CN103468761A - 利用菜籽饼粕制备l-阿拉伯糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，具体步骤如下：将菜籽饼粕用体积分数为70～80%的乙醇溶液脱脂脱色，然后加水提取，过滤收集滤液和滤渣，将滤渣再用NaOH溶液提取，然后用HCl溶液将pH调至4.9～5.1，离心收集上清液，合并水提液和碱提液，得菜籽粗多糖；将所得菜籽粗多糖用大孔吸附树脂D3520层析柱纯化后进行醇沉，再用DE-52纤维素柱纯化，得菜籽阿拉伯聚糖，最后将菜籽阿拉伯聚糖发酵，并用甲醇沉淀得粗L-阿拉伯糖，再用重结晶法提纯得L-阿拉伯糖，制得的L-阿拉伯糖得率为3.35%，纯度为97.6%。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域，特别涉及利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法。
背景技术
L-阿拉伯糖是一种新型的低热量甜味剂，其典型的生理功能是降低肠道内蔗糖转化酶活性，对蔗糖的代谢转化具有显著阻断作用，已被应用于减肥、控制糖尿病等方面，是国际上公认的健康食品添加剂。同时，L-阿拉伯糖还用于治疗白血病、癌症以及抗乙肝的药物原料。目前，日本厚生省和美国食品药品监督管理局已经批准L-阿拉伯糖为食品和药品的健康添加剂；而美国医疗协会也已将L-阿拉伯糖列入抗肥胖剂的营养补充剂或非处方药；2008年5月，中华人民共和国卫生部批准L-阿拉伯糖为新资源食品。L-阿拉伯糖在食品行业的普及应用无疑将成为新的行业热点。目前，全世界L-阿拉伯糖年需求量大约为1万吨，每年还以15%的速度递增。但受原料供应、分离纯化技术的限制，产量上不去，价格居高不下。日本和欧美的市场销售价为10万-12万美元/吨。而在国内，生产L-阿拉伯糖的主要企业有11家，总产能在500吨/年，产量较低，价格也相当昂贵，因此限制了阿拉伯糖的应用，但市场前景极为看好。
菜籽饼粕是来源油菜籽榨油后的副产物。我国油菜籽产量居世界第一位，每年油菜籽制油后所产生的菜籽饼粕达600-700万吨。菜籽饼粕是一个可再生生物质资源库，其蕴含的半纤维素多糖，还含有含有丰富的蛋白质、酚类化合物、植酸、糖类物质等，而这些成分都具有较高利用价值，其中半纤维素多糖是由L-阿拉伯糖等多种单糖组成。目前，我国菜籽饼粕利用相当有限，仅用作肥料或按少量比例添加作反刍动物和淡水鱼养殖的饲料。国内外不少学者以菜籽饼粕为饲料，研究了其对鱼类、畜类及禽类等多种动物生长和生理生化等方面的影响。结果普遍表明，少量短时喂养对动物生长表现正常，但是大量长时喂养就会产生不利影响。直接原因是菜籽饼粕中含有多种抗营养因子及毒素，如硫代葡萄糖苷、芥酸、植酸、单宁、粗纤维、抗蛋白酶因子等，它们的存在影响了菜籽饼粕作为饲料的利用价值。但是如果这些成分能够分离出来并加以利用，将大大提高菜籽饼粕的附加值及综合利用率。如果将菜籽饼粕全部利用，每年可生产至少15万吨的L-阿拉伯糖，相当于目前全国L-阿拉伯糖总产量的300多倍。国内菜籽饼粕价格为2000元/吨，而L-阿拉伯糖的价格高达50万-80万元/吨，生产L-阿拉伯糖的同时，还可以得到饲用浓缩蛋白、植酸（盐）、多酚等产品。因此，急需一种利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，该方法的应用能够提高榨油副产物菜籽饼粕的附加值，拓宽制备L-阿拉伯糖的原材料，提高L-阿拉伯糖的总产量，降低其生产成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，其工艺简单，便于工业化生产。
为实现上述发明目的，技术方案为：
利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，包括如下步骤：
a.将菜籽饼粕加入体积分数为70～80%的乙醇溶液，然后在70～90℃下脱脂脱色，过滤收集滤渣，烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕；
b.将步骤a所得预处理菜籽饼粕加水在温度为90～100℃条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A；将滤渣加入质量分数为4%～6%的NaOH溶液中，在温度为55～65℃条件下提取，然后加入浓度为2～4mol/L HCl溶液将pH调至4.9～5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
c.将步骤b所得菜籽粗多糖用大孔吸附树脂D3520层析柱纯化，上样量相当于柱体积20～24倍，以流速为1.5～2.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35～40%，然后在转速为4000～6000r/min条件下离心15～20min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75～80%，再在转速为4000～6000r/min条件下离心15～20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48～72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；
e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用100mL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L的NaCl洗脱液，透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；
f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖中用质量分数为1.5～2.0%的硫酸酸解，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0～7.0，待反应液冷却至30～35℃时加入1.0～1.5g酵母，在30～35℃条件下发酵2～3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%～85%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤，得到粗L-阿拉伯糖；
g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为50%～60%，并调节pH至6.0～7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90～95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4℃下恒温结晶32～48小时，真空抽滤，45℃～55℃下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
优选的，所述步骤a是将菜籽饼粕按每克菜籽饼粕加入15～20mL体积分数为70～80%的乙醇溶液，然后在70～90℃下脱脂脱色2～3小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2～3次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕。
优选的，所述步骤a是将菜籽饼粕按每克菜籽饼粕加入20mL体积分数为80%的乙醇溶液，然后在80℃下脱脂脱色2小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕。
优选的，所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼粕按固液比为25～30mL/g加水，然后在温度为90～100℃条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A；将滤渣加入质量分数为4%～6%的NaOH溶液，再在温度为55～65℃条件下提取，然后加入浓度为2～4mol/L HCl溶液将pH调至4.9～5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
优选的，所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼粕按固液比为28mL/g加水，然后在温度为94℃条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A；将滤渣按料液质量体积比为20:1加入质量分数为5%的NaOH溶液，再在温度为60℃条件下提取2小时，然后加入浓度为4mol/L HCl溶液将pH调至5，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
优选的，所述步骤d是将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35%，然后在转速为4000r/min条件下离心15min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75%，再在转速为6000r/min条件下离心15min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品。
优选的，所述步骤f是将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入400mL质量分数为2.0%的硫酸，搅拌均匀，在温度为80℃条件下酸解5小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0，待反应液冷却至30℃时加入1.5g酵母，在30℃条件下发酵3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖。
优选的，所述步骤g是将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加50℃的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为60%，并调节pH至7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4℃下恒温结晶48小时，真空抽滤，45℃下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
更优选的，所述步骤c中，所述大孔吸附树脂D3520层析柱由以下方法制备，将大孔吸附树脂D3520用体积分数为90～95%乙醇浸泡24～48h，充分溶胀，再用无水乙醇提取8～12小时，然后湿法装柱，树脂裝至柱高2/3～3/4处，用体积分数为90～95%的乙醇洗至流出液加水不变白色浑浊，再用水洗尽乙醇，然后用质量分数为4%～6%的HCl溶液以4～6柱体积/h流速进行酸洗后浸泡2～4h，继续用水以4～6柱体积/h流速洗至中性，最后用质量分数为4%～6%NaOH溶液以4～6BV/h流速进行碱洗，用水洗至中性，得大孔吸附树脂层析柱。
更优选的，所述步骤e中，所述DE-52纤维素柱由以下方法制备：称取30g DE-52纤维素，用400～500mL浓度为0.5mol/L NaOH处理30～60min，抽滤，水洗至pH8～9；再以400～500mL浓度为0.4～0.6mol/L HCl处理30～60min，抽滤，水洗至pH6～7，然后以浓度为0.4～0.6mol/L NaOH处理后用湿法装柱法装柱而得。
本发明的有益效果在于：本发明公开了利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，利用水和碱液将菜籽饼粕中的菜籽多糖充分提取出来，然后过大孔吸附树脂D3520层析柱，利用大孔吸附树脂D3520的弱极性充分去除蛋白和色素，同时能够避免对多糖被大孔树脂吸附；因此获得的菜籽多糖收率高；将菜籽多糖采用分步醇沉，先用体积分数为35-40%的乙醇沉淀以去除杂质，然后再用质量分数为75-80%的乙醇沉淀将菜籽阿拉伯聚糖沉淀下来，然后过DE-52纤维素柱并用浓度为0.1mol/L的NaCl洗脱，将菜籽阿拉伯聚糖洗脱下来，最后采用酸解、酵母发酵、结晶等工艺，得到高纯度的L-阿拉伯糖。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的工艺路线图。
图2为菜籽阿拉伯聚糖浓缩物在DE-52纤维素柱上的洗脱曲线。
图3为乙酰酯衍生物气相色谱图（A：标准品色谱图；B：菜籽阿拉伯聚糖水解物色谱图、C：L-阿拉伯糖色谱图；1.L-鼠李糖；2.L-岩藻糖；3.L-阿拉伯糖；4.D-木糖；5.D-甘露糖；6.D-葡萄糖；7.D-半乳糖）。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
一、实验材料和仪器
菜籽饼粕由重庆市利农一把手农业科技有限责任公司提供；大孔吸附树脂D3520购自安徽三星树脂科技有限公司；DE-52纤维素购自英国Whatman公司；L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖购自美国Sigma-Aldrich公司；苯酚、硫酸、甲醇、氢氧化钠购自成都市科龙化工试剂厂；高活性干酵母购自安琪酵母股份有限公司。UV-9100型紫外可见分光光度计购自北京瑞利分析仪器公司；FA2004型电子天平购自上海恒平科学仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅购自金坛市富华仪器有限公司；ALPHA1-4/LD型真空冷冻干燥机购自德国Marin Christ公司；N6890型气相色谱分析仪购自美国Agilent公司。
二、分析方法
1、总糖含量测定方法
总糖含量的测定采用改良的苯酚-硫酸法。
2、阿拉伯糖含量测定方法
采用盐酸-地衣酚法。
3、多糖中单糖组成及纯度分析
采用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法（GC）测定单糖组分。
三、利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法
利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，其工艺路线如图1所示，具体步骤如下：
制备方法1：
a.将菜籽饼粕按每克菜籽饼粕加入20mL体积分数为80%的乙醇溶液，然后在80℃下脱脂脱色2小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕；
b.将步骤a所得预处理菜籽饼粕按固液比为28mL/g加水，然后在温度为94℃条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A；将滤渣按料液质量体积比为20:1加入质量分数为5%的NaOH溶液，再在温度为60℃条件下提取2小时，然后加入浓度为4mol/L HCl溶液将pH调至5，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
c.将步骤b所得菜籽粗多糖加入活化的24mm×600mm规格的大孔吸附树脂D3520层析柱，以去除溶液中的游离蛋白及酚类等色素物质，为了进一步纯化可以将重复此步骤3次，上样量相当于柱体积24倍，以流速为1.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35%，然后在转速为4000r/min条件下离心15min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75%，再在转速为6000r/min条件下离心15min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；以提取前菜籽粕质量计算，菜籽阿拉伯聚糖粗品得率分别为5.55%，其总糖含量为82%，蛋白质含量为4.7%；
e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用100mL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L的NaCl洗脱液（如图2所示），透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；其总糖含量为93%，阿拉伯聚糖含量为75%，蛋白质含量为2.8%；
f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入400mL质量分数为2.0%的硫酸，搅拌均匀，在温度为80℃条件下酸解5小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0，待反应液冷却至30℃时加入1.5g酵母，在30℃条件下发酵3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖；利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法（GC）测定粗L-阿拉伯糖，结果如图3所示。
g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加50℃的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为60%，并调节pH至7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4℃下恒温结晶48小时，真空抽滤，45℃下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法（GC）测定L-阿拉伯糖纯度，结果如图3所示。
结果表明，利用本发明制备的L-阿拉伯糖的纯度为97%，得率为3.0%。
制备方法2：
a.将菜籽饼粕按每克菜籽饼粕加入15mL体积分数为70%的乙醇溶液，然后在90℃下脱脂脱色3小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理3次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕；
b.将步骤a所得预处理菜籽饼粕按固液比为25mL/g加水，然后在温度为100℃条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取42次，合并4次滤液，记为提取液A；将滤渣按料液质量体积比为25:1加入质量分数为4%的NaOH溶液，再在温度为55℃条件下提取3小时，然后加入浓度为2mol/L HCl溶液将pH调至5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
c.将步骤b所得菜籽粗多糖加入活化的24mm×600mm规格的大孔吸附树脂D3520层析柱，以去除溶液中的游离蛋白及酚类等色素物质，为了进一步纯化可以将重复此步骤3次，上样量相当于柱体积24倍，以流速为3柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为40%，然后在转速为5000r/min条件下离心20min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为80%，再在转速为5000r/min条件下离心20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；以提取前菜籽粕质量计算，菜籽阿拉伯聚糖粗品得率为5.57%，其总糖含量为85%，蛋白质含量为4.3%；
e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用100mL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L的NaCl洗脱液（如图2所示），透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；其总糖含量为90.7%，阿拉伯糖含量为74%，蛋白质含量为2.6%；
f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入质量分数为1.5%的硫酸400mL，搅拌均匀，在温度为90℃条件下酸解4小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.5，待反应液冷却至34℃时加入1.0g酵母，在34℃条件下发酵2天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖；
g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加45℃的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为50%，并调节pH至6.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90%，加入L-阿拉伯糖晶体，4℃下恒温结晶32小时，真空抽滤，50℃下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法（GC）测定L-阿拉伯糖纯度，其纯度为98%，得率为2.93%。
制备方法3：
a.将菜籽饼粕按每克菜籽饼粕加入18mL体积分数为75%的乙醇溶液，然后在70℃下脱脂脱色2.5小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕；
b.将步骤a所得预处理菜籽饼粕按固液比为30mL/g加水，然后在温度为90℃条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A；将滤渣按料液质量体积比为15:1加入质量分数为6%的NaOH溶液，再在温度为65℃条件下提取2.5小时，然后加入浓度为3mol/L HCl溶液将pH调至4.9，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
c.将步骤b所得菜籽粗多糖加入活化的24mm×600mm规格的大孔吸附树脂D3520层析柱，以去除溶液中的游离蛋白及酚类等色素物质，为了进一步纯化可以将重复此步骤2次，上样量相当于柱体积18倍，以流速为2.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为40%，然后在转速为5000r/min条件下离心20min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为80%，再在转速为5000r/min条件下离心20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；以提取前菜籽粕质量计算，菜籽阿拉伯聚糖粗品得率分别为5.55%，其总糖含量不低于80%，蛋白质含量不高于5%；
e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用100mL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L的NaCl洗脱液（如图2所示），透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；其总糖含量为91.5%，阿拉伯聚糖含量为73.4%，蛋白质含量为2.86%；
f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入质量分数为1.8%的硫酸400mL，搅拌均匀，在温度为85℃条件下酸解4.5小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.5，待反应液冷却至35℃时加入1.2g酵母，在35℃条件下发酵2天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖；
g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加55℃的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为55%，并调节pH至6.5，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90%，加入L-阿拉伯糖晶体，4℃下恒温结晶32小时，真空抽滤，55℃下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。利用糖醇乙酰酯衍生物气相色谱法（GC）测定L-阿拉伯糖纯度，其纯度为98.7%，得率为2.6%。
本发明中，大孔吸附树脂D3520层析柱由以下方法制备，将大孔吸附树脂D3520用体积分数为90～95%乙醇浸泡24～48h，充分溶胀，再用无水乙醇提取8～12小时，然后湿法装柱，树脂裝至柱高2/3～3/4处，用体积分数为90～95%的乙醇洗至流出液加水不变白色浑浊，再用水洗尽乙醇，然后用质量分数为4%～6%的HCl溶液以4～6柱体积/h流速进行酸洗后浸泡2～4h，继续用水以4～6柱体积/h流速洗至中性，最后用质量分数为4%～6%NaOH溶液以4～6BV/h流速进行碱洗，用水洗至中性，得大孔吸附树脂D3520层析柱。
本发明中，DE-52纤维素柱由以下方法制备：称取30g DE-52纤维素，用400～500mL浓度为0.5mol/L NaOH处理30～60min，抽滤，水洗至pH8～9；再以400～500mL浓度为0.4～0.6mol/L HCl处理30～60min，抽滤，水洗至pH6～7，然后以浓度为0.4～0.6mol/LNaOH处理后用湿法装柱法装柱而得。
四、测定不同大孔吸附树脂的去杂质效果
将具有吸附色素和蛋白质能力的D101、D3520、D4020、DM130、DM301、D101、X-5等8种型号的大孔吸附树脂，做动态吸附试验。装24mm×250mm层析柱，填料柱体积40mL。加入50mL步骤b提取的菜籽粗多糖过柱，流速1mL/min，收集液定容至100mL。测定动态吸附前后色素和蛋白质的含量。色素的测定以溶液在420nm处的吸光度表示，蛋白质的测定采用考马斯亮蓝染色法。
脱色率的测定方法：样品溶液采用1M HCl溶液和1M NaOH溶液调pH至7.0，以5000rpm/min转速离心20min，然后采用可见分光光度计在420nm测定吸光值。脱色率的计算公式如下：
脱色率(%)=(A1-A2)/A1×100
式中A1、A2分别是样品溶液在大孔吸附树脂吸附前后的吸光值，结果如表1所示。
表1不同树脂对菜籽多糖提取液中色素的动态吸附性能比较
| 树脂型号 | 吸附前420nm波长处吸光度 | 吸附后420nm波长处吸光度 | 脱色率% |
| D101 | 1.168 | 0.426 | 63.53 |
| D3520 | 1.168 | 0.369 | 68.41 |
| D4020 | 1.168 | 0.613 | 47.52 |
| DM130 | 1.168 | 0.474 | 59.42 |
| DM301 | 1.168 | 0.530 | 54.62 |
| D101 | 1.168 | 0.452 | 61.30 |
| X-5 | 1.168 | 0.498 | 58.05 |
由表2可知，使用大孔树脂D3520层析效果最佳。
蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白作为标准品。
蛋白质脱除率的计算公式如下：
蛋白质脱除率(%)=(C1-C2)/C1×100
式中C1和C2分别是通过大孔吸附树脂前后溶液的蛋白质的浓度（mg/mL），计算结果如表2所示。
表2不同树脂对菜籽多糖提取液中蛋白质的动态吸附性能比较
| 树脂型号 | 吸附前（mg） | 吸附后（mg） | 吸附量（mg/L） | 吸附率（%） |
| D101 | 37.05 | 11.93 | 25.12 | 67.80 |
| D3520 | 37.05 | 6.03 | 31.02 | 83.72 |
| D4020 | 37.05 | 15.82 | 21.23 | 57.30 |
| DM130 | 37.05 | 13.35 | 23.70 | 63.97 |
| DM301 | 37.05 | 12.61 | 24.44 | 65.96 |
| D101 | 37.05 | 7.13 | 29.92 | 80.75 |
| X-5 | 37.05 | 10.82 | 26.23 | 70.79 |
由表2可知，使用大孔树脂D3520吸附对蛋白的吸附效果最好。
多糖浓度的测定采用苯酚硫酸法，以葡萄糖作为标准品。多糖回收率的计算公式如下：
多糖回收率(%)=C4/C3×100
式中C3和C4分别是分别是通过大孔吸附树脂前后溶液的多糖的浓度（mg/mL），计算结果如表3所示：
表3菜籽多糖在不同树脂动态吸附中的回收率
| 树脂型号 | 吸附前（mg） | 吸附后（mg） | 回收率（%） |
| D101 | 87.90 | 56.08 | 63.8 |
| D3520 | 87.90 | 86.32 | 98.2 |
| D4020 | 87.90 | 57.66 | 65.6 |
| DM130 | 87.90 | 51.26 | 58.32 |
| DM301 | 87.90 | 53.20 | 60.52 |
| D101 | 87.90 | 56.08 | 63.80 |
| X-5 | 87.90 | 53.34 | 60.68 |
由表3可知，使用大孔树脂D3520吸附多糖的回收率最高。
由此可知，选用大孔树脂D3520吸附，具有较好的脱色效果和去蛋白效果，同时还能保证多糖的回收率。
五、测定不同浓度乙醇沉淀效果
将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数分别为40%和80%，然后检测沉淀得到菜籽多糖中各组分的含量。其中戊聚糖浓度的测定采用地衣酚-盐酸法，以L-阿拉伯糖作为标准品。戊聚糖含量的计算公式如下：d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35%，然后在转速为4000r/min条件下离心15min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75%，再在转速为6000r/min条件下离心15min，收集沉淀；
戊聚糖含量（%）=C×n×0.88×100/（m×106）
式中C表示由标准曲线得到L-阿拉伯糖值；n为稀释倍数；m为样品干重（g），计算结果如表4所示。
表4不同浓度乙醇沉淀得到的菜籽多糖中各成分含量
| 样品 | 总糖（%） | 戊聚糖（%） | 蛋白质（%） | 灰分（%） |
| 40%乙醇沉淀部分 | 36.1 | 21.3 | 3.92 | 55.36 |
| 80%乙醇沉淀部分 | 81.2 | 63.2 | 4.64 | 8.85 |
由表4可知，用40%的乙醇沉淀总糖得率少，但是灰分含量高，而用80%的乙醇沉淀总糖含量高，灰分含量低，表明低浓度的乙醇有利于去除溶液中的杂质，高浓度的乙醇有利于沉淀菜籽多糖，因此本发明中先用低浓度乙醇沉淀去除杂质，再用高浓度乙醇沉淀获得纯度较高的菜籽多糖。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.利用菜籽饼粕制备L-阿拉伯糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.将菜籽饼粕加入体积分数为70～80%的乙醇溶液，然后在70～90℃下脱脂脱色，过滤收集滤渣，烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕；
b.将步骤a所得预处理菜籽饼粕加水在温度为90～100℃条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A；将滤渣加入质量分数为4%～6%的NaOH溶液中，在温度为55～65℃条件下提取，然后加入浓度为2～4mol/L HCl溶液将pH调至4.9～5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖；
c.将步骤b所得菜籽粗多糖用大孔吸附树脂D3520层析柱纯化，上样量相当于柱体积20～24倍，以流速为1.5～2.5柱体积/h洗脱，收集洗脱液，得菜籽多糖；
d.将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35～40%，然后在转速为4000～6000r/min条件下离心15～20min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75～80%，再在转速为4000～6000r/min条件下离心15～20min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析48～72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品；
e.将步骤d所得菜籽阿拉伯聚糖粗品用DE-52纤维素柱纯化，先用100mL蒸馏水洗脱，再用200mL浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用200mL浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L的NaCl洗脱液，透析，减压浓缩，冻干，得到菜籽阿拉伯聚糖；
f.将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖用质量分数为1.5～2.0%的硫酸酸解，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0～7.0，待反应液冷却至30～35℃时加入1.0～1.5g酵母，在30～35℃条件下发酵2～3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%～85%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤，得到粗L-阿拉伯糖；
g.将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为50%～60%，并调节pH至6.0～7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为90～95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4℃下恒温结晶32～48小时，真空抽滤，45℃～55℃下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a是将菜籽饼粕按每克菜籽饼粕加入15～20mL体积分数为70～80%的乙醇溶液，然后在70～90℃下脱脂脱色2～3小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2～3次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤a是将菜籽饼粕按每克菜籽饼粕加入20mL体积分数为80%的乙醇溶液，然后在80℃下脱脂脱色2小时，过滤收集滤渣，滤渣重复处理2次，并将滤渣烘干，粉碎，得预处理菜籽饼粕。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼粕按固液比为25～30mL/g加水，然后在温度为90～100℃条件下提取，过滤收集滤液和滤渣，滤液记为提取液A；将滤渣加入质量分数为4%～6%的NaOH溶液，再在温度为55～65℃条件下提取，然后加入浓度为2～4mol/L HCl溶液将pH调至4.9～5.1，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤b是将步骤a所得预处理菜籽饼粕按固液比为28mL/g加水，然后在温度为94℃条件下，过滤收集滤液和滤渣，滤渣再加水重复提取2次，合并3次滤液，记为提取液A；将滤渣按料液质量体积比为20:1加入质量分数为5%的NaOH溶液，再在温度为60℃条件下提取2小时，然后加入浓度为4mol/L HCl溶液将pH调至5，离心收集上清液，记为提取液B，合并提取液A和提取液B，得菜籽粗多糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤d是将步骤c所得菜籽多糖加入乙醇至乙醇体积分数为35%，然后在转速为4000r/min条件下离心15min，弃沉淀，将上清液继续加乙醇至乙醇体积分数为75%，再在转速为6000r/min条件下离心15min，收集沉淀；将沉淀加水溶解，并在流水下透析72小时，浓缩，冷冻干燥，得菜籽阿拉伯聚糖粗品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤f是将步骤e所得菜籽阿拉伯聚糖按每克加入400mL质量分数为2.0%的硫酸，搅拌均匀，在温度为80℃条件下酸解5小时，然后加入氢氧化钡溶液将pH调至6.0，待反应液冷却至30℃时加入1.5g酵母，在30℃条件下发酵3天，将发酵液减压蒸馏浓缩至浆状，再加入甲醇至甲醇体积分数为80%，结晶，过滤，将晶体用甲醇洗涤3次，得到粗L-阿拉伯糖。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤g是将步骤f所得粗L-阿拉伯糖加50℃的水溶解至L-阿拉伯糖质量浓度为60%，并调节pH至7.0，再向溶液中加入乙醇至乙醇体积分数为95%，加入L-阿拉伯糖晶体，4℃下恒温结晶48小时，真空抽滤，45℃下烘干至恒重，得到L-阿拉伯糖。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤c中，所述大孔吸附树脂D3520层析柱由以下方法制备，将大孔吸附树脂D3520用体积分数为90～95%乙醇浸泡24～48h，充分溶胀，再用无水乙醇提取8～12小时，然后湿法装柱，树脂裝至柱高2/3～3/4处，用体积分数为90～95%的乙醇洗至流出液加水不变白色浑浊，再用水洗尽乙醇，然后用质量分数为4%～6%的HCl溶液以4～6柱体积/h流速进行酸洗后浸泡2～4h，继续用水以4～6柱体积/h流速洗至中性，最后用质量分数为4%～6%NaOH溶液以4～6BV/h流速进行碱洗，用水洗至中性，得大孔吸附树脂层析柱。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤e中，所述DE-52纤维素柱由以下方法制备：称取30g DE-52纤维素，用400～500mL浓度为0.5mol/L NaOH处理30～60min，抽滤，水洗至pH8～9；再以400～500mL浓度为0.4～0.6mol/L HCl处理30～60min，抽滤，水洗至pH6～7，然后以浓度为0.4～0.6mol/L NaOH处理后用湿法装柱法装柱而得。
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|---|---|---|---|---|
| CN103981294A (zh) * | 2014-05-21 | 2014-08-13 | 山东福田药业有限公司 | 一种利用豌豆皮为原料制备l-阿拉伯糖的工艺 |
| CN106046195A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-10-26 | 浙江大学 | 一种柑橘罐头加工碱处理水中阿拉伯聚糖的纯化方法 |
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