CN103524626B - 重组双靶点蛋白药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类用于抗肿瘤治疗的双靶点抗肿瘤重组蛋白药物OC001及其构建及运用。本发明还提供了该类蛋白药物在制备治疗多种肿瘤的药物中的用途。

Description

重组双靶点蛋白药物及其应用

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白质药物，及其用于制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤主要包括乳腺癌、肝癌等。本发明属于生物医药工程领域。

背景技术

肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤恶性表征的重要标志，这一肿瘤生物学过程包含一系列的细胞信号传导通路的紊乱与异常。大规模系统的肿瘤信号传导通路的筛选表明,下丘脑-垂体-生长轴相关因子在所有已知的促进肿瘤发生发展的信号传导通路中位列第三位。其中生长激素及催乳素激素位于这一机体生长调控轴，在肿瘤的发生和发展过程中起着至关重要的作用。比如生长激素或催乳素得过量表达将显著促进多种肿瘤如乳腺癌和肝癌的发生与发展。因此针对二者的分子靶向治疗途径将大大有助于乳腺癌和肝癌等肿瘤的临床治疗。

传统的肿瘤治疗方法包括手术、放疗、化疗和激素疗法，然而总有大量的肿瘤患者对上述传统的肿瘤治疗方法不敏感从而导致治疗失败。传统的化疗药物的缺陷表现为：1)对肿瘤细胞和正常细胞同样都具有毒性；2)由于肿瘤细胞在基因组上的不稳定性，经过长期的化疗，将导致耐药性的克隆株的出现而导致治疗失效。

本发明的多肽作为人生长激素与人催乳素双靶点抗肿瘤药物，不仅具有高效低毒的特点，还通过导入特异的蛋白质多肽序列从而能发挥长效作用，代表着新一代基因工程肿瘤治疗药物的发展方向。

发明内容

人生长激素与人催乳素在多种人类肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。人生长激素与人催乳素通过结合与各自特异的受体，即人生长激素受体与人催乳素受体而发挥特异性的促进肿瘤恶性增殖与侵袭转移的作用。本发明根据人生长激素与人催乳素各自的受体在分子结构上高度的相似性，设计出能够竞争性地与人生长激素与人催乳素与各自受体结合的重组蛋白分子，从而达到特异性地同时阻断人生长激素受体与人催乳素受体激活的效果，以阻断人生长激素与人催乳素促进肿瘤恶性增殖的能力。

为了提高本药物在体内对肿瘤的杀伤效率，我们还在其羧基端(C末端)插入了两个拷贝的人绒毛膜促性腺激素(hCGB)的羧基端肽段(CTP)，以提高其在体内的稳定性并延长药物的半衰期，从而构建得到OC001多肽。我们将编码OC001的表达载体pIRES-neo转染入中国仓鼠CHO细胞进行瞬时表达可以在细胞培养的上清中检测到重组蛋白多肽OC001的表达。我们将编码OC001的表达载体pIRES-neo分别转染转染入人乳腺癌细胞(及SKBR3及BT-474)及肝癌细胞(Bel-7404)，发现表达此蛋白都可以显著抑制这三种细胞的增殖。在CHO-DG44细胞中真核表达OC001并得到纯化后的蛋白，在体外有显著地抑制乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和子宫内膜癌细胞生长激素信号功能和肿瘤细胞增殖的能力，药代学分析表明OC001在小鼠体内的代谢速率较生长激素显著降低，半衰期明显延长，表明OC001具有抑制肿瘤细胞增殖的良好活性和显著的长效性。

附图说明

图1是免疫印迹检测CHO细胞上清中的OC001表达。

图2是在人肝癌细胞系Bel-7404和乳腺癌细胞系BT-474和SKBR3中转染OC001表达载体后的活力，可见过表达OC001显著抑制了癌细胞的活力。

图3是ELISA检测稳定表达OC001的CHO-DG44单克隆细胞上清，可见第5号克隆的表达量相对较高。

图4是SDS-PAGE检测经纯化后的OC001重组蛋白。

图5是检测OC001重组蛋白对人乳腺癌细胞T47D生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测OC001对STAT5信号的抑制作用，可见在T47D细胞中，OC001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。

图6是检测OC001重组蛋白对人前列腺癌细胞LnCAP生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测OC001对STAT5信号的抑制作用，可见在LnCAP细胞中，OC001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。

图7是检测OC001重组蛋白对人子宫内膜癌细胞RL95-2生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测OC001对STAT5信号的抑制作用，可见在RL95-2细胞中，OC001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。

图8是检测OC001蛋白对人乳腺癌细胞T47D的生长抑制作用，可见在低浓度血清下OC001显著地抑制T47D细胞的活力。

图9是检测OC001蛋白对人子宫内膜癌细胞RL95-2的生长抑制作用，可见在低浓度血清下OC001显著地抑制RL95-2细胞的活力。

图10是皮下注射OC001后检测小鼠血清中的蛋白含量，可见OC001的半衰期显著长于生长激素，显示其具有潜在的长效性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

1.人生长激素基因(cDNA)的克隆

用Trizol法抽提人乳腺癌细胞系MCF7-hGH的总RNA，此细胞系是新加坡国立大学Peter Lobie教授所用于科研及发表论文的细胞系。采用Fermentas公司的RevertAidFirst strand cDNA合成试剂盒(产品目录号：K1622)将总RNA逆转录为cDNA。

设计引物用于扩增人生长激素(GH)基因，所使用的引物序列如下：

5'TTTAGCTAGCATGGCTACAGGCTCCCG 3'(SEQ ID NO:3)

5'ACGAATTCCTAGAAGCCACAGCTGCC 3'(SEQ ID NO:4)

采用Takara公司PrimerSTAR DNA聚合酶(产品目录号：DR044A)进行PCR反应，条件如下：

98℃ 10秒

60℃ 5秒

72℃ 50秒

共30个循环

PCR产物经过纯化后(美国Axygen公司)，用NheⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶(美国Fermentas公司)双酶切后，再经纯化，然后与酶切纯化后的载体pIRES-neo3(Clontech公司)进行连接反应(Takara公司)。转化细菌后，挑取单菌落，小量扩大培养，抽提质粒，再用酶切鉴定得到初步正确的克隆，再进行核酸测序得到证实。

2.将人生长激素第146位的甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)

采用重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)将人生长激素第146位的甘氨酸(G)突变成精氨酸(R)，设计四条引物分别如下：

A:5'TTTAGCTAGCATGGCTACAGGCTCCCG 3'(SEQ ID NO:5)

B:5'GCGTTTGGATCCTTTCCTCTAGG 3'(SEQ ID NO:6)

C:5'CCTAGAGGAAAGGATCCAAACGC 3'(SEQ ID NO:7)

D:5'ACGAATTCCTAGAAGCCACAGCTGCC 3'(SEQ ID NO:8)

用以上克隆成功的pIRES-hGH质粒为模板，用A，B为引物，克隆出片段AB，PCR反应条件如下：

98℃ 10秒

60℃ 5秒

72℃ 30秒

共30个循环

同样以pIRES-hGH质粒为模板，用C,D为引物，克隆出片段CD，反应条件如上。

将以上克隆出来的AB和CD片段纯化回收后，用AB和CD为模板，以A，D为引物，克隆出AD，即突变后的GH(G146R)，反应条件如下：

98℃ 10秒

60℃ 5秒

72℃ 60秒

共30个循环

将AD片段纯化回收后，用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切后，再经纯化，然后与酶切纯化后的载体pIRES-neo3进行连接反应，转化细菌后，挑取单菌落，小量扩大培养，抽提质粒，再用酶切鉴定得到初步正确的克隆，再进行核酸测序得到证实。成功克隆得到pIRES-G146R。

3.OC001b表达载体的构建

G146R与两个拷贝的人绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin(hCGB)基因β亚基C末端肽段(carboxyl-terminal peptide(CTP)of human chorionic gonadotropin(hCG)βsubunit)融合，即构建OC001。

两个拷贝的hCG-CTP采用全基因合成，合成后的序列如下：

5’TCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTCCAAGCCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAATCCTCTTCCTCAAAGGCCCCTCCCCCCAGCCTTCCAAGCCCATCCCGACTCCCGGGGCCCTCGGACACCCCGATCCTCCCACAA 3'(SEQ ID NO:9)

再次采用重叠延伸PCR方法将G146R与两个拷贝的hCG-CTP拼接融合，设计四个引物如下：

a:5'AAAGCTAGCATGGCTACAGGCTCCCGG 3'(SEQ ID NO:10)

b:5'CTTTGAGGAAGAGGAGAAGCCACAGCTGCC 3'(SEQ ID NO:11)

c:5'GGCAGCTGTGGCTTCTCCTCTTCCTCAAAG 3'(SEQ ID NO:12)

d:5'AAAGAATTCTTATTGTGGGAGGATCGG 3'(SEQ ID NO:13)

用以上克隆成功的pIRES-G146R质粒为模板，用a，b为引物，克隆出片段ab，PCR反应条件如下：

98℃ 10秒

60℃ 5秒

72℃ 50秒

共30个循环

用全基因合成的hCG-CTP质粒为模板，用c，d为引物，克隆出片段cd，PCR反应条件如下：

98℃ 10秒

60℃ 5秒

72℃ 20秒

共30个循环

将以上克隆出来的ab和cd片段纯化回收后，用ab和cd为模板，以a，d为引物，克隆出ad，即G146R-2CTP，反应条件如下：

98℃ 10秒

60℃ 5秒

72℃ 60秒

共30个循环

将ad片段纯化回收后，用Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后，再经纯化，然后与酶切纯化后的载体pIRES-neo3进行连接反应，转化细菌后，挑取单菌落，小量扩大培养，抽提质粒，用酶切鉴定得到初步正确的克隆，再进行核酸测序得到证实。至此pIRES-G146R-2CTP克隆成功。

克隆得到的pIRES-G146R-2CTP表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因如SEQ ID NO:2所示。

4.OC001在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达

采用CHO细胞(购自美国ATCC)检测OC001在其中的表达。

CHO细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5％CO2/95％空气培养条件下培养于六孔板中，将细胞培养到大约70％密度后，用转染试剂Attractene(德国Qiagen公司)将表达OC001的质粒转入细胞，孵育24小时后，弃去培养液，并用生理盐水润洗两遍，每孔加入2ml无血清DMEM培养液，继续培养24小时后，将上清吸入Eppendorf管中，12000g离心3分钟后，将上清吸入10KD孔径的超滤管(美国Millipore公司)中，4℃，3000g离心一小时，吸出超滤管中溶液即为浓缩的CHO分泌蛋白。

取12μl浓缩上清加入3μl 5×SDS Loading buffer煮沸10分钟后，上样于浓度为12％的SDS-PAGE胶中，恒压120V跑胶1小时候将胶取出，将胶中蛋白转移到硝酸纤维素膜(美国GE公司)中，室温孵育抗人生长激素的一抗(购自美国NIDKK)两个小时,用洗脱液洗膜后再加入HRP连接的山羊抗兔IgG的二抗(美国Thermo公司)，室温孵育一个小时后再次用洗脱液洗膜，结束后加入HRP底物在化学发光仪中显色，结果如图1：

有两条特异性条带，一条大小约为30KD，另一条大小约为40KD，40KD大小的为糖基化的OC001。

5.表达OC001对乳腺癌细胞系及肝癌细胞系的体外杀伤测试

采用人乳腺癌细胞系BT-474和SKBR3(购自美国ATCC)，人肝癌细胞系BEL-7404(购自中国科学院上海细胞库)，检测表达OC001蛋白对癌细胞增殖的影响。

上述细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5％CO2/95％空气培养条件下培养于六孔板中，将细胞培养到大约70％密度后，用转染试剂Attractene(德国Qiagen公司)将表达OC001的质粒和对照空质粒转入细胞，孵育24小时后，弃去培养液，将细胞用胰蛋白酶消化，吹打成单个细胞并计数，重新将细胞种入96孔板，每个孔含有5000个细胞，孵育6天后，将每空加入10μl CCK-8(日本Dojindo公司)，37℃孵育两个小时候，测450nm吸光值。实验结果表明，过表达OC001的三种癌细胞增殖均受到了明显影响，其结果如图2所示。

6.稳定表达OC001的CHO-DG44细胞系的建立

首先建立过表达OC001的CHO-DG44稳转细胞系

稳转细胞系的建立过程如下：培养CHO-DG44细胞(购自Invitrogen公司)至60％密度时，用QIAGEN公司的转染试剂Effectene转染OC001表达质粒，转染后正常培养48小时后，将培养液换成含有800ug/ml G418的培养液，继续培养1周以上，可见大部分细胞死亡，少数没有死亡的细胞形成细胞克隆，即为稳转OC001的细胞，用抗人生长激素进行免疫印迹检测细胞上清可以发现有OC001的特异性条带。

前期我们得到了群体的稳转细胞，用96孔板有限稀释法，每孔加入0.5个细胞，共挑选了近二十个单克隆，用ELISA测量这些克隆的表达情况，挑选表达较高的克隆进行悬浮培养。

将挑选的十二个克隆依次在96孔板-24孔板-12孔板-6孔板和T25培养瓶中培养并冻存保种，保种后将细胞种在96孔板中，每孔2万个细胞，待48小时后细胞密度达95％左右时，弃去培养液，加入新鲜的不含FBS的Excell-302培养液200μl，孵育48小时后，收集上清培养液，12000g离心5分钟后吸取上清到新的EP管中，置于-80℃待用。

采用Abcam公司人生长激素ELISA试剂盒(Cat No：ab100526)测量单克隆培养上清中的OC001含量，测量结果如图3。

从图3中可知，第5和6号克隆的表达量相对较高，在上清中的含量分别为7.21和4.71mg/L。下一步大量悬浮扩增首先采用第5号克隆。

DG44细胞在有FBS的情况下可以贴壁培养，除去FBS后即可悬浮培养，悬浮培养由于细胞可以达到很高的密度，甚至可以达到10⁷个细胞/ml，所以大部分CHO细胞生产重组蛋白均采用悬浮培养。

7.OC001重组蛋白的表达和纯化。

复苏DG44OC001克隆5，扩大培养到5个T75，待细胞长到大约90％密度时，将细胞传代收集到1个50ml离心管中，加入含10％FBS的10ml EXCEL 302培养液重悬细胞。

将重悬后的细胞加入到2L的滚瓶中，加入10％FBS的10ml EXCEL302，放入滚箱中滚动培养数天。

待细胞长至90％密度时，将培养液弃去，用PBS润洗2遍后，计入不含FBS的EXCEL302培养液，继续培养3天。

收集培养液，12000g*10min，收集上清。

用含有10kD滤膜的浓缩瓶将样品浓缩到100ml。

将样品在低盐buffer：50mM Tris HCl 4度透析过夜。

过阳离子交换树脂，采用高盐buffer:50mM Tris HCl，1M NaCl，低盐buffer:50mlTris HCl.

再过分子筛后，SDS-PAGE上样检测蛋白纯度。

从图4中可见lane1为纯化前的蛋白样品，lane2-4为过完分子筛后的蛋白样品，从图中可以大致得出蛋白纯度>95％.

8.OC001对生长激素信号通路的抑制检测。

采用人乳腺癌细胞系T47D、前列腺癌细胞系LnCAP细胞和子宫内膜癌细胞RL95-2，这三种细胞对hGH的刺激反应良好，GH下游的STAT5水平显著提高。

将T47D、LnCAP和RL95-2细胞传到6孔板中，待细胞长到90％密度后，将培养液换成无血清RPMI-1640，37度孵育12小时。

加入不同浓度比例的hGH和OC001，如图5、6、7所示，37度孵育10分钟后，后用预冷PBS润洗两遍后，加入RIPA裂解液裂解细胞，后离心取出上清蛋白，测浓度后，跑SDS-PAGE胶，转膜，封闭，孵育抗体后加入HRP底物显影如图5、6和7。可见，在三种细胞中，加入hGH刺激后，活化形式的STAT5(p-STAT5)显著上调，加入不同浓度梯度的OC001后，p-STAT5水平被显著抑制。说明OC001可以显著抑制GH信号通路。

9.OC001对乳腺癌细胞T47D和子宫内膜癌细胞RL95-2的体外杀伤检测。

采用乳腺癌细胞T47D和子宫内膜癌细胞RL95-2进行体外功能实验，将T47D和RL95-2细胞消化成单个细胞并重悬计数，调整细胞密度为50000cells/ml，在96孔板中分别加入200ul(10000cells)细胞或100ul(5000cells)细胞，37度孵育12小时后，将培养基分别换为10％FBS medium+vehicle，10％FBS medium+OC001，1％FBS medium+vehicle，1％FBSmedium+OC001，OC001的终浓度为1uM。

37度分别孵育3,6和9天，将培养基弃去，加入100ul含有5ul CCK8试剂的完全培养基，37度孵育2小时后，测OD450值。

从图8和图9可知，在完全培养液(10％FBS)中，OC001对T47D和RL95-2细胞增殖抑制作用有限，在低浓度血清培养基(1％FBS)中，OC001对RL95-2细胞有显著的抑制增殖作用。

10.OC001在小鼠体内的代谢半衰期检测。

因生长激素GH在体内的半衰期很短(12小时左右)，经过改造的OC001预期的半衰期会显著增加，我们用Balb/C小鼠皮下注射的方法来检测和对比hGH和OC001的半衰期。分别皮下注射生长激素hGH和OC001，注射剂量为50μg/kg体重，注射第0,1,2,6,12,24,48,72小时小鼠尾静脉取血，后经离心吸出上清，采用Invitrogen GH ELISA检测试剂盒KAQ1081检测GH的含量变化，从图10中可见，皮下注射生长激素GH后，在约12小时后含量减半，24小时左右含量低到检测阈值，而OC001在48小时后小鼠体内还有显著的表达，到72小时才低至检测阈值。说明OC001在小鼠体内代谢清除速率较GH显著降低，预期可以显著降低给药的频率。

Claims (7)

1.一种重组多肽，其特征在于该重组多肽通过以下方式构建得到：将人生长激素第146位的甘氨酸突变为精氨酸，并在其C端与两个拷贝的人绒毛膜促性腺激素基因β亚基C末端肽段融合；

所述两个拷贝的人绒毛膜促性腺激素基因β亚基C末端肽段的编码基因如SEQ ID NO:9所示；

所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.包含权利要求2所述基因的载体。

4.权利要求1所述的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

5.权利要求2所述的多肽的基因在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

6.权利要求4所述的用途，其特征在于所述肿瘤是乳腺癌或肝癌。

7.权利要求5所述的用途，其特征在于所述肿瘤是乳腺癌或肝癌。