CN103421187A - 一种制备环孢素a完全抗原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环孢素A（CsA）完全抗原的制备方法，该方法以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原，将CsA不完全抗原溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸反应，生成环孢素A完全抗原，该方法简单可行，便于操作，缩短了生产CsA不完全抗原的光化学反应时间，大大节约了环孢素A完全抗原的合成进程。经酶联免疫反应实验及在体动物（小鼠）免疫实验验证本方法合成的CsA完全抗原具有良好的特异性和免疫原性，可用于CsA完全抗原的合成。

Description

一种制备环孢素A完全抗原的方法

技术领域

本发明属于生物技术与药学领域，具体涉及制备环孢素A抗原的方法。

背景技术

环孢素A(CsA)作为器官移植的主要免疫抑制药物，在器官移植的某些领域有着不可替代的作用，可以有效提高移植器官存活时间。但其治疗窗口窄、生物利用度和药代动力学个体差异较大，而且机体对CsA的敏感性和耐受性也存在一定差异。因此，必须长期对患者进行血药浓度监测，减少毒副作用的发生，延长移植器官存活时间。

目前，国内大多是使用美国雅培公司生产的全自动血药浓度监测仪TDxFLx进行血药浓度测定，存在的不足是它必须从美国雅培公司购买专用试剂盒，由于是独家生产，价格昂贵，给患者术后带来了很大的经济负担。部分患者因经济原因中途减少或放弃CsA血药浓度监测，从而造成患者体内CsA中毒或慢性排斥反应器官移植失败。此外，目前TDxFLx的使用多集中在三级甲等医院，患者CsA的血药浓度监测需要到这些医院才能进行药物浓度监测，给患者的用药造成了很大的不便。

CsA血药浓度监测都是基于抗原抗体特异性结合的反应原理，需要获得针对待检物的抗体，而在CsA抗体制备的过程中，环孢素A完全抗原的合成是其中至关重要的一环，环孢素A完全抗原性能的好坏直接影响到下一步CsA单克隆抗体的制备，本方法可以合成效价良好的环孢素A完全抗原。

发明内容

本发明的任务是提供一种制备环孢素A完全抗原的方法，使其具有方法简单，快捷，便于操作，并使所制备的环孢素A完全抗原与抗体反应时具备高特异性与高亲和力，即具有良好的特异性和免疫原性等特点。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的这种制备环孢素A完全抗原的方法，包括以下步骤：

步骤一：以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，以叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）；

步骤二：将CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原。

上述步骤一所述的以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，以叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）的具体方法包括以下步骤：

步骤1：将CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）按摩尔比为1:1.0-1:1.2的比例装入石英比色皿（容量为14mL）中，用移液管加入10mL叔丁醇，超声3min使CsA和4-苯甲酰苯甲酸（BBa）充分溶解；

步骤1中CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）的摩尔比具体可以为1:1.1；步骤1中所述的石英比色皿的容量具体可以为14mL。

步骤2：向步骤1中的石英比色皿中通入氮气鼓泡30±10min后，以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源进行光照，紫外光源距比色皿10±2cm，同时缓慢滴加叔丁醇，并记录反应时间，反应过程中持续通入氮气，反应2.5±0.5h后停止光照，并停止滴加叔丁醇，结束光化学反应，得到淡黄色液体产物1；

步骤3：用CHCL₃与CH₃OH的体积比为85：15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离，得到无色固体粉末状产物2，该无色固体粉末状产物2即为CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

步骤3所述的用CHCL₃与CH₃OH的体积比为85：15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离，得到无色固体粉末状产物2的具体方法是：将步骤2中光化学反应后得到的产物1在10×20cm的荧光薄层层析板采用CHCL₃/CH₃OH=85/15(体积比)的二元展开体系展开，1.5h后取出层析板，将层析板置于通风橱中挥发至干，在254nm紫外灯下显色，刮下比移值Rf为0.60的颜色较深的硅胶合并，用3×10mL的无水甲醇洗提，4000r离心分离10min，合并上层清液，再离心10min，得到澄清洗涤液，洗涤液在减压下旋转蒸干，得到无色固体粉末状产物2。

上述步骤二所述的将CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原的具体方法包括以下步骤：

步骤a：称取4.5mg聚-L-赖氨酸(PL)溶于0.5mL水中，配制成聚-L-赖氨酸的水溶液，浓度为90％；称取15.0mg步骤三中得到的无色固体粉末状产物2溶于0.7mL的二甲基甲酰胺中，配制成无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液；于恒温25℃搅拌的条件下,将配制好的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液滴加到配制好的聚L-赖氨酸水溶液中，得到无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸的混合液，再用10％的NaOH溶液将得到的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸混合液的pH调至中性；

步骤b：采用偶联反应制备环孢素A完全抗原：将步骤四得到的混合液搅拌反应过夜，并在搅拌反应过程中分五次加入60mg的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），每次间隔1±0.5h，加液同时调节混合液的pH值始终保持在6-7之间，得到产物3；

步骤c：用透析法对步骤b得到的产物3进行分离纯化得到无色固体粉末产物4，该产物4即为环孢素A完全抗原。

步骤c中用透析法对步骤b得到的产物3进行分离纯化得到环孢素A完全抗原的具体方法包括以下步骤：

a．透析袋的处理：用电子天平称取84mg NaHCO₃于100mL蒸馏水中，配成10mmol/L NaHCO₃溶液；用电子天平称取372.24mg Na₂EDTA于100mL蒸馏水中，配成10mmol/L Na₂EDTA溶液；剪取长度为20±5cm透析膜，在过量的上述NaHCO₃溶液中浸湿并煮沸10min，再浸入上述Na₂EDTA中煮沸10min，取出用蒸馏水反复浸洗三次以彻底去除杂质，将处理后的透析袋浸入95%乙醇溶液中贮存备用；

b．透析缓冲液的配制：取硼酸1.6g，Tris3.0g，Na₂EDTA0.4g，NaC12.9g，加入100ml蒸馏水，水浴保温使之充分溶解，再加入2-巯基乙醇7μL，振荡混匀即得10xTBN缓冲液(pH=8.5)；使用时将此母液稀释10倍即得1xTBN缓冲液，再与甲醇3：2(体积比)混合，即得所需的缓冲液；

c．透析操作：将处理好的透析袋取出，用蒸馏水漂洗，将其一端用棉线扎紧，充满水后进行挤压试漏，确定透析袋完整无漏液后，用移液管将偶联终产物转移入透析袋，用棉线将另一端扎紧，透析袋置于约150mL上述缓冲液中，持续轻微搅拌，3.5±0.5h换液，共5次；取出透析袋，用移液管吸出透析液并定体积，浓缩减压干燥后得到无色固体粉末产物4，该产物4即为环孢素A完全抗原。

环孢素A(CsA)作为器官移植的主要免疫抑制药物，在器官移植的某些领域有着不可替代的作用，但由于CsA治疗窗口窄、生物利用度和药代动力学个体差异较大，需要长期对患者进行血药浓度监测，以减少毒副作用的发生，延长移植器官存活时间。CsA血药浓度监测都是基于抗原抗体特异性结合的反应原理，需要获得针对待检物的抗体即环孢素A单克隆抗体，而在环孢素A单克隆抗体制备的过程中，环孢素A完全抗原的合成是制备环孢素A单克隆抗体至关重要的一环。环孢素A完全抗原性能的好坏直接影响到下一步CsA单克隆抗体的制备。本方法结合生物学、化学、药学等学科的先进技术，来合成环孢素A完全抗原性，首先利用光化学反应的方法在CsA分子上引入活性官能团（4-苯甲酰苯甲酸），即得到产物CsA不完全抗原，然后将产物CsA不完全抗原与载体聚-L-赖氨酸偶联，生成环孢素A完全抗原。经酶联免疫反应实验及在体动物（小鼠）免疫实验验证本方法合成的CsA完全抗原具有良好的特异性和免疫原性，可用于CsA完全抗原的合成。

环孢素A完全抗原的制备过程中，一方面要使半抗原能与载体分子之间形成较为稳固的化学键，另一方面又要保持免疫抗原CsA的结构和活性，使得制备的环孢素A完全抗原与抗体反应时具备高特异性与高亲和力，这是本课题的难点所在。本发明方法解决了上述难题，以易获得且成本低的高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）。CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原，方法简单可行，便于操作，在体动物（小鼠）实验表明合成的环孢素A完全抗原具有免疫原性。

与现有技术相比，本发明提供的合成环孢素A完全抗原的方法缩短了生产CsA不完全抗原（CsA-BBa）的光化学反应时间，大大节约了环孢素A完全抗原的合成进程。

采用上述本发明制备CsA完全抗原的方法制备三批产品，所得产物经鉴定确认为CsA完全抗原，经测定，第一次合成的环孢素A完全抗原的偶联率为9.1；第二次测得环孢素A完全抗原的偶联率为9.3，第三次测得环孢素A完全抗原的偶联率为9.5，三次重复实验得CsA完全抗原的偶联率均值为9.3。本方法合成的环孢素A完全抗原的工艺稳定，适用于环孢素A完全抗原的合成。

CsA自身无免疫性，欲使CsA具有免疫原性，必需将CsA制备成环孢素A完全抗原。本发明提供的方法采用CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）、聚-L-赖氨酸（PL）反应通过光化学反应、偶联反应的方法合成CsA的完全抗原。在环孢素A完全抗原合成的过程中采用与人体蛋白没有交叉免疫反应的聚-L-赖氨酸作为使CsA产生免疫性的载体，由于CsA与聚-L-赖氨酸不能直接发生反应，需在CsA与聚-L-赖氨酸之间加入一个链接桥使CsA与聚-L-赖氨酸结合，生成环孢素A完全抗原。在环孢素A完全抗原过程中我们采用化学性质活泼的4-苯甲酰苯甲酸（BBa）做为光敏交联剂，是由于4-苯甲酰苯甲酸（BBa）能够随机的插入到CsA的脂肪烃侧链分子结构中，而不会打开CsA的肽环，保存CsA的免疫抑制特性，符合合成环孢素A完全抗原的要求。

环孢素A完全抗原合成方法中的主要实验反应式：

经实验验证：在CsA完全抗原的合成过程中本发明改进了光化学反应实验所用的灯源，本发明采用的是高压汞灯作为灯源，而现有技术采用的是300w碘镓灯，高压汞灯能在较长波长范围内产生较强的辐射，而且具有较好的再现性，对光化学反应来说是一种比较合适的光源高压汞灯，且具有易获得的优点，缩短了光化学反应的反应时间，由原本的4小时缩短为3小时。

在脱水剂1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI）的作用下，生成产物4环孢素A完全抗原，紫外检测结果以及酶联免疫吸附法特异性鉴定结果表明该试验方法用于环孢素A完全抗原的合成是可行的，且能够得理想偶联效率的偶联物（推荐偶联率的最佳值为10，本方法所得偶联率为9±0.5，接近理想值）。同时首次利用在体动物（小鼠）实验对合成的环孢素A完全抗原的免疫原性进行了考察，实验表明合成的环孢素A完全抗原能有效引起机体免疫应答反应并产生相应环孢素A抗体，证明所合成产物4环孢素A完全抗原具有很好的免疫原性，且所采用的免疫方法可取。

由于CsA、BBa、CsA不完全抗原（CsA-BBa）、孢素A完全抗原（CsA-BBa-PL）自身的特性，它们各具有不同的紫外吸收特征，本发明建立了紫外分光光度法来进行孢素A完全抗原（CsA-BBa-PL）的鉴定及偶联效率测定，避免了放射性同位素的使用，不失为一种简便易行的实验的鉴定检测方法。

环孢素A完全抗原的制备过程中，一方面要使半抗原能与载体分子之间形成较为稳固的化学键，另一方面又要保持免疫抗原CsA的结构和活性，使得制备的环孢素A完全抗原与抗体反应时具备高特异性与高亲和力，这是本发明的难点所在。本方法解决了上述难题，以易获得且成本低的高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）。CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原，方法简单可行，便于操作，在体动物（小鼠）实验表明合成的环孢素A完全抗原具有免疫原性。

附图说明

图1：产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的紫外吸收光谱

图2：4-苯甲酰苯甲酸（BBa）的紫外吸收光谱

图3：CsA的紫外吸收光谱

图4：产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的H核磁共振图谱，从产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的H谱中可以看到，产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）在δ=7.3ppm附近新增了一组明显的信号峰，这是苯环上质子的特征峰，从而证明在CsA分子中已接上了BBa，生成了CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

图5.产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的C核磁共振图谱从产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的C谱中可以看到中，产物2在δ=80ppm附近新增了一组明显的信号峰，这是苯环上碳原子的特征峰，证明在CsA分子中已连接上了BBa，生成了CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

图6：产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的质谱图，质谱图中出现了m/z 1451的CsA-BBa的准分子离子峰[M+Na]+。检测结果说明反应在CsA分子上引入了BBa分子，生成了CsA不完全抗原（CsA-BBa）化合物。

图7：A：聚-L-赖氨酸（PL）；B：产物4环孢素A完全抗原（CsA-BBa-PL）；C：产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）。从图7中可以看出，合成的产物4环孢素A完全抗原（CsA-BBa-PL）（B）的光谱图不同于反应的组分聚-L-赖氨酸（PL）（A）、产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）（B）的图谱，A、B、C的紫外吸收峰位依次为203nm、209.5nm、212nm。合成的产物4环孢素A完全抗原（CsA-BBa-PL）的紫外吸收峰较聚-L-赖氨酸（PL）红移，较产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）（B）紫移，说明通过偶联反应生成了新物质，证明环孢素A完全抗原合成是成功的。

图8：吸光度值与抗原包被浓度关系，抗原在接近水平状态时，抗原抗体呈最佳结合比例，可最大限度的出现沉淀物。从附图8曲线上可以看出抗原在5～8μg/mL时为最佳包被浓度。

图9：免疫前后小鼠的脾脏，1为免疫后小鼠脾脏；2为免疫前小鼠脾脏。可以发现免疫后的小鼠脾细胞由于免疫反应的结果比正常同类小鼠脾细胞大，直观上说明环孢素A抗原能有效刺激小鼠机体免疫应答反应。合成的CsA完全抗原具有免疫原性。

具体实施方式

实施例1环孢素A完全抗原的制备

步骤一：用电子天平称取240mg CsA，50mg 4-苯甲酰苯甲酸（BBa），CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）的摩尔比为1:1.1装入石英比色皿（容量为14mL）中，用移液管加入10mL叔丁醇，超声3min使CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）充分溶解；

步骤二：采用光化学反应的方法制备CsA不完全抗原（CsA-BBa）：向上述步骤一中的比色皿中通入氮气鼓泡30±10min后，打开紫外光源开始光照（紫外光源距比色皿10±2cm），并同时旋开比色皿上方的分液漏斗（装有一定体积（300±50mL）的叔丁醇）记录反应时间，使叔丁醇缓慢地滴下（滴速前1h 4-8滴/min，反应后1h 10-15滴/min），反应过程中持续通入氮气，光照2.5±0.5h结束光照，旋紧分液漏斗，结束光化学反应。得到淡黄色液体产物1；

步骤三：采用色谱法（薄层色谱法），在CHCL₃/CH₃OH=85/15(体积比)的二元展开体系中分离步骤二得到的淡黄色液体产物1，得到无色固体粉末状产物2；

薄层展开的具体步骤：

将步骤二中光化学反应后得到的产物1在10×20cm的荧光薄层层析板采用CHCL₃/CH₃OH=85/15(体积比)的二元展开体系展开，1.5h后取出层析板。将层析板置于通风橱中挥发至干。在254nm紫外灯下显色，刮下比移值Rf为0.60的颜色较深的硅胶合并，用3×10mL的无水甲醇洗提。4000r离心分离10min，合并上层清液，再离心10min，得到澄清洗涤液。洗涤液在减压下旋转蒸干，即可得无色固体粉末状产物2。所得产物2依次用两种二元展开剂展开，所用的两种展开剂是：

展开剂1：氯仿：甲醇85/15(体积比)

展开剂2：乙酸乙酯：甲醇65/10（体积比）

采用以上两种展开剂展开产物2均为一个点，说明分离纯化产物1后得到的产物2是一种物质。

步骤四：称取4.5mg聚-L-赖氨酸(PL)溶于0.5mL水中，配置成聚-L-赖氨酸的水溶液，浓度为90％；

称取15.0mg步骤三中得到的无色固体粉末状产物2溶于0.7mL的二甲基甲酰胺中，配置成无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液；

步骤五：于恒温25℃搅拌的条件下,将步骤四配置的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液滴加到步骤四配置的聚L-赖氨酸水溶液中，得到无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸的混合液；

步骤六：用10％的NaOH溶液将步骤五得到的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸混合液的pH调至中性。

步骤七：采用偶联反应制备环孢素A完全抗原：

将步骤六得到的混合液搅拌反应过夜，并在搅拌反应过程中分五次加入60mg的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），每次间隔1±0.5h，加液同时调节混合液的pH值始终保持在6-7之间，完成环孢素A完全抗原的合成反应，得到产物3。

步骤八：用透析法对步骤七得到的产物3进行分离纯化：

透析袋的处理：用电子天平称取84mg NaHCO₃于100mL蒸馏水中，配成10mmol/L NaHCO₃溶液。用电子天平称取372.24mg Na₂EDTA于100mL蒸馏水中，配成10mmol/L Na₂EDTA溶液。剪取适当长度透析膜（20±5cm），在过量的上述NaHCO₃溶液中浸湿并煮沸10min，再浸入上述Na₂EDTA中煮沸10min，取出用蒸馏水反复浸洗三次以彻底去除杂质。将处理后的透析袋浸入95%乙醇溶液中贮存备用。

透析缓冲液的配制：取硼酸1.6g，Tris3.0g，Na₂EDTA0.4g，NaC12.9g，加入100ml蒸馏水，水浴保温使之充分溶解，再加入2-巯基乙醇7μL，振荡混匀即得10xTBN缓冲液(pH=8.5)。使用时将此母液稀释10倍即得1xTBN缓冲液，再与甲醇3：2(体积比)混合，即得所需的缓冲液。

透析操作：将处理好的透析袋取出，用蒸馏水漂洗，将其一端用棉线扎紧，充满水后进行挤压试漏，确定透析袋完整无漏液后，用移液管将偶联终产物转移入透析袋，用棉线将另一端扎紧。透析袋置于约150mL上述缓冲液中，持续轻微搅拌，3.5±0.5h换液，共5次。取出透析袋，用移液管吸出透析液并定体积，浓缩减压干燥后得到无色固体粉末产物4，该无色固体粉末产物4即为环孢素A完全抗原。

实施例2

实施例1制备的环孢素A完全抗原的鉴定：

1.无色固体粉末状产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的鉴定

1.1薄层色谱鉴定结果

采用色谱法（薄层色谱法）将产物2在CHCL₃/CH₃OH=85/15(体积比)的二元展开体系中展开，试验结果证实：产物2的Rf值为0.60，与国外专利文献值测定的0.58接近，可初步判断产物2可能CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

1.2熔点测定结果

用熔点仪分别测得反应物CsA、4-苯甲酰苯甲酸（BBa）及产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的熔点，测定结果如表1所示：

表1.CsA、BBa及产物CsA-BBa的熔点

从表1中可以看出，产物2（CsA-BBa）的熔点比两种反应物的熔点均高，从一个侧面映证了该产物2是CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）分子通过共价键连接在一起的，而不是它们的混合物。

1.3产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）、CsA、BBa的紫外光谱结果

产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）以及反应物CsA、4-苯甲酰苯甲酸（BBa）的紫外光谱图（见附图1、2、3）。以叔丁醇为溶剂。

1.4产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）、CsA、4-苯甲酰苯甲酸（BBa）的红外检测结果

与原料CsA相比，产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）在3400cm^-1处(ν_O-H)的吸收峰明显加强，这是因为产物中增加了羧基及仲醇羟基，产物在1580cm^-1和1400cm^-1处新增了两组吸收峰，分别对应于苯环骨架C=C振动及羧基碳氧键的伸缩振动ν_C-O；产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）中还可见苯环对位二取代和单取代的特征吸收频率，分别为900cm^-1，770cm^-1和707cm^-1。红外检测可证明产物2即为CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

1.5核磁共振检测

从产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的氢、碳核磁共振检测结果来看。氢谱中，产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）在δ=7.3ppm附近新增了一组明显的信号峰，（见附图4）这是苯环上质子的特征峰，从而证明在CsA分子中已接上了BBa；碳谱中，产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）在δ=80ppm附近新增了一组明显的信号峰，（见附图5）这是苯环上碳原子的特征峰，也证明产物2即为CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

1.6质谱

产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的质谱图（见附图6）。质谱图中出现了m/z 1451的产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）的准分子离子峰[M+Na]⁺。检测结果说明产物2即为CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

从以上分析可知，CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）在光化学反应的条件下，生成的产物2即为CsA不完全抗原（CsA-BBa）化合物。

2.产物4环孢素A完全抗原的鉴定

2.1偶联效率的检测

实验采用紫外分光光度法测定偶联效率，所得产物4环孢素A完全抗原的偶联效率为8～9左右。

2.2产物2CsA不完全抗原（CsA-BBa）、聚-L-赖氨酸（PL）、产物4环孢素A完全抗原（CsA-BBa-PL）的紫外扫描图（见附图7）：

从附图7中可以看出，合成的产物4环孢素A完全抗原（CsA-BBa-PL）（B）其光谱图不同于反应的组分聚-L-赖氨酸（PL）（A）、产物2CsA不完全抗原（C）的图谱，A、B、C的紫外吸收峰位依次为203nm、209.5nm、212nm。合成的产物4的紫外吸收峰较聚-L-赖氨酸（PL）红移，较产物2CsA不完全抗原紫移，说明通过偶联反应生成了新物质，证明产物4即为CsA完全抗原。

2.3ELISA法对抗原特异性的鉴定

产物4环孢素A完全抗原特异性检测实验结果如表2：

表2.抗原抗体特异性反应测定结果（n=3）

2.4产物4环孢素A完全抗原最佳包被浓度结果（见附图8）

抗原在接近水平状态时，抗原抗体呈最佳结合比例，可最大限度的出现沉淀物。从附图8曲线上可以看出抗原在5-8μg/mL时为最佳包被浓度。

2.5产物4环孢素A完全抗原特异性测定结果见表3

表3.抗原抗体特异性反应测定结果

从表中数据可以抗出，抗干扰素α抗体、空白对照以及空白小鼠血清与抗原反应显色后的OD值远远小于环孢素A单克隆抗体、免疫小鼠血清的OD值，说明合成产物4环孢素A完全抗原能够特异性的与环孢素A抗体相结合。

2.6产物4环孢素A完全抗原免疫小鼠后，免疫小鼠脾脏与正常小鼠脾脏大小比较图（见附图9）

免疫后的小鼠脾细胞由于免疫反应的结果比正常同类小鼠脾细胞大，直观上说明抗原能有效刺激小鼠机体免疫应答反应。

2.7免疫小鼠血清效价测定结果见表4。

表4.免疫小鼠血清效价测定结果

免疫小鼠血清检测数值均接近阳性对照CsA单克隆抗体的测定值，说明小鼠免疫方案是成功的，进一步证明合成的产物4环孢素A完全抗原具有免疫原性。

Claims (7)

1.一种制备环孢素A完全抗原的方法，包括以下步骤：

步骤一：以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，以叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）；

步骤二：将CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原。

2.根据权利要求1所述的制备环孢素A完全抗原的方法，其特征在于，步骤一所述的以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源，以叔丁醇作为反应溶剂，在光化学反应的条件下进行4-苯甲酰苯甲酸（BBa）和CsA的加成反应，得到中间体CsA不完全抗原（CsA-BBa）的具体方法包括以下步骤：

步骤1：将CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）按摩尔比为1:1.0-1:1.2的比例装入石英比色皿（容量为14mL）中，用移液管加入10mL叔丁醇，超声3min使CsA和4-苯甲酰苯甲酸（BBa）充分溶解；

步骤2：向步骤1中的石英比色皿中通入氮气鼓泡30±10min后，以高压汞灯作为光化学反应的紫外光源进行光照，紫外光源距比色皿10±2cm，同时缓慢滴加叔丁醇，并记录反应时间，反应过程中持续通入氮气，反应2.5±0.5h后停止光照，并停止滴加叔丁醇，结束光化学反应，得到淡黄色液体产物1；

步骤3：用CHCL₃与CH₃OH的体积比为85：15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离，得到无色固体粉末状产物2，该无色固体粉末状产物2即为CsA不完全抗原（CsA-BBa）。

3.根据权利要求1所述的制备环孢素A完全抗原的方法，其特征在于，步骤二所述的将CsA不完全抗原（CsA-BBa）溶于二甲基甲酰胺中，再在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作用下与水溶液中的聚-L-赖氨酸（PL）反应，生成环孢素A完全抗原的具体方法包括以下步骤：

步骤a：称取4.5mg聚-L-赖氨酸(PL)溶于0.5mL水中，配制成聚-L-赖氨酸的水溶液，浓度为90％；称取15.0mg步骤三中得到的无色固体粉末状产物2溶于0.7mL的二甲基甲酰胺中，配制成无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液；于恒温25℃搅拌的条件下,将配制好的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液滴加到配制好的聚L-赖氨酸水溶液中，得到无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸的混合液，再用10％的NaOH溶液将得到的无色固体粉末状产物2的二甲基甲酰胺溶液和聚L-赖氨酸混合液的pH调至中性；

步骤b：采用偶联反应制备环孢素A完全抗原：将步骤四得到的混合液搅拌反应过夜，并在搅拌反应过程中分五次加入60mg的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），每次间隔1±0.5h，加液同时调节混合液的pH值始终保持在6-7之间，得到产物3；

步骤c：用透析法对步骤b得到的产物3进行分离纯化得到无色固体粉末产物4，该产物4即为环孢素A完全抗原。

4.根据权利要求2所述的制备环孢素A完全抗原的方法，其特征在于，步骤1中CsA与4-苯甲酰苯甲酸（BBa）的摩尔比为1:1.1。

5.根据权利要求2所述的制备环孢素A完全抗原的方法，其特征在于，步骤1中所述的石英比色皿的容量为14mL。

6.根据权利要求2所述的制备环孢素A完全抗原的方法，其特征在于，步骤3所述的用CHCL₃与CH₃OH的体积比为85：15的二元展开体系对步骤二得到的淡黄色液体产物1进行分离，得到无色固体粉末状产物2的具体方法是：将步骤2中光化学反应后得到的产物1在10×20cm的荧光薄层层析板采用CHCL₃/CH₃OH=85/15(体积比)的二元展开体系展开，1.5h后取出层析板，将层析板置于通风橱中挥发至干，在254nm紫外灯下显色，刮下比移值Rf为0.60的颜色较深的硅胶合并，用3×10mL的无水甲醇洗提，4000r离心分离10min，合并上层清液，再离心10min，得到澄清洗涤液，洗涤液在减压下旋转蒸干，得到无色固体粉末状产物2。

7.根据权利要求3所述的制备环孢素A完全抗原的方法，其特征在于，步骤c中用透析法对步骤b得到的产物3进行分离纯化得到环孢素A完全抗原的具体方法包括以下步骤：

a．透析袋的处理：用电子天平称取84mg NaHCO₃于100mL蒸馏水中，配成10mmol/L NaHCO₃溶液；用电子天平称取372.24mg Na₂EDTA于100mL蒸馏水中，配成10mmol/L Na₂EDTA溶液；剪取长度为20±5cm透析膜，在过量的上述NaHCO₃溶液中浸湿并煮沸10min，再浸入上述Na₂EDTA中煮沸10min，取出用蒸馏水反复浸洗三次以彻底去除杂质，将处理后的透析袋浸入95%乙醇溶液中贮存备用；

b．透析缓冲液的配制：取硼酸1.6g，Tris3.0g，Na₂EDTA0.4g，NaC12.9g，加入100ml蒸馏水，水浴保温使之充分溶解，再加入2-巯基乙醇7μL，振荡混匀即得10xTBN缓冲液(pH=8.5)；使用时将此母液稀释10倍即得1xTBN缓冲液，再与甲醇3：2(体积比)混合，即得所需的缓冲液；

c．透析操作：将处理好的透析袋取出，用蒸馏水漂洗，将其一端用棉线扎紧，充满水后进行挤压试漏，确定透析袋完整无漏液后，用移液管将偶联终产物转移入透析袋，用棉线将另一端扎紧，透析袋置于约150mL上述缓冲液中，持续轻微搅拌，3.5±0.5h换液，共5次；取出透析袋，用移液管吸出透析液并定体积，浓缩减压干燥后得到无色固体粉末产物4，该产物4即为环孢素A完全抗原。

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