微镜系统

技术领域

本发明涉及一种显微镜系统，该显微镜系统通过使用相位对比来推定并且形成适合观察的照明光分布。

本发明要求于2011年5月18日提交的日本专利申请No.2011-111032的优先权，其内容通过引用合并于此。

背景技术

在相位对比显微镜中，环形孔径与相位环形成照明光的强度分布。

因为照明光强度分布对样本的观察图像有巨大影响，所以已经对相位环进行测试以便进一步改善样本的观察图片。例如，在日本待审专利申请公开No.2009-2371091中，提出调制部件以围绕在相位环的环形形状中形成的环形区域，形成该环形区域使得调制部件的透射轴的方向与该调制部件以外的区域的透射轴方向不同，从而呈现能够连续改变对比的相位对比显微镜。

发明内容

然而，在上述显微镜中，相位环的形状在某种程度上是固定的，而且照明光分布的调整存在限制。此外，即使在选择相位环的形状的情况下，该选择也基于观察者的决定或经验来实施，从而相位环的形状不会总是形成以能够在观察期间以其最优条件来观察对象图像。所以，在相位对比显微镜中，难以在观察期间随意选择形状并且以其最优条件来观察对象的图像。

因此，本发明提供一种显微镜系统，该系统推定并且形成适合观察样本的光振幅透射率分布。

根据本发明的一方面的相位对比显微镜系统包含：照明光学系统，其采用来自光源的照明光来照明样本；成像光学系统，其从来自样本的光形成样本图像；第一空间调制元件，其被放置在成像光学系统的光瞳位置并且改变来自样本的光的振幅透射率分布；图像传感器，其通过成像光学系统检测样本图像并且输出图片信号；计算部件，其基于由图像传感器检测到的输出数据以及由第一空间调制元件形成的来自样本的光振幅透射率分布来计算适用于观察样本的来自样本的光振幅透射率分布。

根据本发明一方面的程序，该程序观察安装在连接到显微镜的计算部件中的样本。该显微镜包含：照明光学系统，其采用来自光源的照明光来照明样本；成像光学系统，其从来自样本的光来形成样本图像；第一空间调制元件，其被放置在成像光学系统的光瞳位置处并且改变来自样本的光振幅透射率分布；图像传感器，其通过成像光学系统检测样本图像并且输出图片信号。

该程序使计算部件基于由图像传感器检测到的输出数据以及来自通过第一空间调制元件形成的来自样本的光振幅透射率分布来执行适合用于观察样本的来自样本的光振幅透射率分布的计算。

根据本发明的方面，提供一种显微镜系统，该显微镜系统在观察期间推定并且形成适于以良好条件观察对象图像的光振幅透射率分布。

附图说明

图1是显微镜系统的示意性配置图。

图2A是形成DMD的照明区域和光阻挡区域的图。

图2B是形成液晶元件的相位调制区域和衍射光透射区域的图。

图3是显微镜系统的示意性配置图。

图4通过使用爬坡法从适于观察的样本找到光振幅透射率分布的流程图。

图5是在显示部件中示出的区域设定部分和波段设定部分的图。

图6A至6C是示出照明区域和相位调制区域的改变的图。

图7是基因算法流程图。

图8是示出照明区域和相位调制区域的示例的图。

图9是评估函数Q（f）的概念图。

参考标记描述

20：计算部件

21：显示部件

22：区域设定部分

23：参数设定部分

24：观察区域

30：照明光源

40：照明光学系统

50：镜台

70：成像光学系统

71：物镜

80：图像传感器

43：DMD（第二空间调制元件）

49：衍射光栅（第二空间调制元件）

43：数字微镜装置（DMD）

73：液晶元件（第一空间调制元件）

731：相位调制区域

735：衍射光透射区域

100,200：显微镜系统

TS：样本

具体实施方式

（第一示例）

作为第一示例，将给出显微镜系统100的描述，该显微镜系统100通过推定照明光强度分布和光振幅透射率分布而自动调整。特别地，显微镜系统100适用于不改变光（尤其是透射光）的强度和仅改变相位的相位对象，诸如无色透明细胞。

<显微镜系统100>

图1是显微镜系统100的示意性配置图。显微镜系统100包括显微镜，该显微镜主要包含：照明光源30；照明光学系统40；镜台50；成像光学系统70以及图像传感器80。此外，显微镜系统100包含诸如计算机的计算部件20。在下文中，从照明光源30发射的光线的中心轴被设定为Z轴方向，而垂直于Z轴并且彼此正交的方向被设定为X轴方向与Y轴方向。

照明光源30是向样本TS发射诸如白色照明光的照明的光源。在当前示例中，使用其中组合红色、绿色以及蓝色LED的光源作为照明光源30。尽管没有特别讨论，但是可以使用白色LED或卤素灯作为光源。照明光学系统40包含准直透镜41、第一聚光透镜42、DMD（数字微镜装置）43、第二聚光透镜45和第三聚光透镜47。

例如，作为DMD 43的第二空间调制元件放置在共轭于照明光源30的位置处。DMD 43放置在同样与在照明光学系统40内部的成像光学系统70的光瞳位置共轭的位置。DMD 43可以改变在成像光学系统70的光瞳的共轭位置的照明光的强度分布。在DMD 43的表面中，多个小的可移动反射镜（在附图中未示出）通过会聚形成并且每个镜面可以独立移动。DMD43可以将照明光的二维空间分布通过移动可移动反射镜来关于样本TS形成为随机形状和尺寸。

包括不确定结构的样本TS（诸如细胞组织）放置在镜台50上并且镜台50在XY轴方向上可移动以移动到要观察的样本TS的位置。此外，镜台50同样在Z轴方向上可移动以调节样本TS的聚焦。

成像光学系统70包括液晶元件73，该液晶元件73是物镜71和第一空间调制元件。此外，成像光学系统70向图像传感器80形成样本TS的透射光或反射光图像。

液晶元件73放置在成像光学系统70的光瞳的位置或与其接近。液晶元件73被配置为可以自由改变光的相位和光的透射率，并且同样被配置为可以基于相位和透射率改变二维空间分布。

计算部件20接收由图像传感器80检测的输出数据并允许在诸如监视器的显示部件21上显示。此外，计算部件20分析输出数据并计算照明光强度分布和来自适于样本TS观察的样本的光振幅透射分布。

在图1中，从照明光源30发射的光通过虚线示出。从照明光源30发射的照明光通过准直透镜41校准，通过第一聚光透镜42会聚并入射到DMD 43。在DMD 43中，可移动反射镜中的一些将入射光反射到第二聚光透镜45侧。此外，其余的反射镜不将入射光反射到第二聚光透镜45侧。

例如，图2A是DMD 43的平面图。例如，DMD 43改变对应于环形形状的反射镜的角度并反射入射光。然后形成照明区域431。此外，其角度没有改变的反射镜的区域是光阻挡区域435。以这种方式，照明光强度分布可以通过改变微小反射镜的角度来改变。

由DMD 43反射的照明光通过第二聚光透镜45和第三聚光透镜47通过样本TS。通过样本TS的光透射物镜71并且入射到液晶元件73。已经入射到液晶元件73的光在图像传感器80上成像，同时一部分光的相位改变。

图2B是液晶元件73的平面图。例如，相位调制区域可以在液晶元件73上形成为环形形状。通过该相位调制区域731透射的光的相位超前或滞后其四分之一波长。通过衍射光透射区域735透射的光的相位（其是相位调制区域731之外的区域）保持固定。形成相位调制区域731以与DMD 43的照明区域431共轭。液晶元件73可以自由改变相位调制区域731的二维空间分布。

显微镜系统100的零阶光（被透射的光）通过DMD 43反射并且照明区域431的照明光对样本TS照明，通过样本TS透射的光通过液晶元件73的相位调制区域731透射并且到达图像传感器80。此外，从样本TS发射的衍射光通过液晶元件73的衍射光透射区域735透射并且到达图像传感器80。然后零阶光和衍射光在图像传感器80上形成图像。因为零阶光的光强度一般强于衍射光，因此最好存在调节通过相位调制区域731的光的透射率的函数。在下文中，除非特别限定，来自样本TS的光振幅透射率分布的改变意味着相位调制区域731的二维空间分布的改变和透射率的改变。

如图1中所示，在图像传感器80上成像的图片的输出数据被发送到计算部件20。在计算部件20中，基于从图像传感器80获得图片的输出数据、由DMD 43形成的孔径431的形状数据和液晶元件73的形状数据来计算适于样本TS的观察的照明光强度分布和光振幅透射率分布。然后用于使适于样本TS的观察的所计算的照明光强度分布和照明光振幅透射率分布的形状数据等被发送到DMD 43和液晶元件73。

当适于样本TS的观察的照明形状被发送到DMD 43时，DMD 43改变照明区域431 的尺寸和形状。类似地，液晶元件73可以自由改变相位调制区域731的尺寸和形状。例如，如果DMD 43的照明区域431的直径增加，则所透射的光的数字孔径增加，因此可以增加分辨率。因为液晶元件73的相位调制区域731与DMD 43的照明区域431共轭，因此相位调制区域731可以改变照明光的强度分布。此外，最好同步改变照明区域431和相位调制区域731的形状和尺寸。

<显微镜系统200>

图3是显微镜系统200的示意性配置图。显微镜系统200被配置为与显微镜系统100基本上相同，其照明光学系统40的配置与显微镜系统100的配置不同。

显微镜系统200的照明光学系统40包括准直透镜41，可改变衍射光栅49，第二聚光透镜45和第三聚光透镜47。

作为第二空间调制元件的可改变衍射光栅49例如从两个衍射元件配置。然后，可改变衍射格栅49通过改变在两个衍射元件之间的空间中在Z轴方向上的距离或在XY轴方向上的相对位置来改变光的衍射角度。此外，可改变衍射格栅49放置于在照明光学系统40中同样与成像光学系统70的光瞳位置共轭的位置处。然后，可改变衍射格栅49可以改变与成像光学系统70的光瞳位置共轭的照明光的强度分布。

来自照明光源30的照明光由准直透镜41校准，所校准的光入射到可改变衍射格栅49。然后，可改变衍射格栅49可以照射如图2A示出的环形形状照明光。可改变衍射格栅49可以通过移动两个衍射元件关于样本TS将照明光形成为随机形状和尺寸。

作为第二空间调制元件的可改变衍射格栅49可将来自照明光源30的照明光改变成随机形状或尺寸而没有浪费。对于该原因，照明光源30的光量可以不大于必须的量。另一方面，因为DMD 43不将照明光的一部分的方向确定为如在显微镜系统100中示出的朝向样本TS，因此存在浪费来自照明光源30的光的情况。

类似于显微镜系统100，穿过样本TS的光通过物镜71透射并入射到液晶元件73。已经入射到液晶元件73的光在图像传感器80上成像，其改变光的一部分的相位。

<<照明光强度分布和光振幅透射率分布的推定方法>>

用于找到适于样本TS的观察的照明光强度分布或来自样本的光振幅透射率分布的计算方法将在下文中描述。作为计算方法，存在诸如模拟退火和禁忌（Tabu）搜索的多种方法。在下文中，将描述爬坡法（最大等级方法）和使用基因算法的方法的两种方法。

<爬坡法>

爬坡法是递增改变初始设定的照明光强度分布和光振幅透射率分布的并且获得每次改变的图片输出数据以便于因此找到在其中输出数据最接近由观察者设定的条件的方法。参考图4，将在下文给出该描述。

图4是采用DMD 43和液晶元件73通过递增改变照明光强度分布和光振幅透射率分布来找到照明光强度分布和适于观察的照明光强度分布和光振幅透射率分布的爬坡法的流程图。在步骤S101，首先将DMD 43的照明区域431设定为初始配置的尺寸和形状。此外，同样将液晶元件73的相位调制区域73设定为初始配置的二维空间分布（尺寸和形状）。此外，同样将液晶元件73的相位调制区域731的透射率设定为初始配置。

例如，在初始配置中的照明区域431为宽环形形状并且其环形外部圆具有最大直径（参考图6A）。在这种状态，样本TS的图像通过图像传感器80检测。样本TS的图像的检测拟在调节照明区域431和相位调制区域731的形状和尺寸之前获取参考图片。由图像传感器80检测的样本TS的图片输出数据被发送至计算部件20并且样本TS的图片在显示部件21（诸如连接到计算部件20的监控器）上显示。

在步骤S102，观察区域通过在显示部件21上显示的区域设定部分23（参考图5）设定在样本TS的图像上。图5是区域设定部分23和波段设定部分29的图。图5示出其中在显示部件21上显示样本TS图片的状态。在显示部件21中，区域设定部分23显示在显示部件21的周围环境中。当在区域设定部分23中的设定框架显示按钮25采用鼠标指点器MP点击时，设定框架显示按钮25在显示部件21上显示观察区域框架24。然后，观察者将显示的观察区域框架24移动到要采用鼠标指点器MP观察的样本TS的位置。然后观察者点击设定按钮27。因此，设定要通过观察者特别观察的观察区域。

在图5中，采用虚线绘出的观察区域框架24示出基于设定框架显示按钮25的点击显示的示例，而采用实线绘出的观察区域框架24示出在设定按钮27已经被点击的状态。在图5中，设定一个观察区域24，然而可以一次设定两个或多个观察区域24。此外，样本TS的整个图像可以通过使用鼠标指点器MP扩大观察区域框架24来设定。

此外，当观察者不想设定观察区域24时，可以跳过步骤S102。在这种情况下，由图像传感器80检测的样本TS的整个图像被设定为观察区域24。此外，观察者将要观察的样本TS的区域移动到中央，所以图像传感器80的中央区域可以被自动选择为区域的一部分。

回到图4，在步骤S103中，采用波段设定部分29（参考图5）将波段设定为用于形成样本TS的观察图像的一个参数。如在图5中所示，在波段设定部分中，可以设定要由观察者使用或观察的光线的波段。例如，如果已经估计了适于样本TS的观察的波长，则该波长可以采用波段设定部分29设定。如在图5中所示的，波段的设定可以通过由观察者输入数字值实施并可以通过从诸如红色、绿色和蓝色LED的多种选择中来选择由观察者期望的波段来实施。照明光源30是红色、绿色和蓝色LED的组合，因此如果选择红色，照明光源30可以仅发射红色光。

回到图4，在步骤S104中，计算部件20改变DMD 43的照明区域431和液晶元件73的相位调制区域731的尺寸和形状。计算部件20轻微改变在步骤S101中设定的初始配置值中的照明区域431和相位调制区域731的尺寸。也就是说，轻微改变照明光的区域和附加相位的区域。

参考图6A至6C，将描述照明区域431和相位调制区域731的强度分布的改变。图6A是在初始状态的DMD 43和液晶元件73的示意性平面图。在图6A中，作为照明区域431的环形外部圆EC为最大直径，而作为在环形外部圆EC和环形内部圆IC之间的差异的环形宽度rd1很宽。这同样适用于相位调制区域731。图6B中，作为照明区域431的环形外部圆EC为最大直径，而作为在环形外部圆EC和环形内部圆IC之间的差异的环形宽度rd1很宽。

图6B是在保持环形宽度rd1恒定期间从图6A的原始状态减少环形内部圆IC的直径和环形外部圆EC的直径的示例。以这种方式，轻微改变照明光的区域和其他相位的区域。图6C是在保持环形外部圆EC的直径恒定期间从图6A的初始状态减少环形内部圆IC的直径并且减少环形宽度rd2的示例。以这种方式，照明光强度分布和其他相位区域轻微改变。尽管未示出，但是在保持环形内部圆IC的直径恒定期间可以减少环形外部圆IC的直径，或可以在减少环形宽度rd1的同时减少环形内部圆IC的直径和环形外部圆EC的直径两者。

回到图4，在步骤S105中，样本TS的图像通过图像传感器80检测。例如，在图6B示出的照明区域431和相位调制区域731的条件下，样本TS的图像通过图像传感器80检测并且将输出数据发送到计算部件20。

在步骤S106，确定当前发送到计算部件20的输出数据比先前的输出数据更好还是更差。例如，假设已经通过在图5中示出的显示部件21的区域设定部分23设定观察区域24。如果更好的条件意味着该样本TS的图像的观察区域24的图像对比增加，则比较基于当前获取的输出数据（例如，在图6B中示出的照明区域431和相位调制区域731）所计算的对比是否比基于之前获取的输出数据（例如，在图6C中示出的照明区域431和相位调制区域731）所计算的对比更好或更差。如果更好，则步骤返回到步骤S104，照明区域431和相位调制区域731进一步改变并且检测到其输出数据（步骤S105）。也就是说，因为观察区域24的图像的对比增加，所以步骤返回到步骤S104并且照明区域431和相位调制区域731进一步改变。另一方面，如果当前的对比比之前更差，则先前的照明区域431和先前的相位调制区域731具有最高的对比。然后步骤进行到下一步骤S107。

在步骤S107，选择适于样本TS的观察的照明区域431和相位调制区域731。也就是说，恰好在观察区域24的对比开始变差之前所使用的照明区域431和相位调制区域731的二维空间分布式是适于样本TS的观察的二维空间分布。

在步骤S108，相位调制区域731的透射率采用在步骤S107中确认的二维空间分布的照明区域431和相位调制区域731轻微改变。例如，90%的相位调制区域731的透射率变为80%。

在步骤S109，样本TS的图像通过图像传感器80检测。然后，通过图像传感器80检测的样本TS的图像的输出数据被发送到计算部件20。

在步骤S110，确定发送到计算部件20的输出数据比先前的输出数据是否更好或更差。具体地，确定当前发送到计算部件20的图片的对比相比先前的图片的对比是否更好或更差。如果观察区域24的图像的对比增加，则步骤返回到步骤S108并且相位调制区域731的透射率进一步改变。另一方面，如果当前对比相比之前更差，则先前的照明区域431和先前的相位调制区域731具有最高的对比。然后，步骤进入下一步骤S111。

在步骤S111，选择样本TS的相位调制区域731的透射率。也就是说，恰好在观察区域24的对比变差之前所使用的相位调制区域731的透射率是适于样本TS的观察的透射率。

在上面流程图的步骤S104，照明区域431和相位调制区域731的尺寸以类似的形状改变。然而，不仅可以实施到相似形状的改变，而且可以实施其本身形状的改变。例如，圆环形形状可以递增地形成以最终变成椭圆环形形状。

<使用基因算法的方法>

接下来，将描述使用基因算法的方法。基因算法是通过获取图片数据片段，该数据片段与先前提供的多个照明光强度分布和光振幅透射率分布分别相关联，并且通过合并适于样本60的观察的振幅透射率分布来找到照明形状的方法。

图7是使用基因算法的流程图。在步骤S201，首先将DMD43的照明区域431和液晶元件73的相位调制区域731设定为初始配置中的尺寸和形状。例如在初始配置中的照明区域431和相位调制区域731是在图6A中示出的宽环形形状并且其环形外部圆具有最大的直径。在这种状态下，通过图像传感器80检测样本TS的图像。此外，同样将相位调制区域731的透射率设定为预定的初始值。

在步骤S202，通过区域设定部分23设定样本TS的观察区域24。通过步骤S201，样本TS的图像在显示部件21上显示。区域设定部分23可以是如图5中示出的样本TS的一部分或整个样本TS。观察者将要观察的样本TS的区域移动到中央，因此可以将图像传感器80的中央区域自动选择为区域的一部分。

在步骤S203，设定用于形成样本TS的图像的参数。观察者可以设定用于输入与观察者请求和允许的样本TS的图像相关的观察条件的参数。参数是诸如在图5中示出的样本TS的波段。

在步骤S204，采用图像传感器80通过使用两个或多个作为初始值的照明光强度分布和照明光振幅透射率分布来检测样本TS的图像。然后，计算部件20获取通过使用多个照明光的强度分布和照明光的振幅透射率分布测量样本TS的图像的图片的所有输出数据。

在步骤S205，比较在步骤S204中获取的样本TS的每个图片的输出数据。如果更好的条件意味着样本TS的图像的观察区域24的对比增加，则在基于当前获得输出数据所计算的对比中选择产生最优对比的照明区域431和相位调制区域731，以及产生第二最优对比的照明区域431和相位调制区域731。具有更好对比的两个照明区域431和相位调制区域731被称为第一照明光强度分布和第一振幅透射率分布，第二照明光强度分布和第二振幅透射率分布。参考图8，将描述两对照明光强度分布和照明光振幅透射率分布的示例。

图8示出DMD 43和液晶元件73的多种照明形状的图。在图8中，白色部分对应于照明区域431和相位调制区域731，而阴影区域对应于光阻挡区域435和衍射光透射区域735。

例如如在图8中所示的，第一照明光强度分布和第一振幅透射率分布是在DMD 43a和液晶元件73a中示出的照明区域431和相位调制区域731。形成照明区域431和相位调制区域731以使得环形外部圆EC具有最大的直径并且环形宽度为rd3。第二照明光强度分布和第二振幅透射率分布是在DMD 43b和液晶元件73b中示出的照明区域431和相位调制区域731。形成照明区域431和相位调制区域731使得环形外部圆EC更小并且环形宽度为rd4。

回到图7，在步骤S206中，计算部件20根据基因算法的融合（crossover）或突变方法，从第一照明强度分布和第一振幅透射率分布以及第二照明强度分布和第二振幅透射率分布形成照明形状，该照明形状具有照明光的下一代强度分布。参考图8，将给出其中形成具有照明光的下一代强度分布的照明形状的示例的描述。

在步骤S205，选择在DMD 43a和液晶元件73a中示出的照明区域431和相位调制区域731和在DMD 43b和液晶元件73b中示出的照明区域431和相位调制区域731。例如，计算部件20实施两对照明区域431和相位调制区域731的融合（组合）或突变的操作，因此形成在DMD 43c和液晶元件73c中、在DMD 43d和液晶元件73d中和在DMD 43e和液晶元件73e中示出的照明区域431和相位调制区域731。

DMD 43c和液晶元件73c为环形外部圆EC具有最大的直径并且环形宽度为大于环形宽度rd3的rd5。DMD 43d和液晶元件73d具有环形外部圆EC，环形内部圆IC以及作为DMD 43a和液晶元件73a以及DMD 43b和液晶元件73b的照明区域431和相位调制区域731的平均的环形宽度rd6。DMD 43e和液晶元件73e是环形分成四份的照明区域431和相位调制区域73。

图8正示出组合的示例。实际上，随机形成DMD 43和液晶元件73的形状，因此照明区域431和相位调制区域731的新形成的形状数量巨大。此外尤其是当通过具有尺寸和形状的二维空间分布之外的空间分布改变相位调制区域73的透射率时，则有无数的组合。

回到图6A至6C，在步骤S207中，通过图像传感器80基于第一照明强度分布和第一振幅透射率分布，第二照明强度分布和第二振幅透射率分布以及下一代照明光强度分布和下一代振幅透射率分布检测样本TS的每个图片的输出数据。然后，计算部件20基于这些输出数据比较对比。然后，新选择最适于样本TS的观察的第一照明强度分布和第二适于样本TS的观察的第二照明强度分布。

在步骤S208，确定是否融合或突变实施到预定的代，例如1000代。如果融合等没有实施到预定的代，则进程返回到步骤S206，并且搜索进一步适于样本的观察的照明强度分布和振幅透射率分布。如果融合等实施到预定的代，则进程前进到步骤S209。

在步骤S209，从由到预定代（例如1000代）的该融合获得的照明区域431和相位调制区域731选择最优对比代的照明形状和振幅透射率分布。在下文中，将该代的照明形状和振幅透射率分布的照明区域431和相位调制区域731用于样本TS的观察。

爬坡法（最大级别法）的计算方法、在图4、图7中示出的基因算法可以作为程序存储在存储介质中。然后存储在该存储介质中的程序安装在计算部件20中，因此该计算部件20可以计算适于样本观察的照明光强度分布和光振幅透射率分布。

此外，在图4的步骤S106或步骤S110中，在图7的步骤S205或步骤S207，计算部件20比较样本TS的图像的对比。然而，不仅样本TS的图像的对比，还有使用空间频率成分的评估函数或最大倾斜量可以用于比较。最大倾斜量是在空间强度值轮廓（横轴：例如是X方向上的位置，纵轴：强度值）中的强度值变化的最大值。将使用图9描述评估函数。

图9是评估函数Q（f）的示例。评估函数Q（f）为包括图片的傅立叶变换值的公式并且在下面例示。

Q(f)=α₁×f₁+α₂×f₂

在此，α₁和α₂为系数而f₁和f₂为变量（函数）。

例如，变量f₁和f₂为通过滤波器ff（ff1，ff2）乘以样本的图片的傅立叶变换值FT所获得的值标准化的变量。作为图片特征量的傅立叶变换值FT可以是采用傅立叶变换计算的空间频率分量的绝对值或采用傅立叶变变换所计算的空间频率分量的平方值。图9示出使用傅立叶变换的绝对值的变量f₁和f₂。

滤波器ff（ff1，ff2）是移除图片的DC分量或低频分量的滤波器。图9示意性示出这些滤波器ff。在此，黑色区域代表移除图片分量。滤波器ff1移除样本TS的图片信号的DC分量，而滤波器ff2移除样本TS的图片信号的DC分量和低频分量。滤波器ff1与ff2在强调图片信号的高频分量的程度上不相同。可以使用不同的滤波器ff以及图9中示出的滤波器ff。

变量f₁和f₂是通过作为图片特征量的傅立叶变换值FT乘以滤波器ff获得的值的面积积分除以傅立叶变换值FT的面积积分N所得的值。因此变量f₁和f₂被标准化。评估函数Q（f）将变量f₁和f₂乘以系数α₁和α₂。例如，系数α₁等于1而系数α₂等于2。

计算部件20从图像传感器80接收图片信号。然后计算部件20将傅立叶变换应用于来自图像传感器80的图片信号。然后，计算部件20计算样本TS的傅立叶变换值（空间频率分量）。然后，计算部件20通过使用样本TS的傅立叶变换值和评估函数Q（f）采用数字值来计算与样本TS的图片相关的评估。

本文到此已经描述了用于执行本发明的最优模式，但是对于本领域技术人员来说显然在不偏离本发明的技术范围的情况下可对示例应用各种修改。

Claims

1.一种相位对比显微镜系统，该显微镜系统观察样本，所述显微镜系统包括:

照明光学系统，其采用来自光源的照明光照明所述样本；

成像光学系统，其从来自所述样本的光形成所述样本的图像；

第一空间调制元件，其放置在所述成像光学系统的光瞳位置处并且改变来自所述样本的光振幅透射率分布；

图像传感器，其通过所述成像光学系统检测所述样本的图像并且输出图片信号；

计算部件，其基于由所述图像传感器检测的输出数据和由所述第一空间调制元件形成的来自所述样本的所述光振幅透射率分布来计算适于观察所述样本的来自所述样本的光振幅透射率分布。

2.根据权利要求1所述的显微镜系统，

其中所述第一空间调制元件基于由所述计算部件所计算的来自所述样本的光振幅透射率分布来改变来自所述样本的所述光振幅透射率分布。

3.根据权利要求2所述的显微镜系统，

其中所述第一空间调制元件改变用于通过所述成像光学系统透射的光的其它相位的空间分布。

4.根据权利要求2所述的显微镜系统，

其中所述第一空间调制元件改变用于通过所述成像光学系统透射的光的透射率的空间分布。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的显微镜系统，该显微镜系统还包括：

第二空间调制元件，其改变与所述成像光学系统的所述光瞳位置共轭的所述照明光的强度分布；

其中所述第二空间调制元件通过多个可移动的反射镜来配置。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的显微镜系统，该显微镜系统还包括：

第二空间调制元件，其改变在所述成像光学系统的所述光瞳的共轭位置处的所述照明光的强度分布，

其中所述第二空间调制元件通过衍射光栅来配置。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的显微镜系统，

其中，改变照明至所述样本的照明光的波长，而且所述计算部件基于每个所改变的波长的所述输出数据来计算最适合用于观察所述样本的波长。

8.根据权利要求1至6中的任一项所述的显微镜系统，

其中所述计算部件基于由所述图像传感器检测的所述输出数据来计算所述样本的图像的对比或空间频率。

9.根据权利要求6所述的显微镜系统，

其中由所述第一空间调制元件形成的相位或透射率的调制区域的形状与由所述第二空间调制元件形成的所述照明光的强度分布的形状相同。

10.根据权利要求6或9所述的显微镜系统，

其中所述计算部件同步改变所述第一空间调制元件和基于此改变所述第二空间调制元件，并且计算适于观察的所述照明光的强度分布。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的显微镜系统，该显微镜系统还包括：

显示部件，其显示参数设定部分和区域设定部分，所述参数设定部分设定用于输入用于所述样本的观察图像的观察条件的参数，所述观察条件由观察者请求并允许，所述区域设定部分设定所述观察图像的观察区域。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的显微镜系统，

其中所述图像传感器放置在所述成像光学系统的成像平面上并且检测所述样本的图片输出数据；以及

其中所述计算部件通过细微改变所述照明光的分布并且通过获取无论何时都改变所述照明光的分布的所述图片输出数据来顺序计算所述照明光的强度分布的适当尺寸。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的显微镜系统，

其中所述图像传感器放置在所述成像光学系统的成像平面上并且检测所述样本的所述图片的输出数据；以及

其中所述计算部件通过改变所述照明光的强度分布以便形成所述照明光的第一和第二强度分布并且通过获取与其对应的第一和第二图片的输出数据来通过基因算法计算所述照明光的最优强度分布，其中所述基因算法使用所述第一和第二图片的输出数据作为初始数据。

14.一种程序，该程序通过使用显微镜系统观察样本，该显微镜系统包括观察所述样本的相位对比显微镜和连接到所述显微镜的计算部件，所述显微镜包括：

照明光学系统，其采用来自光源的照明光照明所述样本；

图像传感器，其检测由所述成像光学系统形成的所述样本的图像并且输出图片信号，

其中所述程序使所述计算部件基于由所述图像传感器检测到的输出数据和由所述第一空间调制元件形成的来自所述样本的所述光振幅透射率分布来计算适于观察所述样本的来自所述样本的光振幅透射率分布。