CN103487574A - 一种量子点标记免疫球蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米生物技术领域，具体为一种量子点标记免疫球蛋白的方法，包括清洗量子点、活化、二次清洗量子点、清洗免疫球蛋白、偶联和分离步骤。本发明利用了水溶性量子点的结构特征和EDC活化羧基的反应特点，以及缩合反应的反应特点，通过优化各个步骤的条件，使量子点表面的羧基得到充分的活化并处于合适的标记环境中；通过优化偶联步骤的条件，使量子点通过缩合反应均能结合到免疫球蛋白的表面，标记效率高。通过排阻层析分离纯化经偶联步骤所得的反应液，可回收未反应的免疫球蛋白继续进行标记，提高免疫球蛋白的利用率，节约成本。由本发明制备的蛋白-量子点偶联物的活性高，并且操作及使用的设备简单，可工业化放大生产。

Description

一种量子点标记免疫球蛋白的方法
技术领域
本发明涉及纳米生物技术领域，尤其涉及一种量子点标记免疫球蛋白的方法。
背景技术
量子点（QDs）是一种由一定数量的实际原子组成的聚集体，且三维尺寸均小于100nm的半导体化合物。量子点具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化和稳定性好等众多优点，在荧光检测领域具有取代传统有机荧光染料的潜力，已成为新一代生物荧光标记物。在各种免疫实验中，通过在蛋白上标记荧光分子以达到跟踪蛋白和检测蛋白含量为目的的方法已经被广泛应用。
2009年张国华等在《食品科学》(2009,Vol.30,No.12P254-257)发表了用水溶性量子点标记莱克多巴胺抗体的方法。申请号为201110451644.9的中国专利“一种定量检测人心急肌钙蛋白I的荧光免疫层析方法及其试剂盒”和申请号200810048733.7的中国专利“一种检测乳腺癌石蜡包埋组织抗原的量子点免疫荧光试剂盒”，分别提出了类似的量子点标记免疫球蛋白的方法。但是，这些文献的中仅描述了量子点标记蛋白的基本原理，仅适用于实验室科研中量子点的研究，不适于工业化放大生产。此外，现有的量子点标记蛋白的方法存在标记后活性大幅降低、蛋白原料损失过大，标记效率低等问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种可放大工业化生产的量子点标记免疫球蛋白的方法，且解决了免疫球蛋白标记后活性大幅降低、免疫球蛋白损耗大、效率低和成本高的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种量子点标记免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）清洗量子点：用pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液清洗量子点至保存量子点的原缓冲液完全除去，用pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液保存量子点并超滤浓缩。
所述pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L。
所述超滤浓缩为在20-25℃和5000-7000r/min的条件下，用100K的超滤管离心6-8min。
所述量子点为羧基水溶性量子点；所述羧基水溶性量子点为核壳型量子点或单一化合物形成的量子点。
所述核壳型量子点为ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点。
所述单一化合物为以下化合物中的任一种：第IIIA族元素和第VA族元素形成的化合物、第IIA族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IIB族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IVA族元素和第IVA族元素组成的化合物、第IVA族元素和第VIA族元素组成的化合物。具体地，所述单一化合物为GaSb、InAs、InP、InGaAs、InAlAs、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、SiC、SiGe、SiSe、SiTe和SiS中的任一种。
（2）活化：按比例分别称取EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），并将EDC和NHS直接加入步骤（1）所得的量子点溶液中，用振荡器混合5-8次后在23-25℃下反应50-70min，得活化量子点；所述EDC、NHS和量子点的物质的量之比为（20000-25000）：5000:1。优选地，EDC、NHS和量子点的摩尔比为25000：5000:1。优选地，在0-4℃且空气湿度小于或等于30%的条件下称取EDC和NHS，并将其迅速加入反应液中。更优选地，在0-4℃的冰盒中称取EDC和NHS。
（3）二次清洗量子点：用pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗步骤（2）所得活化量子点至EDC、NHS和磷酸盐缓冲液完全除去，用pH=8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存活化量子点并超滤浓缩，备用。
所述pH=8.5的硼酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L；所述超滤浓缩为在20-25℃和5000-7000r/min的条件下，用100K的超滤管离心6-8min。
（4）清洗免疫球蛋白：用pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗免疫球蛋白并超滤浓缩除去免疫球蛋白原保存液中的NaN3，用pH=8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存免疫球蛋白，备用。
所述pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L；所述超滤浓缩为在1-4℃和3000-5000r/min的条件下，用50K的超滤管离心8-10min。
（5）偶联：将步骤（3）所得活化量子点溶液与步骤（4）所得免疫球蛋白溶液混合均匀，在23-25℃及不断摇动下反应5-7h，得蛋白-量子点偶联物反应液；活化量子点与免疫球蛋白的摩尔比为1:8-10。优选地，活化量子点与免疫球蛋白的摩尔比为1:10，活化量子点的浓度为0.8μmol/L。
（6）分离：通过排阻层析分离步骤（5）的反应液得蛋白-量子点偶联物溶液和免疫球蛋白回收液；蛋白-量子点偶联物溶液经超滤浓缩后加入封闭液并在4℃下保存；免疫球蛋白回收液经超滤浓缩后回收再利用。排阻层析中使用的排阻层析柱的填料为superdex200或Sephacryl300，流速为1.5ml/min，柱长为40-60cm。所述封闭液为Gly封闭液，Gly的浓度为1mg/mL，溶剂为50mmol/L、pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液。
步骤（6）中浓缩后的蛋白-量子点偶联物溶液中加入NaN3，使蛋白-量子点偶联物溶液中NaN3的浓度为0.01-0.05mg/mL，以使蛋白-量子点偶联物溶液可长期保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用了水溶性量子点的结构特征和EDC活化羧基的反应特点，以及缩合反应的反应特点，通过优化各个步骤的条件，使量子点表面的羧基得到充分的活化并处于合适的标记环境中；通过优化偶联步骤的条件，使量子点通过缩合反应均能结合到免疫球蛋白的表面，标记效率高。通过排阻层析分离纯化经偶联步骤所得的反应液，可回收未反应的免疫球蛋白继续进行标记，提高免疫球蛋白的利用率，节约成本。由本发明制备的蛋白-量子点偶联物的活性高，并且操作及使用的设备简单，可工业化放大生产。
附图说明
图1为毛细管电泳鉴定实施例1-3的量子点标记效率；
图2为实施例2制备的PCT-QDs放置不同时间后的荧光光谱图；
图3为毛细管电泳鉴定实施例5的量子点标记效率。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
实施例1
选用荧光波长为525nm的CdTe/ZnS核壳型量子点标记降钙素原（Procalcitonin，PCT）抗体。
（1）清洗量子点：取10μL8μmol/mL的CdTe/ZnS核壳型量子点于EP（eppendorf）管中，并向EP管中加入2mL10mmol/L，pH=7.2磷酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在5000r/min，25℃条件下离心6min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，并使最后一次量子点溶液的总体积不超过50μL。用微量pH计检测量子点溶液的pH并调节pH值至7.2。
（2）活化：在湿度小于或等于30%及0-4℃的冰盒中称取2mmol的EDC和0.5mmol的NHS并迅速加入经步骤（1）所得的量子点溶液中，用涡旋振荡器震荡均匀后置于摇床上反应50min，反应温度为23℃，得活化量子点溶液。
（3）二次清洗量子点：向步骤（2）的活化量子点溶液中加入2mL50mmol/L、pH=8.3的硼酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在5000r/min、20℃条件下离心6min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，使最后一次活化量子点溶液的总体积不超过200μL。用微量pH计检测活化量子点溶液的pH并调节pH值至8.3。
（4）清洗免疫球蛋白：取0.8μmol的PCT抗体于EP管中，加入2mL50mmol/L、pH=8.3硼酸盐缓冲液，混匀后用50K超滤管在3000r/min、1℃条件下离心8min。重复以上步骤三次，使最后一次PCT抗体溶液总体积不超过50μL。用微量pH计检测PCT抗体溶液的pH并调节pH值至8.3。
（5）偶联：将步骤（3）的活化量子点溶液与步骤（4）的PCT抗体溶液混合，混匀后置于摇床上反应5h，反应温度23℃，得PCT抗体-QDs反应液，PCT抗体-QDs简称PCT-QDs。用毛细管电泳检测量子点和PCT抗体的偶联情况，如图1所示。
（6）分离：通过排阻层析分离步骤（5）的PCT-QDs反应液，得PCT-QDs溶液和PCT回收溶液。排阻层析柱的填料为superdex200，流速为1.5mL/min，凝胶长40cm。
用100K超滤管将PCT-QDs溶液超滤浓缩至200μL以内，测PCT-QDs溶液的浓度后向其加入Gly（甘氨酸）浓度为1mg/mL的Gly封闭液，然后置于4℃下保存；需长期保存时，还需向其中加入NaN3，使蛋白-量子点偶联物溶液中NaN3的浓度为0.05mg/mL，严禁冻存。将PCT回收液置于EP管中后，用50K超滤管在3000r/min，4℃条件下离心10min，检测浓度后可再次用于相同量子点的标记。
Gly封闭液的溶剂为50mmol/L、pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液。
实施例2
（1）清洗量子点：取10μL8μmol/mL的CdTe/ZnS核壳型量子点于EP管中，并向EP管中加入2mL10mmol/L，pH=7.5磷酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在8000r/min，25℃条件下离心8min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，并使最后一次量子点溶液的总体积不超过50μL。用微量pH计检测量子点溶液的pH并调节pH值至7.5。
（2）活化：在湿度小于或等于30%及0-4℃的冰盒中称取2.5mmolEDC和0.5mmolNHS并迅速加入经步骤（1）所得的量子点溶液中，用涡旋振荡器震荡均匀后置于摇床上反应80min，反应温度为25℃，得活化量子点溶液。
（3）二次清洗量子点：向步骤（2）的活化量子点溶液中加入2mL50mmol/L、pH=8.5的硼酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在8000r/min、25℃条件下离心8min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，使最后一次活化量子点溶液的总体积不超过200μL。用微量pH计检测活化量子点溶液的pH并调节pH值至8.5。
（4）清洗免疫球蛋白：取0.8μmol的PCT抗体于EP管中，加入2mL50mmol/L、pH=8.5硼酸盐缓冲液，混匀后用50K超滤管在5000r/min、4℃条件下离心10min。重复以上步骤三次，使最后一次PCT抗体溶液总体积不超过50μL。用微量pH计检测PCT抗体溶液的pH并调节pH值至8.5。
（5）偶联：将步骤（3）的活化量子点溶液与步骤（4）的PCT抗体溶液混合，混匀后置于摇床上反应7h，反应温度25℃，得PCT抗体-QDs反应液，PCT抗体-QDs简称PCT-QDs。用毛细管电泳检测量子点和PCT抗体的偶联情况，如图1所示。
（6）分离：通过排阻层析分离步骤（5）的PCT-QDs反应液，得PCT-QDs溶液和PCT回收溶液。排阻层析柱的填料为superdex200，流速为1.5mL/min，凝胶长60cm。
用100K超滤管将PCT-QDs溶液超滤浓缩至200μL以内，测PCT-QDs溶液的浓度后向其加入Gly浓度为1mg/mL的Gly封闭液，然后置于4℃下保存；长期保存时，还需向其中加入NaN3，使蛋白-量子点偶联物溶液中NaN3的浓度为0.05mg/mL，严禁冻存。将PCT回收液置于EP管中后，用50K超滤管在3000r/min，4℃条件下离心10min，测定浓度后可再次用于相同量子点的标记。
实施例3
本实施与实施例1和2的不同之处在于：采用说明书中关键参数范围外的标记条件进行标记，标记效率显著下降。
（1）清洗量子点：取10μL，8μmol/mL的CdTe/ZnS核壳型量子点于EP管中，并向EP管中加入2mL，10mmol/L，pH=7.4磷酸盐缓冲液，混匀后用100K超滤管在7000r/min，25℃条件下离心8min，回收量子点于EP管中。重复以上步骤三次，并使最后一次量子点溶液的总体积不超过50μL。用微量pH计检测量子点溶液的pH并调节pH值至7.5。
（2）活化：在湿度小于或等于30%及0-4℃的冰盒中称取2.5mmolEDC和0.5mmolNHS并迅速加入经步骤（1）所得的量子点溶液中，用涡旋振荡器震荡均匀后置于摇床上反应80min，反应温度为25℃，得活化量子点溶液。
（3）偶联：将步骤（2）的活化量子点溶液与PCT抗体溶液混合，混匀后置于摇床上反应7h，反应温度23-25℃，得PCT抗体-QDs反应液，PCT抗体-QDs简称PCT-QDs。用毛细管电泳检测量子点与PCT抗体的偶联情况，如图1所示。
实施例4
本实施与实施例1的不同之处在于：量子点选用荧光波长为650nm的GaSb。
实施例5
本实施与实施例1的不同之处在于：实施例1中的各物质的用量均放大5000倍。用毛细管电泳检测量子点与PCT抗体的偶联情况，如图3所示。
验证实验：
通过毛细管电泳鉴定实施例1、2和3制备的PCT-QDs的量子点标记效率，检测结果如图1所示。实施例3制备PCT-QDs的方法，QDs的峰面积最大，明显大于实施例1和实施例2的峰面积。即实施例1和实施例2的方法制备PCT-QDs，量子点与免疫球蛋白的标记率高；实施例3的方法制备PCT-QDs，量子点残留量大。通过公式PCT-QDs/（PCT-QDs+QDs）计算实施例1-3的量子点标记效率，实施例1的标记效率为98.4%，实施例2的标记效率为97.7%，实施例3的标记效率为81.2%。
用荧光分光光度计分别检测实施例1制备的纯化后PCT-QDs在放置5min、1h、24h、3d、10d和30d时的荧光光谱，检测结果如图2所示，图中1为QDs的曲线;2为QDs-PCT，5min的曲线;3为QDs-PCT，1h的曲线;4为QDs-PCT，3h的曲线；5为QDs-PCT，10d的曲线；6为QDs-PCT，30d的曲线。放置不同时间段的PCT-QDs的荧光轻度峰值有降低的趋势，但变化很慢，表明所得PCT-QDs比较稳定。
通过毛细管电泳鉴定实施例5放大5000倍制备的PCT-QDs的量子点标记效率，检测结果如图3所示，QDs的峰面积较小。由此可见，即使放大5000倍进行制备，本方法仍然保持很高的标记效率。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (10)

1.一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）清洗量子点：用pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液清洗量子点至保存量子点的原缓冲液除去，并用pH=7.2-7.5的磷酸盐缓冲液保存量子点；所述量子点为羧基水溶性量子点；
（2）活化：向步骤（1）所得的量子点溶液中加入EDC和NHS并混合均匀，在23-25℃下反应50-70min得活化量子点；所述EDC、NHS和量子点的物质的量之比为20000-25000：5000:1；
（3）二次清洗量子点：用pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗步骤（2）所得活化量子点至EDC、NHS和磷酸盐缓冲液除去，并用pH=8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存活化量子点，备用；
（4）清洗免疫球蛋白：用pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液清洗免疫球蛋白并超滤浓缩除去免疫球蛋白原保存液中的NaN3，用pH=8.3-8.5硼酸盐缓冲液保存免疫球蛋白，备用；
（5）偶联：将步骤（3）所得活化量子点溶液与步骤（4）所得免疫球蛋白溶液混合均匀，在23-25℃反应5-7h得反应液；活化量子点与免疫球蛋白的摩尔比为1:8-10；
（6）分离：通过排阻层析分离步骤（5）的反应液得蛋白-量子点偶联物溶液和免疫球蛋白回收液；蛋白-量子点偶联物溶液经超滤浓缩后加入封闭液并在4℃下保存；免疫球蛋白回收液经超滤浓缩后回收再利用。
2.根据权利要求1所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（6）中浓缩后的蛋白-量子点偶联物溶液中还加入NaN3，使蛋白-量子点偶联物溶液中NaN3的浓度为0.01-0.05mg/mL。
3.根据权利要求1所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，EDC、NHS和量子点的摩尔比为25000：5000:1。
4.根据权利要求1所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，活化量子点与免疫球蛋白的摩尔比为1:10。
5.根据权利要求4所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，活化量子点的浓度为0.8μmol/L。
6.根据权利要求5所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，活化量子点溶液与免疫球蛋白溶液混合后在不断摇动中反应。
7.根据权利要求1所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，排阻层析柱的填料为superdex200或Sephacryl300，流速为1.5ml/min，柱长为40-60cm。
8.根据权利要求1所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述封闭液为Gly封闭液，Gly的浓度为1mg/mL，溶剂为50mmol/L、pH=8.3-8.5的硼酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述羧基水溶性量子点为核壳型量子点或单一化合物形成的量子点。
10.根据权利要求9所述一种量子点标记免疫球蛋白的方法，其特征在于，所述核壳型量子点为ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点；所述单一化合物为以下化合物中的任一种：第IIIA族元素和第VA族元素形成的化合物、第IIA族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IIB族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IVA族元素和第IVA族元素组成的化合物、第IVA族元素和第VIA族元素组成的化合物。
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