CN103468679A - 一种来源于水稻的受衰老信号诱导的OsPaO启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明基因工程技术领域，具体为一种来源于水稻的受衰老信号诱导的OsPaO启动子及其应用。本发明的启动子来源于水稻叶片衰老相关基因OsPaO，其DNA序列为SEQIDNO：1所示。将编码目的产物基因的核酸序列与上述启动子片段融合得到重组DNA，用该种重组DNA转化获得的转基因植株中，目的基因的表达受衰老信号的诱导表达。本发明的启动子可以在衰老信号的诱导下启动目的基因的表达，可用于产量和品质性状的转基因改良。

Description

一种来源于水稻的受衰老信号诱导的OsPaO启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于水稻的受衰老信号诱导的启动子及其应用。

背景技术

启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因上游。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别是依赖DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件， 转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件，并与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用。根据启动子启动转录的模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子[路静等，自然科学进展14（8）：856-862，2004]。

与组成型启动子和组织器官特异性启动子相比，诱导型启动子有着独特的优势：它可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，快速诱导基因转录的开与关。根据来源，可将诱导型启动子分为天然的诱导型启动子和人工构建的诱导型启动子[路静等，自然科学进展 14（8）：856-862，2004]。天然诱导型的启动子包括光、温度、激素、干旱、高盐胁迫、病原菌应答启动子等[路静等，自然科学进展 14（8）：856-862，2004；Narusaka Y，et al，Plant J，34（2）：137-148，2003；Song FM，et al，Gene，290：115-124，2002]。目前研究最多、最深入的人工可诱导表达系统是化学诱导表达系统，如四环素诱导的TetR系统、地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的EcR 系统（Gatz C，et al，Proc Nalt Acad Sci USA，1988，85：1394-1397；Aoyama T，et al，Plant J，1999，11：605-612；Zuo J，et al，Plant J，2000，24：265-273；Unger E，et al，Transgenic Res，2002，11：455-465）。

为了实现叶片功能期调控的目标，Gan和Amasino（Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin，Science，270：1986-1988，1995）将一个源于拟南芥衰老正调控基因的启动子与细胞分裂素合成关键酶基因IPT（异戊烯基转移酶）融合，构建了一个衰老特异的外源基因表达自反馈增强表达融合载体，将该融合载体转入烟草，转基因烟草表现了叶片衰老进程延缓的表型。付永彩等[A senescence-inhibition chimeric gene was transferred into rice by the biolistic method and expressed，J Agr Biotech（农业生物技术学报），7（1）：17-22，2000]将这一融合载体转入水稻，培育了防止早衰的水稻新株系。利用根癌农杆菌感染方法将这一融合基因导入青菜，转基因青菜叶绿素含量高，衰老延迟，为高产优质新型蔬菜品种的培育提供了一种高效的技术途径[袁政等，植物生理与分子生物学学报，28（5）：379-384，2002]。

叶绿素的降解是作物衰老阶段明显的生理现象之一。目前认为叶绿素的降解途径从叶绿素a、脱镁叶绿酸a（pheophorbide a pheide）、红色叶绿素降解物到非荧光叶绿素降解物（NCC）。其中脱镁叶绿酸a加氧酶（pheophorbide a monooxy-genase，PaO）起到了关键作用，因而该途径又被称为PaO途径。PaO通过催化两个氧原子的加入，使叶绿素的卟啉环开环，成为四元线性吡咯衍生物即红色叶绿素降解物，导致绿色的最终消失。大量的实验证据表明：在衰老的叶片中，抑制PaO的活力，将导致脱镁叶绿酸a的积累和叶绿素降解的抑制（Hörtensteiner S，et al，J Biol Chem，273(25):15335-15339，1998）。

本发明为源于水稻的受衰老信号诱导的OsPaO启动子片段分离和功能验证。这一启动子片段可被用于构建驱动产量、品质和抗逆性相关基因在衰老阶段的特异表达体系。这一表达体系的优势是使得目的基因在植物衰老时表现出显著的高活性，在未衰老时期表现出低的活性，即为条件式的基因表达调控方式。因此，这一诱导表达系统在大田作物的转基因改良中有显而易见的应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于水稻的受衰老信号诱导的启动子及其应用。

本发明提供的来源于水稻的受衰老信号诱导的启动子，具体来源于水稻叶片衰老相关基因（水稻脱镁叶绿酸a加氧酶）OsPaO，其DNA序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种包含有SEQ ID NO：1所示的DNA序列的重组DNA载体。该重组DNA载体含有所述的核苷酸序列作为启动子、与该启动子相连的是编码目的基因的DNA序列。

本发明还提供所述包含有SEQ ID NO：1所示的DNA序列的重组DNA载体的细胞系。

本发明还提供所述启动子的应用，即将编码目的产物基因的核酸序列与上述启动子片段融合得到重组DNA，用该种重组DNA转化获得的转基因植株中，目的基因的表达受衰老信号的诱导表达。具体来说，本发明还提供一种在植物中引起目的基因产物表达增高的方法，具体步骤为：

a)用所述的重组DNA载体转化植物；

b)利用衰老信号使得转基因植物在期望的时空中增加目的基因产物的表达。

本发明还提供所述水稻脱镁叶绿酸a加氧酶OsPaO启动子在调控叶片衰老启动与进程，以及驱动衰老阶段特异表达的与作物产量品质性状改良相关基因表达方面的应用。实验表明，本发明的启动子在延缓叶片衰老从而改良作物产量和品质性状，驱动高附加值产物基因在衰老阶段的特异表达，以及改良绿叶菜采后贮藏等方面有很大的应用价值。

附图说明

图1 OsPaO基因上游启动子序列的顺式元件分析。

图2 水稻叶片的离体暗处理的表型。

图3 水稻叶片离体暗处理过程中OsPaO的基因表达情况。

图4 自然衰老下，启动子活性的瞬时转化验证。

图5 pBIA121-OsPaO系列载体构建示意图。

图6 不同长度片段的OsPaO启动子的构建。

具体实施方式

实施例1：OsPaO基因上游启动子片段的元件分析

我们通过PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)在线分析工具对所克隆的启动子片段做顺式元件分析。根据PlantCARE的分析结果，所克隆的2004bp启动子序列中含有多种顺式调控元件（图1），其中主要包括光响应元件（如G-Box、GT1-motif、GTGGC-motif、MNF1、Sp1、3-AF1 binding site、GAG-motif等），与脱落酸有关的元件如ABRE，与茉莉酸甲酯（MeJA）相关的元件（如CGTCA-motif、TGACG-motif等），与水杨酸相关的元件如SARE-element，高温应答（HSE等）等。

实施例2：水稻OsPaO基因上游启动子片段的获得

2.1 水稻叶片的离体暗处理

取在16h L/8h D光照，28℃条件下培养40天的水稻叶片，分别在暗处理0、1、2、4、6、8天取样（图2）。

2.2 RNA提取

取水稻材料约0.1g。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加1ml TRIzol ( invitrogen公司 )，混匀后，室温放置15分钟，加0.2ml氯仿:异戊醇（24:1），剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm，4℃离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4℃离心15分钟。70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0.1% DEPC处理过的ddH₂O水中，贮存于-80℃备用。

2.3 cDNA第一链合成和反转录PCR

采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为：2µg制备的总RNA，0.5µl Rnase inhibitor，加DEPC处理过的去离子水至8.5µl，2µl的Oligo(dT)18 primer，65℃，5min，室温放置10min，13000rpm 简短离心5s。再依次加入4µl 5×First-Strand buffer，0.5µl RNase Inhibitor，2µl 100mM DTT，2µl dNTP，1µl MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37℃反转录1小时，90℃5分钟；冰上冷却；13000rpm 短暂离心5秒钟，存放于-20℃。获得的cDNA可用于相关基因表达量的检测。

2.4 水稻叶片离体暗处理过程中OsPaO基因表达情况

我们利用RT-PCR检测OsPaO基因的表达情况[OsPaO S 5’ CCGACGAGAATGGGTGGGAGAA 3’（SEQ ID NO：2），OsPaO AS 5’ CCAGTGACCTTGTGGTGAGCAA 3’（SEQ ID NO：3）]。图3显示OsPaO基因表达水平在水稻叶片离体暗处理过程中大幅度上升。

2.5 OsPaO基因启动子的载体构建

设计引物：OsPaO S 5’ GCACCAGGGTAAAGCA 3’（SEQ ID NO：4），OsPaO AS 5’ TTTCGTCGACTCGCTT 3’（SEQ ID NO：5），以水稻野生型的基因组DNA为模板，扩增对应长度片段的启动子，将PCR产物接入T载体，测序正确后，用BamHI和HindIII将其从T载体上切下，与同样经过BamHI和HindIII双酶切的pCAMBIA1301双元载体进行连接并转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，抽提质粒后，用电击法将阳性克隆质粒转化农杆菌（GV3101），并鉴定阳性转化子，挑选阳性转化子在三抗（Rif+Gent+Kan）的YEB液体培养基中摇菌，用30%的甘油以体积比1：1进行保菌，存放于-80℃备用。

2.6 载体构建中常用实验方法

2.6.1 DNA限制性内切酶酶切

(1) 20μl酶切体系，2μl DNA，适量的酶切缓冲液（参见Takara目录），酶量（0.2μl酶用于酶切鉴定，0.5μl酶用于酶切克隆）。体系扩大，按比例增大各成分体积；

(2) 按以下次序添加水，buffer、DNA、酶，混匀，37℃反应1.5-3h。（最后添加内切酶）。

2.6.2 玻璃粉制作以及玻璃粉回收DNA片断

玻璃粉制作

(1) 用干净的研钵将石英砂磨到足够细，用筛子筛取大小合适的玻璃粉颗粒；

(2) 用一倍体积的无菌水悬浮玻璃粉，静置片刻；

(3) 当出现分层时，吸取上层混浊液到新的离心管，下层沉淀重复2，3操作；

(4) 2000-3000rpm，1min 离心，去掉上清；

(5) 无菌水清洗除菌后，以1：1比例用无菌水悬浮玻璃粉。

玻璃粉回收DNA片断

(1) 称空离心管重量，切胶后，再称重，计算胶的重量；

(2) 以1mg胶中加入3ul体积6mol/L NaI比例加入NaI，55℃烘箱或者水浴中充分溶解；

(3) 加入5-10ul玻璃粉，充分悬浮混匀；

(4) 冰浴15min，中间每隔5min轻弹离心管，使沉淀的玻璃粉悬浮起来；

(5) 7000rpm，1min离心，弃上清；

(6) 50倍玻璃粉体积加入Rince buffer充分吹打洗涤；

(7) 5000rpm，1min离心，再重复6、7两次；

(8) 去尽buffer，55℃水浴或者烘箱中挥发乙醇5-10min；

(9) 10-20ulMili-Q水吹打悬浮，Votex充分振荡；

(10) 55度烘箱或者水浴中溶解DNA 15min，每隔5min轻轻混匀；

(11) 13000rpm，2min离心后，取上清。

New wash stock solution: 20×rince buffer:H2O:无水乙醇=1：9：10

20×rince buffer: 0.2mol/L Tris-Cl（pH7.5），1mol/L NaCl，20mmol/L EDTA

乙醇沉淀回收DNA片断

(1) 加入1/10 体积的3M NaAc（酶切体系先用等体积酚：氯仿抽提蛋白）；

(2) 加入2V -20℃预冷乙醇，置于冰上30 min；

(3) 12000 rpm，离心10 min；

(4) 1 ml 70%乙醇洗涤沉淀，55℃烘干，溶于TE。

2.6.3 载体与基因片段连接

连接缓冲液 5.5µl

插入片段 3.0µl

T4连接酶 1.0µl

酶切后载体 0.5µl

16℃连接过夜。

2.6.4 感受态细胞制备以及转化

大管制备感受态细胞

(1) 以1：100的比例转接前晚活化的菌种，在37℃摇床中280rpm培养到OD值0.3，本实验采用的是大肠杆菌Top10株系；

(2) 将培养液倒入50ml离心管，冰上稍微预冷，4000rpm，10min离心；

(3) 倒掉上清，加入10ml 0.1mol/L CaCl2的氯化钙，轻轻打散菌块；

(4) 冰上放置30min，2500rpm，10min离心（离心后沉淀出现环状为佳）；

(5) 倒掉上清，快速放置到冰上，加入2ml 0.1mol/L CaCl2，轻轻悬浮菌体；

(6) 放置在冰上，2小时后即可用来转化。

转化

(1) 准备42℃水浴；

(2)将200ul感受态细胞和连接液（5-10ul）或者质粒（1ul）加入到离心管中，混匀；

(3) 冰浴30min后，42℃热激90s，放置在冰上5min；

(4) 转化质粒直接涂板；

(5) 转化连接液加入2倍细胞体积的SOC培养液，37℃摇床50-100rpm预培养（Amp抗性1小时，Kan、Cm抗性2小时），本实验采用的是Kan抗性平板；

(6) 取200ul混合物涂在含一定量抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜；

(7) 次日早上通过抗性筛选获得阳性克隆。

2.6.5 质粒抽提

(1) 挑单菌落到含一定量抗生素的LB液体培养基中37℃摇菌过夜；

(2) 取1ml菌液，12000rpm 30秒收集菌体，收集两次；

(3) 加100ul冰预冷的溶液I悬浮菌体，加入200ul溶液II，上下颠倒混匀，再加入150ul预冷的溶液III，上下颠倒混匀，置于冰上5分钟；

(4) 12000rpm 离心3分钟，转移上清到新的1.5ml离心管中；

(5) 加等体积酚：氯仿抽提一次，12000rpm，3分钟，取上相；

(6) 加2倍体积冰预冷的无水乙醇，混匀后置于冰上30分钟；

(7) 12000rpm 离心5分钟，去上清，用70％乙醇洗涤沉淀；

(8) 55℃烘干5分钟，溶解于50ul TE（pH 8.0），加0.5ugRNase，37℃消化30分钟。-20℃保存。

溶液I: 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；10 mmol/L EDTA，pH 8.0，高压灭菌

溶液II: 0.2 mol/L NaOH，1%SDS（现配现用，不可置于冰上）

溶液III: 每100 ml，60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml去离子水

实施例3：启动子活性的瞬时转化验证

以相同生长期的光照培养的烟草为对照，以幼嫩烟草叶片为对照，对局部开始发黄的自然衰老叶片进行注射，2天后取样染色。实验结果显示，瞬时转有载体PBI121-POsPaO的烟草材料在自然衰老叶片中GUS染色均较深，而对照均未见有明显的GUS染色（图4）。根据以上结果，我们对启动子序列进行了启动子截短片段分析（图5，6）。

实施例4：OsPaO衰老诱导启动子的应用

本发明的OsPaO衰老诱导启动子可用本领域熟知的方法构建到植物表达载体中。为了便于对转OsPaO诱导启动子的细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记（BAR基因、GUS基因、荧光素酶基因等）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，如水稻、玉米、小麦和草坪草等，也可以是双子叶植物，如大豆、棉花和杨树等，但不局限于上述物种。携带有本发明的OsPaO诱导型启动子的表达载体可以借助于Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导和农杆菌等方法介导转化植物细胞或组织，并将转化受体培育成植株，以获得作物产量和品质性状得到显著改良的育种资源材料。

<110> 复旦大学

<120> 一种来源于水稻的受衰老信号诱导的OsPaO启动子及其应用

<130> 001

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2004

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）品种日本晴（Japonica）

<400> 1

gcaccagggt aaagcaacat tttcatattg gaccagttat atttaccaaa tgattcatct 60

tggtcctagt tcttctacct ctggctccct cttttatctc tctatttcct ctcttctctg 120

accagtaaca ggtcaggtag ctagctatct aaagtcagcg ctgtactaat gccaaagctc 180

tctcagagtt agcatcaaag ccacacactt gtgatggatc tcaatctccc catctaggtt 240

tgcactaaag ctcaggaggg aacgaaaaaa agaaagaaaa attgccccca ttgctgtcga 300

gctatctgca gggaatagct tggctttggt ttggtgaaga tttaccgatc ggcgccggcg 360

gcgaggagga ttttgtggag attgcagggg gggggggggg ggggggggag ggggtctagt 420

agtattcctt caccaagtca gcaagcccat ggtcagttgg tcacactcca agctctacat 480

gttcgaggac atttacattg ggcaggtgga ttgcagcctt atgatgatta ttgttttgtg 540

cttctaccat cttgtggcta gcatatgaca acaatggact gcaagattgc aaggtgaggc 600

ttcatggcat ctgttaacct cgagcttaag tagcgcatcg cagtgggagg ccaaaggttg 660

agcacgacga tgggcagagg acgaggttaa gcaaggtgca tacctccggt gcaacttgca 720

accatggtaa aaatatgagg cccaacatgc aatttactca taaataaatg ccatagtagt 780

atcaaacggt tctggatcac aaagtgcact gatggggcgc gggcggtcaa agttccgtac 840

actgcctgtt catgtccacg gcgccgaact gccgaagtga acccagaatc caatgggcgg 900

accggctccc acaagccggt tgggttcgtg tcattctcac gagtgagtag aggtggccaa 960

acgggcggcc cggcccggca cggcacgggc acgggtccgg cacggcccgt ttcggcacgg 1020

cccgttaggc atggctcatg aaacgggccg tgccgtcccg acccacgtgc cgagccgccg 1080

gcccaagcac ggcccgtgga tggccgggcc gtgcccgtgc cggcacggca tgcgtgtggc 1140

ccgccgtgtc agtacgggcc cgtgaatgaa aaatgggccg tggacggggc acggttggcc 1200

caggaaccga aatggcgcgg agggatgcga tgcggacttg cggaggtggc tggcgggctg 1260

ggccatcagc taggaggggt gctcaacgga cttgcggagg cggctagcgg gctgggccgt 1320

cagttgggag ggatgagata cggacttgcg gaaggatgag atgcggactt actacagtag 1380

ccgtgccgtg ccgtgccggc ccgcgggctc ggccggcggc ccaagcacgg cacggctact 1440

cgtgctgtgc cggcacggcc cgttactgta gcaggccgtg ccgggccgtg ccggctacag 1500

gttccgccgt gcctcgggcc gcccgttttg gcccggcccg tttggccacc tctacgagtg 1560

agtataccca gggaagttgg ccgccgctgc gtagccgaag ctccaccaca cgacaccccg 1620

caaaacgcca tgcgtgctcc tgctgcacac ttgtcccccg cctcctccgc cgtgccgtca 1680

cgcaaccacg gactcctcct ccacctccgt ttcctactct cttcttcagt ttctcacctc 1740

tccgcacgag aaaattcgaa tcccccttcc ggctgctggt tttcgtgcca gaaacaggcg 1800

attttaccag tgccagttag ctctcgcctt cctcctcctc catcgtgcta ctactctgtt 1860

cttctggaag aacactggtc tcctcgccta cctcagtcac cactcaccac accaggtgcg 1920

agctataaaa accggcacgc caaaaatctt caaaaccaca cagaaacctc agatctccga 1980

ggcttcccaa gcgagtcgac gaaa 2004

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>

<400> 2

ccgacgagaa tgggtgggag aa 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>

<400> 3

ccagtgacct tgtggtgagc aa 22

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213>

<400> 4

gcaccagggt aaagca 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213>

<400> 5

tttcgtcgac tcgctt 16

Claims (6)

1. 一种来源于水稻的受衰老信号诱导的OsPaO启动子，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2. 一种重组DNA载体，其特征在于该重组DNA载体含有权利要求1 所述的启动子，以及与该启动子相连的是编码目的基因的DNA序列。

3. 一种包含权利要求2所述重组DNA载体的细胞系。

4. 一种如权利要求2所述的重组DNA载体的应用，其特征在于所述的重组DNA载体转化的植物材料，转化有该重组DNA载体的植物在在衰老信号的作用下，目的基因产物水平上升。

5. 一种在植物中引起目的基因产物表达增高的方法，其特征在于具体步骤为：

a)用权利要求2所述的重组DNA载体转化植物；

b)利用衰老信号使得转基因植物在期望的时空中增加目的基因产物的表达。

6. 一种如权利要求1所述的启动子在调控叶片衰老启动与进程，以及驱动衰老阶段特异表达的与作物产量品质性状改良相关基因表达方面的应用。

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