CN103451221A - 发酵制备高纯度赖氨酸盐的方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了发酵制备含L-赖氨酸盐的产品的方法，其包括向产L-赖氨酸的菌导入一个被认为与赖氨酸代谢无关的基因，而且获得的产品中赖氨酸含量可以得到提高。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品，该产品相对于现有含L-赖氨酸盐的产品，能够显著提高抗吸湿性，从而适宜长期保存，制备方法灵活性好而且成本可控。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括创新地向产L-赖氨酸的菌导入一个通常被认为与赖氨酸代谢无关的基因，而且获得的产品中赖氨酸含量可以得到提高。另外，本发明还提供了所述方法生产的产品和应用等。
背景技术
L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中，尤其是含有杂质的赖氨酸盐（如，硫酸盐、盐酸盐），一般可以直接作为饲料添加剂使用。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。
在赖氨酸盐的各类产品中，尤其是赖氨酸硫酸盐，具有非常大的缺点，即具有较大的吸湿性，由此使得其中的含水量过高（如，大于3%），这样过高的产品湿度容易导致产品结块，不易保存，尤其长期保存时容易发霉，这即使在作为安全要求较低的饲料使用时，也是不容许的。尤其是本发明人发现，我国广大农户，牲畜饲养规模不大，赖氨酸盐作为饲料添加剂用量不大，因此整包购进（往往单价更为便宜）的赖氨酸盐产品，因此会有较多留存，长期保存时产品的吸湿性对他们的影响更大。
为此，日本味之素公司采用调节酸根阴离子与赖氨酸的当量比来克服这一缺陷，将酸根阴离子与赖氨酸的当量比调节为0.68~0.95之间，即酸根阴离子的当量小于赖氨酸的当量，这样可以在一定程度上降低产品的平衡湿度（参见中国专利第03120099号）。上述方法对于赖氨酸盐酸盐来说，会带来比较良好的抗吸湿性，在相对湿度为33~58%的常规保存环境下，基本能使得产品的平衡湿度控制在3%以下；然而，对于赖氨酸硫酸盐来说，在此保存环境下，平衡湿度基本都超过3%，甚至会超过5%。
经本发明人长期研究和实验，令人意外地发现了，在抗吸湿性差的赖氨酸硫酸盐中添加一定比例的其它类型的氨基酸，尽管会降低产品中赖氨酸硫酸盐的纯度，但是会使得赖氨酸硫酸盐产品的抗吸湿性得到显著提升，而且该纯度的产品并不影响其作为赖氨酸饲料添加剂的效用。
而且，本发明人还研究出了一种新的发酵方法，与现有技术的不断加强生成赖氨酸的代谢途径的思路相反，打开非赖氨酸代谢的其他旁路，尤其是在十分复杂的代谢通路中令人意外地寻找到了一种酶，打开的程度非常适中，从而能发酵得到赖氨酸和其它类型氨基酸配比适当的产品，无需过多的制备工艺步骤，得到的产品仍旧能够作为赖氨酸饲料添加剂，而且抗吸湿性得到显著提升。
进一步地，本发明人发现，在该发酵所得到的产物中的赖氨酸含量在添加硫酸成盐后很难逾越55%，而目前市场上销售的产品中以较高和高浓度产品为主（一般赖氨酸含量达到55%或以上），因此将产品中赖氨酸含量提升到55%或更高也是需要解决的技术问题。为此，本发明人还提供了一种成本可控的发酵生产高纯度赖氨酸硫酸盐的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括创新地向产L-赖氨酸的菌导入一个通常被认为与赖氨酸代谢无关的基因，而且使得获得的产品中赖氨酸含量提高。另外，本发明还提供了该方法生产的产品和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括：
（1）将编码氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的蛋白或其变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌；
（2）在发酵条件下液体培养步骤（1）获得的菌，并收集培养的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸：
赖氨酸51~55份，优选为51.5~53.5份，更优选为52.3份；
天冬氨酸1.2~1.8份，优选为1.45~1.6份，更优选为1.54份；
苏氨酸0.8~1.1份，优选为0.9~1份，更优选为0.94份；
丝氨酸0.4~0.65份，优选为0.5~0.6份，更优选为0.56份；
谷氨酸2~3份，优选为2.2~2.6份，更优选为2.4份；
甘氨酸0.75~1.1份，优选为0.85~1份，更优选为0.92份；
丙氨酸1.2~1.6份，优选为1.3~1.5份，更优选为1.4份；
缬氨酸0.75~1.1份，优选为0.85~1份，更优选为0.93份；
甲硫氨酸0.3~0.5份，优选为0.35~0.48份，更优选为0.42份；
异亮氨酸0.45~0.75份，优选为0.55~0.65份，更优选为0.61份；
亮氨酸1~1.5份，优选为1.2~1.35份，更优选为1.27份；
酪氨酸0.5~0.8份，优选为0.6~0.75份，更优选为0.67份；
苯丙氨酸0.5~0.8份，优选为0.6~0.7份，更优选为0.64份；
组氨酸0.8~1.2份，优选为0.9~1.05份，更优选为0.97份；和，
精氨酸，0.9~1.3份，优选为1~1.2份，更优选为1.1份；
（3）取通过步骤（2）制备的上清液，进行纯化，得到赖氨酸纯度提高的级份，优选级份中赖氨酸纯度提高至75~95%（w/w），更优选至76~92.6%（w/w），更加优选至78~83%（w/w），最优选至80.7%（w/w）；
（4）另取通过步骤（2）制备的上清液，加入硫酸，并任选进行浓缩，得到酸化的上清液；和
（5）将步骤（3）获得的级份加入硫酸，并喷入干燥机，在干燥机内形成颗粒核心，而后向该干燥机喷入步骤（4）获得的酸化的上清液，包裹上述颗粒核心，然后干燥至含水率小于3%（w/w）。
在本发明的具体实施方式中，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的蛋白。与现有技术的不断加强生成赖氨酸的代谢途径的思路相反，本发明第一方面的方法通过引入RNA聚合酶sigma-32因子来适中地打开非赖氨酸代谢的其他旁路，从而能一次性发酵得到赖氨酸和其它类型氨基酸配比适当的产品，无需过多的制备工艺步骤。RNA聚合酶sigma-32因子通过特异性地对热休克启动子起作用，而参与热休克过程，影响热休克相关蛋白的转录，从而对谷氨酸发酵中的微生物克服代谢产生的毒物产生影响。尽管RNA聚合酶sigma-32因子已经被公开（可参见NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）蛋白和基因登录号 AAB18436.1；也可参见中国专利申请第96193336号），但是RNA聚合酶sigma-32对赖氨酸发酵以及对其中的氨基酸产生分布的影响却没有任何启示。因此，优选在本发明第一方面的方法中，所述变体的氨基酸序列为对如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列添加、缺失或取代一个和几个氨基酸残基而获得的氨基酸序列。
更优选在本发明第一方面的方法中，所述变体的氨基酸序列为对如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列添加、缺失和取代一个或几个氨基酸残基而获得的氨基酸序列，而且编码该变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌后在发酵条件下液体培养，培养的上清液包含如本发明第一方面中所述重量配比的氨基酸。
本领域技术人员可以根据RNA聚合酶sigma-32因子的氨基酸序列推导出其编码的核苷酸序列，优选是密码子改造的核苷酸序列，以调节该代谢途径打开的程度。在本发明的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产L-赖氨酸的菌，只要能够使产L-赖氨酸的菌表达所述RNA聚合酶sigma-32因子即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒等载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明第一方面的方法中，工程菌是大肠杆菌，更优选是对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的大肠杆菌，最优选是表达对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的二氢吡啶二羧酸合成酶的大肠杆菌（参见中国专利第94194962号）。由于大肠杆菌本身适合作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过氯化钙转化法导入大肠杆菌的。
在本文中，在表示配比时所用的“份”，是为了表示在所属组合物中，各成分的重量配比，这对于本领域技术人员来说是能够理解的。重量“份”在对组合物中一种以上的成分进行限定时，可以看作是这些成分在该组合物中的比例。
在本文中，接种量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液（接入的菌液）体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。
在本文中，“纯度”是本领域技术人员所熟知的术语，是不计入水的含量，即指的是产品中某一非水物质占脱水产品的量。“纯度”通常可以以质量百分比来表示。
可以通过经过纯化而提高了赖氨酸纯度的级份和直接酸化而进行喷雾的上清液的比例，来调节最终产品中的赖氨酸含量。精准控制获得上述级份的上清液和直接酸化而进行喷雾的上清液比例，也能够精准控制最终产品中的赖氨酸含量，保持产品质量的稳定性。然而，纯化会增加成本，而本发明人发现在饲料领域没有必要追求过高的纯度，只需要把产品中有效成分纯度提升至适合饲料产品推广应用的程度即可，如55%。因此，步骤（3）中所取的通过步骤（2）制备的上清液一般要小于步骤（4）中所另取的通过步骤（2）制备的上清液，优选在本发明第一方面的方法中，步骤（3）中所取的通过步骤（2）制备的上清液与步骤（4）中所另取的通过步骤（2）制备的上清液的体积比为0.5~1.5：2~4，优选为0.75~1.25：2.5~3.5，更优选为1：3。
本发明第一方面的方法中加入硫酸，从而可以和赖氨酸这一碱性氨基酸成盐，更易于在干燥过程中凝结成颗粒。硫酸的加入量与上清液和/或级份中赖氨酸的比例可以是恒定的。优选在本发明第一方面的方法中，在步骤（4）中，所述通过步骤（2）制备的上清液中的赖氨酸与加入的硫酸的摩尔比为1~3：0.5~1.5，优选为1.5~2.5：0.75~1.25，更优选为2：1。也优选在本发明第一方面的方法中，在步骤（5）中，所述步骤（3）获得的级份中的赖氨酸与加入的硫酸的摩尔比为1~3：0.5~1.5，优选为1.5~2.5：0.75~1.25，更优选为2：1。
纯化可以通过本领域的常规纯化手段来纯化，如膜过滤、层析、结晶等手段来进行。优选在本发明第一方面的方法中，纯化是层析纯化，优选是凝胶过滤层析纯化，更优选是Sephadex G-10层析纯化。这样的纯化设备一般可以通过市场渠道购买。另外，优选在本发明第一方面的方法中，纯化后可以对纯化直接得到的级份进行浓缩，从而获得进行以后步骤的级份。
液体的浓缩和干燥可以通过本领域常用的设备，如，蒸发器、干燥机和/或烘箱，来进行。优选在本发明第一方面的方法中，在步骤（4）中，另取通过步骤（2）制备的上清液，加入硫酸，进行浓缩（优选用蒸发器浓缩），得到酸化的上清液；然后在步骤（5）中，将步骤（3）获得的级份加入硫酸，并喷入流化床干燥机，在该干燥机内形成颗粒核心，而后向该干燥机喷入步骤（4）获得的酸化的上清液，包裹上述颗粒核心，然后于烘箱干燥至含水率小于3%（w/w）。
在第二方面，本发明提供了含L-赖氨酸硫酸盐的颗粒（其优选是饲料添加剂颗粒），其包括颗粒核心和包裹该核心的外层，其中颗粒核心的L-赖氨酸含量为60~72%（w/w），优选为61~70.6%（w/w），更优选为62~65%（w/w），最优选为63.5%（w/w），外层的L-赖氨酸含量为51~55%（w/w），优选为51.5~53.5%（w/w），更优选为52.3%（w/w）。上述内外层结构的颗粒也能够使得体内在后被降解内部高赖氨酸纯度的颗粒核心更可能较持续地发挥作用，因此可能提高饲料添加剂的功效。
经动物证实，即使进一步包含发酵杂质，本发明第二方面的颗粒在对动物喂饲中使用仍旧是安全的，更由于其他种类的氨基酸的加入，甚至还可以进一步提高饲料添加剂的功效。因此，优选本发明第二方面的颗粒是饲料添加剂。
经本发明人长期研究和实验，令人意外地发现了，在抗吸湿性差的赖氨酸硫酸盐中添加一定比例的其它类型的氨基酸，会使得赖氨酸硫酸盐产品的抗吸湿性得到显著提升，因此适宜长期保存。在本文中，平衡含水率可以与平衡湿度互换使用，是本领域技术人员所常用的吸湿性指标，指的是在一定相对湿度环境下，产品含水率达到平衡（即，含水率既不会增加，也不会减少）时的含水率。优选可以在常规保存条件下（相对湿度为33~58%）长期保存，本发明第二方面的产品的（平衡）含水率小于5%（w/w），优选小于3%（w/w），更优选小于2.5%（w/w）。
本发明第二方面的颗粒可以不含有其他杂质（即，本发明第二方面的颗粒由氨基酸组成），也可以进一步包含杂质，如发酵杂质。经本发明人研究，采用本发明第一方面的方法制备的产品中的其他杂质，并不能使上述比例的氨基酸产品在常规保存条件下含水率高于3%（w/w）。因此优选本发明第二方面的颗粒是由本发明第一方面的方法制备的。
本发明第二方面的颗粒中颗粒核心和外层合计的赖氨酸含量可以超过55%（w/w），因此优选本发明第二方面的颗粒中L-赖氨酸含量不小于55%（w/w），优选大于55%（w/w），如55.1%（w/w）。
在第三方面，本发明提供了含L-赖氨酸硫酸盐的颗粒核心，其中L-赖氨酸含量为60~72%（w/w），优选为61~70.6%（w/w），更优选为62~65%（w/w），最优选为63.5%（w/w）。
在本文中，“颗粒核心”指的是可以在较大颗粒内部成为核心的较小颗粒。该颗粒核心的赖氨酸含量更高，杂质更少，因此该颗粒核心本身对动物喂饲的安全性和功效也是可以预期的。所以，优选本发明第三方面的颗粒核心是饲料添加剂颗粒核心。
颗粒核心可以直接使用其中成分混合而成，但是优选是由本发明第一方面的方法的步骤（1）、（2）、（3）和（5）制备的。所以，优选本发明第三方面的颗粒核心是由如下方法制备的：
（1）将编码氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的蛋白或其变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌；
（2）在发酵条件下液体培养步骤（1）获得的菌，并收集培养的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸：
赖氨酸51~55份，优选为51.5~53.5份，更优选为52.3份；
天冬氨酸1.2~1.8份，优选为1.45~1.6份，更优选为1.54份；
苏氨酸0.8~1.1份，优选为0.9~1份，更优选为0.94份；
丝氨酸0.4~0.65份，优选为0.5~0.6份，更优选为0.56份；
谷氨酸2~3份，优选为2.2~2.6份，更优选为2.4份；
甘氨酸0.75~1.1份，优选为0.85~1份，更优选为0.92份；
丙氨酸1.2~1.6份，优选为1.3~1.5份，更优选为1.4份；
缬氨酸0.75~1.1份，优选为0.85~1份，更优选为0.93份；
甲硫氨酸0.3~0.5份，优选为0.35~0.48份，更优选为0.42份；
异亮氨酸0.45~0.75份，优选为0.55~0.65份，更优选为0.61份；
亮氨酸1~1.5份，优选为1.2~1.35份，更优选为1.27份；
酪氨酸0.5~0.8份，优选为0.6~0.75份，更优选为0.67份；
苯丙氨酸0.5~0.8份，优选为0.6~0.7份，更优选为0.64份；
组氨酸0.8~1.2份，优选为0.9~1.05份，更优选为0.97份；和，
精氨酸，0.9~1.3份，优选为1~1.2份，更优选为1.1份；
（3）取通过步骤（2）制备的上清液，进行纯化，得到赖氨酸纯度提高的级份，优选级份中赖氨酸纯度提高至75~95%（w/w），更优选为76~92.6%（w/w），更加优选为78~83%（w/w），最优选为80.7%（w/w）；和
（4）将步骤（3）获得的级份加入硫酸，并喷入干燥机，在干燥机内形成颗粒核心。
在又一个方面，本发明提供了本发明第三方面的颗粒核心在制备含水率小的含L-赖氨酸硫酸盐的饲料添加剂中的应用。优选其中，（平衡）含水率小于5%（w/w），更优选小于3%（w/w），最优选小于2.5%（w/w）。
优选在本发明又一方面的应用中，含L-赖氨酸硫酸盐的饲料添加剂是本发明第二方面的颗粒，其用作饲料添加剂。
本发明具有以下有益效果：本发明的产品抗吸湿性佳，使得产品中的含水率降低50%以上，适合于在我国南北方广大地区长期储存、运输和使用；本发明的产品作为L-赖氨酸饲料，安全可靠，功效有所提升；本发明的发酵方法实施步骤简单，其中仅使用一次发酵，即可获得相应氨基酸种类的产品，其中无安全隐患；本发明的发酵方法分配使用柱层析，节约了生产成本，而且赖氨酸纯度达到目前已经销售的部分赖氨酸产品的纯度，便于商业推广；另外，本发明的发酵方法适应性强，通过经过纯化的上清液的比例，可以调节本发明的产品中的赖氨酸浓度，满足更高纯度产品的需求。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1 RNA聚合酶sigma-32因子基因构建体的制备
根据NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的蛋白登录号 AAB18436.1的氨基酸序列，本发明人设计了适度表达型密码子（非表达量优化密码子），并通过商业途径委托上海生工生物技术有限公司合成编码RNA聚合酶sigma-32因子的基因并构建入大肠杆菌表达质粒pET-20b(+)（可购自美国Novagen公司，商品编号Cat. No. 69739-3）中。克隆过程参照《分子克隆实验指南》以及所用商品化试剂的操作指南进行，简要过程如下：
通过DNA自动合成仪，合成RNA聚合酶sigma-32因子基因的核酸片段，用T4 多核苷酸激酶（购自TaKaRa公司）将这些核酸片段的5’端进行磷酸化，然后等摩尔比混合这5个核酸片段后于65℃变性5分钟,退火降温至16℃，加入T4 DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接12小时。然后，取1μL上述连接产物在50μL反应体积中进行PCR扩增，其中正向引物如序列表的SEQ ID No: 3所示（引入了EcoR I内切酶位点）、反向引物如序列表的SEQ ID No:4所示（引入了Xho I内切酶位点）,反应条件为：以94°C变性4分钟, 然后以94°C变性30秒、 63°C退火60秒并72°C延伸35秒进行35个循环, 最后以72°C延伸4分钟并降温至4°C。
琼脂糖凝胶电泳上述PCR产物，回收约900bp大小的片段,用EcoR I和XhoI双酶切该片段，并与经这两个内切酶酶切的pET-20b(+)质粒用T4 DNA连接酶进行连接，转化入大肠杆菌Top10 F’中。挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，经测序验证，相应核苷酸序列如本发明人设计的SEQ ID No:2所示，编码了如SEQ ID No:1所示的RNA聚合酶sigma-32因子，由公司将构建好的质粒（命名为pET-sigma）寄回。
实施例2 大肠杆菌发酵生产L-赖氨酸
对中国专利第94194962号所述的方法构建的产L-赖氨酸的大肠杆菌菌株W3110(tyrA)/pCABD2，转化pET-sigma质粒，经鉴定获得转化阳性克隆（命名为W3110(tyrA)/pCABD2-sigma）后，将菌株W3110(tyrA)/pCABD2和W3110(tyrA)/pCABD2-sigma分别参照中国专利第03120099号进行赖氨酸发酵实验。简而言之，将菌株接入液体LB培养基中振荡培养至OD500达到0.35，以5%的接种量接入赖氨酸发酵培养基（每升培养基配方为：100g葡萄糖，60g (NH4)2SO4，50g CaCO3，35mL蛋白胨-B（Soy Protein Enzymatic Hydrolysate，购自上海信然生物技术有限公司，总氮含量不低于3%），1g KH2PO4，400mg MgSO4·7H2O，200mg L-甲硫氨酸，10mg FeSO4·7H2O，8.1mg MnSO4·4H2O，300μg生物素和200μg维生素B1，用Tris-HCl调节至pH7）中以36℃振荡（250rpm）培养72小时。然后，离心收集培养基上清液（发酵液），用HPLC定量上清液中的L-赖氨酸含量以及其他成分。结果如表1所示，相对于W3110(tyrA)/pCABD2的发酵液，W3110(tyrA)/pCABD2-sigma的赖氨酸含量略有下降，但其他氨基酸的种类和比例明显提高，其他杂质（高于氨基酸分子量的杂质（糖、多糖、肽和蛋白）和低于氨基酸分子量的杂质（无机盐））的含量基本不变，因此两者发酵产物的性质如果有不同，估计是归因于其他氨基酸的种类和比例。
表1 发酵液中的成分比较
| 发酵菌株 | W3110(tyrA)/pCABD2 | W3110(tyrA)/pCABD2-sigma |
| 赖氨酸含量 | 12.58g/L | 11.96g/L |
| 其他氨基酸含量 | 1.23g/L | 3.29g/L |
| 各氨基酸及其含量比例 | 赖氨酸，72.1：苏氨酸，2.48：丝氨酸，1.27：谷氨酸，0.95：甘氨酸，0.87：丙氨酸，0.70：甲硫氨酸，0.58：缬氨酸、组氨酸和精氨酸，均小于0.1（其余氨基酸未检出（<0.01）） | 赖氨酸，52.3：天冬氨酸1.54：苏氨酸，0.94：丝氨酸，0.56：谷氨酸，2.4：甘氨酸，0.92：丙氨酸，1.4：缬氨酸，0.93：甲硫氨酸，0.42：异亮氨酸，0.61：亮氨酸，1.27：酪氨酸，0.67：苯丙氨酸，0.64：组氨酸，0.97：精氨酸，1.1（其余氨基酸未检出（<0.01）） |
| 高于氨基酸分子量的杂质 | 2.61g/L | 2.32g/L |
| 低于氨基酸分子量的杂质 | 1.03g/L | 1.05g/L |
实施例3 L-赖氨酸硫酸盐产品的精制
实施例2所述的由菌株W3110(tyrA)/pCABD2和W3110(tyrA)/pCABD2-sigma得到的上清液分别取出1/4体积先进行纯化：将这些上清液上样于Sephadex G-10层析柱，用纯水进行洗脱，收集分子量介于100~200Da的级份，用HPLC分别定量级份中的L-赖氨酸含量以及其他成分的含量，其中：W3110(tyrA)/pCABD2的成分分布为：赖氨酸，92.60%；苏氨酸，3.23%；丝氨酸，1.70%；谷氨酸，1.33；甲硫氨酸，0.76%；其他杂质成分共占0.38%（主要是无机盐）；W3110(tyrA)/pCABD2-sigma的成分分布为：赖氨酸，80.73%；天冬氨酸2.39%；苏氨酸，1.51%；丝氨酸，0.89%；谷氨酸，3.73%；缬氨酸，1.37%；甲硫氨酸，0.68%；异亮氨酸，0.97%；亮氨酸，1.97%；酪氨酸，1.12%；苯丙氨酸，0.99%；组氨酸，1.50%；精氨酸，1.72%；其他杂质成分共计0.43%（主要是无机盐）。由此可见，纯化过程基本保留了发酵上清液中的氨基酸成分，基本去除了其他杂质，提高了赖氨酸含量。
分别向上述由不同菌株获得的级份加入浓硫酸，使得硫酸与级份中的赖氨酸的摩尔比为1：2，置于蒸发器上浓缩后，得到酸化的级份。
另外3/4体积的上清液分别加入浓硫酸，使得硫酸与上清液中的赖氨酸的摩尔比为1：2，置于蒸发器上浓缩后，得到酸化的上清液，。
将上述酸化的级份以雾状喷入流化床干燥机内，并且不出料，当酸化的级份全部喷入干燥机后，会在干燥机内干燥形成颗粒核心（其中由菌株W3110(tyrA)/pCABD2得到的级份将形成L-赖氨酸含量为70.6% 的颗粒核心，由菌株W3110(tyrA)/pCABD2-sigma得到的级份将形成L-赖氨酸含量为63.5% 的颗粒核心），紧接着将上述酸化的上清液全部喷入干燥机，并开始收集出料颗粒（后喷入的上清液包裹在核心上干燥成颗粒）。将颗粒置于烘箱内干燥，直至含水率不超过1%，得到L-赖氨酸硫酸盐产品。
实施例4 L-赖氨酸产品的抗吸湿性测试
取实施例3的由W3110(tyrA)/pCABD2-sigma制备的L-赖氨酸硫酸盐产品（记为sigma，其中赖氨酸含量为55.1%）和由W3110(tyrA)/pCABD2制备的L-赖氨酸硫酸盐产品（记为对照1）。
另外，取以下重量配比的化学纯试剂混合均匀（记为对照2）：赖氨酸硫酸盐，69.9；天冬氨酸1.54；苏氨酸，0.94；丝氨酸，0.56；谷氨酸，2.4；甘氨酸，0.92；丙氨酸，1.4；缬氨酸，0.93；甲硫氨酸，0.42；异亮氨酸，0.61；亮氨酸，1.27；酪氨酸，0.67；苯丙氨酸，0.64；组氨酸，0.97；和，精氨酸，1.1。
另外，取以下重量配比的化学纯试剂混合均匀（记为对照3）：赖氨酸硫酸盐，69.9；天冬氨酸1.54；和，谷氨酸，2.4。
将上述样品分别在25℃下以不同相对湿度的环境下放置7天，然后测定当时产品中的平衡含水率，结果如表2所示，基于现有技术而进一步提纯获得的赖氨酸硫酸盐产品容易吸湿，在常规保存环境下（相对湿度33~58%）难以控制含水率在3%以下而长期保存，而如果与一些特定种类和比例的其他氨基酸混合，则能够显著增强其抗吸湿性，使之能长期保存，其中天冬氨酸和谷氨酸对赖氨酸硫酸盐的抗吸湿性增益影响较大，但是并不能完全增强其抗吸湿性；发酵产物中的杂质能够在一定程度上降低赖氨酸硫酸盐的抗吸湿性，但是只要能够保持其中有一些特定种类和比例的其他氨基酸，就能抵消杂质产生的不利影响，并使之能长期保存。
表2 不同产品的平衡含水率测试结果
| 样品 | 对照1 | 对照2 | 对照3 | sigma |
| 相对湿度33% | 3.17% | 1.01% | 0.78% | 1.42% |
| 相对湿度43% | 5.08% | 2.43% | 1.35% | 1.55% |
| 相对湿度58% | 6.36% | 3.74% | 1.62% | 2.20% |
实施例5 L-赖氨酸硫酸盐产品对牛犊生长影响的效用
委托宁夏农科院畜牧研究所用实施例3的由W3110(tyrA)/pCABD2-sigma制备的L-赖氨酸硫酸盐产品与市售85%L-赖氨酸盐酸盐饲料添加剂进行对比试验，等添加量（以其中L-赖氨酸计）喂饲4~6周龄的牛犊，以不添加赖氨酸的饲料为对照，实施例2的产品平均使牛犊日增重量（ADG）提高18.9%，而市售的产品平均提高15.8%，其中略优于市售产品可能归功于实施例3的产品中还含有较多其他种类的氨基酸，也可能归功于实施例3的产品颗粒中的高浓度赖氨酸的内层降解在后而更容易在动物体内保持并起效；试验期间，没有不良反应报告。
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> 发酵制备高纯度赖氨酸盐的方法及其产品
<130> CN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 284
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Thr Asp Lys Met Gln Ser Leu Ala Leu Ala Pro Val Gly Asn Leu
1 5 10 15
Asp Ser Tyr Ile Arg Ala Ala Asn Ala Trp Pro Met Leu Ser Ala Asp
20 25 30
Glu Glu Arg Ala Leu Ala Glu Lys Leu His Tyr His Gly Asp Leu Glu
35 40 45
Ala Ala Lys Thr Leu Ile Leu Ser His Leu Arg Phe Val Val His Ile
50 55 60
Ala Arg Asn Tyr Ala Gly Tyr Gly Leu Pro Gln Ala Asp Leu Ile Gln
65 70 75 80
Glu Gly Asn Ile Gly Leu Met Lys Ala Val Arg Arg Phe Asn Pro Glu
85 90 95
Val Gly Val Arg Leu Val Ser Phe Ala Val His Trp Ile Lys Ala Glu
100 105 110
Ile His Glu Tyr Val Leu Arg Asn Trp Arg Ile Val Lys Val Ala Thr
115 120 125
Thr Lys Ala Gln Arg Lys Leu Phe Phe Asn Leu Arg Lys Thr Lys Gln
130 135 140
Arg Leu Gly Trp Phe Asn Gln Asp Glu Val Glu Met Val Ala Arg Glu
145 150 155 160
Leu Gly Val Thr Ser Lys Asp Val Arg Glu Met Glu Ser Arg Met Ala
165 170 175
Ala Gln Asp Met Thr Phe Asp Leu Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp Ser
180 185 190
Gln Pro Met Ala Pro Val Leu Tyr Leu Gln Asp Lys Ser Ser Asn Phe
195 200 205
Ala Asp Gly Ile Glu Asp Asp Asn Trp Glu Glu Gln Ala Ala Asn Arg
210 215 220
Leu Thr Asp Ala Met Gln Gly Leu Asp Glu Arg Ser Gln Asp Ile Ile
225 230 235 240
Arg Ala Arg Trp Leu Asp Glu Asp Asn Lys Ser Thr Leu Gln Glu Leu
245 250 255
Ala Asp Arg Tyr Gly Val Ser Ala Glu Arg Val Arg Gln Leu Glu Lys
260 265 270
Asn Ala Met Lys Lys Leu Arg Ala Ala Ile Glu Ala
275 280
<210> 2
<211> 855
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgaccgata aaatgcagag cctggcgctg gcgccggtgg gcaacctgga tagctatatt 60
cgcgcggcga acgcgtggcc gatgctgagc gcggatgaag aacgcgcgct ggcggaaaaa 120
ctgcattatc atggcgatct ggaagcggcg aaaaccctga ttctgagcca tctgcgcttt 180
gtggtgcata ttgcgcgcaa ctatgcgggc tatggcctgc cgcaggcgga tctgattcag 240
gaaggcaaca ttggcctgat gaaagcggtg cgccgcttta acccggaagt gggcgtgcgc 300
ctggtgagct ttgcggtgca ttggattaaa gcggaaattc atgaatatgt gctgcgcaac 360
tggcgcattg tgaaagtggc gaccaccaaa gcgcagcgca aactgttttt taacctgcgc 420
aaaaccaaac agcgcctggg ctggtttaac caggatgaag tggaaatggt ggcgcgcgaa 480
ctgggcgtga ccagcaaaga tgtgcgcgaa atggaaagcc gcatggcggc gcaggatatg 540
acctttgatc tgagcagcga tgatgatagc gatagccagc cgatggcgcc ggtgctgtat 600
ctgcaggata aaagcagcaa ctttgcggat ggcattgaag atgataactg ggaagaacag 660
gcggcgaacc gcctgaccga tgcgatgcag ggcctggatg aacgcagcca ggatattatt 720
cgcgcgcgct ggctggatga agataacaaa agcaccctgc aggaactggc ggatcgctat 780
ggcgtgagcg cggaacgcgt gcgccagctg gaaaaaaacg cgatgaaaaa actgcgcgcg 840
gcgattgaag cgtaa 855
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgaattcgat gaccgataaa atgc 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctcgagtta cgcttcaatc gc 22
Claims (10)
1.发酵制备含L-赖氨酸硫酸盐的产品的方法，其包括：
（1）将编码氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的蛋白或其变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌；
（2）在发酵条件下液体培养步骤（1）获得的菌，并收集培养的上清液，所述上清液中包含如下重量配比的氨基酸：
赖氨酸51~55份，优选为51.5~53.5份；
天冬氨酸1.2~1.8份，优选为1.45~1.6份；
苏氨酸0.8~1.1份，优选为0.9~1份；
丝氨酸0.4~0.65份，优选为0.5~0.6份；
谷氨酸2~3份，优选为2.2~2.6份；
甘氨酸0.75~1.1份，优选为0.85~1份；
丙氨酸1.2~1.6份，优选为1.3~1.5份；
缬氨酸0.75~1.1份，优选为0.85~1份；
甲硫氨酸0.3~0.5份，优选为0.35~0.48份；
异亮氨酸0.45~0.75份，优选为0.55~0.65份；
亮氨酸1~1.5份，优选为1.2~1.35份；
酪氨酸0.5~0.8份，优选为0.6~0.75份；
苯丙氨酸0.5~0.8份，优选为0.6~0.7份；
组氨酸0.8~1.2份，优选为0.9~1.05份；和，
精氨酸，0.9~1.3份，优选为1~1.2份；
（3）取通过步骤（2）制备的上清液，进行纯化，得到赖氨酸纯度提高的级份，优选级份中赖氨酸纯度提高至75~95%（w/w），更优选为76~92.6%（w/w），更加优选为78~83%（w/w），最优选为80.7%（w/w）；
（4）另取通过步骤（2）制备的上清液，加入硫酸，并任选进行浓缩，得到酸化的上清液；和
（5）将步骤（3）获得的级份加入硫酸，并喷入干燥机，在干燥机内形成颗粒核心，而后向该干燥机喷入步骤（4）获得的酸化的上清液，包裹上述颗粒核心，然后干燥至含水率小于3%（w/w）。
2.权利要求1所述的方法，其中纯化是层析纯化，优选是凝胶过滤层析纯化，更优选是Sephadex G-10层析纯化。
3.权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中所取的通过步骤（2）制备的上清液与步骤（4）中所另取的通过步骤（2）制备的上清液的体积比为0.5~1.5：2~4，优选为0.75~1.25：2.5~3.5，更优选为1：3。
4.权利要求1所述的方法，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.含L-赖氨酸硫酸盐的颗粒（其优选是饲料添加剂颗粒），其包括颗粒核心和包裹该核心的外层，其中颗粒核心的L-赖氨酸含量为60~72%（w/w），优选为61~70.6%（w/w），更优选为62~65%（w/w），最优选为63.5%（w/w），外层的L-赖氨酸含量为51~55%（w/w），优选为51.5~53.5%（w/w），更优选为52.3%（w/w）。
6.权利要求5所述的颗粒，其含水率小于5%（w/w），优选小于3%（w/w），更优选小于2.5%（w/w）。
7.权利要求5所述的颗粒，其是由权利要求1~4之任一所述的方法制备的。
8.含L-赖氨酸硫酸盐的颗粒核心（其优选是饲料添加剂颗粒核心）在制备含水率小于5%（w/w）（优选小于3%（w/w），更优选小于2.5%（w/w））的含L-赖氨酸硫酸盐的饲料添加剂中的应用，其中所述含L-赖氨酸硫酸盐的颗粒核心的L-赖氨酸含量为60~72%（w/w），优选为61~70.6%（w/w），更优选为62~65%（w/w），最优选为63.5%（w/w）。
9.权利要求8所述的应用，其中所述含L-赖氨酸硫酸盐的颗粒核心是由权利要求1~4之任一所述的方法的步骤（1）、（2）、（3）和（5）制备的。
10.权利要求8所述的应用，其中所述含L-赖氨酸硫酸盐的饲料添加剂是权利要求5~7之任一所述的颗粒。
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-
2012
- 2012-11-07 CN CN201310403477.XA patent/CN103451221B/zh active Active
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