CN103525934B - Miller-Dieker综合征检测芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测Miller-Dieker综合征的基因芯片，该芯片包括片基以及固定在片基上的探针，其中探针为SEQ？ID？N0.1-50所示的核苷酸序列。本发明的诊断芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成，成本低，适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。

Description

Miller-Dieker综合征检测芯片
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的基因芯片，更具体的，本发明是一种检测Miller-Dieker综合征的基因芯片。
背景技术
Miller-Dieker综合征(敏-迪综合症，MDS)是一种以无脑回和特殊面容为特征的复杂综合症。本病是由于17p13.3处多个基因微缺失或点突变引起神经原迁移障碍、导致大脑皮层发育异常造成的。本病发病率约为1.2/10万。主要临床表现为先天性无脑回、严重智力障碍；特殊的短头畸形、前额突出、双颞凹陷、鼻孔朝前的矮鼻子、面部扁平、宽厚的上嘴唇和薄唇缘、小颌等。
MDS绝大多数为散发，少数为家族性遗传，约90％的患者发现染色体17p13.3区域发生约350kb大小的微小缺失，其父母为17p13.3平衡易位携带者的可能性为20％，平衡易位携带者生育患者的可能性为33％。
目前常见的检测手段为FISH，必要的辅助检查包括头颅CT或MRI、智商测定等。FISH可作为临床诊断依据，检出率约为90％。然而尚无一种快速、低成本、大通量和自动化检测Miller-Dieker综合征基因突变的方法。
比较基因组杂交(CGH)芯片分析技术是一种突破性技术，能够支持研究人员通过微阵列准确研究与疾病有关的染色体的变化。比较基因组杂交(CGH)芯片分析的原理是在一张芯片上用两份标记不同荧光素的样品(检测样品和对照样品)同时进行杂交，从而快速而又直观地检测实验样品和对照样品之间基因组DNA的拷贝数量的差异。CGH应用于疾病遗传学的研究，可以提供一个全基因组的扫描图，提示样本DNA在整个染色体组的哪个特定位置存在扩增或缺失，那些发生扩增的区域，极有可能存在致病基因，而缺失区域即可能包含一些抑制基因。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测Miller-Dieker综合征的基因芯片。本发明的诊断芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，时间短，成本低。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及一种检测Miller-Dieker综合征的基因芯片，包括片基以及固定在片基上的探针，其中探针为SEQIDNO.1-50所示的核苷酸序列。
所述片基为载玻片、硅片、膜、高分子材料中的一种。
本发明具有如下的有益效果：本发明的诊断芯片操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，该芯片多次试验重复性高；时间短，从样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYorkColdSpringHarborLaboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
步骤一，样品准备
将水浴锅温度调到37℃和65℃，溶化10XBufferC，短暂涡旋震荡后离心数秒。
对每个反应来说，将gDNA加入到适当的无核酸酶的PCR管中，并加入无核酸酶的水使反应体积达到10.1μL。
在冰上准备酶切混合母液(DigestionMasterMix)，按顺序加入以下试剂：
将2.9μL酶切反应液加入到gDNA反应管中，使之体积达到13μL。上下颠倒使之混匀。进行PCR反应，反应程序为：37℃运行2小时，65℃运行20分钟。反应后将反应管转移到冰上，取2μL酶切好的gDNA，配置0.8％琼脂糖胶，用SYBRGold染色，跑电泳检测酶切是否完全。大部分酶切产物长度应在200bp-500bp。
步骤二，DNA的荧光标记
在每个反应管中加入2.5μL随机引物(RandomPrimers)，使之体积达到13.5μL，轻轻上下颠倒进行混匀。进行PCR反应，反应程序为：95℃变性3分钟。将反应管转移至冰上5min。
准备标记混合母液(LabelingMasterMix)，按顺序加入以下试剂：
将11.5μL标记反应液加入到gDNA反应管中，使之体积达到25μL。轻轻上下颠倒使之混匀。进行PCR反应，反应程序为：37℃运行2小时，65℃运行10分钟。将反应管转移到冰上。
步骤三，标记gDNA的洗脱
加入430μL的1XTE(pH8.0)到每个反应管中。将一个MicroconYM-30过滤柱放入一个1.5mL离心管中，并且将标记好的gDNA加到滤膜上。室温下8000g离心10m。弃滤液。加入480μL的1XTE(pH8.0)到每个过滤柱中。室温下8000g离心10m。弃滤液。
倒置过滤柱，放入一个新的1.5mL离心管中。室温下8000g离心1m收集纯化样本。检查并记录每管洗出液的体积。如果体积超出10μL，将洗出液重新加到滤膜上，室温下8000g离心1m。弃滤液。
重复上述两步直到样本体积均小于等于10μL。加入1XTE(pH8.0)使最终体积达到10μL。从每个样本中取1.5μL检测产量和比活(specificactivity)，使用NanoDropND-1000UV-VIS分光光度计测量。将等量的分别用Cy5和Cy3标记的两种样本在一个新的1.5mL耐高温(heat-resistant)的离心管中混合，达到最终体积158μL。
步骤四，芯片处理
向装有10XBlockingAgent冻干粉的小瓶中加入1350μL无核酶的水。在使用或保存之前，室温放置60m，涡旋振荡混匀。
将水浴锅调至95℃和37℃。
在一个无核酶的离心管中按顺序加入以下试剂：
试剂 体积(μL)/每次杂交反应
Cy5和Cy3标记的gDNA混合液 16
Cot-1DNA(1.0mg/mL) 2
Agilent10X Blocking Agent* 4.5
Agilent2X Hybridization Buffer* 22.5
最终杂交样本体积 45
上下颠倒混合样品，随后短暂离心。将样品管转移到95℃水浴锅中水浴3m。立即将样品管转移到37℃水浴锅中水浴30m。将样品管拿出水浴锅，17900g离心1分钟，收集管底样品。
步骤五，芯片杂交
将一张干净的垫片放在AgilentSureHyb杂交室底部，使垫片标志朝上，并与杂交室底部的长方形区域对齐。确保垫片与杂交室底部同高！缓慢地以“draganddispense”的方式将40μL杂交样品混合液加到垫片上的垫圈内区域。将芯片的“activeside”朝下放在垫片上，使得印有数字条形码的一面朝上，而印有“Agilent”标志的条形码一面朝下。确保两者相互对齐。将杂交室盖子盖在“垫片-杂交样品-芯片”三明治结构上，滑动夹具使之固定。手动加固杂交室上的夹具。垂直旋转组装好的杂交室以润湿芯片，观察气泡是否可以自由流动。如果发现静止的气泡，可以将杂交室放在桌面上通过轻轻敲打芯片或垫片使之移动。将组装好的杂交室固定在旋转器上，放入65℃的杂交炉中以20rpm的转速转动。
步骤六，芯片洗脱和扫描
在室温下将染色缸#1装满WashBuffer1。将一个芯片架放入染色缸#2。放入一个磁力搅拌子。室温下往染色缸#2中装入足够多的WashBuffer1使之足以覆盖芯片架。将染色缸放在磁力搅拌器上。将在37℃烘箱中预热过的染色缸#3放在带有加热元件的磁力搅拌器上，装入3/4体积的预热过的WashBuffer2。放入一个磁力搅拌子。打开加热元件，保持WashBuffer2的温度于37℃；用温度计控制温度。将一个杂交室从杂交炉中拿出来并计时。记录杂交过程中是否形成气泡以及所有气泡是否旋转自由。拆卸杂交室。从有条形码的一端撬开三明治结构。通过将干净镊子伸入两张拨片之间，轻轻分开两张玻片。让垫片落入染色缸底部。将芯片移至染色缸#2(WashBuffer1)的芯片架上。尽可能少地让芯片暴露于空气中。
开启磁力搅拌器搅拌5min。调整转速以达到良好而不过分的搅拌。将芯片架转移至装有WashBuffer2、预热到37℃的染色缸#3，搅拌1min。在5-10s内缓慢将芯片架移出。尽可能减少芯片上的液滴。弃用过的WashBuffer1和WashBuffer2。
立即扫描芯片以减少环境中氧化剂对于信号强度的影响
本实施例操作步骤简单，检测特异性高，稳定性好，多次试验重复性高；时间短，样本抽提到得到扫描结果可在一个工作日内完成。

Claims (2)

1.一种检测Miller-Dieker综合征的基因芯片，由片基以及固定在片基上的探针组成，其特征在于，所述探针为SEQIDNO.1-50所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测Miller-Dieker综合征的基因芯片，其特征在于，所述片基为载玻片、硅片、聚丙烯膜或硅胶晶中的一种。
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