CN103509770B - 一种以玉米芯为主要原料发酵产纤维素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种以玉米芯为主要原料发酵产纤维素酶的方法，采用的发酵菌株是2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2012204的木酶属里氏木酶(Trichoderma reesei)QZ‑5菌株，该发明的特点是以农产品废弃物一玉米芯为主要原料发酵生产制备纤维素酶，采用国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定酶活，即滤纸酶活力FPA法测定，发酵制备的纤维素酶最高酶活可达8IU/ml以上，成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产纤维素酶可广泛应用于纺织、造纸、饲料、食品等领域，属于生物技术领域。

Description

一种以玉米芯为主要原料发酵产纤维素酶的方法
技术领域
本发明采用的发酵菌株是2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2012204的(Trichoderma reesei)QZ-5产纤维素酶的木酶属里氏木酶菌株，该发明的特点是以农产品废弃物一玉米芯为主要原料发酵生产制备纤维素酶，用滤纸酶活力FPA法测酶活，最高酶活可达8IU/ml以上，成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产纤维素酶可广泛应用于纺织、造纸、饲料、食品等领域，属于生物技术领域。
背景技术
纤维素是自然界中分布最广、含量最多、最为廉价的天然可再生资源，占植物界碳含量的50％以上，纤维素酶是具有纤维素降解能力的一类酶的总称，它们协同作用分解纤维素，将纤维素的结晶型结构转变成松散型结构，并有部分被水解为葡萄糖和一些小分子的物质，既能为微生物的生长提供能源和营养物质，又能在纺织、造纸、饲料、食品、能源等领域提供较大的应用前景和价值而受到引起全球科研工作者的关注。
然，至今制备纤维素酶的研究表明，现有纤维素酶的生产原料成本偏高，而农村玉米芯来源广泛，这促使我们去探索研究变废为宝、低成本制备纤维素酶的方法，本发明就是在这样的指导思想下，经过无数次的试验获得成功的。
发明内容
本发明用2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M2012204的(Trichoderma reesei)QZ-5产纤维素酶的里氏木酶菌株为生产出发菌株，研究出以农产品废弃物——玉米芯为主要原料发酵生产制备纤维素酶方法，价格低廉且可变废为宝，简便易行。所产纤维素酶可广泛应用于纺织造纸、能源再生、饲料、食品等领域，属于生物技术领域。
本发明的技术方案：用2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2012204的(Trichoderma reesei)QZ-5产纤维素酶的里氏木酶菌株为生产出发菌株，经种子培养和是以农产品废弃物一玉米芯为主要原料发酵生产制备纤维素酶，工艺为：
1、种子培养基：
葡萄糖15g/L，酵母浸膏6g/L，(NH4)2SO42.2g/L，KH2PO44g/L，MgSO47H2O0.6g/L，CaCl20.6g/L，每个250ml三角瓶中装50ml，用磷酸盐调PH＝5.0，8层纱布封口，115℃灭菌30分钟，冷却。
2、接种工艺：
在无菌超净台上，取斜面菌种一支，加入0.9％的生理盐水10ml，用竹签刮下培养基上的孢子，即为菌种孢子液。取1ml菌种孢子液放入含50m1种子培养基的250ml的三角中，置于摇床。培养条件：转速200rpm，温度28℃，恒温培养50小时，即为发酵产酶的种子液。
3、产酶培养基：
玉米芯20g/L，玉米浆12g/L，(NH4)2SO41.2g/L，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.2g/L，CaCl20.2g/L，用磷酸盐调PH＝5.0，并按每升发酵产酶培养基加0.4ml消泡剂的比例加消泡剂装入发酵罐，121℃灭菌30分。
玉米芯需先粉碎成粉末。
4、产酶工艺：
将培养好的种子按10％的接种量，接种到装有5升产酶培养基的7升发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速200rpm，通气量1.3L/min/L。发酵培养6天。
5、酶液提取：
取出的发酵液用日立CR22G冷冻离心机R12A角转4℃，8000rpm离心10min，收集上清液即为酶液。工业生产中，可采用板框压滤获取酶液。
6、酶活的测定方法：
采用国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定酶活，即滤纸酶活力FPA测定。其定义为：在50℃，pH4.8的条件下，一个FPA国际单位等于酶水解反应中每分钟由滤纸生成1.0Uumol葡萄糖的酶量，以国际单位IU表示，滤纸酶活单位可以用体积表示IU/ml，其方法与步骤为：
(1)将1×6cm的滤纸条WhatmanNo.1滤纸条卷成圆筒，横放在10mL比色皿试管底部，(不要垂直放下，不要使滤纸贴在试管壁上)。
(2)向试管中加入1ml pH＝4.8的浓度为0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液。
(3)将V体积的酶液加入到5mL的缓冲液中，适当的稀释。然后将0.5mL的酶稀释液加入到比色皿试管中。缓冲液作为空白。
(4)将0.5mL酶液加入到装有1ml柠檬酸缓冲液的试管中
(5)恒温水浴(50℃)，反应1小时.
(6)加入1mlDNS试剂，沸水浴5min，冷水浴至室温，并定容到10mL。
(7)54Onm下，测试OD。
(8)参照DNS的标准曲线，确定还原糖的含量。由(3)得到M毫克，由(4)得到m毫克。
(9)公式如下：
M----纤维素酶和滤纸反应之后，酶液中葡萄糖的含量
m----发酵上清液中葡萄糖的含量
180----葡萄糖的分子量
60----反应60min
5----5mL的缓冲液
V----酶原液的体积
0.5----反应加入500ul酶稀释液，
本发明的有益效果：
本发明的发酵产纤维素酶方法与其它制备纤维素酶的方法相比较，具有如下特点：
1、发酵原材料价格低廉，且可变废为宝，绿色环保，没有废弃物。因为纤维素酶过滤后的剩余残存物可用于动物饲料、造纸和生物肥料。
2、粗酶性质稳定，最适温度为55度，较耐热。
3、生产制备成本低，十分有利于全面展开，符合国家政策。
由于本发明所生产制备出来的纤维素酶成本低且可广泛应用于纺织印染、造纸、能源再生、饲料、食品等方面。因此本发明有广泛的工业使用价值和较显著的经济效益前景。
具体实施方式
实施例1
在无菌超净台上，取斜面菌种一支，加入0.9％的生理盐水10ml，用竹签刮下培养基上的孢子，即为菌种孢子液。取1ml菌种孢子液放入含50m1种子培养基的250ml的三角中，置于摇床。培养条件：转速200rpm，温度28℃，恒温培养50小时，即为发酵产酶的种子液。
将玉米芯经过粉碎加工制备成玉米芯粉末，按玉米芯20g/L，玉米浆12g/L，(NH4)2SO41.2g/L，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.2g/L，CaCl20.2g/L的比例配5升产酶培养基，用磷酸盐调PH＝5.0，装入7升发酵罐中，加2ml消泡剂，121℃灭菌30分。
将培养好的种子按10％的接种量，接种到装有5升产酶培养基的7升发酵罐中，加1m1消泡剂。控制温度28℃，搅拌转速200rpm，通气量1.3L/min/L。发酵培养6天。
取出的发酵液用日立CR22G冷冻离心机R12A角转4℃，8000rpm离心10min，收集上清液即为酶液，用国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法——滤纸酶活力FPA测定法测酶活并计算为8.32IU/ml。

Claims (1)

1.一种以玉米芯为主要原料发酵产纤维素酶的方法，其特征是采用2012年6月5日保存于中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC M 2012204的里氏木霉(Trichodermareesei)QZ-S为发酵菌株，以农产品废弃物玉米芯为主要原料在7升发酵罐中发酵生产制备纤维素酶，步骤为：
1)种子培养基：葡萄糖15g/L，酵母浸膏6g/L，(NH4)2SO4 2.2g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO47H2O 0.6g/L，CaCl2 0.6g/L，每个250ml三角瓶中装50ml，用磷酸盐调pH＝5.0，8层纱布封口，115℃灭菌30分钟，冷却；
2)接种：在无菌超净台上，取斜面菌种一支，加入0.9％的生理盐水10ml，用竹签刮下培养基上的孢子，即为菌种孢子液；取1ml菌种孢子液放入含50ml种子培养基的250ml的三角瓶中，置于摇床；培养条件：转速200rpm，温度28℃，恒温培养50小时，即为发酵产酶的种子液；
3)发酵产酶培养基：玉米芯20g/L，玉米浆12g/L，(NH4)2SO4 1.2g/L，KH2PO42g/L，MgSO47H2O0.2g/L，CaCl20.2g/L，用磷酸盐调pH＝5.0，装入发酵罐，并按每升发酵产酶培养基加0.4ml消泡剂的比例加消泡剂，121℃灭菌30分；玉米芯需先粉碎成粉末；
4)发酵产酶：将培养好的种子液按发酵产酶培养基10％的接种量，接种到发酵罐中，控制发酵温度28℃，搅拌转速200rpm，通气量1.3L/min/L，发酵培养6天；
5)发酵产酶及酶液提取：取出的发酵液8000rpm离心10min，收集上清液即为酶液；工业生产中，采用板框压滤获取酶液；
6)酶活的测定方法：采用国际理论应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定酶活，即滤纸酶活力FPA测定。
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