CN103444525A

CN103444525A - 一种无激素的玉米愈伤组织再生方法

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Publication number: CN103444525A
Application number: CN2013103571880A
Authority: CN
Inventors: 祁喜涛; 胡建广; 吴景
Original assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-08-15
Filing date: 2013-08-15
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2033-08-15
Also published as: CN103444525B

Abstract

本发明公开一种无激素的玉米愈伤组织再生方法。将长势良好、呈颗粒状的玉米愈伤组织培养在无激素的胚状体诱导培养基上，于24～26℃培养20～23天，诱导产生胚状体；将胚状体转接到无激素的再生培养基上，培养温度为24～26℃，光照度为12000～18000lux，每天的光照时间为16h，培养至生出根和芽，得到再生植株；将再生植株于如下条件下继续培养6～7天进行壮苗即可：26～28℃、24000～30000lux，每天光照时间为16h。本发明通过改变蔗糖用量来调控再生培养阶段的渗透压，从而实现愈伤组织的高效再生，全程不需要植物激素。这一方法不但节约了实验成本，而且避免了长期使用激素对组织材料的毒害。

Description

一种无激素的玉米愈伤组织再生方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，特别涉及一种无激素的玉米愈伤组织再生方法。

背景技术

高效再生系统的建立是玉米基因工程育种的关键。现有的玉米再生技术无不依赖生长素和细胞分裂素，这些植物激素主要包括萘乙酸（NAA）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA）、脱落酸（ABA）等。现有的玉米再生方法通常为：首先在含生长素的诱导培养基上诱导出松脆、呈颗粒状且生长旺盛的愈伤组织，将这些愈伤组织转移到含NAA（0.1～0.3mg/L）+6-BA（2～4mg/L）或其它激素组合的再生培养基上诱导植株再生，然后将再生植株转移到含NAA（0.1～0.3mg/L）或NAA（0.1～0.3mg/L）+IBA（0.3～0.5mg/L）的生根培养基诱导根再生；也有部分方法为在再生培养之前进行预处理，在这个阶段通常需要添加ABA（3～6mg/L）。

此类再生方法不仅操作步骤多且耗时长，而且常常造成以下不良后果：1）长时间在含激素的培养基上诱导生长，玉米基因组变异频率增加，再生植株畸形率较高，甚至因激素中毒而死亡；2）这种先再生植株后生根的方式，生根时间长，经常出现根系膨大，根毛少，生根率低，影响后期的田间生长。利用现有再生植株再生技术严重束缚基因工程育种技术在玉米育种生产中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种无激素的玉米愈伤组织再生方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种无激素的玉米愈伤组织再生方法，包含如下步骤：

（1）将长势良好、呈颗粒状的玉米愈伤组织培养在胚状体诱导培养基上，于24～26℃培养20～23天，诱导产生胚状体；

（2）将步骤（1）得到的胚状体转接到无激素的再生培养基上，培养温度为24～26℃，光照度为12000～18000lux，每天的光照时间为16h，培养至生出根和芽，得到再生植株；

（3）将步骤（2）得到再生植株于如下条件下继续培养6～7天进行壮苗：26～28℃、24000～30000lux，每天的光照时间为16h；即可炼苗移栽至田间；

步骤（1）中所述的玉米愈伤组织为任何可继代的长势良好的玉米愈伤组织，优选为超甜玉米自交系1132、超甜玉米自交系日超-1或HiII杂交种的玉米愈伤组织；

步骤（1）中所述的胚状体诱导培养基的成分如下：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖40～80g/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES（2-吗啉乙磺酸）500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH值为5.8；

所述的蔗糖的含量优选为60g/L；

步骤（2）中所述的无激素的再生培养基的成分如下：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖20～40g/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH值为5.8；

所述的蔗糖的含量优选为30g/L；

步骤（2）中所述的光照度优选为16000lux；

步骤（2）中所述的培养至生出根和芽的时间优选为4～7天；

步骤（3）中所述的光照度优选为30000lux；

步骤（3）中所述的炼苗的方法优选为：将再生植株小心从培养基中取出，清水冲洗静根部培养基，然后移栽到装有花肥土的小花盆中，浇水后用大小适合的玻璃烧杯倒扣在花盆上，此举目的在于防止刚移栽的植株过度蒸发脱水致死；然后在温度26～28℃、光照30,000lux、光照16h/d，湿度90～95%的培养条件下培养4～5天。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明通过改变蔗糖用量来调控组织材料再生培养阶段的渗透压，从而实现愈伤组织的高效再生，全程不需要植物激素。这一方法不但节约了实验成本，而且避免了长期使用激素对组织材料的毒害，获得的再生植株有下列特点：①幼苗株型正常，根和芽长势旺盛，易于移栽成活，畸形植株频率低；②周期短，从胚壮体诱导到再生植株移到大田仅需不到5周，现有的再生技术通常需要至少6周，显著缩短了再生时间。

（2）本发明可实现愈伤组织先再生出根，然后分化再生出芽，部分实现根芽同步再生，再生周期缩短到仅5周时间；而且显著降低再生植株畸形率，植株可育率明显提高。

附图说明

图1为本发明所述的方法诱导出的玉米胚状体的照片图；其中：a为超甜玉米自交系1132愈伤组织形成的胚状体；b为HiII杂交种愈伤组织形成胚状体；c为超甜玉米自交系日超-1愈伤组织形成的胚状体。

图2为再生培养基上形成的幼苗的照片图；其中：a为超甜玉米自交系1132胚状体再生的幼苗；b为HiII杂交种胚状体再生的幼苗；c为超甜玉米自交系日超-1胚状体再生的幼苗。

图3为再生培养2周时的再生植株的照片图，其中：a为超甜玉米自交系1132再生植株；b为HiII杂交种再生植株；c为超甜玉米自交系日超-1再生植株。

图4为使用现有技术即含激素的愈伤组织再生方法得到的胚状体和再生植株的照片图，其中：a为ABA作用下诱导出的胚状体；b为6-BA和NAA作用下再生的植株；c为IBA和NAA作用下诱导根再生；d为诱导出的再生根。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：再生培养基中蔗糖含量对超甜玉米自交系1132分化再生的影响

（1）挑选松脆、颗粒状长势良好的超甜玉米自交系1132（已在“李余良，多个抗虫基因转化超甜玉米的研究[D].华南农业大学；2004年”公开）愈伤组织，将其分别转接到含蔗糖20,000mg/L、40,000mg/L、60,000mg/L、80,000mg/L的胚状体诱导培养基上培养。胚状体诱导培养基成分为：MS大量元素（即MS培养基中的大量元素）+MS微量元素（即MS培养基中的微量元素）+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖（浓度分别为20,000mg/L、40,000mg/L、60,000mg/L和80,000mg/L）+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8。培养温度24～26℃，培养到第三周（第20天）时观察发现：在含蔗糖20,000mg/L的培养基上，有少量胚状体形成，且再生出少量的根，但无芽点再生出来；在含蔗糖40,000mg/L的培养基上，胚状体较20,000mg/L的培养基上多，同样只再生出根而无芽再生；在含蔗糖60,000mg/L的培养基上，有大量胚状体形成，布满每块愈伤组织，并且每块愈伤组织上均再生出根和少量芽点；在含蔗糖80,000mg/L的培养基上，胚状体较60,000mg/L的培养基上少，与40,000mg/L的培养基上的相当，但是胚状体的长势较40000mg/L的培养基的差，同样只再生出根而无芽再生。综合考虑胚状体多少、是否分化出根和芽等情况，可见蔗糖含量为60,000mg/L的胚状体诱导培养基分化出根和芽的情况明显优于其他蔗糖浓度的胚状体诱导培养基。

（2）将步骤（1）中在含蔗糖60,000mg/L的胚状体培养基上的胚状体转接到分别含蔗糖20,000mg/L、30,000mg/L、40,000mg/L的再生培养基培养。再生培养基成分：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖（浓度分别为20,000mg/L、30,000mg/L、40,000mg/L）+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8。培养温度24～26℃，光照度12,000～18,000lux（分设12,000lux、14,000lux、16,000lux、18,000lux四个光强度梯度），光照16h/d，培养到第4天时观察发现：1）蔗糖浓度一定（30,000mg/L），胚状体在四个光照度条件下均可诱导芽的分化再生，但是随着光照强度的增加，再生出芽点的时间逐渐延长，如在12,000lux条件下再生出芽点时间比18,000lux条件下提前1～2天，但芽的绿色较18,000lux淡，长势也较弱。综合考虑芽再生时间和长势，16,000lux的光照度较理想；2）光照强度一定（16,000lux），在含蔗糖20,000mg/L的培养基上，组织块分化出根和芽，芽的长势比根旺盛，芽长约3.5cm，而根少（只有2条）；在含蔗糖30,000mg/L的培养基上，组织块也分化出根和芽，且根和芽的长势均很旺盛，芽长约2.5cm，根有5～7条；在含蔗糖40,000mg/L的培养基上，组织块分化出茂密的根，未见明显的芽长出。综合考虑根和芽的长势及根的多少，可见蔗糖含量为30,000mg/L的再生培养基得到的再生植株的根和芽是最优的。

（3）将步骤（2）中含蔗糖30,000mg/L的再生培养基连同再生植株一起转移到温度26～28℃、光照度24,000～30,000lux、光照16h/d的培养条件下继续培养，5天后观察发现：光照度在24,000～30,000lux区间，均可实现壮苗、壮根培养，但是光照度为30,000lux条件下，再生苗的颜色浓绿，最为理想；本发明所用人工气候箱为宁波江南仪器厂的RXZ-500。经此阶段培养的再生植株即可炼苗移栽。此时再生植株根系发达，苗株健壮。

实施例2：以超甜玉米自交系1132愈伤组织进行再生培养

（1）挑选松脆、呈颗粒状长势良好愈伤组织72块，将其转接到倒有胚状体诱导培养基的培养皿上培养，每个培养皿（直径10cm）上放置6块愈伤组织。胚状体诱导培养基成分为：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖60,000mg/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8，培养温度25℃，培养3周时所有愈伤组织上全诱导出胚状体，胚状体的形态如图1a所示。

（2）将步骤（1）中得到的72块胚状体转接到含再生培养基的玻璃培养瓶中培养再生幼苗，每瓶1～2块组织。再生培养基成分：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖30,000mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8，培养温度25℃，光照度16,000lux，光照16h/d，约1周（第5天）有70块组织上再生出根和芽（图2a）。再生效率97%（再生效率=再生出根和芽的组织块数/再生培养的组织总块数），每个组织块上分化出1～3个幼芽，但多数为1个幼芽。

（3）将步骤（2）得到的再生植株转移到温度26～28℃、光照30,000lux、光照16h/d的培养条件下（培养基相同）继续培养1周，此时再生植株根系繁茂，移栽成活率高（如图3a所示）。接着移栽炼苗，移栽炼苗的方法和条件是：将再生植株小心从培养基中取出，清水冲洗静根部培养基，然后移栽到装有花肥土的小花盆中，浇水后用大小适合的玻璃烧杯倒扣在花盆上（此举目的在于防止刚移栽的植株过度蒸发脱水致死），然后在温度26～28℃、光照30,000lux、光照16h/d，湿度90～95%的培养条件下培养4～5天即可移栽到田间。本实施例中，炼苗移栽68株，田间成活67株，株型正常，移栽成活率98%（移栽成活率=田间成活株数/炼苗移栽株数）。

实施例3：以HiII愈伤组织进行再生培养

（1）挑选松脆、呈颗粒状长势良好的HiII（已在“马云霞等.农杆菌介导的抗草甘膦基因（sxglr-11）的玉米遗传转化,山西农业科学,2009,6”公开）愈伤组织90块，将其转接到倒有胚状体诱导培养基的培养皿上培养，每个培养皿（直径10cm）上放置6块愈伤组织。胚状体诱导培养基成分为：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖60,000mg/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8，培养温度25℃，培养3周（20天）时所有愈伤组织上全诱导出胚状体，胚状体的形态如图1b所示。

（2）将步骤（1）得到的90块胚状体转接到含再生培养基的玻璃培养瓶中培养再生幼苗，每瓶1～2块组织。再生培养基成分：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖30,000mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8，培养温度25℃，光照度16,000lux，光照16h/d，培养约1周（第5天）有90块组织上再生出根和芽（图2b）。再生效率100%（再生效率=再生出根和芽的组织块数/再生培养的组织总块数），每个组织块上分化出1～3个幼芽，但多数为1个幼芽。

（3）将步骤（2）得到的再生植株连同培养基转移到温度26～28℃、光照30,000lux、光照16h/d的培养条件下继续培养1周，如图3b所示，此时再生植株根系繁茂，移栽成活率高。接着移栽炼苗，操作同实施例2。本实施例中，炼苗移栽90株，田间成活90株，株型正常，移栽成活率100%（移栽成活率=田间成活株数/炼苗移栽株数）。

实施例4：以超甜玉米自交系日超-1愈伤组织进行再生培养

（1）挑选松脆、呈颗粒状长势良好的日超-1（已在“李高科等.优质、抗逆甜玉米群体配合力及遗传潜势分析,中国农学通报,2008,9”公开）愈伤组织60块，将其转接到倒有胚状体诱导培养基的培养皿上培养，每个培养皿（直径10cm）上放置6块愈伤组织。胚状体诱导培养基成分为：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖60,000mg/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8，培养温度25℃，培养约4周（第23天）时59块愈伤组织上诱导出胚状体，胚状体的形态如图1c所示。

（2）将步骤（1）得到的59块胚状体转接到含再生培养基的玻璃培养瓶中培养再生幼苗，每瓶1～2块组织。再生培养基成分：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素（维生素B1）3.5mg/L+烟酸吡哆醇（维生素B6）1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖30,000mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH5.8，培养温度25℃，光照度16,000lux，光照16h/d，培养1周（第7天）有56块组织上再生出根和芽（图2c）。再生效率95%（再生效率=再生出根和芽的组织块数/再生培养的组织总块数），每个组织块上分化出1～3个幼芽，但多数为1个幼芽。

（3）将（2）中再生植株连同培养基转移到温度26～28℃、光照30,000lux、光照16h/d的培养条件下继续培养1周，如图3c所示，此时再生植株根系繁茂，移栽成活率高。接着移栽炼苗，操作同实施例2。本实施例中，炼苗移栽55株，成活55株，株型正常。移栽成活率100%（移栽成活率=田间成活株数/炼苗移栽株数）。

对比例1：原有方法再生培养超甜玉米自交系1132愈伤组织

（1）挑选松脆、呈颗粒状长势良好的愈伤组织60块，将其转接到含脱落酸（ABA）的继代培养基诱导胚状体，每个培养皿（直径10cm）上放置6块愈伤组织。继代培养基成分为：N6大量元素（N6培养基中的大量元素）+B5维生素+谷氨酰胺300mg/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸700mg/L+蔗糖20,000mg/L+AgNO₃900mg/L+ABA3.0mg/L+植物凝胶2700mg/L，pH5.8，培养温度26～28℃，培养3周后（第23天）有58块愈伤组织上诱导出胚状体。但此种方法诱导的胚状体与本发明方法相比，出现第一个胚状体的时间延迟1周左右，且长出幼芽的组织均无根长出，如图4a所示为胚状体。

（2）将步骤（1）得到的58块胚状体转接到含激素的再生培养基上再生幼苗。含激素再生培养基成分：MS大量元素+MS微量元素+B5维生素+谷氨酰胺300mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20,000mg/L+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+植物凝胶2700mg/L，pH5.8，培养温度26～28℃，光照度16,000lux，光照16h/d，培养2周（第14天）有47块组织上再生出幼苗，其余均变成无芽的绿色组织，有芽或无芽的分化组织均无根长出（图4b）。再生效率81%（再生效率=再生出根或芽的组织块数/再生培养的组织总块数）。

（3）将（2）中再生植株转移到生根培养基，温度26～28℃、光照16h/d，30,000lux的培养条件下诱导根再生。生根培养基成分：1/2MS基本培养基（MS培养基中各物质的浓度减少一半）+蔗糖10,000mg/L+IBA3.0mg/L+NAA0.1mg/L+植物凝胶2700mg/L，pH5.8。第一周再生植株均无根长出（图4c），第2周开始相继有根长出，但此种方法再生出的根根毛稀少，而且由于根部畸形膨大使得根系脆而易断（图4d），难以成功移栽。另外，此种方法进行根再生培养，植株基部与培养基接触部位易褐化，导致极难再生根。本实施例中，炼苗移栽22株，成活16株，14株株型正常。移栽成活率73%（移栽成活率=田间成活株数/炼苗移栽株数）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种无激素的玉米愈伤组织再生方法，其特征在于包含如下步骤：

（3）将步骤（2）得到再生植株于如下条件下继续培养6～7天进行壮苗即可：26～28℃、24000～30000lux，每天的光照时间为16h；

步骤（1）中所述的胚状体诱导培养基的成分如下：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素3.5mg/L+烟酸吡哆醇1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖40～80g/L+脯氨酸300mg/L+水解酪蛋白100mg/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH值为5.8；

步骤（2）中所述的无激素的再生培养基的成分如下：MS大量元素+MS微量元素+肌醇250mg/L+盐酸硫胺素3.5mg/L+烟酸吡哆醇1.0mg/L+烟酸0.5mg/L+甘氨酸4.0mg/L+蔗糖20～40g/L+MES500mg/L+植物凝胶2500mg/L，pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的无激素的玉米愈伤组织再生方法，其特征在于：步骤（1）中所述的玉米愈伤组织为超甜玉米自交系1132、超甜玉米自交系日超-1或HiII杂交种的玉米愈伤组织。

3.根据权利要求1所述的无激素的玉米愈伤组织再生方法，其特征在于：步骤（1）中所述的胚状体诱导培养基中的蔗糖含量为60g/L。

4.根据权利要求1所述的无激素的玉米愈伤组织再生方法，其特征在于：步骤（2）中所述的无激素的再生培养基中的蔗糖含量为30g/L。

5.根据权利要求1所述的无激素的玉米愈伤组织再生方法，其特征在于：步骤（2）中所述的光照度为16000lux。

6.根据权利要求1所述的无激素的玉米愈伤组织再生方法，其特征在于：步骤（2）中所述的培养至生出根和芽的时间为4～7天。

7.根据权利要求1所述的无激素的玉米愈伤组织再生方法，其特征在于：步骤（3）中所述的光照度为30000lux。