CN103421772A - 与奶牛耐热性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物分子标记制备技术领域。具体涉及一种与奶牛耐热性状相关的分子标记的制备及应用。本发明克隆得到如序列表SEQ ID NO：1所示的与奶牛耐热性状相关的基因片段，序列长度为426bp，在该序列的第54位、第140位、第80位、第197位、第383位、第130位和第359位分别存在一个等位基因突变，本发明共获得7个多态位点。本发明克隆的分子标记可用于奶牛耐热性状关联分析上。

Description

与奶牛耐热性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于动物分子标记技术领域，具体涉及一种与奶牛耐热性状相关的分子标记及应用，该耐热性状与奶牛的抗热应激反应性状有关。

背景技术

长期以来，热应激是影响我国南方地区奶牛生产的普遍性问题，每年因为热应激使奶牛产奶量降低10万吨以上，严重影响着我国奶牛业的发展，造成了巨大的经济损失。奶牛的热应激是由环境和遗传共同作用的结果，目前奶牛业生产多采用营养调控为主，辅以环境改善的综合措施。通过环境改善和营养调控能在一定程度上改善奶牛的热应激，然而最根本的方法还是通过遗传改良的手段，进行选择繁育，逐步培育抗热应激品种，才能从根本上解决热应激对奶牛生产性能和繁殖性能带来的危害。传统育种法主要从性状的表型进行选择，也取得了一定的进展。特别是当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因效应遗传时，表型选择是非常有效的。但动物的许多经济性状为数量性状，其表型性状受许多微效基因的控制，且受环境的影响较大，此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量多是不确切的，因而选择往往是低效甚至是无效的。而分子标记辅助选择能够通过影响选择的时间、选择的强度以及准确性而极大地提高这类低遗传力性状的选择功效。标记辅助选择，就是通过标记对目标性状实施间接选择，其前提是标记与目标性状紧密关联。分子标记辅助选择与传统育种方法相结合已经是目前畜禽遗传改良工程所采取的主要方法之一，作为分子标记辅助选择的基础，寻找与耐热性状基因座相连锁的分子遗传标记为提高分子标记辅助选择、奶牛耐热抗应激品种培育提供新途径和方法。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)，是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的转换、颠换、插入和缺失而引起的多态性。SNPs是基因组中分布最广泛而稳定的点突变，在动植物的基因组中，存在着大量的SNPs，对于大规模的研究而言，它比微卫星标记和其他的重复序列更可靠，随着对SNP检测和分析技术进一步发展，尤其是与DNA芯片等技术的结合，它已成继第一代限制性片段长度多态性标记和第二代微卫星多态性标记之后的第三代新型分子标记。目前，各国学者在遗传育种方面已展开对SNPs的研究，作为新一代的遗传标记技术，SNPs将在生物的遗传多样性分析、基因标记、连锁图谱的构建、基因组结构与功能研究、遗传改良和医学研究等领域发挥巨大作用。用于检测单个碱基突变或多态性的技术有限制性酶切片断长度多态性(restriction Fragment Length polymorphism，RFLP)，单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)，等位基因特异性PCR(allele specific PCR，AS-PCR)，等位基因特异性寡聚核苷酸探针杂交(allele specificoligonucleotide hybridization，ASO)，构象敏感凝胶电泳(conformation-sensitive gelelectrophoresis，CSGE)，错配化学裂解法(chemical cleavage ofmismatch，CCM)等，针对SNP的自动化批量检测方法有DNA芯片技术(DNA Chip)、焦磷酸测序(pyrosequencing for SNPgenotyping)、变性高效液相层析技术(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)、MALDI-TOF质谱法(matrix assisted laser desorption/ionization time offlight massspectrometry)等，还有一系列基于生物信息学软件用计算机自动识别SNPs的筛查检测方法。

热休克蛋白(heat shock protein Hsp)是在几乎所有应激源作用下均可产生的一组特殊蛋白质，它作为分子伴侣参与维持细胞蛋白质的稳态，对应激造成的损伤起修复作用，保护机体不受或少受伤害，提高机体对应激的耐受能力。Hsp家族主要分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小Hsp等5个亚族。其中，当蛋白受损变性时，Hsp70蛋白可以帮助变性蛋白重新折叠而恢复活性，抑制细胞凋亡。当热应激时，糖皮质激素进入细胞质，细胞质中与糖皮质激素受体相结合的Hsp70和Hsp90被释放，这些存在于细胞质中的Hsp被迅速诱导，组成了抗热应激的第一道防线，随着动物体温的增加，Hsp70的含量显著提高。王枫(2000)等研究表明，Hsp70水平高的细胞热耐受程度明显高于Hsp70水平低的细胞。在鱼类、昆虫和哺乳细胞中，Hsp70基因多态与其表达密切相关，与动植物适应不同环境以及人类抗病性和疾病的易感性有关。

综合考虑Hsp70在个体和细胞应激过程中的主要功能，开展奶牛中Hsp70的研究很有必要。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是发掘基因与性状间的关系、研究基因功能的一个非常重要的手段。所以申请人对该基因在奶牛中进行了多态性研究和关联分析，为申请人更好的在奶牛品种改良中运用该基因提供了重要的理论支持。

发明内容

本发明的目的是通过PCR扩增Hsp70.1基因序列的部分片段，寻找突变位点，筛选一种与奶牛耐热性状相关的分子标记，并建立批量检测方法作为奶牛的标记辅助选择的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过克隆，从Hsp70.1基因中获得一段特异的DNA片段作为与奶牛耐热性状相关的分子标记，它的部分基因外显子及3’-侧翼区序列如序列表SEQ ID NO：1和图1所述。

在序列表SEQ ID NO：1的426bp的序列内，其共有7个多态位点，包括：第54bp处有一个T54C54的碱基突变；第80bp处有一个A80-G80的碱基突变；第130bp处有一个G130-T130的碱基突变；第140bp处有一个C140-T140的碱基突变；第197bp处有一个A197-G197的碱基突变；第359bp处有一个C359-A359的碱基突变；第383bp处有一个G383-A383的碱基突变。因此，采用直接测序的方法进行上述所有位点的检测。

申请人制备了检测上述分子标记碱基突变的引物对，该引物的DNA序列如下所示：

P1正向引物：5′CATCCTTATTACCAACTTGCGTG 3′，(见序列表SEQ ID NO：2)

P2反向引物：5′CGGACAAGAAGAAGGTGCTG 3′。(见序列表SEQ ID NO：3)

申请人提供了一种制备上述分子标记的方法，按照以下步骤制备：

用牛Hsp70.1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得位于牛23号染色体上Hsp70.1基因组序列；提取样本群体中国荷斯坦奶牛血液总DNA，将所得的DNA混合构建成DNA池，根据参考序列设计引物(即：P1和P2所示的引物)，进行PCR扩增，获得奶牛Hsp70.1基因的部分外显子和3′-侧翼序列，PCR产物纯化后直接测序，通过序列分析获得如SEQ ID NO：1所示和图1所示的核苷酸序列；

其中：所述奶牛Hsp70.1基因的部分外显子和3′-侧翼序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明制备的分子标记可应用于奶牛耐热性状检测，所述的引物对也可应用于奶牛耐热性状检测程序中。

更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的与奶牛耐热性状相关基因Hsp70.1的部分外显子和3′-

侧翼序列。序列长度为426bp，该片段就是本发明的与奶牛耐热性状相关的分子标记。

序列表SEQ ID NO：1和2是扩增本发明的分子标记碱基突变的引物对序列。

图1：是本发明克隆的奶牛耐热性状相关的分子标记的核苷酸序列，图中显示了7个多态性位点。图中：下划线部分为引物序列，括号内的碱基为碱基突变，该突变在本发明的权利要求书中用R代表，二者是同一个含义。

图2：是本发明的技术流程示意图。

图3：是PCR扩增获得的Hsp70.1基因部分外显子和3′-侧翼序列的琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道：M是DL2000Marker。

图4：本发明中Hsp70.1基因部分外显子和3′-侧翼序列直接测序检测到的基因突变位点测序色谱图。

具体实施方式

实施实例1：

(一).Hsp70.1基因部分外显子和3′-侧翼序列的克隆

(1)引物设计：

用牛Hsp70.1基因cDNA(GenBank收录号：NM_174550.1)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank牛Genomes数据库中做同源序列筛选，获得位于牛23号染色体上同源性为99％的Hsp70.1基因组序列(GenBank收录号：AC_000180.1)。根据Hsp70.1基因组序列设计扩增引物(P1正向引物5′CATCCTTATTACCAACTTGCGTG  3′；P2反向引物5′CGGACAAGAAGAAGGTGCTG 3′)。以60头中国荷斯坦奶牛为试验群体，提取中国荷斯坦奶牛的血液基因组DNA，将所得的DNA混合构建DNA池作为模板扩增奶牛Hsp70.1部分基因片断。

经过PCR产物纯化和测序，并通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(见图1)；通过测序得到如图4所示的色谱图，发现存在7处单核苷酸多态性(SNP)。即：在SEQ ID NO：1的第54bp处有一个T54-C54的碱基突变；第80bp处有一个A80-G80的碱基突变；第130bp处有一个G130-T130的碱基突变；第140bp处有一个C140-T140的碱基突变；第197bp处有一个A197-G197的碱基突变；第359bp处有一个C359-A359的碱基突变；第383bp处有一个G383-A383的碱基突变。

(2)PCR产物的纯化、克隆和测序

PCR扩增：SEQ ID NO：1所示的序列。反应总体积25μL：10×Tap buffer 2.5μL、dNTP终浓度为200μM，正、反向引物(P1、P2)各为0.2μM，1U Taq DNA聚合酶(购自宝生物工程大连有限公司)。PCR扩增程序是：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 40s，59℃ 40s，72℃ 30s，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

上述的正、反向引物的序列如下所示：

P1正向引物：5′CATCCTTATTACCAACTTGCGTG 3′，

P2反向引物：5′CGGACAAGAAGAAGGTGCTG 3′。

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，用sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)纯化DNA片段。具体步骤如下：加入700μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；9000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min(提高洗脱温度至55-80℃有利于提高DNA的洗脱效率，可洗脱两次。)；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

(3)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

(二).PCR产物直接测序诊断方法建立

(1)引物序列

由于上述426bp序列中存在7个多态位点(见图1和SEQ ID NO：1所示)，位点密集且适合直接测序的方法进行检测。因此，本发明直接就可以用上述引物(P1、P2)进行PCR扩增，而不需要另外设计引物。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积为25μl，其中奶牛基因组DNA约25ng，10×Tap buffer 2.5μL、dNTP终浓度为200μM，正、反向引物(P1、P2)各为0.2μM，1U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序是：94℃4min，然后循环35次94℃40s，59℃40s，72℃30s，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)奶牛基因型鉴定

扩增奶牛(品种为中国荷斯坦奶牛)基因组DNA得到了426bp的特异性扩增片段(详见图1和图3)。直接从测序色谱图(见图3)上进行基因型分析。

(三)PCR产物直接测序在中国荷斯坦奶牛中的分布情况的检测的应用

利用PCR产物直接测序方法在湖北省黄冈市四个规模化奶牛场的中国荷斯坦奶牛共600头中检测了Hsp70.1基因的多态性。这些位点在中国荷斯坦奶牛中的劣势等位基因频率、哈迪温伯格平衡检验值见表1。结果显示除G130-T130位点外，其余位点都符合哈迪-温伯格平衡。

表1Hsp70.1基因3′侧翼区和外显子中7个SNP的特征及它们的劣势等位基因频率

表1说明：MAF为劣势等位基因频率；A＞B表明B是劣势等位基因；；HWP为哈迪-温伯格平衡检验P值。

实施例2：

Hsp70.1基因测序结果显示，包含7个SNP位点的Hsp70.1基因出现14种基因型组合，经Haploview软件对单体型进行构造并计算单体型频率，3种单体型占所有等位基因的91.8％，分别为：单体型1-TATTACG-(占35.8％)，单体型2-CGGTGAA-(占29.7％)和单体型3-TAGCACG-(占26.3％)。这3种单体型构成6种常见基因型11、12、13、22、23和33。

用于关联分析的试验材料同样用湖北省黄冈市四个规模化奶牛场的600头中国荷斯坦奶牛个体。所分析的性状主要为耐热性状。耐热性状包括在高温条件下的直肠温度、呼吸频率、红细胞钾浓度、红细胞Na⁺K⁺ATP酶(NKA)的活性以及产奶量下降率。

统计分析时使用SAS(视窗V8版)软件，利用最小二乘法拟合线性模型，比较奶牛耐热性状在不同基因型之间的差异。所采用的模型为：

YIjk＝μ+Gi+Ysj+Hk+eijk；

Yijk为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应，Ysj为季节效应(其中1代表从4月到9月，2代表从10月到次年3月)，Hk代表场别效应(k代表1、2、3或4)，以及eijk是残差效应。

与耐热性状的关联分析结果显示(如表2)，携带单体型1的个体与非携带单体型1的个体相比，除了产奶量下降率外，其它耐热性状均有显著差异。单体型1的出现与红细胞钾的浓度极显著相关。单体型3则与任何耐热性状不相关。单体型2与直肠温度和红细胞钾浓度相关。与单体型1相反，携带单体型2的个体有降低直肠温度和红细胞钾浓度的趋势。也就是说，在某种程度上，携带单体型2的个体比携带单体型1的个体更耐热。但是，申请人发现单体型1和2的组合与纯单体型2的组合相比有更低的呼吸频率、直肠温度、红细胞钾浓度，及更高的红细胞NKA水平，说明有杂合子优势。

Claims (5)

1.一种作为奶牛标记辅助选择应用的与奶牛耐热性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：

CATCCTTATTACCAACTTGCGTGAAAATGCAAACATTCTGGTGAACACACTCARTATAACATACAGAAATAACAAAAACRAGCTAGTTAGAGGTTACAACCTTATCATAGAACAAACTGACACATCACARGAGTAAATARAGGGCAAGACCAAAGTCCATAGGTCTACTACAGACAGACAAAAAGTAAGGCCCCTARTCCACCTCCTCAATGGTGGGGCCAGACCCAGAGCCCCCTTTAGGGCCCTGAGCCCCAAAGCCGCCAGCCCCGGGGCCGCCCGCCCCCTGGTACAGTCTGCTGATGATGGGGTTACACACCTGCTCCAGCTCCTTCCTCTTGTGCTCAAACTCGTCCTTCTCRGCCAAGGTGTTGGCGTCCAGCCARGAAATCACCTCCTGGCACTTGTCCAGCACCTTCTTCTTGTCCG

上述序列中第54位、第140位的R是T或C；第80位、第197位和第383位的R是A或G，第130位的R是T或G；第359位的R是C或A。

2.检测权利要求1所述分子标记的碱基突变引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：CATCCTTATTACCAACTTGCGTG，

反向引物：CGGACAAGAAGAAGGTGCTG。

3.一种与奶牛耐热性状相关的分子标记的制备方法，其特征按照以下步骤：

用牛Hsp70.1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得位于牛23号染色体上Hsp70.1基因组序列；提取样本群体中国荷斯坦奶牛血液DNA，将所得的DNA混合构建成DNA池，根据参考序列设计如权利要求2所示的引物，进行PCR扩增，获得奶牛的部分外显子和3′-侧翼序列，PCR产物纯化后直接测序，通过序列分析获得如权利要求1所示的核苷酸序列；

其中：

所述奶牛的部分外显子和3′-侧翼序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

4.权利要求1所述的分子标记在奶牛耐热性状检测中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在奶牛耐热性状检测中的应用。

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