CN103525916B - 评估肝细胞癌预后的试剂盒及rffl的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用，该试剂盒包括用于特异性检测RFFL表达水平或表达模式的试剂。应用本发明的技术方案，通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中RFFL的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的生存预后情况进行准确评估。

Description

评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用。
背景技术
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第五位，为第二大肿瘤死因。而据统计我国肝癌死亡人数约占全球因肝癌死亡人数的50%。目前以肝切除术为代表的外科治疗仍然是肝癌的首选治疗方法，但术后5年的复发转移率达60%，甚至更高。随着肝脏外科技术、麻醉和围手术期处理水平的不断改善，使肝癌手术切除率得到了显著的提高，肝癌手术死亡率也不断下降。尽管如此，肝癌患者的整体治疗水平仍无显著改善，其关键原因是肝癌切除术后复发转移率仍居高不下。
肝癌的预后是指预见患有肝癌的患者的各种情况，例如从肝癌中全面康复的可能性，经治疗后复发的可能性，肝癌诊断后患者生存的可能性等等。这可以根据疾病的严重性、诊断时间、治疗进展等各种情况而变化。只有根据其预后适当地应用各种治疗方法时，肝癌才能够得到有效的治疗。例如，对于被评估为有良好的预后的患者，有必要避免可能对患者引起严重副作用的危险的治疗方法，例如激进的化疗或手术、放疗等，而选择那些相对温和、保守和安全的治疗方法。另一方面，对于被评估为有较差的预后的患者，应当积极地进行化疗或手术，例如放疗等治疗方法以力图增加生存期或生存率。
根据迄今为止进行的研究，已经发展的肝癌的预后非常糟糕，显示了自诊断起6个月内死亡的高致死率，剩余仅四个月的平均寿命长度。但是，大小小于3 厘米的肝癌有良好的预后，且已知无需任何特别治疗，一年的生存率为90％，且手术后5 年的生存率为约40～50％。然而，根据现有技术很难精确地评估肝癌患者的预后。为了精确评估预后，需要一种把患者划分为各风险组群的分析方法。然而，迄今为止，仅仅依靠在诊断和初次手术治疗时的临床病理肝癌阶段来确定预后，而没有一种用于精确评估肝癌的方法。
因此，深入研究探讨肝癌复发转移相关的分子标志物，不仅为肝癌患者的治疗和预后评估带来益处，也可为开发新的靶向治疗药物提供依据。因此，寻找评估肝癌预后的新的分子标志物，具有重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明旨在提供一种评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用，以解决现有技术中对肝细胞癌预后评估缺少有效的生物学分子标志物的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种评估肝细胞癌预后的试剂盒。该试剂盒包括用于特异性检测RFFL表达水平或表达模式的试剂。
进一步地，试剂包括用于特异性检测RFFL mRNA 表达水平或表达模式的RT-PCR引物。
进一步地，RT-PCR引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
进一步地，试剂用于特异性检测RFFL所编码的蛋白的表达水平或表达模式。
进一步地，试剂包括：用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。
进一步地，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂包括二甲苯、乙醇及蒸馏水。
进一步地，用于脱水、透明和封片的试剂包括乙醇、二甲苯及显微镜封片用中性树脂。
根据本发明的另一个方面，提供一种RFFL作为分子标志物在制备评估肝细胞癌预后的试剂盒中的应用。
进一步地，试剂盒包括用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。
根据本发明的再一个方面，提供一种RFFL作为分子标志物在体外评估肝细胞癌预后中的应用。
应用本发明的技术方案，通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中RFFL的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的生存预后情况进行准确评估。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了RFFL mRNA和蛋白在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达水平：
图2示出了RFFL蛋白在肝癌组织中的表达水平；
图3示出了RFFL高表达与肝癌患者差的生存结局的相关；以及
图4 示出了本发明在实施中例1中的应用情况及其效果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
RFFL（E3 ubiquitin-protein ligase rififylin）基因定位17q12染色体，编码的蛋白含有363个氨基酸，大小为40KDa。截至目前，未发现有RFFL在肝癌中的作用的研究报道。
本发明的发明人首先采用Real-time qPCR、RT-PCR和Western-blot技术在新鲜肝癌组织及其邻近非瘤肝组织中检测RFFL的表达情况。结果发现，RFFL在肝癌组织中的表达水平明显高于其邻近非瘤肝组织。同时发明人还采用Real-time qPCR和Western-blot技术检测RFFL在正常肝细胞系L02及其它4种肝癌细胞系（HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3）中的表达情况。结果发现，RFFL在4种肝癌细胞系中的表达水平也明显高于正常肝细胞系。
发明人进一步采用免疫组织化学方法，对70例原发性肝细胞癌患者组织标本中RFFL的表达进行了检测，并分析了RFFL表达水平与肝癌临床病理特征的相关性。结果发现， RFFL蛋白在肝癌组织中的阳性表达率和表达水平均明显高于其邻近非瘤肝组织。为了探讨RFFL的表达与肝癌患者生存预后之间的关系，发明人对前述的70例肝癌患者进行了临床随访研究，获得了肝癌患者手术后的生存时间及复发转移的资料。根据RFFL的免疫组化Michio Shimizu评分的结果，将70例肝癌标本分为RFFL高表达组（阳性表达组）和RFFL低表达组（阴性表达组）。采用Kaplan-Meier生存曲线法计算分析RFFL高表达组和低表达组患者手术后的生存情况，并以Log-rank法分别比较和检验两组之间总体生存率和无瘤生存率的差异。结果显示，RFFL高表达组肝癌患者的总体生存率和无瘤生存率均明显低于RFFL低表达组。
接着发明人运用Cox比例风险回归模型对与肝癌预后相关的临床病理参数进行分析。发现不管单因素回归还是多因素回归分析都显示RFFL高表达代表着更差的总体生存时间和无瘤生存时间，RFFL高表达是影响肝癌患者预后的独立危险因素。这提示RFFL的高表达与肝癌患者的不良预后密切相关，可作为肝癌重要的预后标志物。
RFFL蛋白在肝癌组织和多种肝癌细胞系中均呈显著性高表达；RFFL高表达是影响肝癌患者预后的独立危险因素；RFFL可作为评估肝癌患者预后的新的标志物以及针对肝癌复发转移的分子干预治疗的潜在作用靶点。
发明人的上述发现是基于下述实验手段完成的，本发明中采用的样本及实验手段描述如下，如下文中没有详细提及的生物学手段或试剂均采用本领域常规的技术实现：
1. 病理标本均来自于手术切除并经病理组织学确诊的肝细胞癌标本。
2. 临床随访资料的收集。根据患者出院后复查B超、选择性血管造影、CT（Computed Tomography，计算机断层扫描技术）、MRI（Magnetic Resonance Imaging，磁共振成像）、血清AFP（Alpha-fetoprotein，甲胎蛋白）水平或再次手术等确定有无临床复发转移。通过门诊、电话、实地访视等方式进行随访，获得患者的复发转移或死亡时间资料。自患者手术当天开始计算患者总体生存时间和无瘤生存时间。患者术后出现肝癌复发转移或因肝癌导致的死亡，即为随访终止点。若至随访截止日期时仍未观察到患者出现肝癌复发转移和因肝癌导致的死亡，或者已出现其他原因导致的死亡，即为删失数据。随访时间为手术当天至随访终止点，其中删失数据的随访时间为手术当天至随访截止日期。以患者手术当天至患者死亡的时间定义为生存时间，以患者手术当天至发生复发转移的时间定义为无瘤生存时间。
3. L02、HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3细胞培养除特别说明外，均采用含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）（GIBCO，CA，USA）的高糖DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培养基（GIBCO，CA，USA），且均置于37℃恒温和5％ CO2浓度的二氧化碳细胞培养箱Forma Series Ⅱ Water Jacketed CO2 Incubator（Thermo Scientific，OH，USA）中培养。所有操作均在超净工作台（AIR TECH，Shanghai，China）中进行。
4. 总RNA的提取：取新鲜组织50~100 mg，以眼科剪剪碎后放入预冷后的研钵（经180℃高温灭活RNA酶），再倒入约5 ml液氮，仔细研磨粉碎组织，再转移至一无RNA酶（RNase）的1.5 ml离心管中（对于细胞：取对数生长期细胞，去除细胞培养基，加入2~3 ml PBS溶液洗涤细胞，弃去PBS（Phosphate Buffered Saline）溶液，放置于冰上。在培养皿或培养瓶里加入胰蛋白酶（Solarbio，Beijing，China）消化细胞，培基（GIBCO，CA，USA）中和灭活胰蛋白酶，细胞计数，800 g离心5 min，去除上清，1 ml PBS溶液洗涤2次，离心收集细胞），加入500 μl 裂解液（Lysis/Binding Solution，Ambion，TX，USA），剧烈震荡混匀。接着加入50μl匀浆添加剂（Homogenate Additive，Ambion，TX，USA），冰上孵育10分钟（min）。加入500 μl的磺酸-苯酚氯仿（Acid-Phenol Chloroform，Ambion，TX，USA），涡旋30~60秒（s），于离心机（Eppendorf，Hamburg，Germany）中室温下10000 g离心5 min分层。小心吸取上层水相转移至一新的无RNA酶的1.5 ml离心管中，并记录吸取的上清的体积。再加入上述上清液体积的1.25倍体积的100%乙醇。混匀后加入过滤器（Ambion，TX，USA）上室（每次最多加700 μl，超过700 μl则分次加入），室温下10000 g离心15秒，使混合液滤过过滤柱，弃去滤过液。重复上述步骤直至所有的混合液都经过滤器过滤。在过滤器上室加入700 μl的洗涤液1（Wash Solution 1，Ambion，TX，USA），快速离心5~10秒，弃去滤过液。再在过滤器上室加入500 μl的洗涤液2/3（Wash Solution 2/3，Ambion，TX，USA），快速离心5~10秒，弃去滤过液，重复该步骤1次。接着再次室温下10000 g离心1 min，去除剩余液体。将过滤柱取出，换入新的收集管，加入95℃预热的无RNA酶水，10000 g离心20~30秒，收集含有总RNA的滤过液，分装，保存于-20℃或-80℃备用。
5. RNA的定量及质量检测：取1 μl的总RNA提取溶液，加入49 μl的无RNA酶水，混匀，使用DU-800紫外分光光度仪（BECKMAN COULTER，CA，USA）测定波长为260 nm和280 nm时的吸光度值A260和A280，计算A260/A280比值，检测其浓度及纯度。正式检测前需预热紫外分光光度仪，并用50 μl无RNA酶水调零。每例总RNA样本的A260和A280均测3次，取其平均值。总RNA纯度以A260/A280比值评估，A260/A280比值介于1.8~2.1之间即可认为总RNA纯度合格。使用以下公式计算总RNA浓度：总RNA浓度=40×A260×50/1000（μg/μl）。
6. 逆转录反应（Reverse Transcription, RT）：采用Invitrogen公司的用于qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统逆转录试剂盒（Invitrogen，CA，USA），建立20 μl的逆转录反应体系。首先在无RNase的微量离心管中加入以下组分：10 mM的dNTP混合物，1 μl；500 μg/ml 的Oligo（dT）12~18，1 μl；总RNA，1 μl；无RNA酶水，9 μl。混合物在PCR仪（Biometra，Goettingen，Germany）中65℃加热5 min后，立即置于冰上。瞬时离心后，加入以下组分：0.1 M的DTT，2 μl；40单位/μl 的RNaseOUTTM核酸酶抑制剂（Invitrogen，CA，USA），1 μl；5×第一链合成缓冲液，4 μl。轻轻混匀后在37℃下孵育2 min。接着在室温下加入M-MLV逆转录酶1 μl（200单位），轻轻地吹打混匀。然后于37℃下孵育50分钟。再70℃加热15分钟以终止反应。逆转录后所得cDNA产物于-20℃下保存。
7. 荧光实时定量Real-time PCR反应：荧光实时定量Real-time PCR引物设计方法同RT-PCR，由上海生工生物工程有限公司合成。引物设计如下：RFFL基因的上游引物序列为SEQ ID NO：1（5'-caccttgtccccagactttc-3'），RFFL基因的下游引物序列为SEQ ID NO：2（5'-gcctgctgattctcctgaac-3'），产物大小为147bp。以GAPDH基因作为内参，与RFFL基因在相同条件下进行Real-time PCR反应。GAPDH的上游引物序列为SEQ ID NO：3（5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'），GAPDH基因的下游引物序列为SEQ ID NO：4（5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'），产物大小为532 bp。以上引物均加入无RNase水配成浓度为100 μM的贮存液备用。按照Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）试剂盒（Roche，Mannheim，Germany）说明书，在96孔Real-time PCR板（Applied Biosystems，CA，USA）中建立20 μl反应体系：上游引物（100 μM），0.06 μl；下游引物（100 μM），0.06 μl；FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），10 μl；无RNase水，7.88 μl；cDNA模板（≤10 ng/μl），2 μl。加完各试剂后，在96孔Real-time PCR板上贴好膜。以上各步均需在冰上操作。Real-time PCR反应过程在7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems，CA，USA）中进行。反应条件设定为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，60℃延伸1分钟，共40个循环；并进行定量和融解曲线分析。运行Real-time PCR反应，并统计分析结果。分别计算RFFL和GAPDH的Ct（Cycle threshold，循环阈值）值，以GAPDH mRNA的表达量作为内参，RFFL的mRNA的相对表达水平表示为2- Δ Ct，其中ΔCt=Ct（ RFFL ）－Ct（ GAPDH ）；而2- ΔΔ Ct表示RFFL在肝癌组织（A）中的mRNA表达水平相较其在相邻非瘤肝组织（P）中的表达水平的倍数，其中2- ΔΔ Ct = （Ct（ A ， RFFL ）－Ct（ A ， GAPDH ））－（Ct（ P ， RFFL ）－Ct（ P ， GAPDH ））。
8. 总蛋白的提取：取新鲜组织100 mg，以眼科剪剪碎后放入预冷后的研钵（经180℃高温灭菌），倒入5~10 ml液氮，仔细研磨粉碎组织，碾碎后的组织转移至1.5 ml离心管中（对于细胞：去除培养皿中的培基，以冰PBS液轻柔冲洗2次。吸尽PBS液，加入0.5 M的EDTA溶液（GIBCO，CA，USA）0.5 ml，促进细胞脱落。用细胞刮匙刮取细胞，放入1.5 ml EP管中，800 g常温下离心5 min，弃去上清。），再加入1 ml RIPA裂解液（碧云天，上海，中国）。涡旋震荡后，置冰上孵育30 min，每4~5 min涡旋一次。于4℃下12000 g离心15分钟，吸取上清液转移至新的离心管中。重复一次，取上清即为总蛋白。将总蛋白分装保存于-80℃。
9. SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹：配置12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶和5%的浓缩胶。准备蛋白样品。在提取的蛋白中加入5× SDS-PAGE Loading Buffer（碧云天，上海，中国）（稀释至终浓度1×），平时于-80℃保存。将加好Loading Buffer的蛋白样品置于开水中水浴10 min变性。蛋白样品稍冷却后，12000 rpm离心5~10 min，用特制的细长TIP头取上清上样，采用Mini-PROTEAN Tetra System小型垂直电泳系统（BIO-RAD，CA，USA）进行电泳，之后使用TE77 ECL Semi-Dry Transfer Unit半干转膜仪（Amersham Biosciences，NY，USA）将蛋白样品转移至PVDF Western Blotting Membranes（Roche，Mannheim，Germany）上。PVDF[Poly（vinylidene fluoride），聚偏氟乙烯]膜用甲醇预处理5 s成半透明状后，放入转膜缓冲液中；滤纸用转膜缓冲液泡着。去除小玻片，切除积层胶，盖上PVDF膜，防止气泡产生，盖滤纸，再去除大玻片，制成“夹心饼”样（从上往下，依次为：滤纸、胶、PVDF膜、滤纸）。电压12 V下半干转约80 min。转膜完成后，用PBS液将PVDF膜漂洗3~5 min，去除转膜缓冲液。再将膜放入5%的脱脂牛奶（用PBS溶液溶解）中封闭45 min。之后用PBS-T溶液（PBS溶液中加入终浓度为0.1%的吐温-20）洗涤3次，每次5 min。接着将膜放入用PBS溶液适当稀释的7~10 ml的一抗中，于4℃摇床过夜。次日，将膜放入PBS-T液中轻摇5 min，共3次。再将膜放入用PBS溶液适当稀释的二抗中，室温下轻摇20~30 min。接着用PBS-T液洗涤15 min，共3次。将膜用显像试剂WesternBrightTM ECL-spray Western blotting detection system（ADVANSTA，CA，USA）浸泡1 min，再将膜和胶片贴在一起后放入暗盒，压紧暗盒，约1 min，再边显边看。当条带显影而背景未显影时，将胶片放入定影液中漂洗，定影，摄片。采用Bio-Rad Molecular Imager Gel DocTM XR+ Imaging System凝胶成像系统（BIO-RAD，CA，USA）扫描保存，并使用Gel-Pro analyzer 4软件对Western-blot条带图像的灰度值进行半定量分析，并采用方差分析进行统计学分析。每个样本重复检测3次，结果取平均值。使用的一抗包括：兔抗人RFFL多克隆抗体（abcam，Massachusetts，USA）；兔抗人β-Actin蛋白多克隆抗体（Santa Cruz，CA，USA）等。以兔抗人β-Actin蛋白多克隆抗体检测β-Actin蛋白作为内参照。使用的二抗包括：HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（Santa Cruz，CA，USA）；辣根酶标记的山羊抗兔IgG抗体（中杉金桥，北京，中国）等。
11. 免疫组化检测方法如下：免疫组织化学检测采用非生物素-辣根酶标记的超敏二步法。使用的主要试剂为PV-9003山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒（中杉金桥，北京，中国）。
（1）切片：本研究使用的所有的肝细胞癌的石蜡组织标本以3~5 μm厚度行连续切片。
（2）烤片：将石蜡切片放在铜架上，置60℃~70℃烤箱烤30~60 min。
（3）脱蜡：切片从烤箱中取出后，立即置于二甲苯（100%）中，浸泡15 min后换到第二缸二甲苯，再浸泡15 min。
（4）水化：切片从二甲苯取出后依次置于无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇和50%乙醇中浸泡3~10 min；再用自来水冲洗5 min（先装一盆水放在水龙头下，调整水龙头使水量适中，再将切片架放在水盆中冲洗）；蒸馏水过一下。
（5）抗原修复（微波热修复）：13.5 ml柠檬酸修复液A液加上61.5 ml B液，再加去离子水至750 ml，配成柠檬酸抗原修复液；切片正面朝上放在修复液中，在微波炉中煮至沸腾，避免煮干，10 min×2次；修复结束后，切片自然冷却至室温；PBS浸泡，5 min×2次（保证第一次浸泡的是新配的PBS）。
（6）灭活内源性过氧化物酶（HRP酶）：从PBS中取出切片，在蒸馏水中过一下；3% H2O2室温孵育30 min；蒸馏水冲洗（直接用蒸馏水冲洗切片架上的切片，或者将切片放在蒸馏水中浸泡3~5 min）；PBS浸泡5 min。
（7）封闭：滴加封闭血清（相应二抗的封闭血清原液，用PBS稀释至10%，可再加1%BSA）后室温或37℃孵育15~30 min。
（8）孵育一抗：滴加1：300稀释的兔抗人RFFL多克隆抗体（abcam，Massachusetts，USA），37℃预孵育30 min后再置于4℃过夜；第二天先将切片在37℃复温30 min，再泡PBS，3 min×3次。
（9）孵育二抗：切片滴加聚合物辅助剂（PV-9003试剂盒中试剂1），37℃孵育15~20 min；PBS浸泡，3 min×3次；切片滴加二抗（PV-9003试剂盒中试剂2），37℃孵育15~20 min；PBS浸泡，3 min×3次。
（10）显色剂显色：使用DAB显色试剂盒（中杉金桥，北京，中国）配制显色剂，取一干净EP管装1 ml DAB底物液，再加入50 μl浓缩DAB（二氨基联苯胺，Diaminobenzidine）溶液（20×），混匀即可（DAB配好后需避光放置，30 min内使用）；滴加适当显色剂于切片上，镜下控色，记录时间并保证各切片的显色时间一致；染色完成后，切片置自来水中冲洗5 min。
（11）苏木素复染：滴加适当苏木素（碧云天，上海，中国）于切片上，复染时间约为0.5~3 min；自来水冲洗5~10 min。
（12）返蓝、脱水、透明：若复染后过蓝，可将切片置于1%盐酸酒精中过一下；再依次于自来水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和无水乙醇中浸泡3~5 min；最后将切片置于二甲苯中3 min。
（13）封片：滴加适当的封片剂（中性树脂）（碧云天，上海，中国）于切片上，将盖玻片附着于封片剂上，让封片剂扩散至全部组织切片（避免产生气泡）；再将封好的切片水平置于37℃烤箱中适当烤干即可。
（14）镜下阅片：首先在ECLIPSE 80i显微镜（Nikon，Tokyo，Japan）的低倍镜（100×）下观察大体结果；找到感兴趣的区域后，转至高倍镜（400×）观察，并进行照相和RFFL染色结果的评价。
12. 免疫组化的染色评估方法如下：参考Michio Shimizu等（M. Shimizu, Y. Saitoh and H. Itoh, Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal, benign, and malignant human pancreatic tissues. Hum Pathol, 1990. 21（6）: 607~612）报告的方法，在所有标本的每张切片随机选择5个视野，首先按照细胞染色强度计分：无染色记为0分，显著的深度染色记为2分，染色程度居中的浅染色记为1分。其次按阳性染色细胞所占的比例计分：无染色记为0分，1/3以下的局部染色记为1分，1/3以上至2/3以下的多个部位染色记为2分，2/3以上的绝大部分细胞弥漫性染色则记为3分。最后将两者的评分相加，0分为（－），2分为（±），3分为（＋），4分为（＋＋），5分为（＋＋＋）。定义（－）和（±）为阴性表达（或低表达），（＋）、（＋＋）和（＋＋＋）为阳性表达（或高表达）。
13. 统计学分析方法：全部数据均使用IBM SPSS Statistics Version 19.0.0 for Windows统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用配对样本或者独立样本t检验；计数资料采用χ2检验。采用Spearman等级相关分析RFFL的表达水平与肝癌临床病理特征之间的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析法计算肝癌患者手术后的总体生存率（Overall Survival）和无瘤生存率（Disease-free Survival）。采用Log-rank法比较各组间无瘤生存率和总体生存率的差异。采用逐步回归法建立Cox比例风险回归模型，使用单因素和多因素法分析肝癌患者的临床病理特征以及RFFL表达水平等因素对其手术后预后的影响；并确定影响肝癌患者预后的独立危险因素，分别以P<0.05和P>0.10作为引入和剔除影响因素的筛选界值。本研究中所有数据分析的检验均为双侧检验，且均以P<0.05作为差异具有统计学显著性意义的检验界值。
采用上述实验手段，具体地，发明人得到了如下结果：
RFFL mRNA在肝癌组织中的表达水平要显著高于相应的癌旁肝组织，通过Real-time PCR检测25对肝癌组织及相应的癌旁组织，引物设计如下：RFFL基因的上游引物序列为SEQ ID NO：1（5'-caccttgtccccagactttc-3'），RFFL基因的下游引物序列为SEQ ID NO：2（5'-gcctgctgattctcctgaac-3'），产物大小为147bp。以GAPDH基因作为内参，与RFFL基因在相同条件下进行Real-time PCR反应。GAPDH的上游引物序列为SEQ ID NO：3（5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'），GAPDH基因的下游引物序列为SEQ ID NO：4（5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'），产物大小为532 bp，所有引物均按100 μM浓度稀释备用。按TOYOBO公司 PCR 试剂盒说明书，建立50 μl PCR 反应体系如下：SYBR® Green Realtime PCR MasterMix-Plus-25 μl；Plus Solution 5 μl；上游引物（10μM）2 μl；下游引物（10μM）2 μl；所检测样品cDNA溶液5 μl；dH2O 11μl。PCR 反应过程在ABI Prism 7300 Real-Time PCR System（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上完成。反应条件为 95℃预变性60 sec；95℃ 15 sec，60 ℃ 15 sec，72 ℃ 45 sec（样本编号分别为N81、N110、N78、N105、N66、N31、N18、N79、N60、N100、N21、N38、N43、N52、N121、N132、N107、N104、N109、N163、N11、N30、N51、N93、N70）中RFFL mRNA水平（图1A）；通过western-blot检测肝癌组织及相应的癌旁肝组织中RFFL蛋白表达水平，结果显示RFFL蛋白在肝癌组织中的表达水平要显著高于相应的癌旁肝组织（图1B）；同时，发明人发现RFFL mRNA和蛋白在肝癌细胞系中的表达水平亦明显高于正常肝细胞系（图1C,D）。发明人进一步采用免疫组织化学方法，对70例原发性肝细胞癌患者组织标本中RFFL的表达进行了检测，并分析了RFFL表达水平与肝癌临床病理特征的相关性，结果发现RFFL表达水平与肿瘤血管浸润以及UICC分期密切相关（P<0.05），而肿瘤血管浸润和UICC分期是公认的影响肝癌预后的指标（表1）。免疫组织化学结果还发现，RFFL蛋白在肝癌组织中的阳性表达率和表达水平均明显高于其邻近非瘤肝组织。为了探讨RFFL的表达与肝癌患者生存预后之间的关系，发明人对前述的70例肝癌患者进行了临床随访研究，获得了肝癌患者手术后的生存时间及复发转移的资料。根据RFFL的免疫组化Michio Shimizu评分的结果，将70例肝癌标本分为RFFL高表达组（阳性表达组）和RFFL低表达组（阴性表达组）。采用Kaplan-Meier生存曲线法计算分析RFFL高表达组和低表达组患者手术后的生存情况，并以Log-rank法分别比较和检验两组之间总体生存率和无瘤生存率的差异。结果显示，RFFL高表达组肝癌患者的总体生存率和无瘤生存率均明显低于RFFL低表达组（图2,3）。
表1
本发明的发明人在上述发现的基础上，提供了一种评估肝细胞癌预后的试剂盒。该试剂盒包括用于特异性检测RFFL表达水平或表达模式的试剂。采用本发明的试剂盒，RFFL作为一种评估肝细胞癌预后的分子标记能够准确的对肝细胞癌的复发转移进行监测和预后评估。
根据本发明一种典型的实施方式，试剂包括用于特异性检测RFFL mRNA 表达水平或表达模式的RT-PCR引物，能够从mRNA水平上对RFFL表达水平或表达模式进行监测和预后评估。
用于监测和预后评估RFFL在mRNA表达水平或表达模式的RT-PCR引物的可以采用Primer 5设计，优选地，RT-PCR引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
根据本发明一种典型的实施方式，试剂为用于特异性检测RFFL所编码的蛋白的表达水平或表达模式，这样能够从蛋白水平上对RFFL表达水平或表达模式进行监测和预后评估，结果更为准确。
优选地，试剂包括：用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。采用上述试剂，通过本发明描述的免疫组织化学法对RFFL表达水平或表达模式进行监测和预后评估。
优选地，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂包括二甲苯、乙醇及蒸馏水。
优选地，用于脱水、透明和封片的试剂包括乙醇、二甲苯及显微镜封片用中性树脂，例如PVP封片液。
根据本发明一种典型的实施方式，提供RFFL作为分子标志物在制备评估肝细胞癌预后的试剂盒中的应用。
优选地，试剂盒包括用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。
应用本发明的试剂盒评估肝癌患者的术后生存预后：
实施例1
采用本发明对30例肝细胞癌患者进行预后分析，结合临床随访研究，获得了肝癌患者手术后的生存时间及复发转移的资料。根据RFFL的免疫组化Michio Shimizu评分的结果，将30例肝癌标本分为RFFL高表达组（阳性表达组）和RFFL低表达组（阴性表达组）。采用Kaplan-Meier生存曲线法计算分析RFFL高表达组和低表达组患者手术后的生存情况，并以Log-rank法分别比较和检验两组之间总体生存率的差异。结果显示，RFFL高表达组肝癌患者的总体生存率明显低于RFFL低表达组（P<0.05），结果如图4所示：30例肝癌患者中包括RFFL高表达患者18例，RFFL低表达患者12例。免疫组织化学的结果显示RFFL高表达组的总体生存率要显著低于RFFL低表达组（图4），表明应用本发明的试剂盒可以准确评估肝癌患者的术后生存预后。
由此可见，RFFL相对低表达的肝癌患者具有更好的生存预后，即通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中RFFL的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的生存预后情况进行准确评估。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江大学医学院附属义乌医院
<120> 评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
caccttgtcc ccagactttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gcctgctgat tctcctgaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
aggtcggagt caacggattt g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
gtgatggcat ggactgtggt 20

Claims (1)

1.RFFL作为分子标志物在制备评估肝癌患者术后总体生存率的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗体，辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。
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