CN103421103B - 力墀永肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用、制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明“力墀永肽及其在治疗制备肿瘤药物中的应用、制备方法”，涉及生物制药技术领域。本发明的力墀永肽具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列。经小鼠肉瘤S180动物试验验证，其具有对小鼠肉瘤的明显抑制作用。本发明还提供了基因工程方法制备该多肽的方案，能制备得到克级以上的多肽产物。本发明的肽在抗肿瘤方面的作用，使其能够作为制备抗肿瘤药物的主要成分，应用于抗肿瘤药物中。

Description

力墀永肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用、制备方法

第一部分：技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及一种基因工程多肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用和制备方法。

第二部分：背景技术

天然抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，通常是由20～60个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右，多数具有2～4个二硫键，并含有α螺旋或β折叠结构。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，少数抗菌肽具有抗病毒或抗肿瘤的作用。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。力墀永肽是采用基因重组，工程菌表达得到的，具有抗肿瘤作用的一种抗菌肽。

从生物界分离到的抗菌肽可达750多种，它们分布极其广泛，从病毒、细菌、植物、昆虫、软体动物、甲壳动物、两栖动物、鱼类、鸟类及哺乳动物等生物均有发现，不同来源的抗菌肽的作用范围目前尚未有系统和深入的研究。近10年来，随着动物及微生物抗菌肽理论与应用研究的逐渐深入，发现某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用，抗菌对正常哺乳动物细胞及昆虫细胞无不良影响，但对癌细胞则有明显杀伤作用。

植物源的抗菌肽在分离纯化、抗菌特性、细胞毒性、理化性质以及转基因等许多方面的研究进展也很快，发现了一大批理化性质和抗菌特性各异的植物抗菌肽。部分植物源的抗菌肽对G⁺菌、G^-菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒杀作用，尤其对植物病原具有良好活性，人们对于植物源的抗菌肽在药物方面的应用寄予了深厚的期望和好奇，特别是在人类疾病，如癌症的治疗上。比如源自槲寄生的槲寄生毒素(VtB)，氨基酸序列如Seq ID No.3所示，包括3个二硫键，其含有α螺旋和β折叠结构，具有抗肿瘤的作用。

由于抗菌肽分子小，天然资源有限，分离提纯存在一定的困难，足量的天然抗菌肽很难得到；抗菌肽的活性取决于多肽的空间结构，而化学合成的多肽的空间结构存在不确定性，所以不能得到具有活性的产品；基因工程菌是最有希望经济、足量获得活性多肽的良好途径，但是据报道高浓度的抗菌肽可杀灭绝大多数宿主细胞，同时在分泌表达过程中，抗菌肽容易被宿主菌的酶系统所降解，从而产生两败俱伤的情形，而无法真正获得足量的表达产物。目前还没有该类多肽的产业化生产技术报道，也未见到准确表达和获得足量的该类多肽以供试验用的报道，更未见到其在癌症治疗方面的应用报道。

第三部分发明内容

本发明根据上述领域的空白和需求，提供一种源自槲寄生毒素VtB的变构肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用与制备方法。

力墀永肽，其特征在于具有Seq ID No.1所示的氨基酸序列。

编码上述力墀永肽的基因。

所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

含有上述基因的表达载体。

所述表达载体的骨架载体为pKLAC1。

上述力墀永肽的制备方法，其特征在于将上述表达载体转入到酵母感受态细胞中，发酵培养。

所述酵母感受态细胞为K.lactis YCT799。

上述力墀永肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

所述药物为液态注射剂。

本发明根据源自槲寄生的抗菌肽VtB，对其氨基酸序列Seq ID No.3进行变构，在其N端增加一个甘氨酸G，第19位和20位氨基酸残基甘氨酸GG变为半胱氨酸CC，去掉第23位精氨酸R，24位甘氨酸G，26位半胱氨酸C和27位丙氨酸A的氨基酸残基，将第28位氨基酸残基丝氨酸S改为苏氨酸T，得到如Seq ID No.1所示的多肽，命名为力墀永肽，由43个氨基酸组成，分子量为4543.3Da，等电点9.01，疏水比率30％，净电荷+5。含有几丁质结构域与类凝聚素结构域。通过变构，改变了多肽的二硫键位置和空间构象，使得分泌表达出的多肽非常稳定，不会在发酵、纯化和保存过程中被迅速降解，以保证得到高表达量的产物。通过变构，增加了该多肽在动物体内的半衰期，可取得更有效的活性效果。本发明从氨基酸序列及易制造性和稳定性上改变了槲寄生毒素VtB。试验证明，本发明采用基因工程发酵培养方法制备的力墀永肽的产率达到1克/升；体内药物试验小鼠肉瘤S180表明，静注20mg/kg力墀永肽对小鼠黑色素瘤的抑制率可达61.48％。

本发明根据上述Seq ID No.1所示的氨基酸序列，设计了编码该氨基酸序列的基因序列，利用密码子的兼并性，调整了核苷酸序列使其符合酵母表达系统对密码子的偏好性而得到SeqID No.2所示的核苷酸序列，有利于稳定高效表达抗菌肽。

本发明还提供了含有上述基因的表达载体，所采用的骨架载体为pKLAC1或pKLAC2，pKLAC1的结构见说明书附图1，通过pKLAC1或pKLAC2，其中的重组蛋白可在细胞内表达，也可分泌表达。有利于获得高产量和纯度的目的多肽。

本发明还提供了力墀永肽的制备方法，本发明将构建得到的表达载体转入到酵母表达系统中，使其表达力墀永肽，通过后续的分离纯化干燥步骤的得到力墀永肽白色固体结晶。本发明优选采用的酵母感受态细胞K.lactis YCT799，非营养缺陷体，也没有遗传标记，适用于线性化pKLAC或pKLMF为基础的表达载体的转化。使用该表达系统，进一步确保分泌表达的力墀永肽不会被降解。

本发明提供的力墀永肽可以作为抗肿瘤药物的主要成分，制备成各种剂型的药物。本发明优先制备成注射剂。

第四部分附图说明

图1.骨架载体pKLAC1结构图，New England Biolabs，Inc提供。

图2.力墀永肽基因克隆测序图，北京诺赛基因组研究中心测定。

图3.力墀永肽液相色谱图，江南大学国家重点实验室。

第五部分具体实施方式

实施例1.力墀永肽的制备

步骤1.外源DNA合成

利用DNA化学合成仪制备外源基因，得到编码力墀永肽的外源DNA片段，如Sequence IDNo.2所示。将酶切鉴定正确的克隆送至北京诺赛基因组研究中心进行序列测定，基因克隆测序图结果见图2

步骤2.表达载体的构建

表达载体为K.lactis蛋白质表达试剂盒所提供的pKLAC1(购于New England Biolabs，Inc)在pKLAC1(9097bp)上，Lac4启动子(PLAC4-PBI)的5′和3′端被编码β-内酰胺酶的基因(ApR)和pMB1的复制原点所隔开。K.lactis α-结合因子分泌引导序列(α-MF)、多克隆位点(MCS)和Lac4转录终止子(TT)位于3′PLAC4-PBI的下游；酵母的PADH2调控乙酰胺酶标记基因(amdS)的表达。

用Sac II或Bst XI酶切载体pKLAC1使其线性化，将外源DNA片段Sequence ID No.2插入到酵母K.lactis基因组自身的Lac4启动子位点，获得重组载体。该重组载体中，目的基因被克隆到pKLAC1上的K.lactis α结合因子(αMating Factor，α-MF)的下游，在酵母K.lactis的细胞核中，编码α-MF结构域和外源重组蛋白的DNA与酵母基因组整合，编码的α-MF最终将在高尔基体上被剪切以使目的蛋白质分泌表达。

PLAC4-PBI启动子调控表达：一旦融合蛋白质开始表达，位于α-MF上的信号肽就会指导融合蛋白质转运到内质网(ER)膜上，在此信号肽酶(SP)将信号肽切除。分泌小泡(环形)将融合蛋白质转运至高尔基体，Kex蛋白酶在此将α-MF结构域切除，释放成熟的目的蛋白质。随后，目的蛋白质通过分泌小泡运输到质膜(PM)，从质膜分泌到胞外.

步骤3.转化

使用K.lactis YCT799(购于New England Biolabs，Inc)感受态细胞。

将步骤2构建得到的重组载体置于感受态细胞溶液中，使重组质粒吸附于感受态细胞的表面，冰浴一段时间，细胞膜处于收缩状态。然后迅速将感受态细胞置于42℃，使细胞在热环境中膜通道开放，重组质粒由膜外高浓度区向膜内扩散，经过45秒时间后，再将感受态细胞放回冰浴中，膜通道关闭，重组质粒转入酵母菌。

酵母转化子用乙酰胺进行筛选，将细胞转化混合物(含有大量被pKLAC1转化或未转化的细胞)涂于含有5mM乙酰胺的酵母基本碳源(YCB)培养基上。YCB培养基含有K.lactis细胞生长所需的所有营养物质和碳源，但缺少氮源。只有当乙酰胺被乙酰胺酶(由pKLAC1上的amdS基因表达)降解为氨时，才能作为氮源而被利用。因此，只有转化的细胞才能长成菌落。

验证：

挑取菌落，用摇瓶培养，培养基为含38mM硫酸铵的YPGal培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％半乳糖)，28℃～30℃，培养时间70小时。离心3000rpm，取上清液，琼脂糖凝胶电泳分析。

步骤4.转化体的培养

YPGal培养基(3％酵母提取物，5％蛋白胨，12％半乳糖，1％硫酸铵)，标准发酵罐深层通气培养，120℃湿热蒸汽灭菌30分钟，冷却到28℃，接种，培养时间60小时。

步骤5.力墀永肽的分离纯化

发酵液过滤分离掉菌体；离心分离去杂，转速10000rpm，30min，取上清；Sephadex G-50层析，收集目标分子量洗脱液；C18反向制备色谱，收集目标分子量洗脱液；脱盐、浓缩，冻干，产物纯度为95％。

江南大学国家重点实验室液相色谱分析结果见图3。

步骤6.配制成备用液

上步冻干的纯化物，用稀盐酸或乙酸溶解，制成10mg/ml的力墀永肽，保存备用。

实施例2.力墀永肽抗肿瘤小鼠肉瘤S180动物体内试验.

动物：ICR小鼠，18-22g，SPF级，雌性，由江苏扬州大学比较医学中心提供，合格

证号：SCXK(苏)2007--0001。

瘤种：小鼠肉瘤S180。

选用18-22g雌性ICR小鼠及生长良好的7-11天的小鼠肉瘤S180瘤种，接种于ICR小鼠右侧腋部皮下，约4.5-5×10⁶细胞/只，接种24小时后随机分笼，力墀永肽每天静脉给药一次，每次0.2ml，阳性药SN-38每两天腹腔给药一次，每次0.2ml，阴性对照组给予给药组等量的NS。第9天处死动物，称体重、瘤重。计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。

肿瘤生长抑制率＝(空白对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重×100％

结果见下表

表.力墀永肽对小鼠肉瘤S180的生长抑制作用

Claims (8)

1.力墀永肽，其特征为Seq ID No.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的力墀永肽的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述的基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其骨架载体为pKLAC1或pKLAC2。

6.权利要求1所述的力墀永肽的制备方法，其特征在于将权利要求4或5所述的表达载体转入到酵母细胞中进行发酵培养。

7.权利要求1所述的多肽在制备治疗S180肉瘤的肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，所述药物指液态注射剂。