CN106566856B - 提高s－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，包括以下步骤：将外源性的表达ATP6基因的片段导入酵母菌株中，得到重组酵母菌株，将重组酵母菌株进行发酵培养后得到S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽。本发明采用重组DNA技术，将ATP6基因整合至产朊假丝酵母(Candida utilis CCTCC M 209298)基因组中，提高了线粒体中ATP合成酶的活性，促进ATP再生，为胞内SAM和GSH的生物合成提供充足的ATP，并最终实现SAM和GSH联合高产。

Description

提高S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种提高S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法。
背景技术
S－腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽是生物体内重要的小分子活性化合物，都属于微生物细胞内硫元素代谢途径中的关键节点物质。
S－腺苷甲硫氨酸(SAM)是甲硫氨酸的活性形式，在生物体内广泛存在，它是由底物L-甲硫氨酸和ATP经S－腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成的一种重要的中间代谢物质，具有转甲基、转氨丙基和转硫作用。SAM可以通过转硫作用增加肝内谷胱甘肽、硫酸根和牛磺酸的水平，对恶性营养不良、肝毒素及酒精性脂肪肝有效，可防止肝脏因胆汁郁积等导致的肝炎、脂肪肝、肝纤维化、肝硬化和肝癌。由于SAM具有消炎、减轻疼痛及组织修复功能，可明显促进软骨生成和减轻关节疼痛、僵硬和肿胀，欧洲已将其作为治疗关节炎的处方药。此外，SAM还可抗抑郁症，效果好于常规的临床药物，而且副作用少。1999年，美国FDA批准SAM作为保健品上市，在美国己成为最畅销的营养品之一。
谷胱甘肽(GSH)是一种广泛存在于生物体中，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的含有巯基的三肽化合物。GSH结构中的巯基易被氧化脱氢，这一特异结构使其成为生物体内主要的自由基清除剂，保护体内重要蛋白质和酶等分子不被氧化，保证能量代谢和细胞利用。同时，巯基还易与某些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属)等结合，并促进其排出体外，起到中和解毒作用。GSH对于放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等症状也有很强的保护作用。最新研究还表明，GSH能够纠正体内乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽。GSH不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料。将GSH加入到面制品中，不仅可使制造面包的时间大大缩短，还可起到强化食品营养的作用；将其拌到鱼糕中，可防止色泽加深；加到肉制品和干酪等食品中，具有强化风味的效果。
目前，发酵法被认为是生物合成SAM和GSH最具潜力的方法。然而，目前对于发酵法生产SAM和GSH大都集中在其中一种产物上。事实上，由于SAM和GSH均是微生物细胞含硫物质代谢网络中的重要节点物质，二者在合成过程中存在着复杂的关联：在分解代谢过程中，SAM会通过转硫作用合成L-半胱氨酸，为GSH的合成提供重要前体，从而促进GSH的合成。近年来，利用微生物菌株联产发酵SAM和GSH已逐渐引起研究者的广泛关注。
SAM和GSH的生物合成都需要ATP参与，如附图1所示。由图1可见，在前体氨基酸供给充足的情况下，ATP就会成为SAM和GSH过量合成的主要限制性因素，胞内ATP含量的高低决定着底物的转化速度以及SAM和GSH的合成效率。然而，在实际发酵过程中，ATP的供应往往不足，而直接添加ATP或NADH显然很不经济，而且外源添加能量辅助物质又会受到多种因素的影响。因此，需采取策略以保证在联产发酵过程中内源性ATP的充足供给，以满足SAM和GSH过量合成的需要。
对于好氧微生物(如产朊假丝酵母)来说，胞内的ATP主要来源于氧化磷酸化途径。氧化磷酸化途径由电子传递链和ATP合成酶(F0F1-ATPase)组成。F0F1-ATPase包括两个功能结构域：F1处于线粒体的基质中，Fo结合在线粒体内膜上。F1和Fo分别含有3个和1个α亚基。F0F1-ATPase并不是以“孤岛”形式结合在线粒体的内膜上，而是有规律地以二聚体或更高形式的寡聚体组织在一起，α亚基由于存在大量的跨膜螺旋而被认为对F0F1-ATPase的二聚作用有着重要的影响。α亚基还有引导质子从线粒体内膜进入线粒体基质中和诱导F1外膜结构域催化位点的构象变化以帮助ATP合成等功能。在真核生物细胞中，线粒体ATP6基因编码α亚基，所以，ATP6基因所编码的蛋白质产物在F0F1-ATPase中起着重要的作用。因此，若采用基因工程技术手段，将来源于拟南芥的ATP6基因表达至产朊假丝酵母中，有可能提高F0F1-ATPase的活性，促进ATP的再生，为胞内SAM和GSH的生物合成提供充足的ATP，并最终实现SAM和GSH联合高产。截止到目前，针对SAM和GSH生产菌株的遗传改造主要集中在SAM合成酶基因和GSH合成酶基因的过量表达上，而采用重组DNA技术对出发菌株中ATP合成酶进行遗传改造，并实现SAM和GSH联合高产的研究还未见报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种提高S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，采用重组DNA技术，将ATP6基因整合至产朊假丝酵母(Candida utilisCCTCC M 209298)基因组中，为胞内SAM和GSH的生物合成提供充足的ATP，实现SAM和GSH联合高产。
本发明的一种提高S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，包括以下步骤：将外源性的表达ATP6基因的片段导入酵母菌株中，得到重组酵母菌株，将重组酵母菌株进行发酵培养后得到S－腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽。
进一步地，酵母菌株为产朊假丝酵母Candida utilis CCTCC M 209298。
进一步地，表达ATP6基因的片段来源于拟南芥。
进一步地，表达ATP6基因的片段包含编码ATP6基因合成酶的序列和该序列上游的启动子序列。
进一步地，表达ATP6基因的片段还包含插入位点上游序列、插入位点下游序列以及放线菌酮抗性基因mL41。
进一步地，重组酵母菌株经活化、培养获得种子培养液后进行摇瓶发酵培养或分批发酵培养。
进一步地，本发明的重组酵母菌株的构建，包括以下步骤：
(1)以酵母菌株的基因组为模板，利用GAP启动子的上游引物和GAP启动子的下游引物扩增出酵母菌株的启动子序列，启动子序列如SEQ ID No.1所示；
其中，GAP启动子的上游引物的核苷酸序列为：GGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCA；
GAP启动子的下游引物的核苷酸序列为：CCATGGTGAGTGCTCGCTGTAAGCTT；
(2)将步骤(1)得到的启动子序列与ATP6基因片段在启动子的上游引物和ATP6基因下游引物序列的作用下进行PCR扩增，得到ATP6基因表达组件；
其中，ATP6基因片段序列如SEQ ID No.2所示；
ATP6基因表达组件序列如SEQ ID No.3所示；
ATP6基因下游引物序列为：TCACCTTCTGTGTTGCTGGA；
(3)以酵母菌株的基因组为模板，利用插入位点序列的上游引物和插入位点序列的下游引物扩增出插入位点序列，插入位点序列如SEQ ID No.4所示；
其中，插入位点序列的上游引物的核苷酸序列为：GCGGCCGCGATCCTGCCAGTAGTCATAT；
插入位点序列的下游引物的核苷酸序列为：GGATCCTGTACAAAGGGCAGGGACGT；
(4)将步骤(2)得到的所述ATP6基因表达组件序列、步骤(3)得到的插入位点序列以及放线菌酮抗性基因mL41分别连接到质粒中，得到质粒pPICZalpha A-kan，然后用限制性内切酶E.coR 1线性化后电转入酵母菌株的感受态细胞中，培养后筛选出阳性单克隆，得到重组酵母菌株；
其中，放线菌酮抗性基因mL41的序列如SEQ ID No.5所示；
质粒pPICZalpha A-kan的序列如SEQ ID No.6所示。
进一步地，在步骤(2)中，启动子序列与ATP6基因片段的摩尔比为1:1。
进一步地，在步骤(2)中，ATP6基因片段由来源于拟南芥的ATP6基因扩增得到。
进一步地，在步骤(3)中，插入位点为产朊假丝酵母的18S序列。
进一步地，在步骤(4)中，在步骤(4)中，将步骤(2)得到的ATP6基因表达组件序列、步骤(3)得到的插入位点序列以及放线菌酮抗性基因mL41分别连接到质粒pPICZalpha A中。
进一步地，在步骤(4)中，放线菌酮抗性基因mL41由将产朊假丝酵母的L41基因801位的G突变为T得到。
进一步地，在步骤(4)中，利用E.coR 1限制酶将测序正确的pPICZalpha A-kan质粒线性化。
进一步地，在步骤(4)中，提取阳性单克隆的基因组后进行PCR验证，验证正确的即为重组酵母菌株。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明采用重组DNA技术，对产朊假丝酵母Candida utilis CCTCC M 209298菌株进行遗传改造。将来源于拟南芥(A.thaliana)的ATP6基因表达至C.utilis CCTCC M209298后获得突变菌株C.utilis ATP6，使细胞内ATP合成酶的活性增强，有效促进ATP的再生，为胞内SAM和GSH的生物合成提供充足的ATP，并最终实现SAM和GSH联合高产。本发明技术为SAM和GSH联产发酵过程的优化增添了新的方法，同时也为真核细胞内类似耗能产物的高产提供了新的思路。
附图说明
图1是SAM和GSH生物合成反应图；
图2是pPICZalpha A-kan图谱；
图3是原始菌株(WT)和突变菌株(5E)的PCR验证结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明使用的酵母菌株为产朊假丝酵母(Candida utilis CCTCC M 209298)，以下简称C.utilis，苏州大学微生物生理与代谢调控研究室筛选并保存(该菌株在专利CN101781625A中公开过)。
本发明使用的培养基包括：
斜面培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，遗传霉素0.1g/L，琼脂粉15g/L，pH 6.0。
种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，pH 6.0。
发酵培养基：葡萄糖35g/L，硫酸铵10g/L，磷酸二氢钾12.3g/L，L-蛋氨酸4.6g/L，硫酸镁0.05g/L，氯化钙0.05g/L，pH 5.0。
本发明对发酵培养后的菌株进行以下测定，包括：
(1)酵母生物量的测定
以细胞干重(DCW)表示酵母生物量。取10mL发酵液，4000rpm下离心5min，用蒸馏水离心洗涤3次，收集菌体，70℃烘干至恒重。
(2)胞内GSH的提取及测定
取发酵培养得到的新鲜酵母，用蒸馏水洗涤3次后，于30℃下在40％乙醇溶液中处理2小时，离心取上清液作为待测样品。样品中的GSH浓度采用5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)-谷胱甘肽还原酶循环法进行测定。
(3)胞内SAM的提取及测定
取发酵培养得到的新鲜酵母，用蒸馏水洗涤3次后，在4℃下用0.35mol/L稀硫酸处理2小时，离心，上清液经0.22μm滤膜过滤作为待测样品。SAM浓度采用HPLC法测定，流动相为0.5mol/L甲酸铵溶液(pH 4.0)，流速1mL/min，柱温25℃。
实施例1产朊假丝酵母突变株C.utilis ATP6(5E)的构建
产朊假丝酵母突变株C.utilis ATP6(5E)构建方法如下：
(1)在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中检索到C.utilis的全基因组序列，以酿酒酵母的GAP启动子序列为模板，比对找出C.utilis的GAP启动子序列，设计GAP启动子的上游引物GAP-for和下游引物GAP-rev，以C.utilis CCTCC M 209298基因组为模板扩增出C.utilis的GAP启动子序列，片段大小为990bp，GAP启动子序列如SEQ ID No.1所示。
(2)在NCBI数据库中检索到来自于拟南芥(A.thaliana)的ATP6基因序列，大小为168bp，利用基因合成的方法获得ATP6基因片段，ATP6基因片段序列如SEQ ID No.2所示。
(3)在ATP6基因下游设计引物ATP6-rev，将扩增出的GAP启动子片段与ATP6基因片段按摩尔比1:1混合后，利用引物GAP-for、ATP6-rev进行Overlap PCR，获得ATP6基因表达组件GAP-ATP6，其序列如SEQ ID No.3所示。
(4)在NCBI数据库中找到产朊假丝酵母基因表达常用插入位点18S序列，分别设计上下游引物18S-for、18S-rev，利用C.utilis CCTCC M 209298基因组为模板进行扩增，得到C.utilis的18S序列，C.utilis的18S序列如SEQ ID No.4所示。
(5)在NCBI数据库中检索到C.utilis的L41基因，利用定点突变的方法将其801位的G突变为T，获得放线菌酮抗性基因mL41，mL41基因如SEQ ID No.5所示。
(6)将获得的ATP6基因表达组件GAP-ATP6、18S序列以及放线菌酮抗性基因mL41经过酶切、连接、转化的方法分别连接到空质粒中，得到质粒pPICZalpha A-kan，其序列如SEQID No.6所示。pPICZalpha A-kan的图谱如图2所示。
(7)将测序正确的质粒pPICZalpha A-kan用E.coR 1限制酶线性化后，利用电转化法将线性化后的pPICZalpha A-kan质粒转入C.utilis CCTCC M 209298感受态细胞中，在含有100mg/L的遗传霉素(G418)的种子培养基平板上进行培养，筛选阳性单克隆。
(8)将获得的单克隆进行复苏，提取基因组，利用引物GAP-for、ATP6-rev进行PCR验证，验证结果如图3所示。结果显示，突变菌株(5E)在接近1.2kb处有一条带，条带大小与目标条带(1162bp)基本一致，而野生型(WT)没有条带。将获得的PCR片段(GAP-ATP6)进行测序，其结果与SEQ ID No.3所示的序列相同。上述结果表明，在突变菌株5E中，GAP-ATP6片段成功整合到C.utilis CCTCC M 209298的基因组上，且没有发生突变。突变菌株5E即为构建成功的产朊假丝酵母突变株C.utilis ATP6。
本实施例使用的引物序列，如表1所示：
表1引物序列表
引物 核苷酸序列
GAP-for GGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCA
GAP-rev CCATGGTGAGTGCTCGCTGTAAGCTT
ATP6-rev TCACCTTCTGTGTTGCTGGA
18S-for GCGGCCGCGATCCTGCCAGTAGTCATAT
18S-rev GGATCCTGTACAAAGGGCAGGGACGT
实施例2摇瓶发酵培养原始菌株和突变菌株
对原始菌株C.utilis CCTCC M 209298和突变株C.utilis ATP6分别进行摇瓶发酵培养，先将斜面种子活化4小时后接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中进行振荡培养，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间24小时，得到新鲜种子液。然后将新鲜种子液按10％(v/v)的接种量接种到50mL发酵培养基中，于30℃，200rpm下摇床培养30小时。然后对发酵后的菌株进行测定，测试结果如下：
(1)原始菌株C.utilis CCTCC M 209298
细胞干重：14.31-14.63g/L；SAM产量：143.7-150.3mg/L；GSH产量：178.3-199.5mg/L；SAM和GSH联产产量：322.1-349.8mg/L；胞内SAM含量：1.00-1.03％；胞内GSH含量：1.25-1.36％。
(2)突变株C.utilis ATP6
细胞干重：13.64-13.88g/L；SAM产量：156.9-160.8mg/L；GSH产量：210.9-217.3mg/L；SAM和GSH联产产量：371.8-374.2mg/L；胞内SAM含量：1.15-1.16％；胞内GSH含量：1.52-1.59％。
实施例3分批发酵培养原始菌株和突变菌株
对原始菌株C.utilis CCTCC M 209298和突变株C.utilis ATP6分别进行分批发酵培养，先将斜面种子活化4小时后接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中进行振荡培养，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间24小时，得到新鲜种子液。然后将新鲜种子培养液接种至5L发酵罐(BIOTECH-5BGZ，上海保兴生物设备工程有限公司)中，装液量3L，接种量10％，温度30℃，搅拌转速350rpm，通气量3L/min，pH 5.0，培养时间30小时。然后对发酵后的菌株进行测定，测试结果如下：
(1)原始菌株C.utilis CCTCC M 209298
细胞干重：12.42-12.88g/L；SAM产量：124.8-145.3mg/L；GSH产量：182.2-198.7mg/L；SAM和GSH联产产量：297.7-329.5mg/L；胞内SAM含量：0.99-1.05％；胞内GSH含量：1.43-1.47％。
(2)突变株C.utilis ATP6
细胞干重：13.23-13.45g/L；SAM产量：149.6-158.6mg/L；GSH产量：200.3-207.4mg/L；SAM和GSH联产产量：345.4-371.6mg/L；胞内SAM含量：1.05-1.06％；胞内GSH含量：1.53-1.59％。
由实施例2和实施例3的结果可知，本发明采用重组DNA技术对C.utilis菌株进行遗传改造，对比采用原始菌株和采用突变菌株发酵生产SAM和GSH的实验结果，可发现：线粒体中外源ATP6基因的表达促进了SAM和GSH在C.utilis胞内的合成和积累；本发明为SAM和GSH联产发酵过程的优化增添了新的方法，同时也为真核细胞内类似耗能产物的高产提供了新的思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将外源性的表达ATP6基因的片段导入酵母菌株中，得到重组酵母菌株，将所述重组酵母菌株进行发酵培养后得到S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽；所述酵母菌株为产朊假丝酵母Candida utilis CCTCC M 209298；
所述重组酵母菌株的构建包括以下步骤：
(1)以所述酵母菌株的基因组为模板，利用GAP启动子的上游引物和GAP启动子的下游引物扩增出所述酵母菌株的启动子序列，所述启动子序列如SEQ ID No.1所示；
其中，所述GAP启动子的上游引物的核苷酸序列为：GGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCA；
所述GAP启动子的下游引物的核苷酸序列为：CCATGGTGAGTGCTCGCTGTAAGCTT；
(2)将步骤(1)得到的所述启动子序列与ATP6基因片段在所述启动子的上游引物和ATP6基因下游引物序列的作用下进行PCR扩增，得到ATP6基因表达组件；
其中，所述ATP6基因片段序列如SEQ ID No.2所示；
所述ATP6基因表达组件序列如SEQ ID No.3所示；
所述ATP6基因下游引物序列为：TCACCTTCTGTGTTGCTGGA；
(3)以所述酵母菌株的基因组为模板，利用插入位点序列的上游引物和插入位点序列的下游引物扩增出插入位点序列，所述插入位点序列如SEQ ID No.4所示；
其中，所述插入位点序列的上游引物的核苷酸序列为：GCGGCCGCGATCCTGCCAGTAGTCATAT；
所述插入位点的序列下游引物的核苷酸序列为：GGATCCTGTACAAAGGGCAGGGACGT；
(4)将步骤(2)得到的所述ATP6基因表达组件序列、步骤(3)得到的所述插入位点序列以及放线菌酮抗性基因mL41分别连接到质粒中，得到质粒pPICZalpha A-kan，然后用限制性内切酶E.coR 1线性化后电转入酵母菌株的感受态细胞中，培养后筛选出阳性单克隆，得到所述重组酵母菌株；
其中，所述放线菌酮抗性基因mL41的序列如SEQ ID No.5所示；
所述质粒pPICZalpha A-kan的序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述启动子序列与所述ATP6基因片段的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述插入位点为产朊假丝酵母的18S序列。
4.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，其特征在于：在步骤(4)中，将步骤(2)得到的所述ATP6基因表达组件序列、步骤(3)得到的所述插入位点序列以及放线菌酮抗性基因mL41分别连接到质粒pPICZalpha A中。
5.根据权利要求1所述的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽发酵产量的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述放线菌酮抗性基因mL41由将产朊假丝酵母的L41基因801位的G突变为T得到。
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Overexpression of a mitochondrial ATP synthase small subunit gene (AtMtATP6) confers tolerance to several abiotic stresses in Saccharomyces cerevisiae and Arabidopsis thaliana;Xinxin Zhang等;《Biotechnol Lett》;20080313;第30卷;参见摘要 *
Xinxin Zhang等.Overexpression of a mitochondrial ATP synthase small subunit gene (AtMtATP6) confers tolerance to several abiotic stresses in Saccharomyces cerevisiae and Arabidopsis thaliana.《Biotechnol Lett》.2008,第30卷参见摘要. *
基于能量代谢分析的S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产方法;王玉磊等;《化工学报》;20120115;第63卷(第1期);参见第224-228页 *
王玉磊等.基于能量代谢分析的S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产方法.《化工学报》.2012,第63卷(第1期),参见第224-228页. *

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