CN103463626B - Ho-1和ho-1的诱导剂作为抑制prrs病毒感染的新型阻断剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抑制PRRS病毒感染细胞的血红素加氧酶1(heme？oxygenase1，HO-1)及HO-1的诱导剂钴原卟啉(Cobalt？Protoporphyrin，CoPP)和高铁血红素(hemin)作为阻断剂，抑制PRRSV感染细胞的方法。猪HO-1基因在高致病性PRRSV感染后显著上调表达，而在经典PRRSV感染后显著下调表达。PRRSV的易感细胞非洲绿猴肾细胞系的HO-1基因在高致病性PRRSV感染后也显著上调表达，而在经典PRRSV感染后也显著下调表达。利用CoPP和hemin诱导Marc-145和猪肺泡巨噬细胞(PAM)的HO-1表达。结果表明两者都显著诱导了HO-1的表达，抑制了PRRSV感染Marc-145和PAM细胞。
Description
技术领域
本发明涉及HO-1和HO-1的诱导剂作为抑制PRRS病毒感染的新型阻断剂。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)，俗名为猪蓝耳病，是由PRRS病毒(PRRSV)感染引起的对全球养猪业危害极大的猪重要传染病。由于PRRSV具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用(ADE)和持续性感染等特征，临床上常与其它病原混合感染，目前对于该病的致病机制和免疫机理尚不清楚，所以至今仍无确实有效的防制措施。因此，急需开发新的抗PRRS病毒感染的药物，有效防治猪蓝耳病的发生。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种抑制PRRS病毒感染细胞的HO-1及HO-1的诱导剂CoPP和hemin作为阻断剂，抑制PRRSV感染细胞的方法。上述的各种阻断剂都对PRRSV感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRS疾病兽药。
申请人研究发现猪血红素加氧酶1(hemeoxygenase1，HO-1)基因在高致病性PRRSV(HP-PRRSV)感染后显著上调表达，而在经典PRRSV(N-PRRSV)感染后显著下调表达。同时也发现，PRRSV的易感细胞非洲绿猴肾细胞系(Marc-145)的HO-1基因在HP-PRRSV感染后也显著上调表达，而在N-PRRSV感染后也显著下调表达。提示HP-PRRSV与N-PRRSV调控HO-1基因表达的方式不同。
申请人分别利用HO-1的激动剂钴原卟啉(CoPP)和高铁血红素(hemin)诱导Marc-145和猪肺泡巨噬细胞(PAM)HO-1的表达。结果表明，CoPP和hemin都显著诱导了HO-1的表达，而且显著的抑制了PRRSV主要包括经典毒株(代表毒株为Ch-1a和Ch-1R)和高致病性毒株(代表毒株为SD-16和JXA-1)感染Marc-145和PAM细胞。同时经发明人的试验研究，发现CoPP和hemin可以作为阻断PRRSV感染细胞的阻断剂，这在之前的研究中也一直未见应用。
证明HO-1的激动剂-钴原卟啉(CoPP)和和高铁血红素(hemin)诱导HO-1表达，进而抑制PRRSV感染细胞的具体方法为：
首先应用HO-1的激动剂-CoPP和hemin诱导Marc-145和PAM细胞的HO-1，结果表明，CoPP和hemin呈现浓度梯度依赖性的促进了细胞HO-1的表达。
紧接着发明人检测了其对PRRSV感染的影响。实时荧光定量PCR和Westernblot检测结果表明，CoPP和hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白(N)的表达。通过TCID50检测了PRRSV感染后细胞上清的病毒滴度，结果表明，随着CoPP和hemin浓度的升高，显著的降低了PRRSV的病毒滴度。
进一步的，采用间接免疫荧光(IFA)和流式细胞术(FACS)检测了其对PRRSV感染的影响。结果和前面一致性的表明，CoPP和hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的复制，显著性的降低了PRRSV阳性细胞的比例。
最后，通过特异性过表达HO-1，采用实时荧光定量PCR和Westernblot、TCID50、IFA和FACS检测了HO-1对PRRSV感染的影响。结果和CoPP和hemin处理一样，过表达HO-1抑制了PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白(N)的表达、显著的降低了PRRSV的病毒滴度，并显著降低了PRRSV阳性细胞的比例。
综上所述，血红素加氧酶1(hemeoxygenase1，HO-1)及血红素加氧酶1(HO-1)的诱导剂-钴原卟啉(CobaltProtoporphyrin，CoPP)和高铁血红素(hemin)，均对PRRSV感染细胞有抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物。从而为PRRS的防治提供了一个全新的思路，对于实际生产有着极为重要的意义。
附图说明
图1CoPP呈浓度依赖性抑制PRRSV的N蛋白表达。
图2IFA法检测CoPP呈浓度依赖性显著降低PRRSV阳性细胞的比例。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明。
实施例1CoPP和hemin的配制
分别将CoPP和hemin(二者均购自美国Sigma公司)溶解于0.2mol/L的NaOH，用1mol/L的HCL调pH值至7.4，再用PBS倍比稀释，用0.2μm的滤膜过滤除菌，分装后用锡箔纸包裹，贮存于-80℃备用。
实施例2CoPP和hemin处理PRRSV感染的细胞
Marc-145细胞和PAM(105个细胞/ml)分别培养于含DMEM和RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养成70％～80％汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1MOI的PRRSV，4℃吸附1小时(h)，37℃孵育1h，弃去未吸附的病毒液，用1mlPBS/孔洗涤一次。每孔分别加入2ml包含上述实施例1稀释好的不同浓度(0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM)的CoPP的培养基，放入37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养至病毒感染48h，分别收集细胞上清和细胞。
Marc-145细胞和PAM(105个细胞/ml)分别培养于含DMEM和RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养成70％～80％汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1MOI的PRRSV，4℃吸附1h，37℃孵育1h，弃去未吸附的病毒液，用1mlPBS/孔洗涤一次。每孔分别加入2ml包含上述实施例1稀释好的不同浓度(5μM、10μM、50μM)的hemin的培养基，放入37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养至病毒感染36h，分别收集细胞上清和细胞。
实施例3CoPP和hemin抑制PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白的表达
实时荧光定量PCR检测HO-1和PRRSV的N基因表达：胰酶消化实施例2处理的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4℃，500g，离心10min，弃去上清。每管加入1mlTRIzol(购自Invitrogen公司)，参照说明书抽提RNA。用PrimeScriptRTreagentKitPerfectRealTime试剂盒(购自TAKARA公司)将RNA反转录成cDNA。最后应用SYBRGREEN试剂盒(购自瑞士的Roche公司)和上述反转录的cDNA模版及设计好的HO-1和N基因的上下游引物，在AppliedBiosystems的StepOnePlusReal-TimePCRSystem上进行实时荧光定量PCR检测。反应条件为：95℃10min进行变性；95℃15sec，60℃1min，反应40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃15sec进行溶解曲线分析。检测结果见表1。表1结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖性的促进了细胞HO-1的表达，并呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的N基因的mRNA表达。
表1.不同浓度CoPP处理对HO-1和PRRSV的N基因表达的影响
Westernblot检测PRRSV的N蛋白的表达：胰酶消化实施例2处理的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4℃，500g，离心10min，弃去上清。沉淀用200μLNP40裂解液冰上裂解30min；12000g离心10min，除去细胞碎片，取上清，5μl裂解样品+45μLPBS，PierceBCAproteinAssayKit测定总蛋白浓度，进行Westernblot检测。每个泳道40μg总蛋白，在Bio-Lab电泳仪150V电压进行SDS-PAGE；转膜后，将膜小心取出，封闭液4℃封闭过夜；弃封闭液，用洗脱液洗膜，每次5min共洗4次；加入一抗mousemonoclonalanti-Nproteinantibody(购自JenoBiotechInc)，anti-α-tublinantibody室温孵育1h；弃一抗，用PBST洗膜，5min×4次；加入二抗：HRP-GoatMouseIgG，室温孵育1h；弃二抗，用PBST洗膜，5min×4次；PBS洗膜，5min×4次；最后进行ECL发光显色。如图1的检测结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的N蛋白表达。
也采用和CoPP一样的方法检测了hemin对PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白的表达的影响。实时荧光定量PCR检测结果表明，hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的N基因的mRNA表达，尤其是50μM的hemin处理，与对照相比，极显著降低了PRRSV的N基因的表达水平。Westernblot检测结果同样也表明，hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSVN蛋白的表达，尤其是50μM的hemin处理后，几乎观察不到PRRSV的N蛋白的表达。
实施例4CoPP和hemin对PRRSV感染滴度的影响
将实施例2中收集的细胞培养上清，用含2％FBS的细胞培养基作10倍系列稀释10-1至10-8，接种在长满Marc-145细胞70％～80％汇合度的96孔培养板上，每稀释度接种8孔，每孔0.1ml，37℃吸附1h后每孔再加入0.1ml维持液，37℃、5％CO2培养箱中静置培养3-7d，每天观察细胞病变(CPE)。PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。表2的检测结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖性的降低了PRRSV的病毒滴度，0μM的CoPP处理后，PRRSV的TCID50为的3.16×105/mL；而100μM的CoPP处理后，PRRSV的TCID50为的1.37×103/mL。
表2.不同浓度CoPP处理对PRRSV病毒滴度的影响
也采用和CoPP一样的方法检测了hemin对PRRSV感染滴度的影响。将上述5μM、10μM、50μM的hemin处理后收集的细胞培养上清，用含2％FBS的细胞培养基作10倍系列稀释10-1至10-8，接种在长满Marc-145细胞70％～80％汇合度的96孔培养板上，每稀释度接种8孔，每孔0.1ml，37℃吸附1h后每孔再加入0.1ml维持液，37℃、5％CO2培养箱中静置培养3-7d，每天观察CPE。PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。检测结果表明，hemin呈现浓度梯度依赖性的降低了PRRSV的病毒滴度，50μM的hemin处理后再感染PRRSV，与只感染PRRSV的对照相比，病毒滴度至少降低1000倍。
实施例5间接免疫荧光(IFA)法检测CoPP和hemin对PRRSV感染的影响
Marc-145细胞和PAM(105个细胞/ml)分别培养于含DMEM和RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的24孔细胞培养板中，37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养成70％～80％汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1MOI的PRRSV，4℃吸附1h，37℃孵育1h，弃去未吸附的病毒液，用1mlPBS/孔洗涤一次。每孔加入0.5ml包含上述实施例1稀释好的不同浓度的CoPP的培养基，放入37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养至病毒感染48h，弃掉细胞维持培养液。
每孔加入200uL的-20℃预冷的75％乙醇，4℃固定30min；弃掉固定液，400uL/孔PBS洗5min×4次；每孔加入150uL稀释好的mousemonoclonalanti-Nproteinantibody，37℃作用1h；400uL/孔PBS洗5min×4次；每孔加入150uL稀释好的二抗AlexaFluor488-conjugatedAffiniPureGoatMouseIgG(H+L)，1.5mg/ml，1∶300稀释，37℃避光作用1h；PBS洗5min×4次；加入150μLPBS/孔后，于倒置荧光显微镜下观察。如图2的检测结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖性的抑制了PRRSV的感染，0μM的CoPP处理后，能观察到大量的PRRSV阳性细胞，而80μM的CoPP处理后，几乎观察不到PRRSV阳性细胞。
也采用和CoPP一样的IFA方法检测hemin对PRRSV感染的影响。结果表明，hemin呈现浓度梯度依赖性的抑制了PRRSV的感染，尤其是50μM的hemin处理36h后，与只感染PRRSV的对照相比，显著降低了PRRSV阳性细胞比例，几乎观察不到阳性细胞。由此说明，hemin能够阻断PRRSV感染细胞，可用于开发防治PRRSV的药物。
实施例6流式细胞术(FACS)检测CoPP对PRRSV感染的影响
Marc-145细胞和PAM(105个细胞/ml)分别培养于含DMEM和RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养成70％～80％汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1MOI的实验室构建的含绿色荧光蛋白的PRRSV，4℃吸附1h，37℃孵育1h，弃去未吸附的病毒液，用1mlPBS/孔洗涤一次。每孔加入0.5ml培养基(包含上述稀释好的不同浓度的CoPP)，放入37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养至病毒感染48h，弃掉细胞维持培养液。
PBS洗两次，胰酶消化后，2ml含10％FBS的培养液终止消化，将细胞团分散成单个细胞，分别置于5ml离心管内；300g，4℃离心10min，弃掉培养上清；用2mlPBS/管，充分重悬细胞，再以同样的条件离心，弃掉上清；1mlPBS/管充分重悬细胞，200目的滤网过滤后，进行流式细胞分析。表3的检测结果表明，CoPP呈现浓度梯度依赖性的降低了PRRSV阳性的细胞比例，由0μM时的57.5％降至100μM时的2.4％。由此说明，CoPP能够阻断PRRSV感染细胞，可用于开发防治PRRSV的药物。
表3.不同浓度CoPP处理后PRRSV阳性的细胞比例
实施例7HO-1抑制PRRSV感染试验
HO-1PiggyBac表达载体的构建：应用TRIZOL(购自Invitrogen公司)，参照说明书抽提Marc-145细胞的总RNA。用PrimeScriptRTreagentKit试剂盒(购自TAKARA)将RNA反转录成cDNA。参考猴HO-1基因序列(NCBI中的GenBank号：XM_001113241.2)，利用HO-1特异性引物(上游引物：5’-TCCCTCTAGACGCAGCATGGAGCGTCTGCAACC-3’和下游引物：5’-AGTGAATTCTCATTTATCATCATCATCTTTGTAATCCATGGCATAAAGCCCTAC-3’)扩增出猴的HO-1基因的的CDS区段。根据PiggyBac表达载体(购自SystemBiosciences公司)多克隆酶切位点的序列，选用XbaI和EcoRI将载体线性化，将HO-1cDNA连接至表达载体，经过酶切和测序正确后，和表达Piggybac转座酶的载体(PA)按照质量比为5∶1的比例转染至汇合度为80％的Marc-145细胞。经过PCR、WesternBlot和IFA鉴定，HO-1得到正确表达。
HO-1抑制PRRSV感染：将上述过表达HO-1的Marc-145细胞(105个细胞/ml)培养于DMEM培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养成70％～80％汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1MOI的PRRSV，4℃吸附1小时(h)，37℃孵育1h，弃去未吸附的病毒液，用1mlPBS/孔洗涤一次。每孔加入2ml的DMEM培养基，放入37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养至病毒感染48h，分别收集细胞上清和细胞。
按照实施例3的方法检测了HO-1对PRRSV基因组的复制和核衣壳蛋白的表达的影响。实时荧光定量PCR检测结果表明，过表达HO-1，与对照相比，极显著降低了PRRSV的N基因的表达水平。Westernblot检测结果同样也表明，过表达HO-1显著抑制了PRRSV的N蛋白的表达。按照实施例4的方法检测了HO-1对PRRSV感染滴度的影响。将上述收集的细胞培养上清，用含2％FBS的细胞培养基作10倍系列稀释10-1至10-8，接种在长满Marc-145细胞70％～80％汇合度的96孔培养板上，每稀释度接种8孔，每孔0.1ml，37℃吸附1h后每孔再加入0.1ml维持液，37℃、5％CO2培养箱中静置培养3-7d，每天观察CPE。PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。检测结果表明，与对照相比，过表达HO-1显著降低了PRRSV的病毒滴度。
分别按照实施例5和实施例6的方法，采用IFA和FACS检测HO-1对PRRSV感染的影响。结果表明，HO-1显著的抑制了PRRSV的感染，与对照相比，过表达HO-1显著降低了PRRSV阳性细胞比例，过表达HO-1后几乎观察不到PRRSV阳性细胞。由此说明，HO-1能够阻断PRRSV感染细胞，可用于开发防治PRRSV的药物。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进部落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (3)
1.钴原卟啉(CoPP)在制备抑制PRRS病毒感染细胞的抑制剂中的用途。
2.高铁血红素(hemin)在制备抑制PRRS病毒感染细胞的抑制剂中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述抑制剂抑制PRRS病毒感染Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAM)。
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