CN103484561A - 一种核酸单分子检测方法 - Google Patents

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赵琳
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Abstract

本发明公开了一种核酸单分子检测方法，包括以下检测步骤：步骤1使用基于全内反射的荧光倒置显微镜对样本小皿进行实时观察，所述样本小皿的内腔表面覆盖有标记了荧光受体分子的寡核苷酸；步骤2从样本小皿的进口注入修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针和待测样本核苷酸；步骤3用激发荧光供体分子的特定光谱的光对成像面的荧光供体分子进行激发；步骤4用基于全内反射的荧光倒置显微镜的EMCCD相机对荧光受体分子发出的特定光谱的光进行成像记录。使用这种检测方法，可以对核酸分子进行定量检测，也可以对单个核酸分子进行跟踪观察。

Description

一种核酸单分子检测方法
技术领域
本发明涉及生物学检测技术，特别是涉及一种核酸单分子检测方法。
背景技术
基因芯片Microarray技术将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列。但是传统的基因芯片技术无法定量检测，也无法观察单个核酸分子的构象变化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的缺点，提供一种一种核酸单分子检测方法。该方法的检测步骤为：
步骤1使用基于全内反射的荧光倒置显微镜对样本小皿进行实时观察，所述样本小皿的内腔表面覆盖有标记了荧光受体分子的寡核苷酸；
步骤2从样本小皿的进口注入修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针和待测样本核苷酸；
步骤3用激发荧光供体分子的特定光谱的光对成像面的荧光供体分子进行激发；
步骤4用基于全内反射的荧光倒置显微镜的EMCCD相机对荧光受体分子发出的特定光谱的光进行成像记录。
这样，由于基于全能反射的荧光倒置显微镜只能激发样品表面，能够有效的排除更多干扰的背景，也使得悬浮于溶液中的荧光供体分子不会被激发而发出荧光。而样本小皿的内腔表面覆盖有标记了荧光受体分子的寡核苷酸，也不会被激发供体所用的特定光谱的光激发，EMCCD相机此时并不会记录到荧光受体分子发出的荧光。当加入修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针和待测样本核苷酸，如果待测样本核苷酸中有目标核苷酸的话，那么标记了荧光受体分子的寡核苷酸以及修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针就会和目标核苷酸特异性结合，形成稳定的双链结构，并稳定的固定在内腔玻璃的表面上。此时荧光供体分子被激发，发出短波长的荧光，短波长的荧光又进一步激发荧光受体分子，使荧光受体分子发出长波长的荧光，并被EMCCD相机接收。
本发明进一步限定的技术方案是：
前述的核酸单分子检测方法，其中，标记了荧光受体分子的寡核苷酸以及修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针与待测样本核苷酸中的目标核苷酸互补，且互补以后供体荧光分子与受体分子之间的距离处于能量共振转移效率最高的距离附近。
前述的核酸单分子检测方法，其中，样本小皿包括底板和玻璃盖板，底板与盖板之间连接并形成一个以上的腔室，每个腔室靠近底板的一面开有与外界连通的进口与出口。
前述的核酸单分子检测方法，其中，内腔的玻璃盖板表面上非特异性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特异性结合有亲和素，亲和素上特异性结合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上标记有Cy5荧光分子。
本发明的有益效果是：(1)本发明的样本小皿以及修饰有供体荧光分子的寡核苷酸探针事先准备好，检测时无需对待测样本核苷酸进行标记；(2)本发明利用了基于全内反射的荧光倒置显微镜的优点和特点，只激发样本小皿表面，悬浮液样本小皿内腔溶液中的荧光分子不会被激发，对检测没有干扰；(3)本发明可以实现对核酸的定量检测，也可以追踪单个核酸分子的状态和变化。
附图说明
图1为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿的宏观结构爆炸图
图2为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿的宏观结装配炸图
图3为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图a
图4为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图b
图5为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图c
图6为本发明的用于核酸单分子检测的样本小皿内腔玻璃表面微观结构图d
载玻片1，盖玻片2，内腔3，进口4，出口5，小管6，双面胶7，生物素化的牛血清蛋白8，亲和素9，生物素化的寡核苷酸10，Cy5荧光分子11，寡核苷酸12，Cy3染料分子13，待测样本核苷酸14
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种核酸单分子检测方法，选取的荧光对是Cy3和Cy5，并用532nm的激光对供体荧光分子进行激发，其中Cy3是供体荧光分子，Cy5是受体荧光分子。
首先是实验室环境中的样品制备，结合图1和图2，在载玻片1上钻两个直径在0.6至1毫米的孔，作为样本小皿的进口4和出口5，溶液最终都是通过进口4和出口5流进和流出的。进口4和出口5是相对的，取决于从哪个孔注入液体。
接着对载玻片1和盖玻片2进行清洗。一种优选的清洗方案为：先于10％的Alconox清洗剂中超声清洗20min，再于水中超声清洗5min，再于丙酮中超声清洗15min，然后于1mol／L的KOH中超声清洗20min，最后用去离子水漂洗载玻片1。清洗完毕后还可选择性的使用丙烷喷枪燃烧成像面，目的是为了去除残余的荧光有机分子。
接着对载玻片1和盖玻片2进行组装，取两段双面胶7粘贴于干净的载玻片1上，双面胶7间留有4至6毫米的狭缝，进口4和出口5位于狭缝之间，再将干净的盖玻片2贴于双面胶7另一面，形成一个通道，用环氧基树脂将通道的两端封口，从而形成样本小皿的内腔。载玻片1的出口5上还可以用环氧基树脂粘合一个小管6，小管6的作用是便于内腔3中的液体导出。
接着要在内腔中形成被生物素化的牛血清蛋白8包被的表面。结合图3至图5，一种优选的方案为：首先制备1mg／ml的溶解于缓冲液T50中的生物素化的牛血清蛋白8，并注入小皿的内腔中，放置4-6min，生物素化的牛血清蛋白8会非特异性的吸附于内腔表面；接着往内腔中流入100μl缓冲液T50，将没有非特异性吸附于内腔中的生物素化的牛血清蛋白8洗脱；接着将0.2mg／ml的溶于缓冲液T50中的亲和素9注入内腔中，静置1分钟；接着往内腔中流入100μl缓冲液T50，将没有特异性结合于生物素化的牛血清蛋白8上的亲和素9洗脱；最后将30μl被Cy5荧光分子11标记的生物素化的寡核苷酸10注入到内腔中，生物素化的寡核苷酸10会与亲和素9特异性结合。
使用基于全内反射的荧光倒置显微镜(如Olympus的IX81显微镜)对样本小皿进行观察，由于基于全内反射的荧光倒置显微镜只能激发样品表面，能够有效的排除更多干扰的背景，也使得悬浮于溶液中的荧光供体分子不会被激发而发出荧光。而样本小皿的内腔表面覆盖有标记了荧光受体分子的寡核苷酸，也不会被激发供体所用的特定光谱的光激发，EMCCD相机此时并不会记录到荧光受体分子发出的荧光。当加入修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针和待测样本核苷酸，如果待测样本核苷酸中有目标核苷酸的话，那么标记了荧光受体分子的寡核苷酸以及修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针就会和目标核苷酸特异性结合，形成稳定的双链结构，并稳定的固定在内腔玻璃的表面上。此时荧光供体分子被激发，发出短波长的荧光，短波长的荧光又进一步激发荧光受体分子，使荧光受体分子发出长波长的荧光，并被EMCCD相机接收。我们用532nm的激光激发成像面。此时Cy5荧光分子11并不会被激发发光。再从进口4中注入溶于缓冲液T50的被Cy3荧光分子标记的寡核苷酸和待测样本核苷酸。被Cy5荧光分子11标记的生物素化的寡核苷酸10、被Cy3荧光分子13标记的寡核苷酸12和待测样本核苷酸三者之间的关系为：Cy5荧光分子11标记的生物素化的寡核苷酸10与被Cy3荧光分子13标记的寡核苷酸12都与待测样本核苷酸14互补，如图6所示。所以当三者相结合后，Cy3荧光分子13会被532nm激光激发发光，所发射的荧光会进一步激发Cy5荧光分子11发光，从而实现对寡核苷酸的检测。
特别的，悬浮于内腔溶液中的修饰有Cy3荧光分子的寡核苷酸有时会进入被激光激发的表面，但是如果其没有同固定于内腔表面的标记有Cy5荧光分子的寡核苷酸以及目标核苷酸特异性结合，那么它很快又会飘走。虽然Cy5荧光分子有可能被这种一闪而过的Cy3荧光分子发出的光激发，但是由于其没有固定于内腔表面，这种荧光也是在EMCCD相机所成的图像中也是一闪而过，后续对图像的分析中可以对这种荧光光点不做考虑。

Claims (5)

1.一种核酸单分子检测方法，其特征在于：包括以下检测步骤：
步骤1使用基于全内反射的荧光倒置显微镜对样本小皿进行实时观察，所述样本小皿的内腔表面覆盖有标记了荧光受体分子的寡核苷酸；
步骤2从样本小皿的进口注入修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针和待测样本核苷酸；
步骤3用激发荧光供体分子的特定光谱的光对成像面的荧光供体分子进行激发；
步骤4用基于全内反射的荧光倒置显微镜的EMCCD相机对荧光受体分子发出的特定光谱的光进行成像记录。
2.根据权利要求1所述的核酸单分子检测方法，其特征在于：标记了荧光受体分子的寡核苷酸以及修饰有荧光供体分子的寡核苷酸探针与待测样本核苷酸中的目标核苷酸互补，且互补以后供体荧光分子与受体分子之间的距离处于能量共振转移效率最高的距离附近。
3.根据权利要求1或2所述的核酸单分子检测方法，其特征在于：样本小皿包括底板和玻璃盖板，底板与盖板之间连接并形成一个以上的腔室，每个腔室靠近底板的一面开有与外界连通的进口与出口。
4.根据权利要求3所述的核酸单分子检测方法，其特征在于：内腔的玻璃盖板表面上非特异性吸附有生物素化的牛血清蛋白，生物素化的牛血清蛋白上特异性结合有亲和素，亲和素上特异性结合在生物素化的寡核苷酸的一端，生物素化的寡核苷酸的另一端上标记有Cy5荧光分子。
5.根据权利要求4所述的核酸单分子检测方法，其特征在于：腔室的形状为长方形，进口与出口设置在长方形相互远离的两端；长方形的宽为4至6毫米，长方形的高为0.1至0.2毫米，长方形的长为10至30毫米。
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