CN103420928A

CN103420928A - 氚标记和氘标记喹烯酮的制备方法

Info

Publication number: CN103420928A
Application number: CN2012105512219A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 李娟�; 黄玲利; 潘源虎; 斯琴朝克图; 尹伏军; 陶燕飞; 陈冬梅; 刘振利; 彭大鹏; 戴梦红; 谢书宇
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-12-17
Filing date: 2012-12-17
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明属于兽药制备技术领域，具体涉及一种兽药喹烯酮的氚标记和氘标记制备方法。本发明采用微量合成方法，使氚气或氘气与4-溴-2-硝基苯胺或4-碘-2-硝基苯胺在催化剂和酸接受体作用下发生脱卤反应，同时交换上氚或氘，生成4-³H-2-硝基苯胺或4-²H-2-硝基苯胺；再经过氧化反应、Beirut反应、醛酮缩合反应，采用微量合成方法，制得制得C-6位氚或氘标记喹烯酮。获得的产物标记位点明确，比活度高，放化纯度达98以上，化学纯度达99.5％以上。本发明所制备的氚标记喹烯酮为系统开展喹烯酮在动物体内吸收、分布、代谢及残留消除规律研究提供了物质基础，同时制备的氘标记可作为喹烯酮痕量定性、定量分析方法研究的内标物质。

Description

氚标记和氘标记喹烯酮的制备方法

技术领域

本发明属于兽药制备技术领域，具体涉及一种氚或氘标记喹烯酮的制备方法。本方法用放射性同位素氚或稳定同位素氘，在一种饲料药物添加剂药物喹烯酮(Quinocetone，QCT)的喹噁啉环上定位标记制备，以便示踪喹烯酮在动物体内的吸收、分布、代谢和排泄情况，以及提供喹烯酮定性、定量分析方法建立内标物的物质基础。

背景技术

喹噁啉类药物是目前我国用量最大的饲料药物添加剂。物喹烯酮(QCT)是中国自主研发的一种具有抗菌和促生长作用的动物专用药，但研究过程中发现其在试验动物和靶动物体内吸收、分布和消除等途径不明确，很多主要代谢物和次要代谢物去向不明，甚至用现有的常规研究方法无法定性和定量。为保障人类健康和扩大动物性食品的贸易往来，加强QCT的监控以及开展其在动物体内的代谢和毒理方面的研究非常必要。为评估QCT潜在的食品安全风险，有必要进行同位素示踪研究，说明QCT在动物体内吸收、分布及消除规律，推测该化合物在动物体内的残留靶组织及残留标示物。

同位素示踪技术的基本原理是利用标记化合物与相应的非标记化合物两种化合物在化学性质上完全一样，两者一经混合用化学方法就不能分离，只是放射性比度有所降低，降低程度与相应的非标记化合物的数量(或浓度)成正比，这样根据放射性比度的变化就可测量非标记同种化合物的含量。同位素示踪技术在农业科学研究中的应用领域主要是土壤肥料、植物生理、植物营养、生物固氮、生态环境、植物保护、动物生理、动物营养、畜牧兽医、医学及人的营养等方面。作为一种先进的研究工具，解决了许多在基础理论和实际应用方面难以解决的问题，促进了相关学科的发展。在核技术中利用同位素的核特性(放射性衰变与质量差异)以及利用电离辐射的物理、化学与生物效应，可感知物质的存在与状态，并追踪其运动行为，因而具有获取物质信息的能力。同位素示踪技术与常规的理化分析技术相比有着一定的优势。稳定性同位素虽然不释放射线，但可以利用它与普通相应同位素的质量之差，通过质谱仪、气相层析仪、核磁共振等质量分析仪器来测定。

同位素标记喹噁啉类药物相关报道中¹⁴C标记示踪较多。早在1973年德国Bayer公司Duhm等(Duhm，et al.，1973，Bayer Pharma Report no.4151)通过3位上定位标记¹⁴C的方法示踪研究了喹乙醇。但未见¹⁴C标记合成方面的专利和动物示踪研究的公开报道。1989年Pfizer对同类药物卡巴氧(Pfizer(1989a).Carbadox in Pigs Radiotracer.Metabolism C14-Phenyl Labeled.Unpublished Report.Submitted to FAO by Pfizer，Inc.Groton，CN，USA)的喹噁啉环上通过¹⁴C定位标记，进行了动物示踪研究。2011年袁宗辉等对喹赛多喹噁啉环第6位进行了氚或氘标记研究(发明专利CN 101538249B)，标记位点符合此类药物在动物体内的示踪要求。国内也有喹烯酮¹⁴C标记的相关报道。如，2001年杨云裳等(学位论文-¹⁴C标记喹烯酮的合成及药代实验设计，http://www.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？QueryID＝4&CurRec＝1&recid＝&filename＝2001012066.nh&dbname＝CMFD2001&DbCode＝CMFD&urlid＝&yx＝&uid＝WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlQ4REhaYjV1R3hLZURhS0tLRDVmOEdtOENaUDZBZTlmWC9ObzJOWnpSeTExakI4TQ＝＝)应用同位素定位标记方法在喹烯酮的侧链上进行了¹⁴C标记。同一年李剑勇等用¹⁴C标记喹烯酮进行了猪体内药代动力学研究(李剑勇等，喹烯酮在猪体内的药代动力学研究.中国兽医科技[J].2001，31(8)：31-33.)该方法虽然成功标记合成了¹⁴C标记的喹烯酮，却有很明显的缺点。该方法将¹⁴C标记于喹噁啉母环侧链上，在动物体内示踪研究中一旦侧链分解离开母环就无法说明整体药物的代谢特性。2005年李剑勇等(李剑勇等，氚标记喹烯酮在鸡体内的代谢动力学研究.毒理学杂志，2005，19(3)：273.)进行了氚标记喹烯酮在鸡体内代谢动力学研究，却未见其氚标记合成方面的报道。总结以上文献所述的方法，大部分存在以下问题：

1)¹⁴C标记合成成本高，国内无法找到合适的起始原料。

2)标记位置不合理，不符合此类药物在动物体内示踪要求。

3)没有公开的报道或专利文献可供借鉴。

4)现有方法合成路线长，操作步骤烦杂，条件苛刻。

鉴于到目前为止，未见适合于动物体内示踪研究的喹烯酮放射性或稳定同位素标记合成方法，需要开发一种适用于喹烯酮示踪研究的同位素合成方法，以便对其开展同位素示踪研究。本发明的前期工作由华中农业大学完成，已经获得中国发明专利授权，专利号为ZL2009100611540，公开号为CN 101538249，在该专利文献中发明人中描述了制备4-氚-2-硝基苯胺或4-氘-2-硝基苯胺的方法，本发明的基础原料4-氚-2-硝基苯胺或4-氘-2-硝基苯胺的制备参考了该文献的制备方法。

发明内容

本发明目的是得到高比活度、高放化纯度的放射性(稳定)同位素定位标记的喹烯酮。喹噁啉环是本发明药物最稳定的部分，体内代谢过程中大多数代谢产物都保留了喹噁啉环。喹噁啉环上定位标记可得到比活度高、标记部位明确的药物，更适合于药物在靶动物体内的示踪研究。

解决本发明的技术方案是：

参照公开号为CN 101538249(中国发明专利号ZL2009100611540)描述的方法制备4-氚-2-硝基苯胺或4-氘-2-硝基苯胺。该方法的具体步骤为：

(1)取4-溴-2-硝基苯胺20mg或4-碘-2-硝基苯胺25mg，加入催化剂质量比为10％的钯/碳或拉尼镍或氯化钯5mg，等摩尔比的酸接受体氢氧化钠、醋酸钠或碳酸钾，在甲醇或乙醇1ml中溶解，获得反应混合液。

(2)将步骤(1)获得的反应混合液连接到氚化反应装置上，通氚气或氘气，使反应瓶内压力为100～760mmHg，反应温度为4～40℃，搅拌反应时间为5～45min，停止搅拌，液氮冷冻，回收剩余氚气或氘气，放置融化，抽滤收集催化剂。

(3)采用制备高效液相色谱法，按照下列技术参数或步骤分离制备：色谱柱为venusil XBP-C18，用体积比为75∶25的甲醇/水为流动相；控制流速5ml min^-1；检测波长231nm，收集保留时间与邻硝基苯胺对应的流动相组分，去除流动相，得到4位上氚或氘标记的邻硝基苯胺。

在接下来的步骤中，申请人提供了一种氚标记和氘标记喹烯酮制备法，其步骤如下：

(1)取氚或氘标记的邻硝基苯胺中混入适量的未标记邻硝基苯胺稀释至40mg，溶解于异丙醇100～300μL(优选为150～250μL)，加入氢氧化钠16mg，在搅拌下缓缓滴入有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液200～800μL(优选为300～700μL)，在10～35℃下反应1～5h，静置1h，抽滤，用去离子水洗涤产品2次，自然晾干，得到氚或氘标记的苯并呋咱一氧化物的浅黄色晶体；

(2)取步骤(1)获得的氚或氘标记的苯并呋咱一氧化物25mg，加入三乙胺100～500μL，搅拌溶解，加入甲醇40～100μL，滴加乙酰丙酮50～200μL(优选为60～100μL)，反应温度为25～45℃(优选为30～40℃)，避光反应15h，4℃静置2h，抽滤，产物用少量三乙胺洗涤3次，烘箱内70℃干燥2h，得到氚或氘标记的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物；

(3)取步骤(2)获得的氚或氘标记的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物25mg，加入甲醇-水(体积比4∶1)40～200μL(优选为100～150μL)，搅拌溶解，加入三乙胺10～50μL，滴加苯甲醛10～50μL(优选为15～25μL)，并在30～50℃下搅拌反应2～4h，静置，抽滤，用去离子水洗涤产品2次；70℃烘箱干燥2h，得目标产物氚或氘标记的喹烯酮。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

用氢的同位素氚或氘在喹烯酮的喹噁啉环第6位上定位标记合成。合成条件适宜、收率高、反应步骤少，进行“热试验”(放射性试验)时反应条件易于掌握，对技术人员的辐射损伤少。

标记位置如下所示(结构式中：R为氚或氘原子)：

本发明是4-³H-2-硝基苯胺或4-²H-2-硝基苯胺，经过氧化反应、Beirut反应、醛酮缩合反应，采用微量合成方制得氚或氘标记喹烯酮，即，获得高比活度、高放化纯度的氚标记喹烯酮或高纯度的氘标记喹烯酮。

本发明的合成路线如下所示(式中：R为氚或氘原子)：

具体步骤如下：

(1)在3mL反应瓶内投入氚或氘标记的邻硝基苯胺40mg，异丙醇100～300μL，氢氧化钠16mg。在搅拌下缓缓滴入有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液200～800μL，在10～35℃下反应1～5h，静置1h，抽滤，产品用水洗涤2次，自然晾干，得浅黄色晶体氚或氘标记的苯并呋咱一氧化物；

(2)在3mL反应瓶内投入上述反应所得到的氚或氘标记的苯并呋咱一氧化物25mg，加入三乙胺100～500μL，搅拌溶解，加入甲醇40～100μL，滴加乙酰丙酮50～200μL，反应温度为28～35℃，避光反应15h，4℃静置2h，抽滤，产物用少量三乙胺洗涤3次，70℃烘箱干燥2h，得到氚或氘标记的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物；

(3)3mL反应瓶内投入上述反应所得到的氚或氘标记的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物25mg，加入甲醇-水(体积比为4∶1)40～200μL，搅拌溶解，加入三乙胺10～50μL，滴加苯甲醛10～50μL，30～50℃下搅拌反应2～4h，静置，抽滤，用去离子水洗涤产品2次；70℃烘箱干燥2h，得目标产物氚或氘标记的喹烯酮。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)原料易得：本发明所用的原料4-氚-2-硝基苯胺或4-氘-2-硝基苯胺是本申请人制备得到的化合物，其他都是常用试剂和原料。

(2)所需设备简单、易得，本发明只需普通3mL玻璃反应瓶和搅拌子就可。

(3)环境污染少，易于控制，本发明都是在微量范围内合成，全部废弃试剂和原料不超过5mL。

(4)本发明所得到的目标化合物氚标记喹烯酮和氘标记喹烯酮的标记位置明确、比活度高，而且标记位置符合本类药物在靶动物体内任何代谢相关的示踪试验要求。

(5)本发明所得到的目标化合物氚标记喹烯酮放化纯度和化学纯度高；氘标记喹烯酮的化学纯度高、杂质少。

(6)本发明所得到的目标化合物产率高，制备成本低。

附图说明

图1：是4-³H-2-硝基苯胺半制备色谱分离图(1和3为杂质峰，2为4-³H-2-硝基苯胺峰)。

图2：是QCT标准品HPLC检测图谱。

图3：是[³H]-QCTHPLC检测图谱。

图4：是[²H]-QCT HPLC检测图谱。

图5：是[³H]-QCT HPLC放化纯度HPLC-vARC检测图谱。

图6：是[²H]-QCT的LC/MS-IT-TOF MS(E+)一级质谱图。

图7：是[²H]-QCT的LC/MS-IT-TOF MS(E+)二级质谱图。

图8：是[³H]-QCT紫外扫描图。

具体实施方式

实施例1

在3mL反应瓶内投入[³H]-邻硝基苯胺15mg，异丙醇90μL，氢氧化钠9mg。在搅拌下缓缓滴入有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液250μL，在10℃下反应4h，静置1h，抽滤，产品用水洗涤2次，自然晾干，得浅黄色晶体[³H]-苯并呋咱一氧化物，产率70.2％。

在3mL反应瓶内投入[³H]-苯并呋咱一氧化物20mg，加入三乙胺300μL，搅拌溶解，加入甲醇50μL，滴加乙酰丙酮75μL，反应温度为30℃，避光反应15h，4℃静置2h，抽滤，产物用少量三乙胺洗涤3次，70℃烘箱干燥2h，得到淡黄色固体晶体[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物，收率68.6％。

3mL反应瓶内投入上述反应所得到的[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物25mg，加入甲醇-水(体积比为4∶1)150μL，搅拌溶解，加入三乙胺20μL，滴加苯甲醛20μL，40℃搅拌反应4h，静置，抽滤，用去离子水洗涤产品2次；70℃烘箱干燥2h，得黄色固体粉末[³H]-喹烯酮，产率58.9％。

实施例2

在3mL反应瓶内投入[³H]-邻硝基苯胺40mg，异丙醇200μL，氢氧化钠15mg。在搅拌下缓缓滴入有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液600μL，在10℃下反应2h，静置1h，抽滤，产品用水洗涤2次，自然晾干，得浅黄色晶体[³H]-苯并呋咱一氧化物，产率74.8％。

在3mL反应瓶内投入[³H]-苯并呋咱一氧化物25mg，加入三乙胺300μL，搅拌溶解，加入甲醇80μL，滴加乙酰丙酮100μL，反应温度为30℃，避光反应15h，4℃静置2h，抽滤，产物用少量三乙胺洗涤3次，70℃烘箱干燥2h，得到淡黄色固体晶体[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物，收率61.2％。

3mL反应瓶内投入上述反应所得到的[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物25mg，加入甲醇-水(4∶1)100μL，搅拌溶解，加入三乙胺30μL，滴加苯甲醛30μL，40℃搅拌反应4h，静置，抽滤，用去离子水洗涤产品2次；70℃烘箱干燥2h，得黄色固体粉末[³H]-喹烯酮，产率58.5％。

实施例3

在3mL反应瓶内投入[³H]-邻硝基苯胺40mg，异丙醇300μL，氢氧化钠16mg。在搅拌下缓缓滴入有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液700μL，在25℃下反应2h，静置1h，抽滤，产品用水洗涤2次，自然晾干，得浅黄色晶体[³H]-苯并呋咱一氧化物，产率78.3％。

在3mL反应瓶内投入[³H]-苯并呋咱一氧化物25mg，加入三乙胺350μL，搅拌溶解，加入甲醇90μL，滴加乙酰丙酮90μL，反应温度为35℃，避光反应15h，4℃静置2h，抽滤，产物用少量三乙胺洗涤3次，70℃烘箱干燥2h，得到淡黄色固体晶体[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物，收率58.9％。

在3mL反应瓶内投入上述反应所得到的[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物25mg，加入甲醇-水(4∶1)125μL，搅拌溶解，加入三乙胺25μL，滴加苯甲醛20μL，40℃搅拌反应4h，静置，抽滤，用去离子水洗涤产品2次；70℃烘箱干燥2h，得黄色固体粉末[³H]-喹烯酮，产率75.3％。

实施例4

在3mL反应瓶内投入[³H]-邻硝基苯胺30mg，异丙醇180μL，氢氧化钠15mg。在搅拌下缓缓滴入有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液500μL，在25℃下反应2h，静置1h，抽滤，产品用水洗涤2次，自然晾干，得浅黄色晶体[³H]-苯并呋咱一氧化物，产率68.5％。

在3mL反应瓶内投入[³H]-苯并呋咱一氧化物20mg，加入三乙胺275μL，搅拌溶解，加入甲醇100μL，滴加乙酰丙酮100μL，反应温度为35℃，避光反应15h，4℃静置2h，抽滤，产物用少量三乙胺洗涤3次，70℃烘箱干燥2h，得到淡黄色固体晶体[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物，收率65.8％。

在3mL反应瓶内投入上述反应所得到的[³H]-3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物25mg，加入甲醇-水(4∶1)250μL，搅拌溶解，加入三乙胺20μL，滴加苯甲醛20μL，40℃搅拌反应4h，静置，抽滤，用去离子水洗涤产品2次；70℃烘箱干燥2h，得黄色固体粉末[³H]-喹烯酮，产率59.5％。

实施例5氚或氘标记喹烯酮质量标准制定

【分子式】：C₁₈H₁₄N₂O₃。

【化学名】：6-³H-3-甲基-2-苯乙烯酮基-喹噁啉-1，4-二氧化物。

【形状】：本品为淡黄色或黄绿色粉末；无臭，无味；不溶于水，略溶于有机试剂。

【鉴别】：(1)取本品20％乙腈/水溶液，照分光光度法测定，在229±1nm，259±1nm与311±1nm的波长处有最大吸收。见图8。

(2)本品的氘标记产品质谱图证明标记位置正确。见图6、7。

(3)取含量测定项下溶液，照高效液相色谱法测定，与对照品的保留时间一致。见图2、3、4。

【放射性活度和比活度】取本品1mg溶于DMSO 1mL中，再取1μL，用20％乙腈/水定容至10mL。取100μL置于20mL低钾玻璃闪烁瓶中，加入10mL Ultima gold闪烁液，检测其放射性活度。其比活度为18.5GBq/mmol。

【放化纯度】上述本品20％乙腈/水溶液HPLC-vARC进样检测。以放射性活度为纵坐标，时间为横坐标，以面积归一化法计算放化纯度。放化纯度≥99％。

【化学纯度】HPLC二极管阵列检测器全波长扫描无杂峰。含量不低于99.5％。

【标记位置确定】本品起始原料为4-溴-2-硝基苯胺，因此，氚化后得到4-[³H]-2-硝基苯胺，由此合成得到的产品为6-[³H]-QCT。

【稳定性考察】将本品DMSO溶液，无水乙醇溶液和固体物质分别保存于-20℃冰箱内，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月取样，考察此条件对产品的放化纯度影响，见表1。

表1[³H]-QCT的不同保存方式下的放化纯度(％)

Figure 2012105512219100002DEST_PATH_IMAGE001

Claims

1.氚标记和氘标记喹烯酮制备方法，其特征在于下列步骤：

(1)取4-溴-2-硝基苯胺20mg或4-碘-2-硝基苯胺25mg，加入催化剂质量比为10％的钯/碳或拉尼镍或氯化钯5mg，等摩尔比的酸接受体氢氧化钠、醋酸钠或碳酸钾，在甲醇或乙醇1ml中溶解，获得反应混合液；

(2)将步骤(1)获得的反应混合液连接到氚化反应装置上，通氚气或氘气，使反应瓶内压力为100～760mmHg，反应温度为4～40℃，搅拌反应时间为5～45min，停止搅拌，液氮冷冻，回收剩余氚气或氘气，放置融化，抽滤收集催化剂；

(3)采用制备高效液相色谱法，按照下列技术参数或步骤分离制备：色谱柱为venusil XBP-C18，用体积比为75∶25的甲醇/水为流动相；控制流速5ml min^-1；检测波长231nm，收集保留时间与邻硝基苯胺对应的流动相组分，去除流动相，得到4位上氚或氘标记的邻硝基苯胺；

(4)取步骤(3)获得的氚或氘标记的邻硝基苯胺中混入适量的未标记邻硝基苯胺稀释至40mg，溶解于异丙醇100～300μL，加入氢氧化钠16mg，在搅拌下缓缓滴入有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液200～800μL，在10～35℃下反应1～5h，静置1h，抽滤，用去离子水洗涤产品2次，自然晾干，得到氚或氘标记的苯并呋咱一氧化物的浅黄色晶体；

(5)取步骤(3)获得的氚或氘标记的苯并呋咱一氧化物25mg，加入三乙胺100～500μL，搅拌溶解，加入甲醇40～100μL，滴加乙酰丙酮50～200μL，反应温度为28～35℃，避光反应15h，4℃静置2h，抽滤，产物用少量三乙胺洗涤3次，烘箱内70℃干燥2h，得到氚或氘标记的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物；

(6)取步骤(5)获得的氚或氘标记的3-甲基-2-乙酰基喹噁啉-1，4-二氧化物25mg，加入体积比为4∶1的甲醇∶水＝40～200μL，搅拌溶解，加入三乙胺10～50μL，滴加苯甲醛10～50μL，并在30～50℃下搅拌反应2～4h，静置，抽滤，用去离子水洗涤产品2次；70℃烘箱干燥2h，得目标产物氚或氘标记的喹烯酮。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中的异丙醇为150～250μL；有效氯摩尔比为5％的次氯酸钠溶液400～700μL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中甲醇为50～95μL；乙酰丙酮为100～150μL；反应温度为30～35℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中体积比为4∶1的甲醇∶水＝50～150μL；苯甲醛为15～30μL，反应温度为40～50℃。