CN103521148B - 一种包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料及制备方法和应用，以超顺磁性无机纳米材料作为种子粒，利用溶胶-凝胶化学原理，采用水解冷凝合成，在超顺磁性纳米材料表面包覆上无定型金属氧化物，得到超顺磁性复合材料前驱体；将前躯体材料分散到水中，经高温高压水热处理及高温煅烧处理，得到具有超顺磁性、表面包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料。本发明的纳米复合材料具有超顺磁性且分散性好，有很好的生物相容性，且比表面积大，可对低至1x10^-10M级的复杂肽段混合物中的痕量磷酸化肽进行选择性富集，方法简单有效。该材料及制备方法在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

Description

一种包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料及制备方法和应用

技术领域

本发明属于先进纳米复合材料和生化分析技术领域，具体为一种包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料及制备方法和应用。

技术背景

蛋白质可逆磷酸化修饰能够改变蛋白质结构、活性及其相互间的作用，从而调节如细胞信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动，被形象地描述为生理活动的分子开关。准确鉴定蛋白质中的磷酸化位点对深入理解各种生物过程的机理、探索重大疾病的生物标记物和蛋白药靶的寻找极为重要。生物质谱是解析磷酸化肽段结构的有力手段，但是由于磷酸化肽段的离子化效率相对较差，因此样品中非磷酸化肽段信号严重干扰了磷酸化肽段的检测，因此在利用生物质谱分析之前对磷酸化肽段进行预分离富集是非常必要的。

近年来，金属氧化物亲和色谱法（MOAC）是逐渐被用于分离富集磷酸化蛋白和肽段的有效方法。很多金属氧化物以其高选择性和较好的结果重现性被用于填装成柱子或者直接离心分离用于分离富集磷酸化肽段。但是装柱使用相对复杂，采用高速离心的方式则操作费时费力，而且在高速离心时会造成“共沉淀效应”，即高质量的非磷酸化肽段和磷酸化肽段会共沉淀下来。

采用超顺磁性材料为基体，将超顺磁性材料和金属氧化物结合，既可以实现磷酸化蛋白和肽段的选择性富集，又可以利用材料的超顺磁性在外加磁场的作用下实现快速有效的分离。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种磁响应效果好、合成简单、形状均一、富集选择性高的包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料。

本发明的目的之二在于提供所述包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料的制备方法。

本发明的目的之三在于提供所述包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种包覆金属氧化物晶体的磁化内 构纳米复合材料，所述纳米材料是在以超顺磁性无机纳米材料作为种子粒的表面包覆有金属氧化物晶体，尺寸在200～800nm，比表面积为100～500m²/g，孔体积为0.1～0.6cm³/g。

所述超顺磁性无机纳米材料为四氧化三铁、γ-三氧化二铁、纳米铁颗粒中的一种，微粒尺寸为100～400nm。

所述金属氧化物为TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂、Ga₂O₃、In₂O₃、Co₂O₄中的一种。

一种包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：

（1）将150mg超顺磁性无机纳米材料分散在200mL乙醇中，加入lmL28%的浓氨水，超声15～20分钟，然后在机械搅拌条件下将2.0mL钛酸丁酯在5～10分钟内逐滴加入上述混合液，之后在40～50℃下恒温继续搅拌24小时，所得材料用去离子水和乙醇分别清洗3次，得到超顺磁性复合材料前驱体；

（2）将0.5g上超顺磁性复合材料前驱体加入20mL去离子水，转移到30mL的Teflon-lined不锈钢反应釜中，150～200℃下高温高压水热处理24小时，待反应釜温度降至室温，将所得材料用磁铁分离，并用去离子水和乙醇分别清洗3次，然后45～60℃下真空干燥后，在氮气保护下350～450℃煅烧2小时，待反应炉降至室温后，得到包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料。

一种包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料用于对磷酸化蛋白和肽段的选择性萃取，其特征在于包括以下步骤：

（1）将蛋白溶于NH₄HCO₃水溶液中，加入胰蛋白酶，在37℃下酶解16小时，然后用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成缓冲液的将酶解后的肽段混合物稀释至适当浓度；

（2）取包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料的悬浊液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的缓冲液洗涤，在稀释后的肽段混合液加入洗涤后的微球中，在25℃下混旋5～10分钟，用磁铁分离去除上清液，而后利用缓冲液洗涤，除去上清液后加入0.4M氨水，在25℃下混旋2分钟，将磷酸化肽段洗脱下来。

本发明合成的纳米复合材料以超顺磁性无机纳米材料作为种子粒，利用溶胶-凝胶化学原理，采用水解冷凝合成，在超顺磁性纳米材料表面包覆上无定型金属氧化物，得到超顺磁性复合材料前驱体；将前躯体材料分散到水中，经高温高压水热处理及高温煅烧处理，得到具有超顺磁性、表面包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料。

有益效果：本发明的包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料具有超顺磁性且分散性好，有很好的生物相容性，且比表面积大，可对低至1x10^-10M级的复杂肽段混合物中的痕量磷酸化肽进行选择性富集，方法简单有效。该材料及制备方法在蛋白质组学翻译后 修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1是本发明具体实施例纳米材料的形貌表征图，其中：

a、Fe₃O₄TiO₂前驱体材料SEM图；b、Fe₃O₄TiO₂前驱体材料TEM图；

c、包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料SEM图；

d、包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料TEM图。

图2是本发明具体实施例Fe₃O₄TiO₂前驱体材料（a）和包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料（b）的广角X射线衍射图。

图3是本发明具体实施例Fe₃O₄TiO₂前驱体材料的氮气吸附脱附等温线。

图4是本发明具体实施例Fe₃O₄TiO₂前驱体材料的孔径分布图。

图5是本发明具体实施例包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料氮气吸附脱附等温线。

图6是本发明具体实施例包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料的孔径分布图。

图7是β-casein:ovalbumin:BSA的摩尔比为1:1:50的混合肽段酶解液MALDI-TOF-MS分析质谱图，其中：

a、混合肽段酶解液富集前的质谱图；

b、混合肽段经包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料富集后的质谱图。

图8是包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料从不同浓度的β-casein酶解液富集到的磷酸化肽段的分析质谱图，其中：

a、4x10^-9M；b、2x10^-9M；c、4x10^-10M。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明的以Fe₃O₄为核包覆TiO₂晶体的磁化内构纳米复合材料Fe₃O₄TiO₂制备过程如下。

采用溶胶-凝胶法水解冷凝合成Fe₃O₄TiO₂前驱体材料：

取150mg直径为150nm的Fe₃O₄纳米颗粒分散到200mL乙醇中，加入lmL浓氨水（28wt%），超声15-20分钟。然后在机械搅拌条件下将2.0mL钛酸丁酯在5-10分钟内逐滴加入上述混合液，之后在40-50℃下恒温继续搅拌24小时。所得材料用去离子水和乙醇分别清洗3次，得到Fe₃O₄TiO₂前驱体材料，备用。

制备TiO₂结晶体包覆的Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料：

取0.5g上述Fe₃O₄TiO₂前驱体材料加入20mL去离子水，转移到30mL的Teflon-lined不锈钢反应釜中，150-200℃下高温高压水热处理24小时。待反应釜温度降至室温，将所得材料用磁铁分离，并用去离子水和乙醇分别清洗3次。然后45-60℃下真空干燥后，在氮气保护下350-450℃煅烧2小时，待反应炉降至室温后，得到表面包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料。

材料的表征： 

1、纳米材料的形貌表征

利用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）表征Fe₃O₄TiO₂前驱体材料和包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料，表征图见图1。从图1a和图1c中可以看出Fe₃O₄TiO₂前驱体材料和包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料大小均一，分散均匀，具有球状形貌。从图1b中可以看出，Fe₃O₄TiO₂前驱体材料的直径约为230nm，而且大约有40nm厚的TiO₂层可以明显观察到。经过水热和煅烧处理后，Fe₃O₄TiO₂的球形结构得到了很好的保持，直径约为500nm，TiO₂层大约有100nm厚。

2、表面包覆TiO₂的形态表征

利用广角X射线衍射图（XRD）表征Fe₃O₄TiO₂前驱体材料和包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料的表层TiO₂形态，表征图见图2。在图2a中可以看出，Fe₃O₄TiO₂前驱体材料表面覆盖的TiO₂表现为无定型，经水热和煅烧处理后，Fe₃O₄TiO₂的微球图谱与标准谱图Fe₃O₄（JCPDS65-3107）和锐钛矿（JCPDS21-1272）得到了良好的吻合，证实了无定型的TiO₂在处理后变成了结晶化的TiO₂颗粒。

3、孔径分布表征

使用氮气吸附-脱附仪（BET）在77K测量Fe₃O₄TiO₂前驱体材料和包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料的氮气吸附-脱附等温线和孔径分布，表征图见图3到6。在图中可以看出，Fe₃O₄TiO₂前驱体材料的BET比表面积和孔体积分别为139.8m²/g和0.13cm³/g，包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料的BET比表面积和孔体积分别为162.6m²/g和0.24cm³/g，表明该材料具有较大的比表面积-体积比，并且经过水热和煅烧处理，Fe₃O₄TiO₂纳米材料的比表面积变得更大。

4、将磁化内构纳米复合材料Fe₃O₄TiO₂用于对磷酸化肽段富集能力和富集选择性的考察。

用标准磷酸化蛋白β-酪蛋白（β-casein，通常含有痕量α-casein）、卵清蛋白 （ovalbumin）和牛血清蛋白（BSA）的酶解液混合肽段考察Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料的富集能力和富集选择性。

样品准备：β-酪蛋白、卵清蛋白和牛血清蛋白先溶于25mM NH₄HCO₃水溶液中（pH=8.3），加入适量的胰蛋白酶（1:50，w/w），在37℃下酶解16小时。在酶解前，卵清蛋白和牛血清蛋白均用二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原烷基化，β-酪蛋白为直接酶解。将β-酪蛋白:卵清蛋白和牛血清蛋白的酶解液按照摩尔比为1:1:50混合，然后用缓冲液（50%乙腈，0.1%三氟乙酸）将酶解后的肽段混合物稀释至适当浓度，这里稀释到β-酪蛋白酶解液的浓度为4x10^-8M，备用。

磷酸化肽段的富集：取400μg Fe₃O₄TiO₂磁化内构纳米复合材料的悬浊液（200μL，2μg/μL），用缓冲液（50%乙腈，0.1%三氟乙酸）洗涤三次，去除缓冲液后取200μL稀释后的肽段混合液加入洗涤后的微球中，在25℃下混旋5～10分钟，用磁铁分离去除上清液，而后利用缓冲液（50%乙腈，0.1%三氟乙酸）洗涤三次。除去上清液后加入10μL洗脱液（0.4M氨水），在25℃下混旋2分钟，将磷酸化肽段洗脱下来，以备基体辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测分析。

富集前后经基体辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析的质谱图见图7。

从图7a中可以看出，混合肽段直接进行质谱检测，几乎检测不到磷酸化肽段的峰，富集后磷酸化肽段的信号显著增强，在谱图中占据主导地位，完全没有受到高浓度牛血清蛋白的影响，几乎没有非磷酸化肽段检出，同时三条属于α-casein的磷酸化肽段、一条属于ovalbumin的磷酸化肽段也被成功富集并检测到。详细信息列于表1。从β-casein:ovalbumin:BSA的摩尔比为1:1:50的混合肽段酶解液鉴定到的磷酸化肽段的详细信息，其中下划线位置为磷酸化位点，固定β-casein酶解液的浓度为4x10^-8M。富集前后的差异表明包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料对于磷酸化肽段有很好的富集能力和富集选择性。

表1

5、富集灵敏度的考察

利用不同浓度β-casein酶解液考察包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料对于磷酸化肽段富集的灵敏度，分析质谱图见图8。可以看到，当β-casein酶解液的浓度低至4x10^-10M时，经包覆TiO₂结晶体的Fe₃O₄TiO₂纳米材料富集后仍可以检测到磷酸化肽段，说明新材料对于磷酸化肽段有很高的富集效率。

本具体实施例采用以Fe₃O₄为核包覆TiO₂晶体的磁化内构纳米复合材料Fe₃O₄TiO₂，超顺磁性无机纳米材料还可以采用γ-三氧化二铁或纳米铁，金属氧化物还可以采用Al₂O₃、ZrO₂、Ga₂O₃、In₂O₃或Co₂O₄。

Claims (3)

1.一种包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料，其特征在于：所述纳米材料是在以超顺磁性无机纳米材料作为种子粒的表面包覆有金属氧化物晶体，尺寸在200～800nm，比表面积为100～ 500m²/g，孔体积为0.1～0.6cm³/g；

所述超顺磁性无机纳米材料为四氧化三铁、γ-三氧化二铁、纳米铁颗粒中的一种，微粒尺寸为100～400nm；

所述金属氧化物为TiO₂、Al₂O₃、ZrO₂、Ga₂O₃、In₂O₃、Co₂O₄中的一种；

所述纳米复合材料采用以下步骤制备而成：

（1）将150mg超顺磁性无机纳米材料分散在200mL乙醇中，加入lmL 28%的浓氨水，超声15～20分钟，然后在机械搅拌条件下将2.0mL钛酸丁酯在5～10分钟内逐滴加入上述混合液，之后在40～50℃下恒温继续搅拌24小时，所得材料用去离子水和乙醇分别清洗3次，得到超顺磁性复合材料前驱体；

（2）将0.5g上超顺磁性复合材料前驱体加入20mL去离子水，转移到30mL的Teflon-lined不锈钢反应釜中，150～200℃下高温高压水热处理24小时，待反应釜温度降至室温，将所得材料用磁铁分离，并用去离子水和乙醇分别清洗3次，然后45～60℃下真空干燥后，在氮气保护下350～450℃煅烧2小时，待反应炉降至室温后，得到包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料。

2.根据权利要求1所述的包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将150mg超顺磁性无机纳米材料分散在200mL乙醇中，加入lmL 28%的浓氨水，超声15～20分钟，然后在机械搅拌条件下将2.0mL钛酸丁酯在5～10分钟内逐滴加入上述混合液，之后在40～50℃下恒温继续搅拌24小时，所得材料用去离子水和乙醇分别清洗3次，得到超顺磁性复合材料前驱体；

（2）将0.5g上超顺磁性复合材料前驱体加入20mL去离子水，转移到30mL的Teflon-lined不锈钢反应釜中，150～200℃下高温高压水热处理24小时，待反应釜温度降至室温，将所得材料用磁铁分离，并用去离子水和乙醇分别清洗3次，然后45～60℃下真空干燥后，在氮气保护下350～450℃煅烧2小时，待反应炉降至室温后，得到包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料。

3.根据权利要求1所述的包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料用于对磷酸化蛋白和肽段的选择性萃取，其特征在于包括以下步骤：

（1）将蛋白溶于NH₄HCO₃水溶液中，加入胰蛋白酶，在37℃下酶解16小时，然后用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成缓冲液的将酶解后的肽段混合物稀释至适当浓度；

（2）取包覆金属氧化物晶体的磁化内构纳米复合材料的悬浊液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的缓冲液洗涤，在稀释后的肽段混合液加入洗涤后的微球中，在25℃下混旋5～10分钟，用磁铁分离去除上清液，而后利用缓冲液洗涤，除去上清液后加入0.4M氨水，在25℃下混旋2分钟，将磷酸化肽段洗脱下来。