CN103502459B - 抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子 - Google Patents

抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子 Download PDF

Info

Publication number
CN103502459B
CN103502459B CN201180068239.7A CN201180068239A CN103502459B CN 103502459 B CN103502459 B CN 103502459B CN 201180068239 A CN201180068239 A CN 201180068239A CN 103502459 B CN103502459 B CN 103502459B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
desired polypeptides
aprt gene
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201180068239.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103502459A (zh
Inventor
杨元生
M·马里亚蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agency for Science Technology and Research Singapore
Original Assignee
Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agency for Science Technology and Research Singapore filed Critical Agency for Science Technology and Research Singapore
Publication of CN103502459A publication Critical patent/CN103502459A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103502459B publication Critical patent/CN103502459B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/869—Herpesviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/02007—Adenine phosphoribosyltransferase (2.4.2.7)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及这样的核酸分子，其包含疱疹病毒的功能启动子、疱疹病毒的功能增强子以及aprt（腺嘌呤磷酸核糖转移酶）基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件。还公开了使用所述核酸分子、含有所述核酸分子的载体和宿主细胞产生所希望的多肽的方法。

Description

抗基因沉默的经修饰的人CMV启动子
相关申请的交叉参考
该申请要求2010年12月24日提交的美国临时申请号61/427,121的优先权的权益，为所有目的将所述临时申请的内容完整引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及分子生物学、病毒学和基因治疗领域，尤其涉及含有疱疹病毒的功能启动子、疱疹病毒的功能增强子和aprt（腺嘌呤磷酸核糖转移酶）基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件的核酸分子，本发明包括所述核酸分子的用途以及产生目的多肽或蛋白质的方法。
背景技术
迄今为止，基因治疗中的大多数研究已经利用了病毒启动子。一般而言，强的病毒启动子为有效的病毒繁殖所需，并且它们通过使用控制并募集宿主转录机的机制，经常比真核启动子诱导更高水平的转录。此外，病毒启动子倾向于更紧凑，因此更易于操纵并适应于基因治疗载体。
人巨细胞病毒主要立即早期基因启动子(hCMV)已经广泛用于学术研究和工业应用中，用于哺乳动物细胞中高水平重组蛋白质的产生。例如，hCMV中驱动立即/早期基因表达的增强子/启动子元件已经广泛用于生物技术中，用于驱动异源基因在真核表达载体中的表达。正在使用的其他病毒启动子包括猿猴病毒40(SV40)、劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR和其他逆转录病毒LTR启动子。因此病毒启动子的应用已经非常普遍，并且已经成功用于体外和体内的某些应用。然而，真核细胞已经进化了检测并使病毒转基因的表达沉默的机制。病毒启动子已经显示经常不能维持体内转基因的表达，尽管有病毒启动子易于在体外和体内失活并沉默的大量证据，但是大部分的基因治疗应用还是继续利用它们来驱动转基因的表达。不过，一个普遍的问题在于，通过转导进入到哺乳动物细胞中的异源基因瞬时表达至足够的水平，然后在长期培养过程中在稳定转染的细胞系中所述表达被抑制并逐渐被沉默。因此基因沉默是基因治疗中的主要障碍。
转基因表达的丢失主要归因于转录沉默，其涉及CpGDNA序列上的甲基化、组蛋白脱乙酰作用或整合位点附近的染色质凝聚。CpG岛一般至少200bp长，富含GC，并含有至少约60%频率的CpG二核苷酸。DNA甲基化是共价修饰，其中胞嘧啶的5’位置被甲基化。在哺乳动物中，该修饰发生在CpG二核苷酸。在组蛋白非常分散的开放染色质中，DNA是未甲基化的，由开放的圆圈表示（图1），基因活跃地表达。甲基化后，甲基结合(MBD)蛋白将组蛋白修饰蛋白和协阻抑物募集到甲基化的区域，引起染色质变得致密，并将所述基因沉默。
已经应用多种抗甲基化技术来防止基因沉默。例如，Senigl,H和同事(Senigl,H;Plachy,J.;Hejnar,J.,ThecoreelementofaCpGislandprotectsaviansarcomaandleukosisvirus-derivedvectorsfromtranscriptionalsilencing(2008)JournalofVirology,82:7818-7827)显示，在小病毒启动子RSVLTR(-200个碱基)的增强子和启动子之间插入CpG岛的内部元件(IE)防止基因沉默。然而，该策略对于较大的启动子可能不起作用，因为已经报道，IE仅可保护约150个碱基免于甲基化(Siegfried,Z.;Eden,S.,等DNAmethylationrepressestranscriptioninvivo(1998)Naturegenetics22:203-206）。
UCOE（遍在染色质开放元件）已经用于研究和生物技术应用中，如细胞培养中的重组蛋白质产物。UCOE赋予增加比例的高产基因整合事件，其在转基因表达的水平和稳定性上均有改良。尽管UCOE在本领域中被称为CpG岛相关元件(WO2006/095156)，已知UCOE还具有不同的功能，UCOE使染色质在结构上松散，因此即使基因整合到异染色质中也能够表达。因此并不清楚UCOE是否能防止各种核酸的DNA甲基化。
产生可在规模扩大期内维持高生产性的细胞系对生物制药而言是极其重要的。产品的不稳定性可影响产品的产量和产品的一致性，妨碍该产品的注册批准。使用目前可用的表达载体产生的大多数克隆具有不稳定的生产性。因此，大量的克隆需要经过筛选，以获得稳定的高产细胞系。在以前的文献报道中已经表明，生产性的丢失主要是由于转录沉默，其涉及启动子内CpG二核苷酸的甲基化。
考虑到重组蛋白质的表达在生物技术中的重要性，仍然需要包含经修饰的启动子或增强子组合的改良的表达载体。
发明概述
一方面，本发明提供包含疱疹病毒的功能启动子、疱疹病毒的功能增强子和aprt（腺嘌呤磷酸核糖转移酶）基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件的核酸分子。
第二方面，本发明提供产生所希望的多肽的方法。所述方法包括提供如本文定义的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包含编码所希望的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地连接至疱疹病毒的启动子和疱疹病毒的增强子，和允许表达所述所希望的多肽。
第三方面，本发明提供包含如本文定义的核酸分子的载体。
第四方面，本发明提供包含如本文定义的核酸分子的宿主细胞。
第五方面，本发明提供如本文定义的核酸分子的用途，所述核酸分子用于增强目的多肽的表达，其中所述核酸分子包含编码目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地连接至疱疹病毒的启动子和疱疹病毒的增强子。
附图简述
当结合非限制性实施例和附图进行考虑时，参考详细的描述能更好地理解本发明，在所述附图中：
图1阐明了转录基因沉默机制的图示。图1A显示了核苷酸的共价修饰，其中胞嘧啶的5’位置被甲基化。图1B显示了在CpG二核苷酸处发生的DNA甲基化。在组蛋白(“H3”)非常分散的开放染色质中，DNA是未甲基化的，由开放的圆圈表示，基因活跃地表达。通过甲基化，甲基结合(“MBD”)蛋白将组蛋白修饰蛋白（如“HDAC”：组蛋白脱乙酰酶）和协阻抑物（如“HP1”：异染色质蛋白1）募集到甲基化的区域，使染色质变得致密，并将所述基因沉默。
图2显示了在仓鼠APRT基因上发现的CpG岛的内部元件(IE)的核苷酸序列(SEQIDNO:4)。所述内部元件(IE)是仓鼠APRT基因的CpG岛的小区域(Brandeis,M.;Frank,D.;Keshet,I.,等Sp1ElementsProtectACpgIslandFromDe-NovoMethylation(1994)Nature371:435-438)。
图3A显示了含有人巨细胞病毒(CMV)增强子和启动子的核苷酸序列(SEQIDNO:6)。以粗体显示CG二核苷酸，其均可被甲基化，导致基因沉默。下划线和粗体显示的CTCGAG序列表示使用定点诱变在增强子和启动子之间产生的XhoI位点，用于插入IE。
图3B显示了图3A的核苷酸序列的图示。每个环指的是序列中的CG二核苷酸。所述CG二核苷酸均可被甲基化，导致基因沉默。
图4显示了根据本发明多个实施方案的12个不同核酸分子的图示，其中将aprt基因的CpG岛的一个或两个IE以正向或反向插入到增强子的上游、增强子与启动子（P）之间以及启动子（P）的下游，以研究定位、方向和拷贝数对IE防止基因沉默能力的影响以及IE的插入是否影响启动子的强度。野生型CMV称为WTCMV，而经修饰的CMV在下文中称为IECMV。
图5显示了含有CMV增强子区和启动子（P）区的载体序列，其用于在哺乳动物细胞中表达所克隆的DNA插入片段。MluI用于将IE插入到CMV增强子的上游，XhoI用于将IE插入到CMV的增强子和启动子之间，NheI用于将IE插入到启动子的下游。IRESatt是衰减的内部核糖体进入位点（IRES）。IRES允许在一个启动子控制下表达多个基因。IRES翻译效率的衰减用于更有效地选择高产克隆。mNPT是具有降低的酶活性的突变新霉素，其允许更有效地选择高产克隆。
图6显示了克隆产生以及评估细胞培养中本发明的核酸分子长期表达的图示方法。
图7显示了在瞬时（图7A）和稳定基因表达（图7B）中含有经修饰的CMV启动子(“IECMV”，见图4)与野生型CMV启动子(“WTCMV”)的12个核酸分子强度的比较。向CMV中插入IE的目的是为了提高表达的稳定性，但不改变表达水平。在瞬时和稳定转染中使用GFP作为报告基因比较经修饰的CMV启动子与WTCMV在表达基因中的强度。使用FACS测定瞬时转染的库和稳定表达克隆的平均荧光强度。用星号表示95%置信水平上相对于WTCMV的统计学显著差异。不希望受理论的束缚，在瞬时转染中，将IE插入到CMV的下游降低表达水平，而插入到其他位置看起来具有较小的影响。在稳定转染中，UF2、UR2和MR1具有的表达水平与野生型CMV相当。
图8显示了使用WTCMV产生的代表性克隆B4在第8周和第0周时GFP阳性细胞的百分比。在第0周时，所有细胞表达GFP。在没有选择试剂G418的情况下传代8周后，仅34%的细胞仍然表达GFP。
图9显示了根据本发明的多个实施方案使用IECMV启动子(MF2)获得的代表性克隆B8在第0周和第8周时GFP阳性细胞的百分比。所述IECMV启动子(MF2)含有在增强子和小型启动子之间插入的2个IE（图9A）。在第0周时，所有细胞表达GFP。在没有选择试剂G418的情况下传代8周后，所有细胞仍然表达GFP。
图10显示了使用WTCMV产生的代表性克隆B4在第0周和第8周时的柱状图。将GFP表达的保留（%）如下计算为第8周时的平均荧光强度(MFI)与第0周时平均荧光强度(MFI)的比值：
图11显示了在CHO细胞8周传代过程中使用GFP作为报告基因，使用含有经修饰的CMV启动子(IECMV，见图4)和野生型CMV(WTCMV)的核酸分子维持GFP表达的比较。对于每个载体，从3个稳定库中分离9个克隆。在不存在选择压力的情况下将其培养超过8周。通过使用FACS监测8周后使用WT和IECMV启动子产生的各克隆的GFP表达，作为生产稳定性的量度。图11A表示GFP阳性细胞的百分比。图11B表示GFP表达的保留百分比。在稳定性测试之前，所有克隆具有100%的GFP阳性细胞。8周传代后，大多数野生型克隆中GFP阳性细胞降低至100%以下，并且平均起来，8周传代后维持的表达水平比其初始表达水平低20%。相反，使用IECMV，如UF2、UR2、MF2、MR1、MR2和DR2产生的大多数克隆仍然具有接近100%的GFP阳性细胞，并且平均起来，在使用UF1、UR2、MR1、MR2、DF2和DR2产生的克隆中的表达水平维持接近或超过其初始表达水平的40%。
图12显示了含有根据本发明多个实施方案的修饰hCMV启动子(IECMV)的三个核酸分子的图示，即“UR2”，其中2个IE反向插入到增强子的上游；“MR1”，其中1个IE反向插入到增强子与启动子之间；和“UR2+MR1”，其含有（反向）插入到增强子上游的2个IE和（反向）插入到增强子与启动子之间的1个IE。对每个载体，从3个稳定转染的库中分离18个克隆，用于比较长期培养过程中表达水平的强度和维持。
图13显示了经修饰的CMVs(IECMVs)，即MR1、UR2和UR2+MR1（见图12）与野生型(WTCMV)在稳定表达中的强度的比较。与图11中的结果一致，UR2和MRl在表达基因中显示的强度与WTCMV相当。然而，UR2+MR1的组合导致较低的基因表达水平。
图14显示了在传代8周后，经修饰的CMV，即MR1、UR2和UR2+MR1与野生型(WTCMV)在维持GFP阳性细胞的比例上的比较。与图11中的结果一致，与WTCMV相比，在传代8周的过程中UR2和MRl提高了GFP阳性细胞的比例。然而，UR2+MR1的组合未进一步增强表达的稳定性。
图15显示了在传代8周后，经修饰的CMVs，即MR1、UR2和UR2+MR1与野生型(WTCMV)在保留表达上的比较。与图11中的结果一致，与WTCMV相比，在传代8周过程中UR2和MRl增强了表达的稳定性。然而，UR2+MR1的组合未进一步增强表达的稳定性。
图16显示了如下两个载体序列的图示：A）含有小鼠CMV增强子和人EF1α启动子的“野生型mCE”（从Invivogen购买的mcE）；和B）“mCE+2IE”，其中在由小鼠CMV增强子和人EF1α启动子组成的启动子上应用2个IE。对每个载体，从3个稳定转染的库中分离9个克隆，用于比较长期培养过程中表达水平的强度和维持。
图17显示了经修饰的mCE(mCE+2IE)与野生型mCE在稳定表达中的强度的比较。与野生型mCE相比，向mCE中插入2个IE导致更低的表达水平。
图18显示了在传代8周后，经修饰的mCE(mCE+2IE)与野生型mCE在维持GFP阳性细胞比例上的比较。与野生型mCE相比，向mCE中插入2个IE导致更低的GFP阳性细胞比例。
图19显示了在传代8周后，经修饰的mCE(mCE+2IE)与野生型mCE在保留表达上的比较。看起来，在增强子和启动子之间插入2个IE未提高GFP表达的稳定性。这些结果与图18中的那些结果一起表明，IE的效应是启动子特异性的。
图20阐明含有反向插入增强子和小型启动子之间的1个IE的核酸分子MR1的抗沉默机制（见图4）。分别使用WTCMV和MR1产生的三个克隆的特征在于：在传代8周过程中GFP的表达水平、基因拷贝数和mRNA水平发生变化。使用qRT-PCR测定GFP基因拷贝数和mRNA水平并对β-肌动蛋白归一化。图20A显示了在WTCMV与MRl之间GFP表达水平的变化，图20B显示了在WTCMV与MRl之间GFP基因拷贝数的变化，而图20C显示了在WTCMV与MRl之间GFPmRNA水平的变化。在长期培养过程中，使用WTCMV产生的克隆中的GFP基因拷贝数保持不变，而mRNA水平下降并与平均荧光强度的降低相关联，提示GFP表达水平的丢失是由于转录沉默。相反，在长期培养过程中，使用MRl产生的克隆维持GFP基因拷贝数和mRNA水平，因此在表达水平上显示较少的下降。
发明详述
本发明基于这样的令人惊奇的发现，将一个或多个CpG岛元件(IE)以特定方向插入到疱疹病毒启动子区中的特定位置可以防止核酸分子，特别是DNA免于被甲基化，由此可维持基因表达水平，而不降低所述启动子的强度。特别地，疱疹病毒的经修饰的启动子区由于存在一个或多个IE而对基因沉默更具抗性。因此，该策略可应用于保护大的启动子。然而，还发现，并不是所有的所称作的CpG岛相关元件均能够行使防止任意核酸序列中的基因沉默的功能（例如见，图17-19），而是该功能是启动子特异性的。因此这是个令人惊奇的发现：aprt（腺嘌呤磷酸核糖转移酶）基因的内部元件可以防止疱疹病毒的核酸序列内的基因沉默。在该上下文中，发现小鼠aprt基因的内部元件内的SPl结合位点对脱甲基作用至关重要。
本发明提供包含疱疹病毒的功能启动子、疱疹病毒的功能增强子和aprt（腺嘌呤磷酸核糖转移酶）基因和/或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件的核酸分子。
aprt基因可来自任意生物或物种，并且例如可选自仓鼠aprt基因、小鼠aprt基因、大鼠aprt基因、人类aprt基因、牛aprt基因、斑马鱼aprt基因、鼠疫耶尔森氏菌（Yersiniapestis）aprt基因、热带爪蟾（Xenopustropicalis）aprt基因、霉菌aprt基因、黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）aprt基因、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）aprt基因、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）aprt基因、大肠杆菌（E.coli）aprt基因、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）aprt基因和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）aprt基因，仅提及这些例子。当期望是仓鼠的aprt基因时，所述仓鼠可以是任意属，例如金仓鼠属（Mesocricetus）、毛足鼠属（Phodopus）、原仓鼠属（Cricetus）、仓鼠属（Cricetulus）、短耳仓鼠属（Allocricetulus）、甘肃仓鼠属（Cansumys）和大仓鼠属（Tscherskia）。任意亚种的仓鼠均可使用并且可包括灰仓鼠（Cricetulusgriseus）、仓鼠属、高山仓鼠（Cricetulusalticola）、黑线仓鼠（Cricetulusbarabensis）、藏仓鼠（Cricetuluskamensis）、长尾仓鼠（Cricetuluslongicaudatus）、灰仓鼠（Cricetulusmigratorius）和索氏仓鼠（Cricetulussokolovi）。当期望是小鼠的aprt基因时，所述小鼠可以是任意亚种，例如小家鼠（Musmusculus）、白足鼠（Peromyscusleucopus）或鹿鼠（Peromyscusmaniculatus）。
如在本发明的上下文中所用，“内部元件”指一段核苷酸序列，其通过防止自身和启动子区的DNA甲基化而防止基因沉默，所述序列包括增强子和最小启动子。
在多个实施方案中，aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件可包括转录因子Spl的一个或多个结合位点。当所述aprt基因是仓鼠基因时，该aprt基因的CpG岛的Spl结合位点具有序列：5’-GCCCCGCCCCGTCCCGCCCC-3’(SEQIDNO:1)。当所述aprt基因是小鼠基因时，该aprt基因的CpG岛的Spl结合位点具有序列：5’-CCCGCCC-3’(SEQIDNO:2)或序列5’-TCCGCCC-3’(SEQIDNO:3)。当所述aprt基因是仓鼠aprt基因时，该aprt基因的CpG岛的内部元件具有序列：
5’-TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCTCCCCGCAACCCACTCTCCCAGAGGCCCCGCCCCGTCCCGCCCCCTCCCGGCCTCTCCTCGTGCTGGATCGCTCCCTAAGGA-3’(SEQIDNO:4)。
当所述aprt基因是小鼠aprt基因时，该aprt基因的CpG岛的内部元件具有序列：
5’-AGGATGGACATCGCACATCCCCTTTCCACCCATATATCTTTGAGGTAGGGATGCTTGTGTTTAGGCAGCTCAAGAAATCTAACCCCTGACTCAGGCCCCACACACACCTCGCAGAGGCCCCGCCTCTCAGCCTGTCCCGCCCCTCGTGCTAGACCAACCCGCACCCAGAAGCCCCGCCCATCGAGGACGCTCCGCCCTTGTTCCCCCCGGGATTGACGTG-3’(SEQIDNO:5)。
在多个实施方案中，aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件可以以相对于启动子的序列正向（有义）或反向（反义）地独立地排列在本发明的核酸分子中。aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的多个内部元件，例如2个、3个、4个、5个或更多个内部元件可独立地排列在本发明的核酸分子中。
在多个实施方案中，所述核酸分子还可包括编码目的多肽的表达性可表达的核苷酸序列。所述表达性可表达的核苷酸序列有效连接被有效地连接至疱疹病毒的启动子和疱疹病毒的增强子。有效连接是这样的连接，其中根据本发明的调节性DNA序列和待表达的DNA序列以允许基因序列表达的方式连接。因此，所述表达性可表达的核苷酸序列可以从疱疹病毒的功能启动子处开始转录。在超过约10轮、约20轮、约30轮、约40轮、约50轮、约60轮或更多轮的表达中，所述aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件增强和/或稳定转录水平。
在多个实施方案中，所述表达性可表达的核苷酸序列是异源核苷酸序列。在一些实施方案中所述表达性可表达的核苷酸序列在一些实施方案中可以排列在疱疹病毒的启动子和疱疹病毒的增强子的下游。当用于指核苷酸序列或核酸分子时，术语“异源的”表示不是在已经（或正在）引入核酸分子的各种细胞中天然存在的核苷酸序列。因此异源核酸序列起源于除所述各种细胞外的来源并可以是天然存在的或非天然存在的。各种异源核酸序列例如可被整合到本发明的核酸分子中。
所述功能启动子和所述增强子可以是相同疱疹病毒的或不同类型疱疹病毒的功能启动子和增强子。所述疱疹病毒可以是任意疱疹病毒。非限制性示例性实例可包括巨细胞病毒，如hCMV、棒状病毒属、蔷薇疹病毒属、单纯疱疹病毒属、水痘病毒属、马立克病毒属（mardivirus）、传染性喉气管炎病毒属（iltovirus）、β疱疹病毒、γ疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、水痘带状疱疹病毒、小鼠γ疱疹病毒-68、猿猴疱疹B病毒（HerpesSimianBvirus）、单纯疱疹病毒1型病毒和卡波西氏肉瘤相关的疱疹病毒。在多个实施方案中，所述巨细胞病毒是人巨细胞病毒(hCMV)。
疱疹病毒的核酸分子含有启动子区（其包括功能增强子和最小启动子），并可以是任意长度。在一些实施方案中，所述启动子区可以是至少约300个碱基对的大小、至少约350个碱基对或更多个碱基对的大小、约400个碱基对或更多个碱基对的大小、约450个碱基对或更多个碱基对的大小、约500个碱基对或更多个碱基对的大小、约550个碱基对或更多个碱基对的大小或约600个碱基对或更多个碱基对的大小。
在多个实施方案中，功能启动子和功能增强子可包含在以下序列中：
5’-TTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACTCGAGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC-3’(SEQIDNO:6)。
在多个实施方案中，功能启动子具有序列：
5’-TGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC-3’(SEQIDNO:7)。
在多个实施方案中，功能增强子具有序列：
5’-TGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA-3’(SEQIDNO:8)。
通常，疱疹病毒的增强子排列在所述疱疹病毒的启动子的上游。
在多个实施方案中，aprt基因或其功能变体的CpG岛的至少一个或多个内部元件排列在所述疱疹病毒启动子的上游或邻近所述疱疹病毒启动子的下游。当aprt基因或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件排列在疱疹病毒启动子的上游时，所述内部元件可排列在（i）疱疹病毒的增强子和疱疹病毒的启动子之间或（ii）邻近疱疹病毒的增强子的上游。
在多个实施方案中，aprt基因或其功能变体的CpG岛的至少一个或多个内部元件的排列邻近于疱疹病毒的增强子或疱疹病毒的启动子。如本文所用，与核酸序列元件相关的“邻近的”或“邻近地”包括这样的实施方案，其中一个序列元件的3’末端与其他序列元件的5’末端直接连接。在其他实施方案中，各序列元件可被少于20个额外的核苷酸间隔开，所述核苷酸既不属于第一个也不属于第二个序列元件，但却限定了接头类型的序列。如果两条序列被此类接头样序列间隔开，那么它们仍然在框内。在此类实施方案中，接头样的额外核苷酸序列可以是3、6、9、12、15或18个核苷酸的长度。
aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件可以以正向（有义）或反向（反义）独立地排列在本发明的核酸分子中。在特定实施方案中，可在图4中阐明本发明的核酸分子，其中1）aprt基因或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件以正向或反向邻近地排列在疱疹病毒的增强子的上游（见UF1、UF2、UR1和UR2）；2）aprt基因或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件以正向或反向排列在疱疹病毒的增强子和启动子之间（见MF1、MF2、MR1和MR2）；和3）aprt基因或其功能变体的CpG岛的一个或多个内部元件以正向或反向邻近地排列在疱疹病毒的启动子的下游（见DF1、DF2、DR1和DR2）。
如本文所用，“核酸”与“核酸分子”可互换使用，并指任意可能构型的任意核酸，如线性单链的核酸、双链的核酸或其组合。核酸可包括，但不限于DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）、RNA分子（例如，mRNA）、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA的类似物、cDNA合成的DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸和PNA（蛋白质核酸）。DNA或RNA可以是基因组来源或合成来源，并可以是单链的或双链的。各核酸还可含有非天然核苷酸类似物和/或与亲和标记物或标签连接。还包括核酸类似物，如肽核酸等。
如本文所用，通用一般术语“核苷酸”包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。然而，在核苷酸序列，即寡核苷酸或多核苷酸的背景下，所述核苷酸与磷酸骨架聚合，即为一磷酸盐。术语“核苷酸”还包括经修饰的核苷酸，如但不限于硫代磷酸酯核苷酸（phophorothioatenucleotide）和氮杂嘌呤核苷酸核苷酸（deazapurinenucleotide）、2’-甲氧基核苷酸和其他核苷酸类似物。
在多个实施方案中，根据本发明的核酸分子是DNA分子。在一些实施方案中，疱疹病毒的功能启动子是核酸分子中包含的唯一启动子。
在多个实施方案中，本发明的核酸分子包含在载体中。术语“载体”指单链或双链的环形核酸分子，其可引入，例如转染至细胞中并在细胞基因组内复制或独立于细胞基因组进行复制。可切割环形双链核酸分子并利用限制性内切核酸酶处理将其线性化。本领域技术人员可容易地获得核酸载体、限制性内切核酸酶的分类以及限制性内切核酸酶切割核苷酸序列的知识。可通过限制性内切核酸酶切割载体并将两个片段连接在一起而将本发明的核酸分子插入到载体中。因此，本发明还提供包含本发明的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体是真核或原核表达载体。在其他实施方案中，载体是质粒。可使用市售质粒，如pBR322、puC19、pBluescript等。通常，可使用哺乳动物表达载体并且可通过商业途径获得所述哺乳动物表达载体。哺乳动物表达载体的实例可包括，但不限于pCDM8(Seed,B.Nature,1987,329:840)、pMT2PC(Kaufman等,1987,EMBOJ.6:187-195)、pCI和pSI哺乳动物载体。
在一些实施方案中，在合适的宿主细胞中包含核酸分子。包含本发明的核酸分子的宿主细胞可以是真核或原核细胞。在该上下文中，可在适合于表达本发明的核酸分子的条件下培养（经转化的）宿主细胞。可在无血清条件下，任选地在无动物来源的任何蛋白质/肽的培养基中建系、适应并完全培养宿主细胞。市售培养基，如RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM;Sigma)、基本必需培养基(MEM;Sigma)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、无血清CHO培养基(Sigma)和无蛋白质CHO培养基(Sigma)是示例性的适当营养溶液。需要时，可用多种化合物补充任意培养基，所述化合物的实例是激素和/或其他生长因子（如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子）、盐（如氯化钠、钙盐、镁盐、磷酸盐）、缓冲液（如HEPES）、核苷酸（如腺苷、胸苷）、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等同的能源、抗生素、微量元素。还可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必需补充物。
在一些实施方案中，所述核酸分子是分离的核酸分子。本发明的“分离的”核酸分子可以指与核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分离的一种核酸分子。分离的分子，例如DNA分子可以基本上不含其他细胞物质或培养基（当通过重组技术产生时）或基本上不含化学前体或其他化学品（当化学合成时）。换言之，分离的核酸分子可以不含或基本上不含在核酸来源的细胞或生物的基因组DNA中位于核酸侧翼的序列（即，位于核酸5’和3’端的序列，例如蛋白质编码序列）。
通常，如本文所用，术语“功能变体”指这样的序列，其与各自的原始序列，即一般是相应的aprt基因具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%的序列同一性、或75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性。“序列同一性”指序列的性质，其测定序列的相似性或关系。该术语指aprt基因的核酸序列分别与正在讨论的核酸序列进行同源性比对后获得的配对相同的残基的百分数，其中百分数的数值指两条序列中较长的一条中残基的数目。
本发明还包括与上述核酸序列基本上互补的核酸序列。如本文中所用，“基本上互补”指这样的事实，即给定的核酸序列与另一核酸序列至少90%，例如至少95%，在一些实施方案中100%互补。术语“互补”或“补码”指彼此可以形成多种有利的相互作用的两个核苷酸。此类有利的相互作用包括并只能是Watson-Crick碱基配对。如果第一条序列的核苷酸与第二条序列的所有核苷酸均互补，那么该核苷酸序列是另一条核苷酸序列的完整补码。
本发明还涉及产生所希望的多肽的方法。该方法包括：提供根据本发明的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包含编码所希望的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地连接至疱疹病毒的启动子和疱疹病毒的增强子，和允许所希望的多肽的表达。
如本文所用，术语“多肽”意在涵盖天然存在的蛋白质，以及重组产生或合成产生的那些蛋白质。术语“多肽”不限于特定长度的编码产物，因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“多肽”还包括组合起来以形成编码产物的两个或多个多肽。多肽还包括杂合多肽，其包含从至少两个不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一个或多个对其中表达所述多肽的细胞而言是异源的。多肽进一步包括上文提及的多肽和杂合多肽的天然存在的等位基因变异和改造变异。
在一些实施方案中，编码所希望的多肽的核苷酸序列是异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，允许所希望的多肽表达的步骤包括向合适的宿主细胞中引入根据本发明的核酸分子。在一些实施方案中，在适合在宿主细胞中表达的载体中包含根据本发明的核酸分子。
所述宿主细胞可以是任意合适的细胞，如真核细胞。所述真核细胞例如可以是动物细胞、植物细胞（例如，单子叶植物、双子叶植物、藻类）、真菌、酵母细胞、鞭毛、微孢子虫或原生生物。动物细胞可来自哺乳动物，如灵长类、人、鼠、牛、啮齿动物、人类、昆虫、爬行动物或鸟，仅提及这些例子。动物细胞，如哺乳动物细胞的实例可包括中国仓鼠卵巢细胞(例如，CHO-K1)、COS细胞(例如，COS-1,COS-7)、幼地鼠肾细胞(BHK)、人胚肾(HEK)(例如，HEK293)、Bowes黑色素瘤细胞、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠骨髓瘤细胞、产生抗体的杂交瘤细胞、人白血病细胞等。在一些实施方案中，宿主细胞是神经元。在其他实施方案中，宿主细胞是干细胞。酵母细胞例如可以是酿酒酵母（S.cerevisiae）、栗酒裂殖酵母（S.pombe）、白色念珠菌（C.albican）或酵母菌（Saccharomycetale）细胞。
在一些实施方案中，允许所希望的多肽在宿主细胞中表达超过约30代或更多代。在该实施方案的背景下，当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子相比时，宿主细胞在约30代或更多代后，所希望的多肽的表达水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，在约30代或更多代后，仍然表达所希望的多肽的所述宿主细胞的数目可以增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，允许所希望的多肽表达超过约4周或更长的时间。在该实施方案的背景下，当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子相比时，4周或更长的时间后，所希望的多肽的表达水平可以增加提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，4周或更长的时间后，仍然表达所希望的多肽的宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，允许所希望的多肽在宿主细胞中表达超过约60代或更多代。
在一些实施方案中，允许所希望的多肽表达超过8周或更多的时间。在该实施方案的背景下，当与不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件的核酸分子相比时，8周或更多长的时间后，所希望的多肽的表达水平提高。
在一些实施方案中，所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，8周或更长的时间后，仍然表达所希望的多肽的所述宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
本发明还提供根据本发明的核酸分子的用途，所述核酸分子用于增强目的多肽的表达，其中所述核酸分子包含编码目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列被有效地连接至疱疹病毒的启动子和疱疹病毒的增强子。
在一些实施方案中，目的多肽在合适的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，允许目的多肽在宿主细胞中表达超过约30代或更多代。在一些实施方案中，允许目的多肽在宿主细胞中表达超过约60代或更多代。
在一些实施方案中，当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子相比时，宿主细胞在约30代或更多代后，所希望的多肽的表达水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子相比时，宿主细胞在约60代或更多代后，所希望的多肽的表达水平提高，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，宿主细胞在约30代或更多代后，仍然表达所希望的多肽的宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，所希望的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列的核酸分子的多个宿主细胞相比时，在约60代或更多代后，仍然表达所希望的多肽的所述宿主细胞的数目增加，所述核酸分子不具有aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件。
在一些实施方案中，aprt基因和/或其功能变体的CpG岛的内部元件防止功能启动子和/或功能增强子的甲基化，由此降低和/或防止所希望的多肽表达水平的降低。
本发明的核酸分子例如可以用于例如在哺乳动物细胞中产生重组蛋白质，用于细胞工程、蛋白质工程或基因治疗。
以下示例性的数据阐明了根据本发明的核酸分子的用途和优势。
实施例.
IECMV启动子的产生
在图4和图5中概括了IECMV的产生和用于测试IECMV在长期培养过程中维持基因表达的能力的载体。使用PCR以退火两条引物来合成IE元件，
IE-正向：5’-TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCT
CCCCGCAACCCACTCTCCCAGAGGCCCCGCCCC-3’(SEQIDNO:12)和
IE反向：5’-TCCTTAGGGAGCGATCCAGCACGAGGAGAGGCCGGGAGGGGGCGGGACGGGGCGGGGCCTCTGGGAGA-3’(SEQIDNO:13)。
通过重叠PCR连接两个拷贝的IE。从pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)上克隆pCIN中的野生型CMV启动子。为了产生IECMV，使用QuickChange定点诱变试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)在CMV增强子与最小启动子(mP)之间产生XhoI位点。然后使用MluI位点将一个拷贝或两个拷贝的IE以正向或反向插入到CMV启动子的上游，使用XhoI位点将IE插入到增强子与mP之间，使用NheI位点将IE插入到CMV启动子的下游。从NewEnglandBiolabs(Ipswich,MA)购买用于载体构建的所有限制性内切核酸酶和连接酶。
CHO细胞中GFP表达的FACS分析
FACSCaliburTM系统(BectonDickinson,CA,USA)用于评估多个克隆的绿色荧光水平。通过在269或516的PMT电压设置的FL1，利用对数增加检测525nM处的绿色荧光。对于每个样品，分析1万个细胞。使用Flowjo软件进行数据分析。
GFP基因拷贝数和mRNA水平的分析
分别使用PureGeneDNA纯化试剂盒(GentraSystems,Minneapolis,MN)和RNAqueous-4PCR试剂盒(Ambion,Austin,TX)从细胞中分离基因组DNA和RNA。使用ImProm-II逆转录系统(Promega,Madison,WI)从mRNA制备第一链cDNA。对于每个逆转录反应，使用100ng总RNA。使用实时定量PCR(qRT-PCR)测定相对GFP转基因拷贝数和mRNA水平。将持家基因β-肌动蛋白作为内对照，以归一化样品之间DNA或RNA输入量的可能差异。通过ABIPrism7000序列检测系统与iTagSYBRGreenSupermix(Bio-Rad,Hercules,CA)的结合使用来进行qRT-PCR。使用2-ΔΔCt方法(Livak和Schittgen,2001,Methods25(4):402-408)分析所收集的数据。
实施例1:单细胞克隆的产生
使用电穿孔在6孔板中将含有不同的经修饰的CMV启动子（其中插入了IE）的载体转染到CHOK1细胞中。转染48小时后，加入选择试剂G418，用于选择细胞，所述细胞的基因组中整合了载体。经过2至3周的选择后，大多数存活的细胞会稳定表达GFP。然后使用有限稀释法获得单细胞克隆并保存起来。
实施例2:长期基因表达的测试
将在步骤1中获得的单细胞克隆解冻并在6孔板中培养。第0周时，在显微镜下为不同的克隆拍照，以评估GFP阳性细胞的百分率。还使用FAC定量测定每个克隆GFP阳性细胞的百分率和表达水平。然后在无G418的情况下将细胞传代8周。再次拍照并完成FACS分析，并将其与第0周时的结果进行比较。
在本文中描述了通过使用aprt基因的核心CpG岛元件(IE)而对基因沉默更有抗性的经修饰的hCMV启动子。野生型hCMV启动子由增强子和启动子组成。不希望受任何理论的束缚，发现在增强子的上游或增强子与启动子之间插入单个IE元件增强了hCMV维持长期基因表达的能力，并且不影响用于高水平表达的启动子强度。还发现，在最小启动子的下游插入IE也保护hCMV免于基因沉默，但却抑制基因表达。因此，不希望受理论的束缚，IE在每个位置上的保护效应不同并且依赖于其定位。
使用本发明的核酸分子的另一优势是产生高稳定性的细胞系。与使用野生型CMV产生的克隆（其含有许多不表达细胞并维持低于20%表达）相比，在传代8周后，使用经修饰的CMV产生的所有克隆含有100%GFP阳性细胞并维持超过50%原始水平的GFP表达。同样，在瞬时和稳定转染中，经修饰的IECMV与野生型CMV在表达基因方面具有相当的强度。IE元件提供的这种抗沉默保护应该对产生高稳定性的细胞系有益。
不应该认为该说明书中以前出版的文件的列表或讨论是认可所述文件是现有技术的一部分或公知常规知识。将所列出的所有文件并入本文作为参考。
可在缺少本文没有具体公开的任何元素、限制的情况下适当地实施本文说明性描述的发明。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广泛地且不受限制地理解。此外，本文使用的术语和表述已经用作描述术语，而非限制术语，并且在此类术语和表述的使用中不意在排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物或其部分，而认为多种修改在所要求的发明中范围内是可能的。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方案具体公开了本发明，但是本领域技术人员可借助于本文公开的本发明的修改和改变，并且认为此类修改和改变在本发明的范围内。
其他实施方案在以下权利要求中。此外，以马库什组形式描述了本发明的特征或方面，由此技术人员也将认为以马库什组的任何个体成员或亚组成员的形式描述了本发明。

Claims (49)

1.核酸分子，其包含巨细胞病毒的功能启动子、巨细胞病毒的功能增强子和aprt(腺嘌呤磷酸核糖转移酶)基因的CpG岛的一个或多个内部元件，其中所述aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个包含转录因子Sp1的一个或多个结合位点，其中所述aprt基因是仓鼠aprt基因和小鼠aprt基因中的一个，其中所述aprt基因是仓鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG岛的内部元件如下述序列所示：
5’-
TCCAGCAAATGCGTTACTTCCTGCCAAAAGCCAGCCTCCCCGCAACCCACT
CTCCCAGAGGCCCCGCCCCGTCCCGCCCCCTCCCGGCCTCTCCTCGTGCTG
GATCGCTCCCTAAGGA-3’(SEQIDNO；4），
且其中所述aprt基因是小鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG岛的内部元件如下述序列所示：
5’-
AGGATGGACATCGCACATCCCCTTTCCACCCATATATCTTTGAGGTAGGGA
TGCTTGTGTTTAGGCAGCTCAAGAAATCTAACCCCTGACTCAGGCCCCACA
CACACCTCGCAGAGGCCCCGCCTCTCAGCCTGTCCCGCCCCTCGTGCTAGA
CCAACCCGCACCCAGAAGCCCCGCCCATCGAGGACGCTCCGCCCTTGTTC
CCCCCGGGATTGACGTG-3’(SEQIDNO：5)。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述仓鼠是仓鼠属物种。
3.权利要求2的核酸分子，其中所述仓鼠是灰仓鼠。
4.权利要求1的核酸分子，其中所述aprt基因是仓鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG岛的Spl结合位点具有序列：5’-GCCCCGCCCCGTCCCGCCCC-3’(SEQIDNO:1)。
5.权利要求1的核酸分子，其中所述aprt基因是小鼠aprt基因并且所述aprt基因的CpG岛的Spl结合位点具有序列5’-CCCGCCC-3’(SEQIDNO:2)或序列5’-TCCGCCC-3’(SEQIDNO:3)。
6.权利要求1的核酸分子，其中所述aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件以相对于启动子的序列正向地或反向地独立地排列在所述核酸分子中。
7.权利要求1的核酸分子，其包含所述aprt基因的CpG岛的多个内部元件。
8.权利要求1至7任一项的核酸分子，其进一步包含编码目的多肽的可表达的核苷酸序列，所述可表达的核苷酸序列有效连接至所述巨细胞病毒的启动子和所述巨细胞病毒的增强子。
9.权利要求8的核酸分子，其中所述可表达的核苷酸序列是异源核苷酸序列。
10.权利要求8的核酸分子，其中所述可表达的核苷酸序列排列在所述巨细胞病毒的启动子和所述巨细胞病毒的增强子的下游。
11.权利要求1的核酸分子，其中所述启动子和所述增强子是同一巨细胞病毒的启动子和增强子。
12.权利要求1的核酸分子，其中所述巨细胞病毒是人巨细胞病毒。
13.权利要求1的核酸分子，其中所述功能启动子和所述功能增强子被包含在以下序列中：
5’-
TTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATT
AGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGG
CCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGA
CGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGG
TGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡ
ＴGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGG
CATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC
TACGTATTAGTCATCGCTATTACTCGAGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATC
AATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCC
CATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCC
AAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
TACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTC-3’(SEQIDNO：6)。
14.权利要求1的核酸分子，其中所述功能启动子如下述序列所示：
5’-
TGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCA
C
GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGC
ACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTG
ACGCAAATGGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAG
CTC-3’(SEQIDNO：7)。
15.权利要求1的核酸分子，其中所述功能增强子如下述序列所示
5’-
TGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTA
GTTCATACCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGC
CCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGAC
GTATGTTCCCATAGTAACCCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGT
GGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATAT
GCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCCGCCTGGC
ATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCT
ACGTATTAGTCATCGCTATTA-3’(SEQIDNO：8)。
16.权利要求1的核酸分子，其中所述巨细胞病毒的增强子排列在所述巨细胞病毒的启动子的上游。
17.权利要求1的核酸分子，其中所述aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个排列在所述巨细胞病毒的启动子的上游，或排列在所述巨细胞病毒的启动子的下游小于20个核苷酸的位置。
18.权利要求17的核酸分子，其中所述aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个排列在(i)所述巨细胞病毒的增强子和所述巨细胞病毒的启动子之间，或(ii)排列在所述巨细胞病毒的增强子的上游小于20个核苷酸的位置。
19.权利要求17或18的核酸分子，其中所述aprt基因的CpG岛的一个或多个内部元件中的至少一个与所述巨细胞病毒的增强子或所述巨细胞病毒的启动子之间的间隔小于20个核苷酸。
20.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子是DNA分子。
21.权利要求1的核酸分子，其中所述巨细胞病毒的功能启动子是所述核酸分子中包含的唯一启动子。
22.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在载体中。
23.权利要求22的核酸分子，其中所述载体是质粒。
24.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子被包含在合适的宿主细胞中。
25.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子是分离的核酸分子。
26.产生目的多肽的方法，所述方法包括：
-提供权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包含编码目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至所述巨细胞病毒的启动子和所述巨细胞病毒的增强子，和
-允许目的多肽的表达。
27.权利要求26的方法，其中所述的编码目的多肽的核苷酸序列是异源核苷酸序列。
28.权利要求26或27的方法，其中允许所述目的多肽的表达包括将权利要求1的核酸分子引入到合适的宿主细胞中。
29.权利要求28的方法，其中权利要求1的核酸分子被包含在适合于所述宿主细胞中表达的载体中。
30.权利要求28的方法，其中允许所述目的多肽在所述宿主细胞中表达超过8周。
31.权利要求30的方法，其中当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子相比时，所述宿主细胞在8周后，所述目的多肽的表达水平提高。
32.权利要求30或31的方法，其中所述目的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子的多个宿主细胞相比时，所述宿主细胞在8周后，仍然表达目的多肽的宿主细胞的数目增加。
33.权利要求26的方法，其中允许所述目的多肽表达超过4周的时间。
34.权利要求26的方法，其中当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子相比时，4周的时间后，所述目的多肽的表达水平提高。
35.权利要求26的方法，其中所述目的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子的多个宿主细胞相比时，在4周的时间后，仍然表达目的多肽的所述宿主细胞的数目增加。
36.权利要求26的方法，其中允许所述目的多肽在宿主细胞中表达超过8周。
37.权利要求26的方法，其中允许所述目的多肽表达超过8周的时间。
38.权利要求37的方法，其中当与不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子相比时，8周后，所述目的多肽的表达水平提高。
39.权利要求26的方法，其中所述目的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子的多个宿主细胞相比时，在8周后，仍然表达目的多肽的所述宿主细胞的数目增加。
40.载体，其包含权利要求1至21任一项的核酸分子。
41.权利要求40的载体，其中所述载体是真核表达载体。
42.权利要求40或41的载体，其中所述载体是质粒。
43.宿主细胞，其包含权利要求1至23任一项的核酸分子。
44.根据权利要求1至23任一项的核酸分子的用途，所述核酸分子用于增强目的多肽的表达，其中所述核酸分子包含编码目的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至所述巨细胞病毒的启动子和所述巨细胞病毒的增强子。
45.权利要求44的用途，其中所述目的多肽在合适的宿主细胞中表达。
46.权利要求45的用途，其中允许所述目的多肽在宿主细胞中表达超过8周。
47.权利要求45的用途，其中当与具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子时，所述宿主细胞在8周后，所述目的多肽的表达水平提高。
48.权利要求44的用途，其中所述目的目的多肽在多个宿主细胞中表达，并且其中当与包含具有编码目的多肽的异源核苷酸序列而不具有aprt基因的CpG岛的内部元件的核酸分子的多个宿主细胞相比时，宿主细胞在8周后，仍然表达所述目的多肽的宿主细胞的数目增加。
49.权利要求44的用途，其中所述aprt基因的CpG岛的内部元件防止功能启动子和/或功能增强子的甲基化，所述甲基化降低所述目的多肽表达水平和/或防止所述目的多肽表达。
CN201180068239.7A 2010-12-24 2011-12-22 抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子 Expired - Fee Related CN103502459B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061427121P 2010-12-24 2010-12-24
US61/427,121 2010-12-24
PCT/SG2011/000449 WO2012087246A1 (en) 2010-12-24 2011-12-22 Modified human cmv promoters that are resistant to gene silencing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103502459A CN103502459A (zh) 2014-01-08
CN103502459B true CN103502459B (zh) 2016-04-13

Family

ID=46314255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180068239.7A Expired - Fee Related CN103502459B (zh) 2010-12-24 2011-12-22 抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20140017726A1 (zh)
EP (1) EP2655636B1 (zh)
KR (1) KR102013586B1 (zh)
CN (1) CN103502459B (zh)
SG (1) SG191246A1 (zh)
WO (1) WO2012087246A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104278032A (zh) * 2014-02-14 2015-01-14 上海美百瑞生物医药技术有限公司 一种新型双启动子结构单元
CA2943719A1 (en) * 2014-05-19 2015-11-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for production of polypeptides
CL2016001661A1 (es) 2016-06-29 2017-03-03 Univ Chile Promotor hibrido de ß-actina (de cricetulus griseus) y citomegalovirus (cmv), con región rica en dinucleótidos, citosina-guanina, vectores, líneas celulares, procedimiento para producir proteínas recombinantes.

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004067701A2 (en) * 2003-02-01 2004-08-12 Innovata Plc Improved genetic elements providing high levels of expression
WO2009146668A2 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Ustav Molekulami Genetiky Av Cr, V.V.I. Regulatory gene element comprising promotor/enhancer protected from dna methylation and gene expression silencing

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2231099A (en) * 1998-01-16 1999-08-02 Genzyme Corporation Novel promoter elements for persistent gene expression
EP1737966B1 (en) * 2004-04-02 2012-05-09 Board of Regents, The University of Texas System Cancer specific promoters
EP1932911A4 (en) * 2005-09-08 2009-10-28 Univ Osaka Res Found PROMOTER FOR INTRODUCING A GENE IN LYMPHOCYTES OR BLOOD CELLS AND APPLYING THEREOF

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004067701A2 (en) * 2003-02-01 2004-08-12 Innovata Plc Improved genetic elements providing high levels of expression
WO2009146668A2 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Ustav Molekulami Genetiky Av Cr, V.V.I. Regulatory gene element comprising promotor/enhancer protected from dna methylation and gene expression silencing

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CpG-island fragments from the HNRPA2B1/CBX3 genomic locus reduce silencing and enhance transgene expression from the hCMV promoter/enhancer in mammalian cells;Steven Williams,et al;《BMC Biotechnology》;20050603;第5卷(第17期);1－9 *
The Core Element of a CpG Island Protects Avian Sarcoma and Leukosis Virus-Derived Vectors from Transcriptional Silencing;Filip Sˇenigl，et al;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20080831;第82卷(第16期);7818–7827 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2655636A1 (en) 2013-10-30
CN103502459A (zh) 2014-01-08
WO2012087246A1 (en) 2012-06-28
SG191246A1 (en) 2013-07-31
US20140017726A1 (en) 2014-01-16
EP2655636B1 (en) 2015-04-22
KR20140012968A (ko) 2014-02-04
KR102013586B1 (ko) 2019-08-23
EP2655636A4 (en) 2014-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5270544B2 (ja) 調節核酸配列要素
JP4489424B2 (ja) 染色体に基くプラットホーム
EP3138911B1 (en) Crispr-based genome modification and regulation
JP7109547B2 (ja) 真核ゲノム修飾のための操作されたＣａｓ９システム
JP2016523084A (ja) 標的組込み
Chin et al. Engineering selection stringency on expression vector for the production of recombinant human alpha1-antitrypsin using Chinese Hamster ovary cells
EP2935319B1 (en) Production of therapeutic proteins in genetically modified mammalian cells
US11254928B2 (en) Gene modification assays
CN103502459B (zh) 抗基因沉默的经修饰的人cmv启动子
JP2023076667A (ja) 組み換え型タンパク質の効率的な選択性
EP2788483B1 (en) Expression cassette
KR20100097123A (ko) 신규한 재조합 서열
CA3136659C (en) Stable targeted integration
WO2010023787A1 (ja) 遺伝子発現安定化エレメント
TWI704224B (zh) 編輯核酸序列之組成物及方法
US20190309323A1 (en) Promoter with an enriched cytosine-guanine dinucleotide region, vectors, cellular lines, method for producing recombinant protein
CN118234854A (zh) 利用顺式作用调控元件的改善的先导编辑系统效率
WO2023039508A1 (en) Improved prime editing system efficiency with cis-acting regulatory elements
WO2024044673A1 (en) Dual cut retron editors for genomic insertions and deletions
WO2023183588A1 (en) Methods of assessing engineered retron activity, and uses thereof
WO2020139156A1 (en) Gene therapy dna vector and its application
JP2021533797A (ja) 細胞質ｄｎａセンサー経路の下方制御

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160413

Termination date: 20201222

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee