CN103534232A - 用于制备3,5-二碘-o-[3-碘苯基]-l-酪氨酸的硫酸化衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过在作为溶剂的氯磺酸和二甲基乙酰胺的存在下，由相应酚化合物开始来制备衍生物3，5-二碘-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸(T3S)的单钠盐的方法。如此得到的T3S化合物可以方便地以良好产率、作为固体以纯形式分离。本发明进一步涉及用于T3S的制备方法，其中起始试剂为T2，并且进一步包括片剂形式的该化合物的制剂。进一步，本发明公开了基于T3S衍生物的非放射性免疫分析法。

Description

用于制备3,5-二碘-O-[3-碘苯基]-L-酪氨酸的硫酸化衍生物的方法
发明领域
本发明的领域涉及用于制备甲状腺激素的硫酸化衍生物或其盐的方法。
发明背景
甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸(3，5-二碘-O-[3-碘苯基]-L-酪氨酸或T3)是代谢的最有活性的甲状腺激素。如同甲状腺素(T4)，其是甲状腺生理学生成的，且与其甲状腺球蛋白形式(一种糖蛋白前体)一起被贮存。平均而言，一个甲状腺球蛋白分子包含三或四个T4残基和至多一个T3残基。TSH生成通过酶组织蛋白酶D、B和L活化甲状腺球蛋白蛋白水解，释放甲状腺激素T3和T4。然而，T3生成不限于该机制：实际上，在外周组织中，甲状腺素转化成三碘甲状腺原氨酸(80％的三碘甲状腺原氨酸是由甲状腺素外周生成的，20％是由内部甲状腺生成的)。
T3的重要性不仅在于其是唯一最有活性的甲状腺激素的事实。实际地，在这方面，已知由于其不足可引起多种病理学病症。特别地，例如，在胚胎发育期间和童年期的神经组织中，T3缺乏会导致脑和小脑皮层生长、轴突增殖、细胞迁移、髓鞘形成、树突分支和突触形成的减少。由于在生命初期T3缺乏，观察到神经系统发育延迟，接着观察到认知缺陷和运动缺陷，其可引起一种称为白痴病的临床现象。而且，在成年人中，已经通过脑PET证实，当三碘甲状腺原氨酸水平降低时，大脑内血流量和大脑葡萄糖代谢较低。这些数据可以解释甲状腺机能减退的个体中心理运动性缺陷。
除了在神经组织中观察到的影响之外，也已知在骨组织中观察到影响，其中三碘甲状腺原氨酸刺激软骨内成骨，因而经由骨骺骨中心成熟产生线性更长的骨。即使三碘甲状腺原氨酸不是出生后骨线性生长所必需的，其也是适宜的胎儿骨发育必不可少的。
而且，已经证实了T3在表皮组织中的作用，其中三碘甲状腺原氨酸不仅参与皮附件的成熟，而且参与其分解从而促进细胞再生。因此，该激素的过量和不足都可引起皮肤病学问题。
因此，T3甲状腺激素可以肯定地被认为是一种多效激素，其除了具有上述作用之外还具有已确证的作用，在血液组织中，其增加红细胞生成素生成，并因而促进血生成；在脂肪组织中，其促进前脂肪细胞向脂肪细胞的成熟，增加脂肪酸脂解，最后还调节胆固醇代谢。
通过自身免疫病理学非常频繁地产生的甲状腺机能减退相当普遍：实际地，在意大利人中的患病率，女性为约1.5％，男性为1％。通过替代疗法以令人满意地方式对其进行药理学治疗，所述替代疗法主要是基于合成性左旋甲状腺素(T4)，选择该药物是因为其更有活性的形式即T3的半衰期非常短，为此通常不能使用。
然而，采用左旋甲状腺素治疗还显示出一些与如下事实相关的缺点：虽然血浆的甲状腺得到恢复，组织的却不一定得到恢复。药理学替代物的研究，比如在EP1560575B中描述的基于拟甲状腺素T3活性可提出的替代物，可能代表目前选择治疗的期望替代物。
然而，就涉及的T3S而言，主要障碍似乎表现为难于实现大规模合成。实际地，迄今为止，仅仅以实验室规模制备T3S是可能的。
在这点上，已经描述了利用大量过量的硫酸化试剂例如浓硫酸(H2SO4)或氯磺酸(CSA)由T3制备T3S，例如在US2970165和Biochim.Biophys.Acta，33，461(1959)中，其描述了在低温下，利用直接加入浓硫酸由固体形式的T3制备T3S。
Endocrinology，Vol.117，No.1，1-7(1985)和Endocrinology，Vol.117，No.1，8-12(1985)预期利用在冷却下在二甲基甲酰胺中加入氯磺酸(CSA)溶液，接着通过Sephadex LH-20的纯化步骤，由T3合成T3S。
然而，迄今为止，没有任何现有技术的方法可以放大用于于纯形式的最终产物的克计产出，主要是因为报道的纯化方步需要极大体积。
有利地，现在发现在DMAC的存在下，用氯磺酸(CSA)作为硫酸化试剂由三碘甲状腺原氨酸开始硫酸化反应得到高转化率。而且，可以采用比已知的现有技术方法报道的更小体积进行纯化。最终，产物T3S可以以必需的数量和质量(数百克)被纯化至其临床用途所需的水平，并且是在工业规模可适用的情况下。
此外，因为迄今为止，只描述检测血清中T3S水平的放射性分析，比如在Chopra et al.(J.Clin.Endocrinol.Metab.，1992，75：189-194)中描述的RIA，需要基于例如非放射性试剂的更安全的免疫分析法。使用这类试剂也允许临床和/或研究机构进行这些测量。为此目的，开发了非放射性免疫分析法，并且其属于本发明的一部分。
附图说明
图1.图面a)竞争性ELISA的T3S校正曲线；图面b)DELFIA校正曲线。T3S是以33.6、56、93.3、155.5、259、432、720、1200、2000pg/ml分析的。
图2.DTPA-T3S单酰胺合成的示意图。
发明简述
本发明涉及一种由式I的3，5-二碘-O-(4-羟基-3-碘苯基)-L-酪氨酸或其盐开始，制备3，5-二碘-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸的单阳离子盐的方法，其按照下述方案：
Figure BDA0000414258970000031
其中M为碱金属，优选Na，
包括下述步骤：
a)在作为溶剂的二甲基乙酰胺(DMAC)的存在下，用氯磺酸(CSA)硫酸化式I的化合物或其盐；
b)通过将a)中得到的反应混合物加入到碱金属无机盐，优选单阳离子钠，更优选NaHCO3的水溶液中来盐化a)中得到的硫酸化衍生物，得到式II的化合物(T3S)。
根据一个特别优选的实施方案，式I的化合物(T3)是通过在脂族胺、优选地选自直链单烷基(C1-C4)脂肪族胺(其中，乙胺是优选的)的存在下，用碘化剂(优选NaI和I2)碘化式III的化合物(T2)获得的：
Figure BDA0000414258970000041
碘化剂的加入是在优选地低于25℃的温度下，在水性溶剂、优选水的存在下进行。优选地，碘化剂以在0.9至1.1mol/mol的化合物III(T2)之间的摩尔比存在。
因此，用于制备T3S的方法包括通过在上述条件下碘化T2，然后在二甲基乙酰胺中用氯磺酸将其硫酸化来制备T3，如在详细说明中更好地描述的。
而且，根据一个进一步的方面，本发明还包括将活性成分T3S配制成药物组合物，优选固体，其中将T3S(优选地粉末形式)与稀释剂混合，然后，向该混合物中加入助流剂、润滑剂(优选二山嵛酸甘油酯)和崩解剂(优选交联羧甲纤维素或其衍生物)，将该混合物过筛并与包括活性成分的稀释混合物进一步混合。
因此，根据该方案，所述方法包括步骤：其中以一个或多个部分加入稀释剂例如微晶纤维素，使其混合，然后配制包括助流剂(优选二山嵛酸甘油酯)、润滑剂(优选硬脂酸镁或硬脂酸锌)、水合胶体二氧化硅、胶体二氧化硅，以及优选地崩解剂(优选交联羧甲纤维素或其衍生物)的混合物，然后使其过筛，并将其与包括活性成分的混合物与稀释剂进一步混合。然后，可以加入其它赋形剂、稳定剂和稀释剂(比如例如碳酸钙)，并且混合可变的时间。
根据一个特别优选的方面，本发明进一步公开了一种通过上述方法制备的片剂，其包括1至1000μg的量的作为活性成分的T3S，并且包括下述稀释剂、赋形剂、助流剂和润滑剂：碳酸钙、二山嵛酸甘油酯、交联羧甲纤维素钠盐、水合胶体二氧化硅、硬脂酸镁、微晶纤维素。单剂量的优选的量在下表中给出：
每片的量
碳酸钙 20-40mg
二山嵛酸甘油酯 2-15mg
交联羧甲纤维素钠盐 1-10mg
水合胶体二氧化硅 0.1-5mg
硬脂酸镁 0.01-2mg
微晶纤维素 至少30mg
本发明的一个进一步的实施方案由非放射性免疫分析法来表示。
优选地，免疫分析法为酶联免疫分析法(ELISA)，更优选竞争性ELISA，更优选地在多孔板中进行，使用荧光基或酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或抗生物素蛋白-衍生物可检测部分(即生物素)作为可检测部分。
作为T3S非放射性检测分析的进一步发展，已经开发了用于镧系元素荧光免疫分析的试剂。基于新试剂用于T3S定量的分析、合成试剂及试剂盒代表本发明的进一步的目的。
发明详述
本发明的目的是一种从式I的3，5-二碘-O-[4-羟基-3-碘苯基]-L-酪氨酸或其成盐的衍生物开始，制备甲状腺激素T3的硫酸化形式、作为单阳离子盐的具有式II的3，5-二碘-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸(T3S)的方法。
Figure BDA0000414258970000061
其中M是碱金属，优选Na，其包括下述步骤：
a)在作为溶剂的二甲基乙酰胺(DMAC)的存在下，用氯磺酸(CSA)硫酸化式I的化合物(T3)；
b)盐化a)中得到的硫酸化衍生物，得到式II的化合物。盐化通常是通过将a)中得到的反应混合物加入到碱金属无机盐，优选钠盐，更优选Na2CO3或NaHCO3的水溶液中来获得的。
为了本发明的目的，T3S指式II的化合物，包括三碘甲状腺原氨酸的硫酸化形式或其单阳离子盐(式II的化合物)。
步骤a)是通过在冷却下向T3在DMAC中的悬浮液中加入CSA，同时使该溶液保持在强力搅拌下进行的。
温度保持在低于约10℃的值，更优选-10℃至8℃，更优选-8℃至6℃，甚至更优选-5℃至5℃。
向悬浮液中加入CSA是慢慢进行的，优选地在30至60min的时间段，这取决于使用的试剂的量，并且优选地在惰性气氛下，例如在氮气气氛或氩气气氛下。
根据一个优选的实施方案，CSA和T3之间的摩尔比大于4，优选4.5至10，甚至更优选7至9。甚至更优选7.5至8.5mol的CSA/mol的T3。T3在DMAC中的浓度(表示为mol的T3/L的DMAC)为0.06至0.15mol/L，更优选0.12至0.14mol/L。由此可见，CSA和溶剂之间的比例可以是0.35至1.28mol的CSA/L的DMAC，优选约0.8至1.15mol/L，甚至更优选约0.96至1.1mol的CSA/L的DMAC。
在加入CSA之后，使该混合物反应不超过4-5小时的时间段，通常无需冷却，允许温度达到室温(20-25℃)。
在所描述条件下，当超过85％、优选地超过90％、甚至更优选地超过95％的T3已经转化为T3S时，硫酸化通常完成。
根据一个特别优选的实施方案，该方法的步骤a)预期在30-40min时间段内，在约-5℃至约5℃的温度下，向在DMAC中的T3溶液(浓度为0.12-0.14mol的T3/L的DMAC)中加入CSA，优选的比例为每摩尔T3约8摩尔的CSA。在加入结束时，通常停止冷却，在不超过4-5小时，优选地不超过2-3小时，使温度升高至室温(约15至25℃)。
然后，根据盐化步骤b)将硫酸化混合物加入到无机碱金属盐(优选单阳离子，其中Na是特别优选的阳离子)的水溶液中，加入量能够中和存在的氯磺酸。
盐化优选地用碳酸钠(Na2CO3)或碳酸氢钠(NaHCO3)的水溶液进行，其用量是在前述步骤中使用的氯磺酸的量的函数，并且至少足够中和得到的溶液的pH。通常，当使用Na2CO3时，用量为约1.5摩尔每摩尔CSA是足够的。根据该实施方案，Na2CO3溶液的浓度为约0.7mol/L的溶液。在这种条件下，在猝灭之后获得溶液pH为6.5至7.5。
根据该实施方案，得到的T3S化合物的相应单阳离子盐具有式II，其中M优选地为Na。
根据步骤b)加入反应混合物在可变的时间段内进行，典型地为1h至3h，同时保持温度低于30℃。
按照进一步的步骤c)，通过色谱纯化根据上述步骤b)得到在溶液中呈单阳离子盐的式II的T3S化合物。为了减少作为副产物形成的无机盐的一部分，色谱之前任选地进行b)中得到的反应混合物的沉淀和/或过滤，例如重量分析的过滤或在真空下的过滤。
色谱(c)是在聚合物类型的吸附树脂上进行的。优选地，这类树脂由大孔芳香族聚合物基质构成。优选的树脂的实例为XADTMAmberlitesTM，甚至更优选AmberliteTM XADTM1600。
还熟知，在使用之前，将树脂通过本领域已知的方法活化，所述方法比如例如用水、丙酮等冲洗(关于一般参考文献，参见Rohm和Haas于“Laboratory Column Procedures and Testing of Amberlite andDuolite Polymeric Adsorbents”，section“Preparation of Resins”)。根据本发明的方法，优选地用选择用于再次洗脱的溶剂(即，丙酮或水/丙酮混合物)活化树脂。
优选地，通过用由具有较高极性的混合物开始的具有递减梯度极性的溶剂的洗脱混合物从树脂洗脱T3S。根据一个优选的实施方案，所述洗脱混合物首先为水，接着为具有合适反比的适合的极性有机溶剂的连续稀释液。
优选的洗脱混合物由比例为1：0至0.7：0.3的水/乙腈和水/丙酮代表。优选地，洗脱混合物由比例为1：0至0.85：0.15的水和丙酮的混合物代表，并且通过柱的洗脱速率通常为0.9至1.1体积的柱/h。
将由柱洗脱的且包含具有纯度水平高于95％、更优选地高于96％、98％99％(通过本领域众所周知分析方法测量，比如例如UV检测和HPLC分析的分析)的最终产物的级分收集在一起，并且可以通过蒸发溶剂，即在真空下冷冻干燥或其它已知方法分离活性成分。
然而，根据一个优选的实施方案，例如通过在真空下部分蒸发至约10g/kg溶液的浓度来浓缩洗脱的级分。
在该浓度下，通过加入稀释的强无机酸溶液将溶液的pH调节为低于6.5的值，优选5.5至6.5，所述无机酸优选地为选自硫酸和盐酸的一种酸，盐酸是特别优选的，并且以0.9至1.1N的浓度的稀释形式使用。
将该溶液进一步浓缩约10-15倍，并且可以分离呈固体的T3S，例如通过冷冻干燥、喷雾干燥或优选地用有机溶剂(优选的极性类型)处理分离为固体形式，然后任选地进一步微粉化。
因此，根据该优选的实施方案，通过用选自：丙酮、乙腈和C1-C4醇的溶剂处理来分离固体形式的式II的化合物。然而，可以使用其它溶剂，其选自：芳香族烷烃、醚、氯化溶剂、酯、二甲基甲酰胺、硝基甲烷(nitrometane)、二甲亚砜、2-甲氧基乙醇或其混合物，其能够获得固体形式且可分离的盐。
因此，详细地，在色谱和将包含T3S的级分浓缩至浓度为约10g/kg的溶液之后，pH调节至低于6.5的值，优选5.5至6.5，并且进一步蒸发至式II化合物的浓度为170到500g/kg悬浮液或凝胶，用有机溶剂处理该浓缩溶液。优选地，所述溶剂为极性有机溶剂，选自：丙酮，低级醇比如乙醇、丙醇、异丙醇等，和乙腈，丙酮是特别优选的。
为了使固体形式的单阳离子T3S盐完全地沉淀出，向浓缩的T3S溶液中加入丙酮是在20至25℃下进行，优选地在0至25℃的温度下在搅拌下放置1-3h。
根据已知的比例向该悬浮液中加入溶剂：当使用丙酮时，其在温度为20-25℃下加入量为1-11g的丙酮/g T3S。
在例如通过过滤分离液相与固相之后，如此获得固体形式的式II的单阳离子或更优选地其钠盐，其具有的HPLC纯度高于95％，更优选地高于96％、98％或者甚至＞99％。
因此，作为一个整体来看，根据本发明的方法能够获得以高产率(总产率：≥60％)和高纯度水平(HPLC＞99％)分离最终产物(T3S)。
实际地，比现有技术的方法有利地是，已经在DMAC的存在下在硫酸化混合物a)中，副产物的含量低于10％，通常低于7％。
在硫酸化反应及其后盐化中的高转化百分数则能够通过工业可适用的色谱步骤及限定体积获得纯形式的产物。
即使当以数百克制备时，T3S可有效地与其它副产物分离，且具有高纯度(＞99％)，因此使得在临床实施中有可能使用该三碘甲状腺原氨酸衍生物。
为了制备临床使用的制剂，优选地将固体形式且纯度直至99％的T3S进一步微粉化，例如在氮气压力微粉化，以减小粒径。
特别优选的粒径小于25μm(至少90％，更优选地至少95％的颗粒具有低于25μm的尺寸)，当在老化试验箱中进行加速稳定性试验时，使其稳定至少一个月。
因此，根据本发明的一个优选的方面，所述方法包括微粉化纯形式的固体T3S，得到上述定义尺寸的颗粒，并且使用其制备用于口服给药的固体制剂。
根据该方面，在微粉化之后，将T3S与合适的其它组分一起配制成粉末混合物，也可任选地以颗粒或微粒形式，优选地通过直接压片将该粉末混合物配制成片剂或丸剂。
向固体形式或更优选地为片剂的T3S制剂中加入微粉化的活性成分(或多种活性成分，当优选地与左旋甲状腺素组合时)，首先加入一部分量的必需的最终稀释剂，优选地稀释剂的30、40或优选地至少50％，并且将它们混合，得到混合物a)。优选的稀释剂是纤维素或其衍生物，例如微晶纤维素。其它的合适的稀释剂为高岭土(caolin)、淀粉或碱金属无机盐比如碳酸镁或碳酸钙。特别优选的是碳酸钙，更优选地与微晶纤维素组合。
然后，将混合物a)与包括其它组分的混合物b)混合，通常，所述混合物b)包括：助流剂、润滑剂和崩解剂，将其过筛，并且与包括活性成分的混合物a)连续混合。
在崩解剂中，特别优选的是交联羧甲纤维素或其衍生物。为此目的其它可用的试剂为交聚维酮、聚甲基丙烯酸酯、麦芽糊精(maltodestrines)、淀粉羟乙酸钠、预胶化淀粉、海藻酸钠。
在助流剂中，特别优选的是二山嵛酸甘油酯。其它的可用的助流剂为：磷酸三钙、滑石、淀粉或其衍生物。
在润滑剂中，特别优选的是硬脂酸镁或硬脂酸锌，水合胶体二氧化硅、胶体二氧化硅。其它赋形剂、稳定剂和稀释剂(比如例如碳酸钙)可以连续地加入，并且混合可变的时间。然后，量取最终混合物，并且优选地通过直接压片制备片剂。
T3S在固体剂量单元中的存在量为1至1000μg，更优选2.5至500μg，甚至更优选5至250μg，其作为唯一活性成分或者与其它活性成分优选T4(左旋甲状腺素)组合。根据该实施方案，T4的存在量为1至800μg，或5-400μg，更优选10-200μg。因此，在同时包括T3和T4作为活性成分的片剂的制备方法中，将其与混合物a)中的优选的稀释剂混合，并进一步与如上所述的其它组分依次预混合。
因此，根据一个优选的方面，本发明公开了一种通过上述方法制备的片剂，其包括1至1000μg的量的作为活性成分的T3S，与下述其它组分一起：
-稀释剂，选自纤维素或其衍生物，优选地与第二稀释剂(优选碳酸钙)一起，至多为全部稀释剂的35％(w/w)；
-助流剂，选自二山嵛酸甘油酯(最优选的)、滑石、二氧化硅衍生物(其中三硅酸镁)、酰胺、磷酸三钙，在组合物中的存在量通常为1至10％，最优选4至6％(w/w)；
-崩解剂，选自：淀粉、交联羧甲纤维素钠和交聚维酮。优选的是0.5至10％的量、甚至更优选1-5％、最优选2-到4％(w/w)的交联羧甲纤维素钠盐；
-润滑剂，选自：硬脂酸镁、水合胶体二氧化硅和滑石，更优选硬脂酸镁和硅胶，总量范围为0.1至7％，甚至更优选第一润滑剂为0.1至2％且第二润滑剂为0.5至5％(w/w)。
特别优选的赋形剂为下述成分：碳酸钙、二山嵛酸甘油酯、交联羧甲纤维素钠盐、水合胶体二氧化硅、硬脂酸镁、微晶纤维素，根据下述优选的量：
每片的量
碳酸钙 20-40mg，优选25-35mg，更优选30mg
二山嵛酸甘油酯 2-15mg，优选4-8mg，更优选5mg
交联羧甲纤维素钠盐 1-10mg，优选2-6mg，更优选3.5mg
水合胶体二氧化硅 0.1-5mg，优选0.5-4，更优选2mg
硬脂酸镁 0.01-2mg，优选0.1-1mg，更优选0.5mg
微晶纤维素 至少30mg
在一个更优选的实施方案中，所述组合物包括2.5至500μg的T3S，或更优选地5-250μg的T3S。
对于其中还存在T4的组合组合物，T3S的存在量优选地为2.5-500μg，T4的存在量为1至800μg，或者甚至更优选地：T3S：5-250μg，T4：5-400μg，.或T3S：10-100μg和T410-200μg。
意图上述量针对单剂量单元，优选约110mg的片剂，优选地用于每日单剂量施用，但是本领域技术人员可以根据可替代的组合物形式、片剂重量和/或治疗方案进行调节。
根据优选的实施方案的片剂显示出活性成分的最佳溶解速率(参见下表)和最佳稳定性(至少24个月)。
根据ICH Guidelines的条件测量下述性质：
溶出试验 在45’之后≥75％
水分含量 ≤10％
抗压碎性 ≥20N
HPLC标题T3S 90-110％
HPLC标题T4(当存在时) 90-110％
在根据本发明的方法中，包括T3(式I的化合物)的所有试剂都是市售可获得的。
然而，根据一个特别优选的实施方案，T3是通过在脂族胺、优选地选自单烷基(C1-C4)直链脂肪族胺(其中，优选乙胺)的存在下，用碘化剂(优选NaI和I2)碘化式III的化合物(3，5-二碘-甲状腺原氨酸，Levoditi或T2)制备的：
T2优选地如描述的制备。
碘化剂的加入是在优选地低于25℃下，在水性溶剂、优选水的存在下进行的。
优选地，碘化剂以0.9至1.1mol/mol的化合物III(T2)的摩尔比存在。
在碘化之后，优选地通过过滤分离呈钠盐的T3，然后通过再悬浮在水中且用酸(优选乙酸或硫酸)酸化将其转化成酸形式。
优选地通过过滤分离酸形式，再次再悬浮在水中以除去盐并过滤。
将呈湿固体的T3悬浮在N，N-二甲基乙酰胺中，使该悬浮液脱水并进行硫酸化反应。
根据一个优选的方案，CSA和T3之间的摩尔比大于4，优选4.5至10，甚至更优选7至9。甚至更优选，7.5至8.5mol的CSA/mol的T3。T3在DMAC中的浓度，表示为mol的T3/L的DMAC，为0.10至0.15mol/L，更优选0.12至0.14mol/L。由此可见，CSA和溶剂之间的比例可以是0.58至1.28mol的CSA/L的DMAC，优选0.89至1.15mol/L，甚至更优选0.96至1.09mol的CSA/L的DMAC。
在加入CSA之后，使该混合物反应不超过4-5小时的时间段，通常无需冷却，使温度升高至室温。
在所描述条件下，当超过85％、优选地超过90％、甚至更优选地超过95％的T3已经转化为T3S时，硫酸化通常完成。
根据一个特别优选的实施方案，该方法的步骤a)预期在30-40min时间段内，在约-5℃至约10℃的温度下，向在DMAC中的T3溶液(浓度为0.12-0.14mol的T3/L的DMAC)中加入CSA，优选的比例为约8摩尔的CSA每摩尔的T3。在加入结束时，通常停止冷却，在不超过4-5小时，优选地不超过2-3小时，使温度升高至室温(约15至25℃)。
然后，根据盐化步骤b)将硫酸化混合物加入到无机碱金属盐(优选二元阳离子，其中Na是特别优选的阳离子)的水溶液中，使得加入量中和存在的氯磺酸。
盐化优选地用Na2CO3或碳酸氢钠NaHCO3的水溶液进行，其用量是使用的氯磺酸的量的函数，至少足够中和得到的溶液的pH。通常，当使用Na2CO3时，用量为至少1.5摩尔的盐每摩尔CSA是足够的。根据一个特别优选的方面，当无机碱金属盐是Na2CO3时，其最终浓度为至少0.7mol/L溶液。在这样的条件下，在猝灭之后，所得溶液的pH为6.5至7.5。
根据该实施方案，得到的T3S化合物的相应单阳离子盐具有式II，其中M优选地为Na。
根据步骤b)加入反应混合物在可变的时间段内进行，典型地为1h至3h，同时保持温度低于30℃。
按照如上所述步骤b)和c)，得到在溶液中呈单阳离子盐的式II的T3S化合物。
根据申请人的最佳知识，根据本发明的方法首次描述了由T3或T2制备用于临床用途的T3S，纯度为至少95％，更优选地至少96％、98％或＞99％。
根据一个进一步的实施方案，本发明还涉及基于比色分析、荧光或化学发光检测的非放射性T3S免疫分析法。
优选地，免疫分析法为酶联免疫分析法(ELISA)，更优选地为竞争性ELISA，其中递增量的T3S竞争性结合已结合抗-T3S抗体(例如，在Chopra et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.，1992，75：189-194中公开的多克隆抗体)的固相，固定量的T3S结合可检测部分比如荧光基或酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或任选地连接可检测部分的抗生物素蛋白结合-衍生物(即，生物素)。
Figure BDA0000414258970000141
用于非放射性分析的T3S衍生物通常含于通式A：
Figure BDA0000414258970000142
其中R选自：
a)可检测部分，选自：荧光基团或选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶的酶，
c)抗生物素蛋白-结合衍生物，任选地连接可检测部分，
d)镧系元素螯合剂。
当R为镧系元素螯合剂时。T3S衍生物优选地为式IV的化合物。
所述分析为优选地在多孔板中进。优选地，所述可检测部分为荧光基或酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或抗生物素蛋白-衍生物(即生物素)。根据后一个实施方案，检测优选地采用抗生物素蛋白-衍生物进行，优选包括酶比如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(优选HRP)的抗生蛋白链菌素，其将特定底物转化成有色的、荧光或化学发光的产物。使用生物素-抗生物素蛋白的相互作用，与作为信号发展技术的各种检测发光结合，能够使信号扩增且具有与RIA试验相当的增强的灵敏性(参见，即Chopra et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.，1992，75：189-194)，而不需要放射性，这是相对于现有技术的一个明确的优点。
ELISA分析、T3S-衍生物比如生物素衍生物、其合成及包括这类试剂用于T3S定量的试剂盒，代表本发明的一个进一步的目的。
作为一个可替代的实施方案，非放射性T3S免疫分析法开发用于荧光技术，称为镧系元素荧光免疫分析，描述在
Figure BDA0000414258970000152
I et al.Anal Biochem.1984Mar；137(2)：335-43中，由其得到1-1000pg/mlT3S的灵敏性。开发用于T3S检测的该分析、合成的试剂、及包括所述试剂用于T3S定量的试剂盒，代表本发明的一个进一步的目的。
因此，式IV的DTPA-T3S单酰胺(3，5-二碘-N-[[(羧甲基)[2-[(羧甲基)[2-[二(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙基]氨基]乙酰基]-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸)代表根据一个优选的实施方案的螯合化合物：
Figure BDA0000414258970000151
其它分子可以由本领域专家通过结合T3S与各种螯合部分来设计和合成，其中适于络合镧系元素离子的分子例如次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺-N，N′-二(2-羟基苯乙酸)(EDDHA)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、丙二胺四乙酸(PDTA)、二乙三胺四乙酸(DTTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)及类似分子。螯合剂和T3S之间的结合可以通过本领域专家已知的各种方法获得，包括直接酰胺键形成，如在试验性部分中示例的，或者使用双官能螯合剂，其甚至可以是市售产品，比如(S)-1-对-异硫氰基苄基二乙三胺五乙酸(DTPA异硫氰酸酯-Invitrogen产品目录I24221)，或类似的产品。
用作螯合物标记的合适的镧系元素金属选自：钐、铽、镝和铕。特别优选的为铕螯合物3，5-二碘-N-[[(羧甲基)[2-[(羧甲基)[2-[二(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙基]氨基]乙酰基]-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸(式V)。
其合成的示意图显示在图2中。该方法可以概述如下：通过加入溶于合适的有机溶剂中的等摩尔量的水部分水解DTPA二酸酐，然后在合适的有机碱或无机碱的存在下，使主要由DTPA单酸酐组成的产物与T3S反应。在溶剂蒸发之后，用水稀释油性残余物。收集得到的沉淀物，用水洗涤，并且溶于水/丙酮混合物中。将该粗反应产物在Amberlite XAD1600柱或类似树脂上纯化，用水/丙酮的混合物或梯度展开。将包含产物的级分收集并蒸干，得到期望的DTPA-T3S单酰胺。
根据已知的方法，通过向单酰胺水溶液中加入等摩尔量的镧系元素盐，并且用合适的碱(例如NaOH)调节pH为7得到镧系元素络合物。任选地，可以通过吸附在离子交换柱(例如Amberlite XAD1600)上并且用水/溶剂混合物洗脱来使镧系元素螯合产物脱盐。
而且在该情况下，获得与已知的RIA试验(参见Chopra et al.，如上)相当的灵敏性，同时避免使用放射性同位素，其代表相对现有技术的分析明确的优点。
根据上述教导，技术人员可以预期ELISA的可替代形式，其仍然包括在本发明中。例如，靶激素T3S可以共价结合平皿和抗体，任选地连接示踪剂酶或者与连接示踪剂酶的抗体组合使用，用于竞争性测量未知样品中的T3S水平。根据一个进一步的实施方案，示踪剂为根据本领域技术人员已知的方法直接结合可检测酶(例如，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)的抗原本身(T3S)，也可以从即用结合试剂盒获得。
根据一个进一步的实施方案，本发明包括用于T3S施用和血清中剂量的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于按照上述非放射性分析进行T3S免疫检测的剂量试剂盒，和具有每日剂量(即，每周、两周、每月或两月需要)的量的T3S或T3S和T4组合物的施用/治疗试剂盒，所述组合物优选地为如上所述片剂的形式。
根据第一个优选的实施方案，用于T3S非放射性免疫检测的剂量试剂盒可以包括多克隆抗体、抗生物素蛋白-结合T3S衍生物，其中优选地所述缀合物为T3S-生物素，所述抗生物素蛋白-衍生物可检测部分为即抗生蛋白链菌素。更优选地，所述抗生物素蛋白-衍生物为抗生蛋白链菌素，并且所述可检测部分包括酶化学发光部分(比如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，优选HRP。
根据来源于镧系元素荧光免疫分析的实施方案，试剂盒可以包括与抗体一起的、特别地开发用于这种检测的试剂，比如镧系元素金属螯合复合物T3S衍生物，其中所述金属选自：钐、铽、镝和铕。特别优选的是铕螯合物3，5-二碘-N-[[(羧甲基)[2-[(羧甲基)[2-[二(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙基]氨基]乙酰基]-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸(式V的化合物)。
试剂盒也可以包括用于配制校正曲线的T3S标准品。标准品可以预稀释，并且即用作校正浓度的溶液或溶解在合适的溶剂中。试剂盒也可以包括其它试剂，选自：稀释剂、染料-分子、缓冲剂、防腐剂、抗-T3S抗体、说明书小册子。
现在，通过下述实施例描述本发明，其仅仅是示例性的，而不必看作限制本发明的范围。
试验部分
实施例1.在DMAC中T3S的制备
原料的总量以相对于100g的T3表示。
在氮气氛下，将3，5-二碘-O-(4-羟基-3-碘苯基)-L-酪氨酸(100g；0.154mol)悬浮在DMAC(2.0L)中，并强力搅拌以避免固体沉淀。在冷却至-5℃之后，在40分钟之内滴加CSA(142.2g；1.229mol)，同时保持温度在-5至5℃之间。在加入结束时，停止冷却，并且将反应混合物在搅拌下放置约4h。在1.5h内，将反应混合物滴加到碳酸氢钠的搅拌水溶液(335.5g；3.994mol水溶液，4.5L)中。在加入结束时，由如此得到的溶液中随时间观察到作为无机盐混合物的结晶固体沉淀物。过滤出这种固体，然后在AmberliteTM XADTM1600上，依靠用具有极性递减的水/丙酮混合物洗脱来纯化得到的溶液，将洗脱液收集到级分中。在真空下蒸发包含具有合适的纯度水平的产物的级分至浓度为10g/kg。用HCl1N调节这种悬浮液的pH至6.2。将悬浮液进一步浓缩至比例为约1：3的固体和残余水。在冷却下用丙酮处理这种残余物2h，然后过滤并用丙酮洗涤。将产物在真空下40℃干燥。得到74g呈白色固体的T3S。无水碱的产率为：62％。
实施例2.由T2(Levoditi)制备T3S
反应示意图如下：
所有的原料量都以用于1kg的Levoditi来表示。
将碘(约0.48kg，来源：SQM)、NaI(约0.65kg，来源：Ajay-SQM)和水装入反应器18-22℃中，并且搅拌直到完全溶解。在室温下，持续搅拌得到的碘化混合物直至使用。
将根据在Chalmers，J.R.et al. A.J.Chem.Soc.1949，3424-3433)中描述的方法由L-酪氨酸得到的Levoditi、NaI(approx.0.32kg)和水装入另一个反应器，并且加入70％的单乙胺。
将碘化混合物加入反应混合物中。
将得到的悬浮液在18-22℃下搅拌至少6h，然后在1h内冷却至0℃，搅拌3-4h并过滤。用水洗涤滤饼。
将湿固体悬浮在水中，向该混合物中加入乙酸并搅拌。过滤该悬浮液，并且用水洗涤滤饼。
将湿固体再悬浮在水中，搅拌、过滤并用水洗涤。
然后，将滤饼悬浮在DMAC(约12.15kg)中，并且在真空下蒸馏使悬浮液脱水。
将悬浮液冷却至5-10℃，在氮气氛中，慢慢地加入CSA(约1.54kg)，并保持温度低于15℃。
在1h内，将该溶液加入至18-22℃，并且再保持1小时，然后加入之前制备的、保持温度在30℃下、包含Na2CO3(约2.27kg)在水(约29.02kg)中的溶液的反应器中。
在Amberlite XAD1600(12.5L)柱上，通过从95：5开始极性递减至70：30的水(87.5L)和水/丙酮混合物(125L)洗脱来纯化所述溶液。收集具有高HPLC纯度的级分，并且在真空下蒸馏直到得到期望的组合物(约0.04kg的T3S/L的悬浮液)。
将该悬浮液冷却至40℃，加入乙醇(约5.22kg)，得到溶液。
在2h内，将该混合物冷却至0℃，引起沉淀，再搅拌1小时，然后过滤。在室温下，用乙醇/水混合物洗涤滤饼。
将湿固体在真空下，在近似40℃下干燥。
得到0.98kg呈白色固体的纯T3-硫酸钠盐(HPLC面积％＞99％)。
来自T2的总产率(基于无水碱计)：68.5％。
实施例3.T3S片剂的制备
将活性成分、以及与不同量的左旋甲状腺素的组合与50％量的微晶纤维素预混合十五分钟。
向该预混合物中依次加入下述成分：二山嵛酸甘油酯、水合胶体硅胶、交联羧甲纤维素钠、硬脂酸镁和碳酸钙(之前过筛穿过0.6mm干净的光筛/网目筛)、与其余50％的微晶纤维素一起，再混合20分钟。
通过从搅拌器的六个点采样来检查活性成分在混合物中分布均匀性；测试表明活性成分(或多种活性成分)均匀地分布在混合物内，在用左旋甲状腺素的制剂情况下也同样。
然后，利用装有圆平冲头的旋转式压片机压制该粉末混合物，并且使片剂进行脆碎度、崩解时间和活性成分分布的试验。
对于混合和压制方法进行的试验结果证实对于25至200μg的T3S剂量，其都是可重现的。而且，其表明如此得到的片剂具有相当于官方欧洲药典(VI Ed.)所提供要求的参数。
片剂组合物
T3S Na盐 20.6μg(相当于20μg T3S)
碳酸钙 30mg
二山嵛酸甘油酯 5mg
交联羧甲纤维素钠盐 3.5mg
水合胶体二氧化硅 2mg
硬脂酸镁 0.5mg
微晶纤维素 直至110mg
在I期临床试验中，将如上制备的片剂用于切除甲状腺的个体，表明它们可用作甲状腺激素替代治疗(参见US2011/0245342)。
实际上，在口服施用之后在血清中发现显示被吸收的T3S(穿过胃肠屏障)，并且其以剂量相关方式转化为临床活性T3。在单剂量施用之后48小时，仍可检测到T3在血清中的水平。
实施例4.通过具有化学发光检测的免疫分析法对T3S定量
T3S生物素衍生物的合成
简而言之，如下合成T3S生物素衍生物：将N-羟基琥珀酰亚胺基d-生物素-15-酰氨基-4，7，10，13-四氧杂十五烷酸酯A(50mg；0.0849mmol)溶解在DMAC(2mL)中，向其中加入DIPEA(14.5uL；0.0866mmol)，同时在连续搅拌下使反应混合物保持在0℃。然后，加入T3S(68.4mg；0.0908mmol，如在Mol&Visser，Endocrinology1985，117：1-7中制备的)，在几分钟之后，将该悬浮液放置加热至室温，得到澄清溶液。使其搅拌2h，然后保持在同一温度下过夜。在减压(10mbar；40℃)下蒸发DMAC，得到无色油状物。将如此得到的粗物质溶于H2O中，并且通过半制备性HPLC纯化。收集包含产物的级分，浓缩并最后冻干，得到呈白色固体的T3S-生物素(59.6mg；0.0495mmol)。产率58％。
如在Chopra et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.，1992，75：189-194中描述的，得到多克隆的抗-T3S抗血清。
该分析是基于竞争性ELISA，其中在白色96孔板中，递增量的T3S与结合了生物素的固定量的T3S竞争结合抗体。使用生物素-抗生物素蛋白相互作用，其允许信号扩增，与作为用于信号发展技术的发光结合，能够得到与RIA试验(描述在Chopra et al.，J.Clin.Endocrinol.Metab.，1992，75：189-194)相当的灵敏性。
以下述浓度制备T3S的标准溶液：在稀释缓冲液：PBS、0.05％吐温、0.3％BSA中1000、200、40、8、1.6pg/ml。
在上述稀释缓冲液中制备示踪溶液(T3S-生物素，180.6μM)。抗体溶液：将T3S兔子抗血清以1：50000稀释在稀释缓冲液加8mM ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸盐)、1.2mg/mL水杨酸钠中。
在4℃下，将96孔白色板用100μL/孔的稀释在磷酸盐缓冲液pH7.8中的2μg/ml抗兔子IgG涂覆过夜。同时，将生物素标记的T3S的标准溶液与如在表A中报道的稀释的抗血清和T3S-生物素溶液混合。在室温下避光培养混合样品过夜。
第二天，将所述板用洗涤缓冲液(在PBS中的0.05％吐温20)洗涤四次，然后在室温下，在阻断缓冲液(在洗涤缓冲液中的2％BSA)培养1h。
此后，将所述板用洗涤缓冲液洗涤四次，加入100μL/孔的混合样品，一式三份，并且在室温下培养所述板3h。
然后，将所述板用洗涤缓冲液洗涤三次，并且在室温下，用抗生蛋白链菌素(Streptavidin)Poly-HRP(在RASA中10ng/mL，100μL孔)培养1h。
在另外洗涤六次之后，将所述板用SuperSignal ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate(100μL/孔)避光培养5分钟，采用荧光平板读数器以每秒计数(CPS)读取发射光。
表A：校正曲线的制备
Figure BDA0000414258970000221
在缓冲液中，使用范围为1.6-1000pg/mL的五种浓度的试验项目制备校正曲线。将曲线显示在图1的图面a)中。
实施例5.通过镧系元素荧光免疫分析定量T3S
式V的化合物的制备：
[[3，5-二碘-N-[[(羧甲基)[2-[(羧甲基)[2-[二(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙基]氨基]乙酰基]-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸(6-)]铕酸酯(3-)]三钠(式V)。
Eu-DTPA-T3S单酰胺的合成
3，5-二碘-N-[[(羧甲基)[2-[(羧甲基)[2-[二(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙基]氨基]乙酰基]-O-[3-碘-4-(磺基氧基)苯基]-L-酪氨酸(DTPA-T3S单酰胺)的合成反应方案显示在图2中。
在室温下，将H2O(0.282ml；15.64mmol)在DMAC(43mL)中的溶液滴加至N，N-二[2-(2，6-dioxylenol orange-4-吗啉基)乙基]甘氨酸A(4.27g；11.94mmol)在DMAC(85mL)中的悬浮液中。在加入结束时，将该混合物加热至80℃。在4.5h之后，将反应混合物冷却至25℃，经20分钟滴加T3S/1(3g；3.98mmol)和DIPEA(2.71mL；15.92mmol)在DMAC(85mL)中的溶液。在减压(10mbar；40℃)下蒸发DMAC。用H2O(200mL)稀释油性残余物，得到淡黄色固体的沉淀，将其过滤、用H2O洗涤并干燥。将如此得到的粗物质溶于丙酮/H2O20：80(v/v)中，将该溶液(pH＝2，97)装载在
Figure BDA0000414258970000232
XAD-1600树脂柱(200mL；直径6cm)上，并且用丙酮/H2O梯度洗脱。收集包含具有类似组合物的产物的级分，并且蒸发，得到呈固体的配体DTPA-T3S(1.27g；1.15mmol)。产率26％。
在20℃下，将二氯化铕六水合物(0.17g，0.46mmol)分批加入配体DTPA-T3S(0.51g；0.46mmol)在H2O(50mL)中的溶液中(pH2.93)；在每次加入之后，搅拌该悬浮液直到完全溶解。一旦络合完成，则用0.1NaOH调节pH至7，通过由XAD-1600树脂(100mL；直径3cm)用水/丙酮洗脱使该溶液脱盐。收集包含期望产物且不含盐的级分，并且蒸发，得到呈黄色固体的式IV的化合物(0.37g，0.28mmol)。产率：61％。
根据
Figure BDA0000414258970000234
I et al.Anal Biochem.1984Mar；137(2)：335-43设计免疫分析方法。使用的溶液为如在实施例4中描述的，除了下述不同：使用Wash(Perkin Elmer)代替上述洗涤缓冲液。示踪剂储备溶液包含铕100μM，将其贮存在+4℃，避光保存。使用前，将其以1：300000稀释在分析缓冲液中，得到440pg/ml的最终浓度。
在
Figure BDA0000414258970000243
Yellow板(Perkin Elmer)中进行分析。在用混合样品培养3-h之后，向所有孔中加入稀释的式V的化合物溶液(每孔50μL)。然后，用塑料粘合片密封所述板，并且在37℃下，在搅拌下培养1h。
在三次洗涤之后，将所述板在吸水纸上轻敲干燥，并且加入Delfia增强作用溶液(Delfia Enhancement Solution)(Perkin Elmer)(200μL)。在25℃下1h之后，根据“Europium”制造商的试验设计在Victor3仪器中读取板。
使用范围为30-2000pg/mL的九种浓度的试验项目制备校正曲线。曲线显示在图1，图面b)中。
实施例6.HRP-T3S单酰胺的合成
使用包含活化的HRP的市售试剂盒(例如，HOOKTM HRP PLUSLabeling Kit-G-Biosciences)直接制备缀合物。将1-2mg的T3S溶于1mL所提供的碳酸盐缓冲液中，然后将该溶液分配到包含冻干的活化HRP的小瓶中，通过反复移液轻轻地混合，以便重构活化酶。在室温下约1小时之后，加入20μL所提供的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)溶液，然后在室温下使其反应约15分钟。最后，加入50μL的猝灭缓冲液，接着在轻轻搅拌或振摇下培养15分钟。通过透析或柱脱盐，使最终缀合物脱盐和在PBS中交换缓冲液。制备T3S-HRP缀合物的合适的稀释物，将其在单步骤ELISA中用作示踪剂，如在实施例4中描述的，省略了抗生蛋白链菌素-HRP培养步骤。
Figure BDA0000414258970000241
比较实施例：在DMF中的T3S合成和洗脱试验。
Figure BDA0000414258970000251
根据上述方案，在DMF中进行反应。
简而言之：将T3(40mg)溶于氨性乙醇中。
在氮气流下蒸发该溶液。
向残余物中，加入2ml的氯磺酸的热溶液(通过混合2.5mL的99％氯磺酸和8ml的N，N-DMF获得)。随后，使该混合物在搅拌下达到室温，并且继续反应过夜。
将混合物用水(5mL)稀释，然后在Sephadex LH-20柱(5mL)上洗脱，得到级分A。用0.1N的HCl(5mL)继续洗脱，得到级分B。
将这些级分再装载在柱上，并且通过0.1N HCl(约4mL)、水和无水乙醇顺续洗脱来纯化。
然而，使用五种不同量的水和无水乙醇进行纯化。将通过这五种条件获得的T3S产率和纯度概括在表B中。
表B：纯化试验
Figure BDA0000414258970000252
表B显示当在上述条件下进行合成并且使用DMF作为溶剂时，可以获得高转化率，但是总产率相当低。

Claims (28)

1.一种按照下述反应制备具有式II(T3S)的甲状腺激素的硫酸化形式的方法：
其中：
M为碱金属，优选Na；
包括步骤：
a)在二甲基乙酰胺(DMAC)的存在下，用氯磺酸(CSA)硫酸化式I的化合物；
b)在碱金属无机盐的水溶液中盐化，得到式II的化合物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述无机盐为钠盐。
3.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中CSA和式I的化合物之间的摩尔比为4至10，优选7至9。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中在步骤a)中，式I的化合物在DMAC中的浓度为0.060-0.090mol/L的DMAC。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中步骤a)中的硫酸化反应是在低于10℃的温度，优选-10℃至8℃的温度下进行。
6.根据权利要求5的方法，其中使步骤a)中的硫酸化进行至少2小时。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中根据步骤b)的盐化是在NaHCO3水溶液中进行的。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其进一步包括步骤c)通过在聚合吸附剂固相上、用水和有机溶剂的极性递减混合物洗脱的色谱纯化式II的化合物，其中所述步骤c)任选地在过滤步骤之后。
9.根据权利要求8的方法，其中所述极性递减的混合物是比例为1.0：0至0.7：0.3的水和极性溶剂的混合物。
10.根据权利要求8-9中任一项的方法，其中在洗脱之后，将该溶液浓缩至至少10g的式II化合物/kg，并且使溶液pH值达到5.5至6.5。
11.根据权利要求8-10中任一项的方法，其中在用有机极性溶剂处理之后，获得呈固体的式II的化合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述极性有机溶剂选自：丙酮、乙醇、异丙醇和乙腈。
13.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中将固体形式的式II的化合物进一步微粉化。
14.根据权利要求11-13中任一项的方法，其包括进一步混合任选地与左旋甲状腺素(T4)组合的式II的化合物的固体和/或微粉化形式与至少一种选自下述的稀释剂：纤维素或其衍生物、高岭土、淀粉和选自碳酸钙和碳酸镁的无机碱性盐。
15.根据权利要求14的方法，其中将式II的化合物和其中稀释剂为微晶纤维素的稀释剂的混合物进一步与至少一种助流剂、至少一种崩解剂、和任选的润滑剂混合，然后通过直接压制该混合物配制成片剂，其中，所述助流剂选自二山嵛酸甘油酯、磷酸三钙、滑石、淀粉及其衍生物；所述崩解剂选自交联羧甲纤维素或其衍生物、交聚维酮、聚甲基丙烯酸甲酯、麦芽糖糊精、乙醇酸淀粉钠、预胶化淀粉、海藻酸钠；所述润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸锌、水合胶体二氧化硅和胶体二氧化硅。
16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中式I的试剂是通过在水介质中且在脂族胺的存在下，用碘化剂，优选包括I2/NaI的混合物碘化3’，5二-碘甲腺原氨酸(T2)获得的。
17.药物组合物，包括1至1000μg的量的作为活性成分的T3S，任选地与T4、以及与下述成分一起组合：碳酸钙、二山嵛酸甘油酯、交联羧甲纤维素钠盐、水合胶体二氧化硅、硬脂酸镁、微晶纤维素。
18.权利要求17的组合物，其中T3S的量为2.5到500μg，更优选5-250μg。
19.权利要求17-18中任一项的组合物，包括下述量的作为活性成分的T3S和T4，2.5-500μg的T3S和1至800μg的T4，5-250μg的T3S和5-400μg的T4，10-100μg的T3S和10-200μg的T4。
20.一种用于T3S检测和定量的非放射性免疫分析法，包括非放射性T3S-缀合物。
21.根据权利要求20的非放射性免疫分析法，其中所述非放射性T3S-缀合物具有式A：
Figure FDA0000414258960000031
其中R选自：
a)可检测部分，选自：荧光基团，
b)酶，选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，
c)抗生物素蛋白-结合衍生物，任选地连接可检测部分，
d)镧系元素螯合剂。
22.权利要求21的免疫分析法，其中所述非放射性缀合物为式A’的T3S-生物素或T3S-HRP，
Figure FDA0000414258960000032
23.权利要求20-22的免疫分析法，其中所述免疫分析法为竞争性ELISA。
24.权利要求21的免疫分析法，包括镧系元素荧光检测系统。
25.权利要求24的免疫分析法，其中所述式A的非放射性T3S-缀合物为式IV的化合物，并且为镧系元素螯合剂，
Figure FDA0000414258960000041
26.根据权利要求21、23-25中任一项的免疫分析法，其中所述螯合的镧系元素金属选自：钐、铽、镝和铕。
27.根据权利要求26的免疫分析法，包括式V的铕螯合物
28.试剂盒，包括含有如在权利要求21-27的任一项中定义的式A的非放射性T3S-缀合物的容器，和具有用于制备T3S校正曲线的试剂和选自下述的任选的试剂或其组合的容器：稀释剂、染料分子、缓冲剂、防腐剂、抗-T3S抗体、说明书小册子。
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