CN103495002A - 一种抗肿瘤的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤方剂及其制备方法和应用。以质量份数计，包括以下组份：铁牛七10-20g；芋儿七10-20g；金牛七10-20g；灯台七10-20g；追风七10-20g；太白三七10-20g。本发明受国家林业局林业公益性行业科研专项“秦岭林药资源保护及其开发利用技术研究”资助，从秦岭太白山特色中草药中筛选出6味“太白七药”组成抗肿瘤方剂,该方剂组方严谨、配伍得当，具有清热解毒、活血消肿、益气补血的功效，可应用于肿瘤的治疗。MTT法检测证实本发明方剂对肿瘤细胞增殖具有抑制作用，筛选出最佳药物配伍和剂量组成能诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤中药方剂—“肿瘤消”。

Description

一种抗肿瘤的中药组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，涉及一种抗肿瘤的中药组合物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤（Tumor）是目前危害人类健康的主要疾病之一。据WHO统计，2012年全球新确诊的肿瘤病人多达1500万。在过去几年中，全球每年死于癌症的人数高达700万，癌症已经成为世界上导致死亡人数最多的疾病。目前全球医药市场对安全、有效的抗肿瘤药物存在巨大需求空间。肿瘤最基本的生物学特征是细胞生长失控，寻找对肿瘤细胞生长具有靶向抑制作用的抗肿瘤药是药物研发者的重要课题。

当前治疗肿瘤的手段主要包括化疗、放疗和手术治疗。但大量的临床治疗证明，化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时对机体正常细胞具有损害作用。中药抗肿瘤具有作用机制独特、药效持久、多靶点、多途径、抗肿瘤谱广、毒副作用小等优点，对于治疗肿瘤具有巨大的潜力和不可替代的优势，如今在临床上已经逐步占据了主导地位。

现已发现的抗肿瘤药物中，源于植物的占32.25％。从天然植物中寻找抗肿瘤活性成分是当前及今后一段时期内抗肿瘤药物研发的热点。秦岭主峰太白山为我国“三大药山”之一，中草药资源异常丰富，其中有149种以“七”字命名的药用植物，即“太白七药”。早在1953年，美国就将“太白七药”中的桃儿七提纯制成药品用于抗癌，并载入美国药典（USP）。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种抗肿瘤的中药组合物及其制备方法和应用，所提供的抗肿瘤药物是基于“太白七药”的新的中药组合物。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种抗肿瘤的中药组合物，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七10～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～20份和太白三七10～20份。

进一步的，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七15～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～15份和太白三七10～15份。

以及，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七15～20份、芋儿七10～15份、金牛七10～15份、灯台七10～20份、追风七10～12份和太白三七10～12份。

具体的，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七20份、芋儿七15份、金牛七15份、灯台七15份、追风七12份和太白三七10份。

所述该组合物的有效成分是将铁牛七、芋儿七、金牛七、灯台七、追风七和太白三七粉碎后，加水浸泡，然后煎煮提取至少30min，过滤所得的煎出液；

或者，该组合物的有效成分是将铁牛七、芋儿七、金牛七、灯台七、追风七和太白三七粉碎后，与炼蜜按照1～5:1的质量比混合成丸。

一种抗肿瘤的中药制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）按照质量份数计，将铁牛七10～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～20份和太白三七10～20份混合并粉碎后，加相当于药材量5～8倍的冷水浸泡1～2h；

2）浸泡结束后，煮沸30～60min，滤过；药渣加3～5倍质量水再次煎煮20～40min，滤过；合并两次煎出液，于水浴上浓缩至浸膏，每ml浸膏相当于药材量2～4g，得到水煎剂；

或者，按照以下步骤制备成丸剂：

1）按照质量份数计，将铁牛七10～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～20份和太白三七10～20份混合并粉碎后，过80目筛，收集得到药粉；

2）将蜂蜜于蒸发皿中加热至沸，炼至黏稠有光泽的程度，得到炼蜜；

3）将炼蜜与药粉按1:1～1:5的质量比例混合，得到软材，再将软材静置后制丸，得到抗肿瘤的中药丸剂。

还以所制备的浸膏作为有效成分，添加辅料制成片剂或胶囊。

所述的中药组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物是促肿瘤细胞凋亡的药物。

所述的抗肿瘤药物包括肺腺癌的药物、抗宫颈癌的药物、抗骨髓瘤的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的效果：

本发明提供的抗肿瘤的中药组合物，是由“太白七药”组成的方剂，该方剂组方严谨、配伍得当，具有清热解毒、活血消肿、益气补血的功效，可应用于肿瘤的治疗。

本发明的中药组合物是从“太白七药”中筛选出6味特效中草药组成以铁牛七为君药的抗肿瘤中药方剂，该方剂能够抑制A549、Hela、SP2/0等肿瘤细胞的生长，尤其是能够通过促使肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长。在对肿瘤细胞凋亡实验当中，观察到了DNA梯状条带和凋亡小体。

本发明还通过MTT试验检测本发明方剂对肿瘤细胞的抑制作用，并进一步筛选出最佳药物配伍和浓度，组成抗肿瘤中药方剂—“肿瘤消”。细胞凋亡检测证实“肿瘤消”方剂的抗肿瘤机制在于能诱导肿瘤细胞凋亡。

本发明受国家林业局林业公益性行业科研专项“秦岭林药资源保护及其开发利用技术研究”资助，将传统中医药理论与现代科学技术相结合，已经在细胞凋亡实验的基础上，研究了本发明方剂对肿瘤细胞的抑制作用，筛选出最佳药物配伍，为临床用药提供理论依据。同时揭示了使用本发明方剂治疗肿瘤的科学性和严谨性。此外，组方中的中草药均来源于我国秦岭太白山特色林药，对于发掘秦岭太白山中草药资源具有重要指导意义。

附图说明

图1为本发明的“肿瘤消”方剂诱导A549细胞凋亡的形态学观察结果，其中A:空白对照组；B:125ug/ml药物组；C:500ug/ml“药物组；D:1000ug/ml药物组；E:2000ug/ml药物组；

图2为DNA片段化检测本发明的“肿瘤消”方剂对A549细胞凋亡的影响；

图3为荧光显微镜下观察本发明的“肿瘤消”方剂对A549细胞形态的影响（hochest染色）；其中A:空白对照组；B:125ug/ml药物组；C:500ug/ml“药物组；D:1000ug/ml药物组；E:2000ug/ml药物组。

具体实施方式

本发明公布了一种抗肿瘤方剂“肿瘤消”及其制备方法和应用，研究本发明方剂对肿瘤细胞的抑制作用，筛选出最佳药物配伍和浓度，为临床用药提供理论依据。另一方面将传统中医药理论与现代科学技术相结合，通过探讨本发明方剂的抗肿瘤机制，证实本发明方剂能诱导A549、Hela、SP2/0等多种肿瘤细胞凋亡，揭示了使用本发明方剂治疗肿瘤的科学性和严谨性。

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明抗肿瘤中药方剂源于我国传统中医药理论和现代药理学的研究成果，同时总结陕西省太白山区民间用药的经验，优选出6味“太白七药”组成抗肿瘤方剂。方剂以铁牛七（Trillium tschonoskii Maxim）为君药，芋儿七（Aconitum brachypodum Diels）为臣药，金牛七（Aconitum taipeicumHand.-Mazz）为佐药，灯台七（Rhizoma Paridis）为使药，辅以追风七（Rootor all-grass of Aleppo Avens）和太白三七[Tongoloa dunnii（Boiss.）Wolff]组成。方剂的重量配比如下（60kg成人临床拟用剂量）：

近年临床对抗肿瘤中药方剂做了大量的筛选和研究工作。扶正固本、活血化瘀、清热解毒以及以毒攻毒等治疗方法已被实验和临床研究所证实并广泛应用。本发明方剂中铁牛七含有毒物质—乌头碱，而乌头碱以毒攻毒的抗肿瘤功效已被实验研究所证实；芋儿七具有镇静、止痛、活血、止血的功效；金牛七具有散瘀消肿，治疗跌打损伤的作用；灯台七为清热解毒、熄风定惊药；追风七具有祛风除湿，活血消肿的作用；太白三七为益气活血药，在太白山区民间有使用太白三七治疗血管瘤的经验。总结以上中医药理论和药理学研究成果发现：本发明方剂兼有清热解毒，活血消肿，益气补血的功效。6味药配伍后水煎，以期达到增效、减毒的目的。

本发明方剂符合中医治疗肿瘤“坚者削之”、“结者散之”、“留者攻之”、“虚者补之”的治疗原则。本发明方剂组方严谨、配伍得当，使用此方剂治疗肿瘤理论上具有可行性，通过试验研究证实了本发明方剂的抗肿瘤功效和机制。

下面给出一些具体的组方实施例。

实施例1

本实例所需原料药为铁牛七20g，芋儿七15g，金牛七15g，灯台七15g，追风七12g，太白三七10g。

实施例2

本实例所需原料药为铁牛七20g，芋儿七15g，金牛七12g，灯台七15g，追风七12g，太白三七10g。

实施例3

本实例所需原料药为铁牛七20g，芋儿七15g，金牛七15g，灯台七12g，追风七12g，太白三七10g。

实施例4

本实例所需原料药为铁牛七20g，芋儿七15g，金牛七12g，灯台七12g，追风七12g，太白三七10g。

实施例5

本实例所需原料药为铁牛七20g，芋儿七12g，金牛七12g，灯台七12g，追风七12g，太白三七10g。

实施例6

本实例所需原料药为铁牛七15g，芋儿七12g，金牛七12g，灯台七12g，追风七12g，太白三七10g。

实施例7

本实例所需原料药为铁牛七15g，芋儿七12g，金牛七12g，灯台七12g，追风七10g，太白三七10g。

实施例8

本实例所需原料药为铁牛七15g，芋儿七10g，金牛七10g，灯台七10g，追风七10g，太白三七10g。

以上实施例的制备工艺如下：

本发明方剂的制备，可利用通用的中药制药工艺和设备制成水煎剂、丸剂、片剂和胶囊剂等不同剂型，能满足不同患者需求。

（1）水煎剂的制备：

全部药材均在适宜季节采收自秦岭太白山，于干燥通风处自然阴干，保存。将铁牛七、芋儿七、金牛七、灯台七、追风七和太白三七粉碎后，准确称量置煎煮容器内，煎煮容器以瓦罐、砂锅为佳，加相当于药材质量8倍的蒸馏水浸泡2h，煮沸30～60min，滤过；药渣加3～5倍质量水继续煎煮，煮沸20～40min，滤过。合并两次煎出液，于水浴锅上浓缩至每1ml相当于药材量2～4g的水煎剂。

（2）丸剂的制备：

①将6味中草药粉碎成细粉，过80目筛备用。

②炼蜜：称取一定量的蜂蜜于蒸发皿中加热至沸，将蜂蜜炼至黏稠有光泽的程度。

③合药：将炼制好的炼蜜与药粉按1:1或1:5比例混合。

④制条，成丸：将混合好的软材放置一段时间，产生一定粘性后搓条，手工或用制丸板做成一定量的、光滑的、圆球形丸粒，大量生产可用机械制丸。

（3）片剂的制备：参照（1）法制备出水煎剂，将水煎剂浓缩成浸膏，加入适量乙醇，静置24h以上，沉淀回收乙醇并浓缩，加入适量淀粉、糊精等粉料，混匀制成软材，于颗粒机内制得湿颗粒，之后干燥成干颗粒，压片即成。

（4）胶囊剂的制备：参照（1）法制备出水煎剂，将水煎剂浓缩成浸膏，加入适量乙醇，静置24h以上，沉淀回收乙醇并浓缩，室温干燥。将干燥品粉碎成细粉，装入胶囊即成。

（5）因实验需要，对所得水煎剂进行如下处理：将所得水煎剂以12000r/min，离心30min，去除不溶性成分。将上清液与等体积乙醇混匀，4℃过夜，12000r/min，离心30min，去除不溶性成分。将所得的上清液冷冻干燥、称重，溶解于RPMI-1640培养基中，调整药物浓度为400mg/ml，依次通过0.45um和0.22um的滤器过滤除菌，4℃保存、备用，临用前再用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。

下面给出抗肿瘤的效果实验

当前研究抗肿瘤药物的作用机制主要集中在干扰细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞迁移等方面。本次试验通过MTT法对本发明方剂8个实施例所得水煎剂进行抗肿瘤活性初步鉴定，试验结果证实本发明方剂8个实施例普遍对三种肿瘤细胞株（人肺腺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株Hela、小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0）增殖具有明显抑制作用。试验筛选出方剂的最佳药物配伍和剂量即实施例1：铁牛七20g，芋儿七15g，金牛七15g，灯台七15g，追风七12g，太白三七10g；并将本发明的中药组合物命名为“肿瘤消”中药方剂。细胞凋亡的形态学观察提示“肿瘤消”方剂的抗肿瘤机制可能是诱导肿瘤细胞凋亡。进一步采用两种方法（DNA片段化检测、Hoechst染色）进行细胞凋亡检测，试验结果证实“肿瘤消”方剂的抗肿瘤机制是诱导肿瘤细胞凋亡。

实验一：MTT法检测本发明方剂对肿瘤细胞增殖的影响

对本发明方剂的8个实施例进行了MTT试验，检测药物对人肺腺癌A549细胞、人宫颈癌Hela细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞的增殖的抑制作用。实验过程及结果简述如下：

分别取生长状态良好的A549细胞、Hela细胞和SP2/0细胞各一瓶，接种于96孔板上，每孔90ul，每组设三个复孔，并设空白调零孔。实验孔加入用RPMI-1640培养基稀释的不同浓度的药物，使药物终浓度分别为125ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml和2000ug/ml，对照孔加入等体积RPMI-1640培养基，混匀后将培养板置于37℃、5％C0₂培养箱中分别培养24h、48h。在培养结束前4h取出培养板，向每孔中加入浓度为5mg/m1的噻唑兰（MTT）15ul，继续培养4h后，吸去上清，每孔加入DMSO150ul，在水平摇床上避光作用10分钟，然后在酶联免疫检测仪490nm波长处测量各孔光密度值(OD值)。结果判定：实验结果以细胞抑制率(Restrain Rate,RR)表示。细胞抑制率(RR)=(1-实验组OD/对照组OD)×100％。结果见表1。

表1本发明方剂各实施例对肿瘤细胞增殖的影响

从表1可以看出，本发明的8个实施例普遍对三种肿瘤细胞（A549、Hela、SP2/0）的增殖具有抑制作用，作用效果基本呈现剂量和时间依赖关系，其中抑制作用最强的为实施例1。

A549细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，80%左右融合时进行传代培养。将A549细胞接种于6孔板，待细胞生长至75%融合时加入药物，使终浓度分别为125ug/ml、500ug/ml、1000ug/ml和2000ug/ml，药物作用24h后倒置显微镜观察细胞形态。结果见图1。

从图1可见：正常对照组细胞呈梭形并贴壁生长，细胞间连接紧密。中药组合物各剂量组细胞体积缩小，变圆，细胞连接较松，有的出血空泡化，上清液中漂浮有凋亡的细胞。表明本发明提供的抗肿瘤的促进了肿瘤细胞的凋亡。

实验二：DNA片段化检测细胞凋亡

原理：发生细胞凋亡时，内源性核酸酶被激活，染色体DNA链在核小体之间被切割，形成180～200bp或其整数倍的DNA片段，将这些DNA片段抽提出来进行电泳，可得到DNA梯状条带（DNA Ladder）。

方法：

（1）收集凋亡细胞：经“肿瘤消”方剂刺激细胞发生凋亡后，取1～2×10⁶个细胞，离心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2h；

（2）洗涤：取出固定的细胞，2000r/min离心5min，去掉上清液，PBS洗二次；

（3）裂解细胞：加400μl细胞裂解液，充分混匀再加蛋白酶K100μl，置65℃水浴消化2h；

（4）蛋白处理：加75μl8mol/L的醋酸钾，4℃15min，再加750μl氯仿，充分混匀后，10000r/min离心10min后，将上清移至一新的Eppendorf管中；

（5）沉淀DNA：加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见乳白色沉淀；

（6）洗涤DNA：加1ml70%乙醇，混匀，10000r/min离心5min，去上清；

（7）溶解DNA：根据DAN沉淀的大小，加一定量的TE，37℃溶解；

（8）2%琼脂糖凝胶电泳：80V，2h.

结果：从图2所示的对A549细胞凋亡的影响中可以看出，经药物处理后提取的DNA琼脂糖凝胶电泳出现梯状条带（DNA Ladder），最小的条带为180～200bp，其他的条带为其整倍数大小，且随着药物浓度的增大，DNALadder越明显。而正常细胞因基因组DNA分子量大，迁移距离短，故电泳条带停留在加样孔附近。

试验三：Hoechst染色检测细胞凋亡

原理：细胞凋亡最显著的变化是染色体固缩，DNA裂解使细胞核形态发生变化。Hoechst33258可作为荧光探针与DNA分子结合。在凋亡细胞中，细胞膜对Hoechst33258的摄取增高，且由于染色体高度浓缩，Hoechst33258与之结合增强，染色呈强蓝色荧光，而正常细胞只呈微弱荧光，死细胞则不被染色，由此可检测出凋亡。

方法：

(1)经“肿瘤消”方剂刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10min；

(2)去固定液，用PBS洗两遍，每次3min，吸尽液体；

(3)加入0.5ml Hoechst33258染色液，染色5分钟；

(4)去染色液，用PBS洗两遍，每次3min，吸尽液体；

(5)滴一滴抗荧光猝灭封片液于培养皿上，荧光显微镜观察。

结果：从图3所示的对A549细胞形态的影响可以看出，正常细胞的细胞核呈均匀的蓝色，而凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，颜色有些发白。随着药物浓度的加大，呈致密浓染的细胞核越来越多，有的细胞可呈现细胞核碎裂后形成的凋亡小体。

以上结果表明本发明提供的“肿瘤消”方剂能够通过促肿瘤细胞凋亡，而抑制肿瘤细胞生长，从而达到抗肿瘤的效果；因此，本发明提供的中药组合物及其有效成分能够应用于抗肿瘤药物的制备。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤的中药组合物，其特征在于，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七10～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～20份和太白三七10～20份。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤的中药组合物，其特征在于，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七15～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～15份和太白三七10～15份。

3.如权利要求1所述的抗肿瘤的中药组合物，其特征在于，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七15～20份、芋儿七10～15份、金牛七10～15份、灯台七10～20份、追风七10～12份和太白三七10～12份。

4.如权利要求1所述的抗肿瘤的中药组合物，其特征在于，以质量份数计，包括以下组份：

铁牛七20份、芋儿七15份、金牛七15份、灯台七15份、追风七12份和太白三七10份。

5.如权利要求1所述的抗肿瘤的中药组合物，其特征在于，该组合物的有效成分是将铁牛七、芋儿七、金牛七、灯台七、追风七和太白三七粉碎后，加水浸泡，然后煎煮提取至少30min，过滤所得的煎出液；

或者，该组合物的有效成分是将铁牛七、芋儿七、金牛七、灯台七、追风七和太白三七粉碎后，与炼蜜按照1～5:1的质量比混合成丸。

6.一种抗肿瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按照质量份数计，将铁牛七10～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～20份和太白三七10～20份混合并粉碎后，加相当于药材量5～8倍的冷水浸泡1～2h；

2）浸泡结束后，煮沸30～60min，滤过；药渣加3～5倍质量水再次煎煮20～40min，滤过；合并两次煎出液，于水浴上浓缩至浸膏，每ml浸膏相当于药材量2～4g，得到水煎剂；

或者，按照以下步骤制备成丸剂：

1）按照质量份数计，将铁牛七10～20份、芋儿七10～20份、金牛七10～20份、灯台七10～20份、追风七10～20份和太白三七10～20份混合并粉碎后，过80目筛，收集得到药粉；

2）将蜂蜜于蒸发皿中加热至沸，炼至黏稠有光泽的程度，得到炼蜜；

3）将炼蜜与药粉按1:1～1:5的质量比例混合，得到软材，再将软材静置后制丸，得到抗肿瘤的中药丸剂。

7.如权利要求6所述的抗肿瘤的中药制剂的制备方法，其特征在于，以所制备的浸膏作为有效成分，添加辅料制成片剂或胶囊。

8.权利要求1所述的中药组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是促肿瘤细胞凋亡的药物。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物包括抗肺腺癌的药物、抗宫颈癌的药物、抗骨髓瘤的药物。

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