CN103483258A

CN103483258A - 一种格尔德霉素类似物及其在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用

Info

Publication number: CN103483258A
Application number: CN201310479267.9A
Authority: CN
Inventors: 吴成柱; 刘浩; 赵晴; 李红梅; 赵素容; 霍强
Original assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Current assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明提供一种格尔德霉素类似物及其在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，17-去甲氧基莱布斯他汀，分子量：518.64，分子式：C₂₈H₄₂O₇。本发明提供的17-去甲氧基莱布斯他汀在制备临床抗肿瘤药物中的应用，可按本制剂领域已知方法制成肠道或飞肠道组合药的剂型，制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。本发明提供的17-去甲氧基莱布斯他汀毒性低，该化合物作用的靶点为Hsp90，能有效控制肿瘤发展、转移，具有很好临床抗肿瘤药的应用前景。

Description

一种格尔德霉素类似物及其在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用

技术领域

本发明属于天然化合物领域，具体涉及一种格尔德霉素类似物及其在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用。

背景技术

肿瘤的侵袭转移作为恶性肿瘤的重要生物学特征，是困扰临床治疗的主要因素之一，也是临床上治愈肿瘤要攻克的最大难题。近年来研究表明，从天然产物中寻找高效、低毒的抗侵袭转移药物是提高临床疗效的关键。

热休克蛋白90(heat shock protein90,Hsp90)作为分子伴侣蛋白调节众多信号蛋白的构象成熟和稳定性，在细胞生长、分化、凋亡、癌变和肿瘤的发展等方面发挥着重要作用，已成为了目前抗肿瘤药物研发的重要靶点之一（Sankhala KK,Mita MM,Mita AC,Takimoto CH.Heat shock proteins:a potential anticancer target.Curr Drug Targets2011,12(14),2001-2008.）。已超过200种蛋白被确定为Hsp90的客户蛋白，其中包括跨膜酪氨酸激酶受体(Her-2)、血管内皮生长因子受体、蛋白激酶B（Akt）、突变信号蛋白(v-Src、p53)和基质金属蛋白酶（MMPs）等，Hsp90在肿瘤发生、转移的信号通路中起重要作用。

当前在多种生物学背景下探究Hsp90抑制剂，其中可通过抑制Hsp90活性，获得一个对于多个方面病况或病症的治疗效应。

格尔德霉素(geldanamycin，GA)是含有大环内酰胺的包含苯醌的安莎霉素家族成员，最初是从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中分离得到的天然产物。GA杀死肿瘤细胞的纳摩尔效应和表观选择性，以及其在哺乳动物细胞中的主要标靶是Hsp90的发现已激起研发其作为抗癌药物的兴趣。然而，GA溶解性极低且给予格尔德霉素的相关肝毒性导致研发可批准用于治疗应用的药剂较为困难。

近年来，许多学者为降低GA肝毒性和增强生物利用度进行了比较广泛的结构改造，并取得了一定成果。分子生物学研究表明，GA的苯醌结构容易转变成活泼的氢醌形式以及其苯醌结构的C-19位与谷胱甘肽相互作用并结合引导其细胞内消耗，引发具有苯醌结构GA衍生物的剂量限制性肝毒性（Cysyk RL,Parker RJ,Barchi JJ,Steeq PS,HartmanNR,Strong JM.Reaction of geldanamycin and C17-substituted analogues withglutathione:product identifications and pharmacological implications.Chem ResToxicol.2006,19(3),376-381.）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低肝毒性的格尔德霉素类似物。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

一种格尔德霉素类似物，17-去甲氧基莱布斯他汀，分子量：518.64，化学命名为：7(S)-(Carbamoyloxy)-11R,18-dihydroxy-6S,12S-dimethoxy-2,8,10S,14R-tetramethyl-22-azabicylo[16.3.1]docosa-20(21),2(E),8(E),18,20-pentaen-1-one，分子式：C₂₈H₄₂O₇，其化学结构式如下：

17-去甲氧基莱布斯他汀是一种从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus JCM4427)培养液中提取分离的一种天然产物，也是GA生合成过程中的关键中间产物。其结构特征是用苯环取代了GA中的苯醌结构，从而降低了其肝毒性。

本发明的另一个目的在于提供所述格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用。

本发明的关键之处是证明了17-去甲氧基莱布斯他汀通过调节PI3K/Akt信号通路和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases9,MMP9）蛋白表达，抑制肿瘤细胞的侵袭转移，从而证明17-去甲氧基莱布斯他汀具有较强的抑制肿瘤细胞侵袭转移的能力。

众多研究表明磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路与肿瘤细胞产生耐药和侵袭转移密切相关，PI3K/Akt信号通路可参与调控基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases2,MMP2）蛋白表达，从而调控乳腺癌细胞的侵袭转移（MorozevichGE,Kozlova NI,Cheglakov IB,Ushakova NA,Preobrazhenskaya MF,Berman AE.Implication of alpha5beta1integrin in invasion of drug-resistant MCF-7/ADR）。而Akt是细胞生存信号通路PI3K/Akt中的关键分子，它是Hsp90的客户蛋白之一，受Hsp90的调控。

细胞外基质(ECM)的降解是肿瘤侵袭转移的关键步骤之一,它主要依靠蛋白水解酶的作用，其中MMPs是最重要的一组酶类，而MMP9是MMPs中相对分子质量最大的，MMP9参与ECM的IV型、V型胶原和明胶的降解,在肿瘤的血管新生、浸润和转移等过程中扮演着非常重要的角色。在正常情况下，MMPs在体内与基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）保持着相对平衡，这种相对平衡决定着ECM的降解和聚集,从而影响恶性肿瘤的浸润和转移能力。通过抑制MMP9的活性，能够抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，而MMP9是Hsp90的客户蛋白之一，受Hsp90的调控。

本发明中17-去甲氧基莱布斯他汀的作用靶点是Hsp90，17-去甲氧基莱布斯他汀通过竞争性地结合Hsp90的N-末端ATP/ADP结构域，从而抑制Hsp90分子伴侣功能。

本发明的有益效果是：(1)17-去甲氧基莱布斯他汀可有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，且呈现浓度和时间依赖性；(2)17-去甲氧基莱布斯他汀抑制肿瘤细胞的侵袭转移，该化合物作用的靶点为Hsp90，能有效控制肿瘤发展、转移，具有临床应用前景；(3)17-去甲氧基莱布斯他汀毒性低，而目前临床所用的抗肿瘤药物大多数对人体有较大的毒性具有很好的临床抗肿瘤药的应用前景。

本发明所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，其中所述肿瘤为乳腺癌。

本发明所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，其中所述肿瘤是造血系统、内分泌系统、肺系统、肠胃系统、骨骼肌系统、生殖系统、中枢神经系统或泌尿系统的癌症。

本发明所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，可按本制剂领域已知方法与药物赋形剂或载体组合制成肠道或飞肠道组合药的剂型，制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。

制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。

附图说明

图1为MTT法检测不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖影响的线性图。

图2为划痕实验检测不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞后，划痕外貌在放大10X10倍的倒置显微镜照片；其中，对照为未加药组，给药组给药浓度依次为0.5、5、50μmol/l。

图3为Transwell小室法（迁移实验）检测不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞后，MDA-MB-231细胞在放大10X10倍的倒置显微镜照片；其中，对照为未加药组，给药组给药浓度依次为0.5、5、50μmol/l。

图4为图3中所述的不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力影响的直方图。

图5为Transwell小室法（侵袭实验）检测不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞后，MDA-MB-231细胞在放大10X10倍的倒置显微镜照片；其中，对照为未加药组，给药组给药浓度依次为0.5、5、50μmol/l。

图6为图5中所述的不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力影响的直方图。

图7为Western blotting（蛋白印迹）检测经不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理后的人乳腺癌MDA-MB-231细胞中MMP9,TIMP蛋白表达的显影。其中，对照为未加药组，给药组给药浓度依次为0.5、5、50μmol/l。

图8为Western blotting检测经不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理后的人乳腺癌MDA-MB-231细胞中Akt,p-AKt蛋白表达的显影。其中，对照为未加药组，给药组给药浓度依次为0.5、5、20、50μmol/l。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施例作进一步的描述，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

下面通过具体实施例对17-去甲氧基莱布斯他汀的制备进行说明。

实施例1

17-去甲氧基莱布斯他汀的制备及结构确定：

仪器与试剂：Bruker ARX-400核磁共振仪（德国Bruker公司）；ODS（100～200目，北京欧亚新技术公司）；硅胶（Kieselegel60,70～230目和230～400目，Merk公司）；薄层色谱板（硅胶60F₂₅₄,Merk公司）；所有试剂均为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）。

<1>.吸水链霉菌JCM4427的发酵：

吸水链霉菌JCM4427(Streptomyces groscopicus JCM4427)平板培养物，挖块接种于液体发酵培养基(淀粉2%，棉子饼粉0.5%，葡萄糖0.5%，玉米浆1.0%，酵母粉0.5%，CaCO₃0.2%)中，在28℃、160r/min(转/分钟)条件下，振荡培养7天。

<2>.17-去甲氧基莱布斯他汀的提取分离与纯化：

在上述条件下培养7天的吸水链霉菌JCM4427的发酵培养液，用同等体积乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液经旋转蒸发浓缩获得粗品。乙酸乙酯层浸膏实施硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇混合液梯度洗脱，分部收集，用薄层层析色谱(TLC)进行检测，合并馏分。馏分5(Fr.5)再经反相柱色谱(ODS)和制备型高效液相(ODS-C18柱，250X10mm，流动相为乙腈：水(30:70),4ml/min)，制备得到17-去甲氧基莱布斯他汀纯品。

<3>.17-去甲氧基莱布斯他汀的结构确定：

¹H-和¹³C-NMR数据见表1：(化合物溶于DMSO-d₆)。

表1：(化合物溶于DMSO-d6)

下面再通过具体实施例对17-去甲氧基莱布斯他汀抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用进行验证。17-去甲氧基莱布斯他汀通过调节PI3K/Akt信号通路和基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinases9,MMP9）蛋白表达，抑制肿瘤细胞的侵袭转移，从而证明17-去甲氧基莱布斯他汀具有较强的抑制肿瘤细胞侵袭转移的能力。

实施例2

MTT法检测17-去甲氧基莱布斯他汀对MDA-MB-231细胞增殖的影响：

该实验部分通过对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤作用进行效果评价。

(1)实验材料：

细胞株：人乳腺癌MDA-MB-231细胞来源于美国American Type Culture Collection(ATCC)公司。

试剂：17-去甲氧基莱布斯他汀，来自蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；DMEM培养液、二甲基亚砜(DMSO)、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；96孔培养板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELL LAB公司)，多功能酶标仪(美国BioTek公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

(2)方法：

细胞培养：将人乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于DMEM培养液中（含10%灭活胎牛血清，100IU/l青霉素，100μg/ml链霉素），放置于5%CO₂，37℃，饱和湿度环境下培养并传代。

MTT法：取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μL培养液中含有5000个细胞，于5%CO₂饱和湿度37℃培养箱中培养。培养24h后，按不同浓度处理17-去甲氧基莱布斯他汀，每个处理3个复孔，继续培养24、48、72h后每孔加入10μL浓度为5g·L^-1的MTT溶液继续孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO150μl，37℃孵育30min，微量振荡器振荡10min使结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm波长下检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率：细胞存活率/%=实验组A_570nm/对照组A_570nm×100%，绘制剂量效应曲线。以上实验重复3次。

(3)实验结果：见附图1，从结果可看出，17-去甲氧基莱布斯他汀在体外可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，其细胞毒性与药物浓度与作用时间成正比。

实施例3

划痕实验检测17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响：

恶性肿瘤的侵袭转移特性是导致患者病死的主要原因。该实验部分通过划痕实验检测化合物抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力。

(1)实验材料：

试剂：17-去甲氧基莱布斯他汀，来自蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；DMEM培养液、DMSO、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELL LAB公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

(2)方法：

细胞培养：同上。

划痕实验：将对数生长期的MDA-MB-231细胞制成单细胞悬液接种于24孔细胞培养板，每孔3×10⁵个细胞，培养24h，用无菌枪头沿孔中心划出一道“伤痕”，PBS冲洗干净，每孔加入含2%胎牛血清的DMEM高糖培养基500μL。实验分为对照组和药物处理组，处理24h后观察细胞向中间迁移的情况并拍照。

(3)实验结果：见附图2，从结果可看出，不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞24h后，可观察到该化合物在低浓度(0.5、5、50μmol/l)具有显著的抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。此结果说明该化合物具有抑制肿瘤细胞迁移的作用。

实施例4

Transwell小室法检测17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响：

该实验部分通过Transwell小室法检测化合物抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力。

(1)实验材料：

试剂：17-去甲氧基莱布斯他汀，来自蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；多聚甲醛购自美国Sigma公司；DMEM培养液、DMSO、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；Transwell购自Costar公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。

(2)方法：

细胞培养：同上。

Transwell小室法：取对数生长期MDA-MB-231细胞，消化离心，用含17-去甲氧基莱布斯他亭无血清培养基稀释细胞至5×10⁵/ml，每个Transwell小室中加入100μL，下室每孔加入含5%胎牛血清的DMEM高糖培养基600μL，培养24h后取出小室，用棉签擦去小室上层未迁移的细胞，4%多聚甲醛室温固定15min，0.1%结晶紫染色15min，各取5个400×视野显微镜下观察拍照。迁移抑制率/%=(1－实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100%。

(3)实验结果：见附图3和4，从结果可看出，不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞24h后，可观察到该化合物具有显著的抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。17-去甲氧基莱布斯他汀在不同浓度0.5、5、50μmol/l下，抑制MDA-MB-231细胞迁移能力依次为38%、59%、68%。此结果说明该化合物具有显著的抗肿瘤细胞迁移作用，并与药物浓度呈正比。

实施例5

Transwell小室法检测17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响：

肿瘤转移是个多步骤的复杂过程，而肿瘤细胞侵袭基膜是其中的首要环节。该实验部分通过Transwell小室，加入Matrigel(基膜的类似物)模拟体内的侵袭过程，观察化合物抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力。

(1)实验材料：

试剂：17-去甲氧基莱布斯他汀，来自蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；多聚甲醛购自美国Sigma公司；DMEM培养液、DMSO、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素、Matrigel基质蛋白购自Hyclone；Transwell购自Costar公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。

(2)方法：

细胞培养：同上。

Transwell小室法：每个Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜铺50μL Matrigel基质蛋白，药物处理36h，其余操作同细胞迁移实验。侵袭抑制率/%=（1－实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×100%。

(3)实验结果：见附图5和6，从结果可看出，不同浓度17-去甲氧基莱布斯他汀处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞36h后，可观察到该化合物具有显著的抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。17-去甲氧基莱布斯他汀在不同浓度0.5、5、50μmol/l下，抑制MDA-MB-231细胞迁移能力依次为37%、58%、78%。此结果说明该化合物具有显著的抗肿瘤细胞侵袭作用，并与药物浓度呈正比。

实施例6

Western blotting检测17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中MMP9,基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）蛋白表达的影响：

细胞外基质(ECM)的降解是肿瘤侵袭转移的关键步骤之一,主要依靠蛋白水解酶的作用，其中基质金属蛋白酶（MMPs）是最重要的一组酶类，MMPs是一族依赖锌离子和钙离子而降解各种ECM的蛋白水解酶，MMP9是MMPs中相对分子质量最大的，MMP9参与ECM的IV型、V型胶原和明胶的降解,在肿瘤的血管新生、浸润和转移等过程中扮演着非常重要的角色。在正常情况下，MMPs在体内与TIMPs保持着相对平衡，这种相对平衡决定着ECM的降解和聚集,从而影响恶性肿瘤的浸润和转移能力。目前研究已知TIMP1能特异性与MMP9形成不可逆的l:l非共价复合物,抑制MMP9的活性，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

(1)实验材料：

试剂：17-去甲氧基莱布斯他汀，来自蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；DMEM培养液、DMSO、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素、购自Hyclone；6孔板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司；兔抗人MMP9抗体(武汉博士德生物工程公司)；兔抗人TIMP(武汉博士德生物工程公司)；β-actin(美国Santa Cruz公司)；二抗(美国Santa Cruz公司)；ECL反应液(美国Santa Cruz公司)。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELL LAB公司)，倒置显微镜(日本OLYMPUS公司),凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)，电泳仪(美国BIO-RAD公司)，倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，超速离心机(美国Beckman)。

(2)方法：

Western blotting：调细胞浓度为2X10⁵/ml接种于6孔板，2ml/孔，24小时后开始给药。收集培养细胞，用冰PBS清洗后，滤纸吸干液体后加入细胞裂解液，200μl/孔，置冰上30分钟，细胞刮下，转移至EP管内80℃冻存，经3次反复冻融后BCA法定量。取蛋白提取物40μg，加入5X SDS上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝燃料到达凝胶最前沿，停止电泳。

转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transfer buffer中。同时取适当大小的PVDF膜和4张3M滤纸，将PVDF先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一起浸于Transferbuffer中，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒压60V，4℃层析柜中转膜2小时。

封膜：将转有蛋白的膜浸于含10%脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1:400稀释的兔抗人MMP9一抗(含5%脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)、1:300兔抗人TIMP一抗(含5%脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)中，在4℃过夜。TBST漂洗5分钟X5次，再浸于1：2000稀释的二抗(含5%脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)中，在室温1小时，TBST漂洗5分钟X4次。配制显色液(ECL A0.5ml,ECL B0.5ml)，放置凝胶成像系统中显色分析。

(3)实验结果：见附图7，从结果可看出，随着17-去甲氧基莱布斯他汀浓度的增加，MMP9蛋白质含量显著减少。泳道1：对照；泳道2：0.5μmol/l的17-去甲氧基莱布斯他汀；泳道3：5μmol/l的17-去甲氧基莱布斯他汀；泳道4：50μmol/l的17-去甲氧基莱布斯他汀。17-去甲氧基莱布斯他汀0.5-50μmol/l浓度时剂量依赖性地抑制MDA-MB-231细胞中MMP9的表达。与此同时基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP1在0.5,5μmol/l浓度时表达水平没有明显变化，但50μmol/l时TIMP1蛋白表达显著增加，可通过抑制MMP9活性，从而进一步抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭转移的能力。

实施例7

Western blotting检测17-去甲氧基莱布斯他汀对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中Akt,p-Akt蛋白表达的影响：

众多研究表明PI3K/Akt通路与肿瘤细胞侵袭转移密切相关，且与MMP2表达具有相关性。PI3K/Akt信号通路可参与调控MMP2表达，从而调控乳腺癌细胞的侵袭转移。Akt是细胞生存信号通路PI3K/Akt中的关键分子，然而其中PI3K信号通路中关键蛋白Akt可受Hsp90的调控，其被磷酸化形成p-Akt后才具有活性。

(1)实验材料：

试剂：17-去甲氧基莱布斯他汀，蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；DMEM培养液、DMSO、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素、购自Hyclone；6孔板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司；兔抗人AKt抗体(美国Cell signaling公司)；兔抗人p-Akt(美国Cell signaling公司)；β-actin(美国Santa Cruz公司)；二抗(美国Santa Cruz公司)；ECL反应液(美国Santa Cruz公司)。

(2)方法：

转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transfer buffer中。同时取适当大小的PVDF膜和4张3M滤纸，将PVDF先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一起浸于Transferbuffer中，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒压60V，4℃层析柜中转膜1.5小时。

封膜：将转有蛋白的膜浸于含10%脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1:2000稀释的兔抗人Akt(含5%脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)、1:1500兔抗人p-Akt一抗(含5%脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)中，在4℃过夜。TBST漂洗5分钟X5次，再浸于1：5000稀释的二抗(含5%脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)中，在室温1小时，TBST漂洗5分钟X4次。配制显色液(ECL A0.5ml,ECL B0.5ml)，放置凝胶成像系统中显色分析。

(3)实验结果：见附图8，从结果可看出，随着17-去甲氧基莱布斯他汀浓度的增加，Akt,磷酸化的蛋白激酶B（p-Akt）蛋白质含量显著减少。泳道1：50μmol/l的17-去甲氧基莱布斯他汀；泳道2：20μmol/l的17-去甲氧基莱布斯他汀；泳道3：2μmol/l的17-去甲氧基莱布斯他汀；泳道4：0.5μmol/l的17-去甲氧基莱布斯他汀；泳道5：对照。17-去甲氧基莱布斯他汀0.5-50μmol/l浓度时剂量依赖性地抑制MDA-MB-231细胞中Akt,p-Akt的表达。

以上实验充分证明了17-去甲氧基莱布斯他汀通过调节PI3K/Akt信号通路和MMP9可有效地抑制肿瘤细胞的侵袭转移，能够通过抑制肿瘤侵袭转移而发挥抗肿瘤作用。

Claims

1.一种格尔德霉素类似物，17-去甲氧基莱布斯他汀，分子量：518.64，化学命名为：7(S)-(Carbamoyloxy)-11R,18-dihydroxy-6S,12S-dimethoxy-2,8,10S,14R-tetramethyl-22-azabicylo[16.3.1]docosa-20(21),2(E),8(E),18,20-pentaen-1-one，分子式：C₂₈H₄₂O₇，其化学结构式如下：

2.如权利要求1所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用。

3.如权利要求2所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌。

4.如权利要求2所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤是造血系统、内分泌系统、肺系统、肠胃系统、骨骼肌系统、生殖系统、中枢神经系统或泌尿系统的癌症。

5.如权利要求2至4中任一项所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，其特征在于：17-去甲氧基莱布斯他汀与药物赋形剂或载体组成药物组合物，药物组合物的制剂形式主要包括液体制剂、片剂、颗粒剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。

6.如权利要求5所述的格尔德霉素类似物在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用，其特征在于：所述制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。