CN103460993B - 一种大型真菌去甲基化育种方法及装置 - Google Patents

Abstract

一种大型真菌去甲基化育种方法及装置，该装置有培养皿主体和培养皿盖，所述培养皿主体包括底盘和侧壁，所述培养皿主体内设有至少一个与环形隔板；培养皿主体的中心区域为单纯培养基区域，加入培养基A；与培养皿主体的中心区域相邻的诱变区域及连续的其他诱变区域，加入培养基A和抑制剂B；将待诱变菌株接种于培养皿的单纯培养基区域，在适生长条件下进行倒置培养；中心区域的待诱变菌株菌丝生长进入邻近的诱变区域，抑制剂进入生长菌丝产生作用；获得诱变菌株。优点是：育种装置结构简单，使用方便；方法简单，诱变和检测可以同步进行，能快速、高效的对大型菌株进行诱变。

Description

一种大型真菌去甲基化育种方法及装置

技术领域

本发明涉及一种大型真菌去甲基化育种方法及装置。

背景技术

大型真菌(macrofungi)是菌物中形成大型子实体的一类真菌，泛指广义上的蘑菇(mushroom)或蕈菌(macrofungi)。大型真菌是菌物中的一个重要类群，很多种类具有较高的营养价值和药用价值，是目前菌物中最有开发应用前景的一类。我国已有上千年的大型真菌栽培历史，商业化栽培的大型真菌品种基本上都是经人工育种而获得。对于生化途径清晰度菌株，通过代谢工程策略可以更容易地选择菌种改良靶点；而对于生化途径不清晰的菌株，也可以直接通过基因组改组、核糖体工程和表观遗传修饰等手段进行遗传选育，从而获得理想表型。

通过遗传选育手段直接阻断和高表达表观遗传学靶点能够有效地确定目的靶点与表型和次级代谢生物合成之间的关系，然而，除了少数模式真菌外，很多的大型真菌都缺乏高效的遗传操作系统，因此在目前的技术条件下，很难使用分子遗传学手段直接操纵非模式真菌的表观遗传。

随着研究的深入，一系列的小分子物质被筛选出来特异性地或者半特异性地抑制表观遗传修饰酶类，它们在很多大型真菌上也有较好的效果。控制表观遗传靶点的小分子能够影响多种生理过程，其中包括对发育时序、表型控制和次级代谢产物生物合成的调控。在真菌细胞中，DNA 甲基化与去甲基化是受DNA甲基转移酶和DNA去甲基化酶调控的一个动态平衡过程，利用DNA甲基转移酶抑制剂可激活真菌的沉默基因的表达，从而改变菌株的表型和次级代谢产物图谱。这种方法成本低，诱变率高，能够同时进行高通量筛选，而且对菌株的遗传背景没有过高要求。目前，DNA去甲基化的操作方法是液体摇瓶法，即把菌株与抑制剂在液体摇瓶中共同培养一段时间后，取出菌丝体在平板培养皿上涂布筛检，诱变过程和检测过程割裂成两步。这种方法不但工作量大、周期长，最主要无法实现诱变与检测直接挂钩，很多已经发生改变的菌丝体由于未在培养皿上涂布导致无法被检出，效率比较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、诱变和检测可同步进行、检出效率高的大型真菌去甲基化育种方法及装置。

本发明的技术解决方案是：

一种大型真菌去甲基化育种方法，其具体步骤是：

1.1、采用去甲基化育种大型真菌的装置，有培养皿主体和与该培养皿主体配合使用的培养皿盖，所述培养皿主体包括底盘和自底盘边缘向上延伸围成一圈的侧壁，所述培养皿主体内设有至少一个与侧壁形成同心环的环形隔板将培养皿主体由内至外分隔成独立的培养区域；培养皿主体的中心区域为单纯培养基区域，加入培养基A；与培养皿主体的中心区域相邻的诱变区域及连续的其他诱变区域，加入培养基A和抑制剂B；所述培养基A为琼脂培养基，所述抑制剂B为小分子化学抑制剂，所述小分子化学抑制剂为核苷类DNA甲基转移酶抑制剂或非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂；

1.2、将待诱变菌株接种于培养皿的单纯培养基区域，在适生长条件下进行倒置培养；

1.3、中心区域的待诱变菌株菌丝生长进入邻近的诱变区域，抑制剂进入生长菌丝产生作用；

1.4、获得诱变菌株。

所述独立诱变区域还加入指示剂C、辅助剂D中的至少一种，所述指示剂C为酸碱指示剂，在明确目的性诱变育种时添加，针对诱变目的物设计加入的指示剂成分，以快速直接的实现该目的，极大减少工作量；所述辅助剂D为菌株细胞壁通透性增强成分，以增加抑制剂B进入待诱变菌株的接触量，使诱变更快速。

所述核苷类DNA甲基转移酶抑制剂为5-氮杂胞苷、5-氮-2’-脱氧胞苷、5-氟脱氧胞苷及脱氧胞苷衍生物中的一种，所述非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂为聚苯复合物、4-氨基苯酸衍生物中的一种。

所述待诱变菌株为大型真菌，所述培养基A为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、麦粒琼脂培养基、麦芽酵母蛋白胨琼脂培养基（MYPA）、木屑麸皮蔗糖琼脂培养基（SWSA）中的一种。

所述指示剂C为酚红、甲基红、特异基团显色剂中的至少一种，加入指示剂能够实现诱变与特异性目的物检测同步；所述辅助剂D为二甲基亚砜或溶菌酶，辅助通透剂能够增加菌株与抑制剂的接触量。

所述环形隔板的数目≥2个，环形隔板分隔的诱变区域中抑制剂B浓度由内至外递增，抑制剂浓度不够未产生诱变，菌丝自由生长进入相邻更高抑制剂浓度的诱变区，直至发生诱变。

一种大型真菌去甲基化育种装置，有培养皿主体和与该培养皿主体配合使用的培养皿盖，所述培养皿主体包括底盘和自底盘边缘向上延伸围成一圈的侧壁，其特殊之处在于：所述培养皿主体内设有至少一个与侧壁形成同心环的环形隔板。

所述环形隔板的数目≥2个，所述环形隔板高度相等。

所述环形隔板的数目≥2个，所述环形隔板高度由内部环形隔板到外部环形隔板呈阶梯递增或递减，以适用于气生菌丝旺盛型真菌育种使用，有效控制进入更高浓度诱变区域的菌丝量，增加菌丝在低浓度区域接触时间。

所述环形隔板的数目为2个，将培养皿主体由内至外分隔成独立的培养区Ⅰ、培养区Ⅱ、培养区Ⅲ。

本发明的有益效果是：

1、育种方法简单，能快速、高效的对大型菌株进行诱变。

2、诱变和检测可以同步进行，诱变后菌落形态变化也可直接检测出；使用更少的试剂量，与液体摇瓶法相比，检出周期短、效率高，省时省力。

3、与连续浓度梯度平板相比，同心环独立区域增加了特定浓度下菌株的诱变空间，使诱变几率增大。

4、育种装置结构简单，使用方便，多级同心环结构能够确保诱变的连续性，一次操作实现多批次浓度检出，更加直观的观察到每个培养区内的菌株大小，诱变效率高，节约诱变时间。

附图说明

图1是本发明（对应实施例1）的示意图；

图2是图1中该培养皿主体的结构示意图；

图3是本发明（对应实施例2）的示意图；

图4是图2中该培养皿主体的结构示意图；

图5是本发明（对应实施例3）的示意图；

图6是图3中该培养皿主体的结构示意图。

图中：1-培养皿盖，2-培养皿主体，201-侧壁，202-底盘， 203-环形隔板，2001-培养区Ⅰ，2002-培养区Ⅱ，2003-培养区Ⅲ。

具体实施方式

实施例1

如图1、图2所示，该大型真菌去甲基化育种装置，有培养皿主体2和与该培养皿主体2配合使用的培养皿盖1，所述培养皿主体2包括底盘202和自底盘202边缘向上延伸围成一圈的侧壁201，所述培养皿主体2内设有两个与侧壁201形成同心环的环形隔板203，将培养皿主体2由内至外分隔成独立的培养区Ⅰ2001、培养区Ⅱ2002、培养区Ⅲ2003，所述环形隔板203高度由内部环形隔板203到外部环形隔板203呈阶梯递减，以控制进入培养区Ⅲ2003的菌丝量，增加菌丝在培养区Ⅱ2002接触时间。

平菇菌株育种（Pleurotus ostreatus）：

培养区Ⅰ2001为单纯培养基区域，加入PDA培养基；

培养区Ⅱ2002、培养区Ⅲ2003为诱变区域，加入经0.2μm无菌滤膜过滤除菌的5-氮杂胞苷溶液和50℃PDA培养基混合物；培养区Ⅱ2002、培养区Ⅲ2003中5-氮杂胞苷终浓度分别为1×10^-3M、1×10^-2M，培养区Ⅱ2002抑制剂浓度不够未产生诱变，菌丝自由生长进入相邻培养区Ⅲ2003中更高抑制剂浓度的诱变区。

将待诱变菌株平菇菌株接种于培养皿的培养区Ⅰ2001，28℃避光倒置培养；培养区Ⅰ2001的平菇菌株生长进入邻近的培养区Ⅱ2002，培养区Ⅱ2002的平菇菌株生长进入邻近的培养区Ⅲ2003，获得诱变菌株。采用HPLC法或限制行酶切法确认诱变发生，筛检生长速度加快或菌落形态变厚的菌丝体进行出菇培养试验。

实施例2

如图3、图4所示，该大型真菌去甲基化育种装置，有培养皿主体2和与该培养皿主体2配合使用的培养皿盖1，所述培养皿主体2包括底盘202和自底盘202边缘向上延伸围成一圈的侧壁201，所述培养皿主体2内设有两个与侧壁201形成同心环的环形隔板203，将培养皿主体2由内至外分隔成独立的培养区Ⅰ2001、培养区Ⅱ2002、培养区Ⅲ2003，所述环形隔板203高度相等。

香菇菌株育种（Lentinula edodes）：

培养区Ⅰ2001为单纯培养基区域，加入PDA培养基；

培养区Ⅱ2002、培养区Ⅲ2003为诱变区域，加入经0.2μm无菌滤膜过滤除菌的5-氮-2’-脱氧胞苷和50℃PDA培养基混合物；培养区Ⅱ2002、培养区Ⅲ2003中5-氮-2’-脱氧胞苷终浓度分别为1×10^-3M、1×10^-2M，培养区Ⅱ2002抑制剂浓度不够未产生诱变，菌丝自由生长进入相邻培养区Ⅲ2003中更高抑制剂浓度的诱变区。

将待诱变菌株香菇菌株接种于培养皿的培养区Ⅰ2001，26℃避光倒置培养；培养区Ⅰ2001的香菇菌株生长进入邻近的培养区Ⅱ2002，培养区Ⅱ2002的香菇菌株生长进入邻近的培养区Ⅲ2003，获得诱变菌株。采用HPLC法或限制行酶切法确认诱变发生，筛检粗壮菌丝体进行出菇培养试验。

实施例3

如图5、图6所示，该大型真菌去甲基化育种装置，有培养皿主体2和与该培养皿主体2配合使用的培养皿盖1，所述培养皿主体2包括底盘202和自底盘202边缘向上延伸围成一圈的侧壁201，所述培养皿主体2内设有一个与侧壁201形成同心环的环形隔板203，将培养皿主体2由内至外分隔成独立的培养区Ⅰ2001、培养区Ⅱ2002。

蛹虫草菌株育种（Cordyceps militaris）：

培养区Ⅰ2001为单纯培养基区域，加入麦粒琼脂培养基；

培养区Ⅱ2002为诱变区域，加入培养基A、抑制剂B、指示剂C和辅助剂D；培养基A为麦粒琼脂培养基，抑制剂B为5-氮杂胞苷溶液，指示剂C使用酚红，辅助剂D使用二甲基亚砜，5-氮杂胞苷溶液经0.2μm无菌滤膜过滤除菌，酚红用量0.025g/L与麦粒琼脂培养基共灭菌后，降温至50℃与5-氮杂胞苷混匀，使5-氮杂胞苷溶液浓度为1×10^-3M。将待诱变菌株蛹虫草菌株接种于培养皿的培养区Ⅰ2001，25℃避光倒置培养；培养区Ⅰ2001的蛹虫草菌株生长进入邻近的培养区Ⅱ2002，获得诱变菌株。采用HPLC法或限制行酶切法确认诱变发生，筛检变色明显或速度提升的菌丝体进行出菇培养试验。

实施例4

杏鲍菇菌株育种（Pleurotus eryngii）：

方法及装置与香菇菌株育种（Lentinula edodes）实施例2相同，培养基替换为MYPA培养基，抑制剂替换为5-氟脱氧胞苷。25℃避光倒置培养。获得诱变菌株。采用HPLC法或限制行酶切法确认诱变发生，筛检粗壮菌丝体进行出菇培养试验。

实施例5

金针菇菌株育种（Flammulina velutiper）：

方法及装置与香菇菌株育种（Lentinula edodes）实施例2相同，培养基替换为SWSA培养基，抑制剂替换为4-氨基苯酸衍生物。23℃避光倒置培养。获得诱变菌株。采用HPLC法或限制行酶切法确认诱变发生，筛检粗壮菌丝体进行出菇培养试验。

实施例6

滑菇菌株育种（Pholiota nameko）：

方法及装置与香菇菌株育种（Lentinula edodes）实施例2相同，培养基替换为加富PDA培养基，抑制剂替换为5-氮杂胞苷。22℃避光倒置培养。获得诱变菌株。采用HPLC法或限制行酶切法确认诱变发生，筛检粗壮菌丝体进行出菇培养试验。

Claims (6)

1.一种大型真菌去甲基化育种方法，其特征是：

具体步骤是：

1.1、采用去甲基化育种大型真菌的装置，有培养皿主体和与该培养皿主体配合使用的培养皿盖，所述培养皿主体包括底盘和自底盘边缘向上延伸围成一圈的侧壁，所述培养皿主体内设有至少一个与侧壁形成同心环的环形隔板将培养皿主体由内至外分隔成独立的培养区域；培养皿主体的中心区域为单纯培养基区域，加入培养基A；与培养皿主体的中心区域相邻的诱变区域及连续的其他诱变区域，加入培养基A和抑制剂B；所述培养基A为琼脂培养基，所述抑制剂B为小分子化学抑制剂，所述小分子化学抑制剂为核苷类DNA甲基转移酶抑制剂或非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂；

1.2、将待诱变菌株接种于培养皿的单纯培养基区域，在适生长条件下进行倒置培养；

1.3、中心区域的待诱变菌株菌丝生长进入邻近的诱变区域，抑制剂进入生长菌丝产生作用；

1.4、获得诱变菌株。

2.根据权利要求1所述的大型真菌去甲基化育种方法，其特征是：所述独立诱变区域还加入指示剂C、辅助剂D中的至少一种，所述指示剂C为酸碱指示剂，在明确目的性诱变育种时添加，针对诱变目的物设计加入的指示剂成分；所述辅助剂D为菌株细胞壁通透性增强成分。

3.根据权利要求1所述的大型真菌去甲基化育种方法，其特征是：所述核苷类DNA甲基转移酶抑制剂为5-氮杂胞苷、5-氮-2’-脱氧胞苷、5-氟脱氧胞苷及脱氧胞苷衍生物中的一种，所述非核苷类DNA甲基转移酶抑制剂为聚苯复合物、4-氨基苯酸衍生物中的一种。

4.根据权利要求1所述的大型真菌去甲基化育种方法，其特征是：所述待诱变菌株为大型真菌，所述培养基A为马铃薯葡萄糖琼脂培养基、麦粒琼脂培养基、麦芽酵母蛋白胨琼脂培养基、木屑麸皮蔗糖琼脂培养基中的一种。

5.根据权利要求2所述的大型真菌去甲基化育种方法，其特征是：所述指示剂C为酚红、甲基红、特异基团显色剂中的至少一种；所述辅助剂D为二甲基亚砜或溶菌酶。

6.根据权利要求1所述的大型真菌去甲基化育种方法，其特征是：所述环形隔板的数目≥2个，环形隔板分隔的诱变区域中抑制剂B浓度由内至外递增，抑制剂浓度不够未产生诱变，菌丝自由生长进入相邻更高抑制剂浓度的诱变区，直至发生诱变。