CN103432191B - 一种能促进血管新生的当归补血复方微囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明针对现有技术中当归补血汤剂型的缺陷，提供把现有方剂当归补血汤制成复方提取物，并将此复方提取物作为整体进行包埋，实现微囊化，不仅保留其功效，还能发挥微囊化的优势。本发明选择了水提醇沉法提取当归补血汤；然后用复凝聚法作为当归补血汤微囊制备方法，同时筛选出海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙及其浓度作为适合的囊材。本发明提供的当归补血复方微囊，除克服了传统汤剂的溶出度不高、服用困难，携带不便等缺陷外，由于把复方进行整体包埋所以并不影响当归补血汤的整体药效，同时微囊化的制剂达到了缓释的效果，大大改善了传统当归补血汤的整体性能。而此制备方法中提取工艺简单、所用试剂安全，微囊制备工艺简单易行，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种能促进血管新生的当归补血复方微囊及其制备方法。
背景技术
血管新生对组织再生、创伤修复以及缺血性疾病等起着重要的作用，中医药治疗创伤及缺血性疾病有其特色和优势。中草药或复方安全、有效、价廉，目前中药对血管新生的研究方兴未艾，探索促血管新生的中药或复方并研究其作机制具有重要的社会和经济意义。
当归补血汤是补气生血的经典方剂，由黄芪、当归按5:1组成。现代研究表明，黄芪中黄芪多糖、黄芪皂苷，当归中当归多糖、阿魏酸等均具有益气养元、促血管新生的作用，另一方面，当归补血汤作为复方，其黄芪、当归的多种活性成分在共煎时有协同作用，其促进血管新生的黄芪甲苷、黄芪多糖、阿魏酸的含量比单煎含量要多，符合中医的整体思想。而当归补血汤中没有某一部分、部位或单体能代表全方功效及其物质基础，其促进血管新生的作用应归功于汤剂整体，这与中医整体观及其现代复杂性系统理论不谋而合。
微囊技术首先在1957年初由GreenB.K.提出，它是指用半透膜包被生物活性物质以形成微囊的技术。近年来，在医学领域，很多学者对微囊的制备和应用进行了大量的研究，其良好的发展前景引起了人们极大的兴趣。药物经微囊化可以减缓其在空气中分解，降低对人体组织脏器的刺激，具有缓释、控释作用而减少服药量、延长药效。既保留了药物的独特的性能，又能发挥微囊化的作用，故微囊化技术己经成为当今世界上的一种发展迅速、用途广泛的新型技术。在中医药领域，中药微囊化技术已进行相关的研究，中药微囊剂亦能发挥缓释、长效等作用，同时还具有制剂稳定、服用量小、工艺简单且对囊心物要求不高等独特优点，可以作为中药新剂型改革与发展的趋势。因此，进行微囊技术的研究，尤其是进一步开展中药微囊技术的制备、应用及深化微囊理论研究具有重大意义。
传统的当归补血汤为汤剂，具有传统汤剂溶出度不高、服用困难，携带不便等缺陷；而倘若把组成当归补血汤的药材黄芪中所含黄芪多糖、黄芪皂苷，当归中所含当归多糖、阿魏酸等具有益气养元、促血管新生的作用的部位提取出来进行简单的合并并制成颗粒剂等常见剂型，其并不能完全代替当归补血汤这一复方，因为黄芪、当归的多种活性成分在共煎时有协同作用，其黄芪甲苷、黄芪多糖、阿魏酸的含量比单煎含量要高得多，所以当归补血汤中没有某一部分、部位或单体能代表全方功效及其物质基础。所以在现有的研究基础下，未见把当归补血汤用中医整体观的思路并结合现代中药微囊技术，在改变当归补血汤剂型的同时，提高其药物性能。
发明内容
本发明针对现有技术存在缺陷提供了一种能促进血管新生的当归补血复方微囊及其制备方法。具体为提供把现有方剂当归补血汤制成复方提取物，并将此复方提取物作为整体进行包埋，实现微囊化，不仅保留当归补血汤的功效，还能发挥微囊化的优势，进而为中医药新型制剂的研制奠定基础。
本发明选择了水提醇沉、旋转蒸发等当归补血汤提取方法；当归补血汤微囊制备方法复凝聚法作为当归补血汤微囊制备方法，筛选出海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙作为适合的囊材，以微囊中的阿魏酸的包封率作为主要指标，通过单因素及正交试验考察了海藻酸钠的浓度、壳聚糖的浓度、当归补血汤提取物浓度、氯化钙的浓度对微囊性能的影响，并通过验证试验确定了复凝聚法制备当归补血汤微囊最佳工艺条件，即海藻酸钠1.5%、壳聚糖0.3%、当归补血汤药物浓度0.4g/mL、氯化钙浓度2%。包埋率可达59.92%，显示了良好的成型效果，能达到微囊的制备目的和要求。通过电子显微镜观察微囊形态，测定微囊粒径，制定了粒径分布图，显示了良好的成型效果。精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验表明具有良好的精密度、重复性、回收率，达到了微囊制备的目的和要求。其体外溶出度试验表明，壳聚糖/海藻酸钠当归补血汤微囊具有显著的缓释特征，释药动力学拟合符合一级方程及Higuchi方程。
技术方案
本发明一种能促进血管新生的当归补血复方微囊的制备方法，包括当归补血复方浸膏制备与微囊制备两大工艺，具体步骤如下：
（1）当归补血复方浸膏的制备工艺：取质量配比为5:1的黄芪、当归药材浸泡后用水煎煮，取药液部分进行浓缩；把所得浓缩液于酒精中醇沉，冷藏后取上清液，将此上清液进一步挥干乙醇，得当归补血复方提取物；把所得的当归补血复方提取物低温干燥至无水分浸膏，即得当归补血复方浸膏。
（2）微囊制备工艺：将步骤（1）所得当归补血复方浸膏溶入海藻酸钠溶液中；然后将此当归补血复方浸膏的海藻酸钠溶液滴加入氯化钙溶液中制得球状固体，真空抽滤得球状固体；将此球状固体颗粒洗涤后加入壳聚糖醋酸溶液中反应，之后再加入戊二醛固化，真空抽滤取固体部分并干燥至无水分即得当归补血复方微囊。
本发明有如下几种改进：
步骤（1）中所述酒精浓度为80%，冷藏温度为4℃。
步骤（2）中所述当归补血复方浸膏的海藻酸钠溶液是用注射器配置9号针头滴加入处于磁力搅拌中的氯化钙溶液中；所述壳聚糖醋酸溶液中反应时间为1h；所述戊二醛固化时间为90min。
步骤（2）中所述海藻酸钠溶液中海藻酸钠浓度为1.5%、所述壳聚糖醋酸溶液中壳聚糖浓度为0.3%、所述当归补血复方浸膏中药物浓度为0.4g/mL、所述氯化钙溶液中氯化钙浓度为2%。
本发明同时提供用上述当归补血复方微囊的制备方法制备得到的当归补血复方微囊。所得当归补血复方微囊的主要成分为阿魏酸、黄芪甲苷。
有益效果
本发明把当归补血汤提取物作为整体进行包埋并制成微囊，此当归补血汤复方微囊通过电子显微镜观察微囊形态，测定微囊粒径，显示了良好的成型效果。精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验表明具有良好的精密度、重复性、回收率，达到了微囊制备的目的和要求。其体外溶出度试验表明，本发明提供的当归补血复方微囊具有显著的缓释特征，释药动力学拟合符合一级方程及Higuchi方程。
所以，用本发明提供的制备方法制备得到的当归补血复方微囊，除克服了传统汤剂的溶出度不高、服用困难，携带不便等缺陷外，由于把复方进行整体包埋所以并不影响当归补血汤的整体药效，同时微囊化的制剂达到了缓释的效果，大大改善了传统当归补血汤的整体性能。
经研究发现，复凝聚法制备当归补血复方微囊，当制备方法中海藻酸钠为1.5%、壳聚糖为0.3%、当归补血汤提取物浓度为0.4g/mL、氯化钙浓度为2%时，包埋率可达59.92%。
本发明所提供当归补血复方微囊的制备方法中当归补血提取物提取工艺简单、所用试剂安全，微囊制备工艺也同样简单易行，适合工业化生产。
附图说明
图1微囊整体图
图2微囊（60）╳
图3微囊粒径分布
图4当归补血复方微囊释放曲线
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，不是对本技术方案的限制。
本发明中的药材来源如下：黄芪、当归分别购于南京海源中药饮片有限公司和徐州彭祖中药饮片有限公司。
实施例1当归补血复方微囊制备方法的选择
方法（一）：
按质量配比称取黄芪2kg，当归400g药材浸泡2小时后水煎煮2小时，煎煮两次，将两次煎煮的药液浓缩至2.4kg的浓缩液，予80%的酒精醇沉，冰箱下放置12小时后取出，倒出上清液，在旋转蒸发仪中将乙醇蒸馏，得当归补血复方提取物约500ml，放置真空干燥器中低温下干燥至无水分浸膏，称重。
用50ml注射器将当归补血汤提取物的海藻酸钠溶液吸入针管，配置9号针头，缓慢滴加至磁力搅拌仪搅拌下的氯化钙溶液中，即见氯化钙溶液中直径约1mm的淡黄色球状固体，滴加完搅拌30min后真空抽虑，将微囊用蒸馏水洗涤，再加入至壳聚糖醋酸溶液中反应1h，加入戊二醛6ml固化90min，真空抽滤，40℃下干燥48h即得当归补血复方微囊。称重约10g。
方法（二）：
按质量配比称取黄芪2kg，当归400g药材，将黄芪、当归药磨成粗粉，以70%乙醇渗漉，回收乙醇，提取物干燥，磨粉，为当归补血汤提取物，亦为囊心物。取液体石蜡400ml，置3000ml烧瓶中，加热至70℃，加司盘6030g，升温至100℃，加入PEG6000100g，使之熔化，在搅拌下加入囊心物100g，降温至60℃，搅拌15min，滴入经过冰冻的石油醚600ml，不断搅拌，即凝成PEG6000包裹的水溶性中药提取有效部位微囊。过滤，微囊用少量石油醚洗涤2次，室温干燥即得，重量约为100g。所制微囊成形较均匀，易分离。
方法（三）：
按质量配比称取黄芪2kg，当归400g药材浸泡2小时后水煎煮2小时，煎煮两次，将两次煎煮的药液浓缩至2.4kg的浓缩液，予80%的酒精醇沉，冰箱下放置12小时后取出，倒出上清液，在旋转蒸发仪中将乙醇蒸馏，得当归补血复方提取物约500ml，称重。将叶当归补血汤提取物溶于食用酒精中，并加入一定量的乳化剂(蔗糖酯)；壁材溶液：向壁材中加入，在50～60℃搅拌溶解，使其溶胀、分散，制成壁材溶液。按照一定的芯壁比和一定壁材质量浓度要求，将芯材溶液加入到壁材溶液中，搅拌、混匀，得到的混合液经胶体磨均质乳化后，在一定的条件下进行喷雾干燥，制成当归补血汤微囊。
最终筛选出方法（一），简单易行产率高。
实施例2当归补血复方微囊制备的工艺研究
用实施例1中得到当归补血汤微囊，考察微囊材料配比影响因素，分别从单因素、正交试验、验证试验方面筛选出海藻酸钠1.5%、壳聚糖0.3%、当归补血汤药物浓度0.4g/mL、氯化钙浓度2%。包埋率可达59.92%，显示了良好的成型效果，能达到微囊的制备目的和要求。（正交实验见表1，方差分析见表2，验证试验见表,3）
表1正交试验结果
表2方差分析
表3验证试验结果
实施例3当归补血汤微囊的质量评价
根据实施例2中当归补血汤微囊的最佳工艺结果，选择3组最佳工艺所得微囊，分别从以下几个方面进行质量评价：
（1）微囊形态及粒径分布
采用生物显微镜及成像系统对以最佳工艺参数下制得的当归补血汤微囊的外形进行观察，并随机抽取200个微囊进行粒径测定。图1可见微囊的形态呈类球形，分布大体均匀；图2为微囊放大60倍之后的形态；图3可知200个微囊的粒径分布主要集中在800～900um之间。
（2）提取物对胰岛素抵抗大鼠肝功能的影响
给药结束后，大鼠放血处死，取肝脏福尔马林固定，做病理切片，并做苏木素-伊红(HE)染色。结果显示（图1）：对照组大鼠肝组织结构完整、清楚，肝小叶结构正常，肝细胞排列成肝索状，在中央静脉周围呈放射状分布，细胞呈多边形。胰岛素抵抗大鼠呈中-重度脂肪肝，部分脂滴形成大空泡，将细胞核挤压至一边，肝小叶结构破坏，肝细胞排列不规整,并伴大量肝细胞肿胀，部分呈气球样变，所有大鼠均可见到小叶内炎症，炎症细胞以单个核细胞为主，伴点状或小灶性坏死。而给药后，肝脏损伤状况有所改善，组织HE染色显示即有局灶性肝细胞脂肪变性，呈以小泡性为主的混合性脂肪变性，局部出现小叶内炎症细胞浸润。
（3）精密度试验
精密吸取阿魏酸对照品溶液（浓度12μg/ml）20μL，注入液相色谱仪，按照设定的色谱条件进行测定，连续进样6次，测定峰面积。结果见表4；阿魏酸的峰面积相对标准偏差(RSD)为1.85%，小于2%，说明精密度良好。
表4仪器精密度试验结果
（4）重复性试验
取当归补血复方微囊约1g，精密称定，共6份，按照制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定阿魏酸含量。结果见表5；阿魏酸含量的相对标准偏差(RSD)为1.64，小于2%，说明重复性良好。
表5重复性试验结果
（5）稳定性试验
取同一份供试品溶液测定阿魏酸含量，分别在0、2、4、6、8、10小时测定一次，共测定6次。结果见表6：阿魏酸的峰面积相对标准偏差(RSD)为1.80%，均小于2%，说明样品在10h内具有良好的稳定性。
表6稳定性试验结果
（6）回收率试验
精密称取已知微囊含量样品6份，分别加入一定量阿魏酸对照品，按照设定的色谱条件测定阿魏酸含量。结果表明：阿魏酸的平均回收率分别97.73%，回收率相对标准偏差(RSD)为1.84%，小于2%，说明本法具有良好的回收率，见表7。
表7加样回收率结果
（7）体外释放试验
1.微囊的释放度曲线
按照《中国药典》2005年版二部第二法桨法[65]测定溶出度，以磷酸盐缓冲液(pH6.8)200ml作为溶出介质置于250mL溶出杯中，转速100r/min，温度为（37±0.5）℃。精确称取微囊10g放入溶出杯中，分别于0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，10，20h各时间点取样1mL，样品液经0.45μm微孔滤膜滤过装入进样瓶，用HPLC色谱分析阿魏酸含量，计算各时间点内释放量累积百分率（表8），同时绘制当归补血汤-时间的释放动力学曲线（图3）。
释放率(%)=(m2/M2)×100%
(其中m2：某时间点阿魏酸累积释放量；M2：微囊内阿魏酸的总含量)
表8微囊累及释放结果
微囊累积释放时间(h)
根据当归补血复方微囊体外溶出实验的测定结果，以时间t(单位h)为横坐标，释放率为纵坐标绘图，结果如图4所示。由表8可以看出，当归补血汤微囊在1h内释放30%左右，随后每小时内缓慢释放，表明该载药微囊有一定缓释作用。微囊在前0.5h内释放较快，考虑是来自于吸附在微囊表面的药物分子，随后溶剂从微囊空隙渗入囊内，包封于微囊中的药物逐渐从空隙缓慢释放，从而达到缓释作用。
Claims (2)
1.一种能促进血管新生的当归补血复方微囊的制备方法，包括当归补血复方浸膏制备与微囊制备两大工艺，具体步骤如下：
(1)当归补血复方浸膏的制备工艺：取质量配比为5:1的黄芪、当归药材浸泡后用水煎煮，取药液部分进行浓缩；把所得浓缩液于80％酒精中醇沉，4℃冷藏后取上清液，将此上清液进一步挥干乙醇，得当归补血复方提取物；把所得的当归补血复方提取物低温干燥至无水分浸膏，即得当归补血复方浸膏；
(2)微囊制备工艺：将步骤(1)所得当归补血复方浸膏溶入1.5％的海藻酸钠溶液中；然后将此当归补血复方浸膏的海藻酸钠溶液用9号针头滴加入处于磁力搅拌中浓度为2％的氯化钙溶液中制得球状固体，真空抽滤得球状固体；将此球状固体颗粒洗涤后加入0.3％的壳聚糖醋酸溶液中反应1h，之后再加入戊二醛固化90min，真空抽滤取固体部分并干燥至无水分即得当归补血复方微囊。
2.如权利要求1所述的当归补血复方微囊，其特征在于：所述当归补血复方微囊的主要成分为阿魏酸、黄芪甲苷。
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