CN103417799B - 一种中药组合物在制备治疗贫血的药物中的应用 - Google Patents
一种中药组合物在制备治疗贫血的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物在制备治疗贫血药物中的应用。本发明药物中含有鹿茸、海马、淫羊藿、蛇床子、淫羊藿、韭菜子、覆盆子、菟丝子、川楝子、金樱子等多味中药具有性激素样作用,可以刺激肾上腺皮质功能,增高血红蛋白含量,试验证明该中药组合物对治疗贫血具有显著疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合的新用途,具体的涉及该中药组合物在制备治疗贫血的药物中的应用。
背景技术
贫血(anaemia)是指全身循环血液中红细胞总量减少至正常值以下。但由于全身循环血液中红细胞总量的测定技术比较复杂,所以临床上一般指外周血中血红蛋白的浓度低于患者同年龄组、同性别和同地区的正常标准。国内的正常标准比国外的标准略低。沿海和平原地区,成年男子的血红蛋白如低于12.5g/dl,成年女子的血红蛋白低于11.0g/dl,可以认为有贫血。12岁以下儿童比成年男子的血红蛋白正常值约低15%左右,男孩和女孩无明显差别。海拔高的地区一般要高些。中国血液病学家认为在中国海平面地区,成年男性 Hb<120 g/L ,成年女性(非妊娠)Hb<110 g/L ,孕妇Hb<100 g/L ,就是贫血。据世界卫生组织统计:全球约有30亿人不同程度贫血,每年因患贫血引致各类疾病而死亡的人数上千万。中国患贫血的人口概率高于西方国家,在患贫血的人群中,女性明显高于男性,老人和儿童高于中青年。
根据贫血发生的原因分为红细胞或血红蛋白生成不足,红细胞破坏过多(溶血)和失血性贫血3大类。(1)红细胞和血红蛋白生成不足①特异造血因子缺乏:如巨幼红细胞性贫血,叶酸缺乏或吸收障碍,维生素B12缺乏,吸收障碍或转运障碍;小细胞性贫血,缺铁性贫血,铅中毒等。②再生障碍性贫血(原发性及继发性):纯红细胞再生障碍性贫血分为先天性纯红细胞再障碍性贫血和获得性纯红细胞再生障碍性贫血。③感染性、炎症性及癌症性贫血、慢性肾脏病所致的贫血等。(2)溶血性贫血 溶血性贫血可由红细胞内在异常因素或红细胞外在因素引起。①红细胞内在异常:红细胞膜结构缺陷:如遗传性球形细胞增多症,椭圆形细胞增多症,阵发性睡眠性血红蛋白尿等;红细胞酶缺陷;如葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症,丙酮酸激酶缺乏症,己糖激酶缺乏症等;血红蛋白合成缺陷;如珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血),血红蛋白病等。②红细胞外在因素:免疫性疾病:由被动获得性抗体引起者如 Rb、A或B同种免疫性溶血;主动产生抗体者如自身免疫性溶血性贫血,药物所致的免疫性溶血性贫血等。非免疫性因素;如药物、化学物质、毒素或物理、感染因素引起的溶血。(3)失血性贫血:包括急性失血性贫血及慢性失血性贫血。
中医认为血的生成和调节与心、肝、脾、肾等脏腑关系密切,故中医谓“心主血、肝藏血、脾统血。”而这些脏腑功能的充分发挥,又有赖于肾之命火温照。因此,心、肝、脾、肾功能衰弱,均可导致血虚。而血虚之形成不外乎内外因素。外邪六淫与温热侵入机体,潜而不定期出,深入化血之机,导致新血无生,这一致病因素与现代医学所说的“细菌感染、原虫、毒素发生溶血为病”不谋而合。在内因上,或为七情失节,或为饮食失宜,或为失血而成,或为先天禀赋不足,或为病后房劳过甚,或为妊娠失调,而引起造血之机受阻;或消化之机紊乱,水谷不化,精微不成,发生血虚之疾。可见在内因方面与现代医学所说的“缺乏造血原料或造血器官功能障碍,或慢性失血而成贫血”基本上是一致的。
ZL 02146569.X公开了一种药物组合物,并公开了该该药物组合物具有治疗阳痿早泄,腰膝酸痛,体倦乏力的作用。
发明内容
本发明目的是提供一种中药组合物在制备治疗贫血的药物中的应用,该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
菟丝子150-350、枸杞子100-200、五味子30-60、蛇床子20-50、金樱子20-50、韭菜子20-50、巴戟天20-50、肉苁蓉20-50、生地黄30-60、川牛膝20-50、淫羊藿40-100、覆盆子20-50、人参15-35、鹿茸10-25、海马15-35、川楝子15-35。
制备治疗贫血的药物的该中药组合物原料药的重量份可优选为:
菟丝子150、枸杞子200、五味子30、蛇床子50、金樱子20、韭菜子20、巴戟天50、肉苁蓉20、生地黄30、川牛膝50、淫羊藿40、覆盆子50、人参15、鹿茸25、海马15、川楝子35。
还可以优选为:
菟丝子350、枸杞子100、五味子60、蛇床子20、金樱子50、韭菜子50、巴戟天20、肉苁蓉50、生地黄60、川牛膝20、淫羊藿100、覆盆子20、人参35、鹿茸10、海马35、川楝子15。
还可以优选为:
菟丝子250、枸杞子138、五味子46、蛇床子35、金樱子35、韭菜子35、巴戟天35、肉苁蓉35、生地黄46、川牛膝35、淫羊藿70、覆盆子35、人参25、鹿茸16、海马21、川楝子23。
还可以优选为:
菟丝子250、枸杞子150、五味子45、蛇床子30、金樱子30、韭菜子30、巴戟天30、肉苁蓉30、生地黄45、川牛膝30、淫羊藿70、覆盆子30、人参20、鹿茸19、海马20、川楝子20。
实验证实本发明药物对环磷酰胺所致小鼠白细胞减少性贫血有防治作用,对于改善乙酰苯肼所致小鼠红细胞减少性贫血有防治作用。同时本发明药物还可以减少IFN-γ和TNF-α分泌,改善T细胞功能紊乱,对再生障碍性贫血具有防治作用;本发明药物还能够改善小鼠胸腺指数和脾脏指数,对小鼠胸腺和脾脏的形态大小产生影响,能够增强小鼠胸腺和脾脏的免疫活性,对免疫抑制所致小鼠血虚后的免疫功能具有一定作用。
为了实现本发明的目的,将该中药组合物制成各种药物剂型,理论上本发明中药组合物可以按照制剂一般方法,例如,范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺,制成任何剂型,根据其适用对象和适应症优选为为汤剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂或丸剂。
为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等;粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000,PEG4000,虫蜡等。
为实现制成成药的目的,对该中药组合物中的部分或者全部药材进行必要的提取或者粉碎,但并不排除全部煎汤服用。
本发明胶囊剂优选为如下方法制备:
a、按比例称取蛇床子、菟丝子、五味子、淫羊藿,加6-10倍量70%乙醇,回流提取1-3次,每次1-3小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得醇提浸膏;
b、将步骤a醇提后的药材残渣与比例量的枸杞子、生地黄、覆盆子、金樱子、韭菜子、巴戟天、川楝子合并,加7-12倍量水煎煮1-3次,每次1-3小时,滤过,合并滤液,与步骤a所得醇提浸膏混合,减压浓缩至在60℃测定相对密度为1.25-1.30,得浸膏;
c、按比例称取人参、鹿茸、海马、肉苁蓉、川牛膝,粉碎成细粉与步骤b所得浸膏混合均匀,60-70℃干燥,粉碎,过筛,填充胶囊。
进一步优选为如下方法制备:
a、按比例称取蛇床子、菟丝子、五味子、淫羊藿,加8倍量70%乙醇,回流提取2次,每次2小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得醇提浸膏;
b、将步骤a醇提后的药材残渣与比例量的枸杞子、生地黄、覆盆子、金樱子、韭菜子、巴戟天、川楝子合并,加9倍量水煎煮2次,每次2小时,滤过,合并滤液,与步骤a所得醇提浸膏混合,减压浓缩至在60℃测定相对密度为1.25-1.30,得浸膏;
c、按比例称取人参、鹿茸、海马、肉苁蓉、川牛膝,粉碎成细粉与步骤b所得浸膏混合均匀,60-70℃干燥,粉碎,过筛,填充胶囊。
在该技术方案中所述提取溶剂的倍数是指药材(干重)与溶剂的重量体积比,即1g药材对应1ml提取溶剂。
为证实本发明中药组合物的疗效,进行如下试验:
一、本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型的影响
1 实验材料
1.1 试验用药物
1.1.1本发明药物: 按实施例1原料药配方及制备工艺制备的胶囊内容物,石家庄以岭药业股份有限公司提供;
1.1.2阳性药:鲨肝醇:临床用量60-180mg/日,批号:1109142。江苏鹏鹞药业有限公司生产。
1.1.3工具药:注射用环磷酰胺:冻干粉。批号:11040921。江苏恒瑞医药股份有限公司生产。
实验系统
1.2.1 动物种系:健康ICR小鼠
1.2.2 动物级别:SPF级
1.2.3 动物性别和数量:雌雄各半,共72只
1.2.4 动物年龄:4周龄以上
1.2.5 动物体重:18~20g
1.2.6 动物来源:购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:0239795
1.2.7 饲养条件:动物饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心,光照12小时/天,温度20~25℃,相对湿度40~70%。小鼠笼养,6只/笼。
1.2.8 检疫过程:新领到的动物检疫期3天。在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况,以及是否存在疾病和死亡征兆。
1.2.9 饲料:实验动物全价颗粒饲料,由北京军事医学科学院实验动物中心提供,生产许可证:SCXK-(军)2005-005。
1.2.11垫料:购自河北省实验动物中心,每周更换2次。
1.2.12 动物标识:动物识别采用5%苦味酸标记。
仪器系统
仪器 | 厂家 |
AL204电子天平 | METTLER POLEDO |
MEK-6318K血球计数仪 | 日本光电 |
EPICS—XLⅡ流式细胞仪 | 美国Beckman Coulter |
XD711酶标仪 | 上海讯达 |
2 实验方法
2.1 实验设计依据
2.1.1 采用标准:中华人民共和国卫生部药政管理局颁布的中药新药研究指南(药学,药理学,毒理学)、新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学,药理学,毒理学),人民卫生出版社出版的《中药药理研究方法学》、《药理实验方法学》及相关文献确定。
2.1.2 委托单位提供资料:无
2.2 剂量与分组
本品临床拟用量6.86g生药/天,即0.11g生药/kg,设定小鼠高、中、低剂量组的剂量分别为人剂量的20、10、5倍,即2.29、1.14、0.57g生药/kg×day。另设正常对照组、模型组、阳性药组(鲨肝醇组),共6组。溶媒均为0.5%羧甲基纤维素钠。如表1所示。
表1本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型实验分组和给药剂量
组 别 | 动物数 | 剂量(g生药/kg.d) | 与临床的倍数关系 |
空白对照组 | 12 | —— | —— |
模型组 | 12 | —— | —— |
鲨肝醇组 | 12 | 0.048 | 16 |
低剂量组 | 12 | 0.57 | 5 |
中剂量组 | 12 | 1.14 | 10 |
高剂量组 | 12 | 2.29 | 20 |
2.3 给药方法
灌胃给药,与临床推荐的口服途径相一致。每天上午按体重给药,每天一次。
供试品配制和保存
各受试药用0.5%CMC-Na混悬成实验用浓度:本发明药物治疗组浓度由高到低依次为0.08g/ml、0.04g/ml、0.02g/ml,鲨肝醇组浓度为0.0048g/ml,以上各药给药量均为10ml/kg体重,每周配制一次,2~8℃保存备用。
供试品的给予
灌胃给药,每日一次,连续14天,对照组给予相同体积溶剂对照(0.5%羧甲基纤维素钠);给药容积0.1ml/10g体重。
观测的指标、时间和内容
2.6.1造模方法:于实验开始1、3、5、7天按100mg.kg-1体重剂量腹腔注射CTX,共注射4次。造模7天后测外周血常规,外周血红细胞数和血红蛋白含量低于正常值的20%时,成功建立贫血模型。以首次注射CTX的前一天为实验0天,从造模起即开始口服灌胃给药,体积为0.1ml/10g体重,模型对照组和空白对照组灌胃等体积的0.5%羧甲基纤维素钠,连续给药14天。
2.6.2观测指标
(一)一般状态观察:
观察各组小鼠皮毛、活动及进食情况。每周称体重一次。
(二)外周血常规指标检测:分别在造模前、造模第7天,末次给药2小时眼眶采血20µl,抗凝,全自动血球计数仪检测血常规。
(三)脏器指数检测
颈椎脱臼处死小鼠,打开胸腔及腹腔,依次剪取胸腺、脾脏,称量重量(g)并记录,按照下列公式分别计算胸腺指数和脾脏指数。
脾脏指数=脾脏重量(g)/小鼠体重(g)
胸腺指数=胸腺重量(g)/小鼠体重(g)
(四)免疫学分型检测:抗凝外周血用0.83% NHCl3裂解红细胞后,加入相应抗体进行避光孵育,加入PBS终止反应并用200目滤网过滤,送流式细胞仪(EPICS ALTRA,BeckmanCoulter,美国)进行检测,用EXPO32软件采集数据并用EXPO32 Analyze软件分析数据。分别检测CD4、CD8、CD80/86等指标,并设一抗二抗阴性对照。
(五)免疫相关细胞因子检测:取外周血检测肿瘤坏死因子TNF-α,干扰素IFN-Ύ。
统计方法
所有数据用均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS统计软件包,首先进行正态性检验,符合正态分布的数据,均数比较用单因素方差分析,若方差齐,两两比较采用最小显著差法,若方差不齐则采用Dunnett’s T3检验行两两比较;如不符合正态分布,则用非参数检验进行统计分析。
结果
3.1对体重食水的影响:
表2 本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型食水量的影响(g/100g体重)
表3 本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型体重的影响( ±s,n=9)
组别 | 造模前 | 造模后 | 治疗后 |
空白对照组 | 25.00±3.13 | 27.25±4.35 | 28.42±4.32 |
模型组 | 24.83±3.59 | 24.00±3.38△ | 23.09±1.87△ |
鲨肝醇组 | 25.25±3.05 | 25.00±2.13 | 24.45±2.07 |
低剂量组 | 25.25±3.02 | 24.92±3.12 | 23.82±4.14 |
中剂量组 | 24.33±3.42 | 25.50±3.61 | 25.58±3.63 |
高剂量组 | 25.50±3.63 | 23.67±3.42 | 24.09±2.88 |
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
由表2、3所见,腹腔注射环磷酰胺后,小鼠的食量、水量、体重与空白组相比均有所下降,体重下降非常明显(P<0.05),直至实验结束,仍具有显著统计学差异(P<0.05);各给药组上述指标下降程度均小于模型组,但与模型组无明显的统计学差异。
3.2 对外周血常规指标的影响:
表4 本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型血球计数的影响 (±s,n=12)
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
由表4可见,造模前各组动物血常规指标没有明显差异;动物造模7天后,与空白对照组相比,各造模组小鼠血常规指标均有不同程度的下降,其中模型组WBC 、RBC 、HCT 、HGB、PLT与空白组相比有显著差异(P<0.01);各治疗组虽有逆转上述变化的趋势,但与模型组相比均无统计学差异。治疗14天后,模型组与空白组相比WBC 、RBC 、HCT 、HGB、MCH仍有显著差异(P<0.01),各治疗组血常规指标有不同程度的改善,其中鲨肝醇组WBC和HGB升高明显,与模型组相比具有显著统计学差异(P<0.05,P<0.05),本发明药物低、中、高剂量组均可显著升高造模导致的WBC降低,低剂量组可显著提高HGB含量,与模型组比有显著差异(P<0.01~0.05)。
3.3对免疫相关细胞因子的影响:
表5 本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型免疫指标的影响(±s)
组 别 | 动物数(只) | TNF-α | IFN-Ύ |
空白对照组 | 12 | 8.15±2.72 | 156.23±141.61 |
模型组 | 11 | 16.61±4.53△△ | 778.91±874.99 |
鲨肝醇组 | 11 | 10.74±6.29 | 203.90±215.24 |
低剂量组 | 11 | 14.41±10.93 | 264.85±602.94 |
中剂量组 | 11 | 11.26±8.69 | 513.45±567.83 |
高剂量组 | 11 | 8.98±2.39** | 539.67±719.31 |
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01。
由表5可见,与空白对照组相比,模型组TNF-α、IFN- Ύ显著升高,其中模型组TNF-α与空白组比有显著统计学差异(P<0.01);各治疗组TNF-α、IFN- Ύ指标升高程度均小于与模型组,本发明药物低、中、高剂量组均可以降低TNF-α水平,其中高剂量组与模型组比有显著差异(P<0.01),作用强度随剂量增大而增强,呈现出一定的剂量依赖关系。
3.4对免疫学分型的影响:
表6 本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型流式指标的影响(±s,n=9)
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
由表6可见,与空白对照组相比,模型组CD4+、CD8+、CD80+、CD86等指标均有不同程度升高,其中CD4+升高出现显著统计学差异(P<0.01);各治疗组虽有改变上述变化的明显趋势,但与模型组相比均无显著的统计学差异。
3.5对脏器指数的影响:
表7 本发明药物对环磷酰胺所致小鼠贫血模型脏器指数的影响(±s)
组 别 | 动物数(只) | 胸腺 | 脾脏 |
空白对照组 | 12 | 0.2881±0.0766 | 0.4405±0.0683 |
模型组 | 11 | 0.1889±0.0240△ | 0.6024±0.1594△△ |
鲨肝醇组 | 11 | 0.2207±0.0505 | 0.4325±0.1193** |
低剂量组 | 11 | 0.2088±0.0305 | 0.4870±0.1344* |
中剂量组 | 12 | 0.2014±0.0378 | 0.4525 ±0.1538** |
高剂量组 | 11 | 0.2050±0.0498 | 0.4200 ±0.1033** |
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
由表7可见,与正常组相比,模型组小鼠胸腺指数显著降低(P<0.05),脾脏指数显著增大(P<0.01)。各治疗组胸腺指数降低幅度小于模型组,但与模型组均无明显统计学差异。各治疗组小鼠脾脏指数均明显小于模型组(P<0.01~0.05),本发明药物各剂量组对脾脏指数的降低作用随剂量增大而增强,呈现出一定的剂量依赖关系。
4 结论:本发明药物对环磷酰胺所致小鼠白细胞减少性贫血有一定的防治作用。
二、本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型的影响
实验目的
采用乙酰苯肼致小鼠贫血模型,观察本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血的影响,判断其对贫血的防治作用。
实验材料
1.1 试验用药物
1.1.1 本发明药物:按照实施例1原料药配方及制备工艺制备,石家庄以岭股份有限公司提供。
1.1.2 阳性药:司坦唑醇片,规格:2mg/片,批号:110215,广西南宁百会药业集团有限公司生产。
1.2.2工具药:乙酰苯肼,粉剂,批号:43956,阿拉丁试剂(中国)有限公司生产。
实验系统
1.2.1 动物种系:健康ICR小鼠
1.2.2 动物级别:SPF级
1.2.3 动物性别和数量:雌雄各半,共72只
1.2.4 动物年龄:4周龄以上
1.2.5 动物体重:18~20g
1.2.6 动物来源:购于北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:0239795
1.2.7 饲养条件:动物饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心,光照12小时/天,温度20~25℃,相对湿度40~70%。小鼠笼养,6只/笼。
1.2.8 检疫过程:新领到的动物检疫期3天。在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况,以及是否存在疾病和死亡征兆。
1.2.9 饲料:实验动物全价颗粒饲料,由北京军事医学科学院实验动物中心提供,生产许可证:SCXK-(军)2005-005。
1.2.11垫料:购自河北省实验动物中心,每周更换2次。
1.2.12 动物标识:动物识别采用5%苦味酸标记。
仪器系统
仪器 | 厂家 |
AL204电子天平 | METTLER POLEDO |
MEK-6318K血球计数仪 | 日本光电 |
EPICS—XLⅡ流式细胞仪 | 美国Beckman Coulter |
XD711酶标仪 | 上海讯达 |
2 实验方法
2.1 实验设计依据
2.1.1 采用标准:中华人民共和国卫生部药政管理局颁布的中药新药研究指南(药学,药理学,毒理学)、新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学,药理学,毒理学),人民卫生出版社出版的《中药药理研究方法学》、《药理实验方法学》及相关文献确定。
剂量与分组
本品临床拟用量6.86g生药/天,即0.11g生药/kg,设定小鼠高、中、低剂量组的剂量分别为人剂量的20、10、5倍,即2.29、1.14、0.57g生药/kg×day。另设正常对照组、模型组、阳性药组(司坦唑醇组),共6组。溶媒均为0.5%羧甲基纤维素钠。
根据以上剂量设置情况,将小鼠分为下列6组,见附表8:
表8 本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型的实验分组和给药剂量
组 别 | 动物数 | 剂量(g生药/kg.d) | 与临床的倍数关系 |
空白对照组 | 12 | —— | —— |
模型组 | 12 | —— | —— |
司坦唑醇组 | 12 | 4mg/kg | 40 |
低剂量组 | 12 | 0.57 | 5 |
中剂量组 | 12 | 1.14 | 10 |
高剂量组 | 12 | 2.29 | 20 |
2.3 给药方法
灌胃给药,与临床推荐的口服途径相一致。每天上午按体重给药,每天一次。
供试品配制和保存
各受试药用0.5%CMC-Na混悬成实验用浓度:本发明药物治疗组浓度由高到低依次为0.08g/ml、0.04g/ml、0.02g/ml,司坦唑醇组浓度为0.0004g/ml,以上各药给药量均为10ml/kg体重,每周配制一次,2~8℃保存备用。
供试品的给予
灌胃给药,每日一次,连续14天,对照组给予相同体积溶剂对照(0.5%羧甲基纤维素钠);给药容积0.1ml/10g体重。
观测的指标、时间和内容
2.6.1造模方法:于实验第1、4、7天皮下注射2%乙酰苯肼生理盐水溶液,首次剂量为200mg/kg,后两次减半,造模第9天即可造成血虚模型(此模型可维持9-14天),造模的同时开始灌胃给药。
2.6.2观测指标
(一)一般状态观察:
观察各组小鼠皮毛、活动及进食情况。于每周记录小鼠体重。
(二)外周血常规指标检测:分别在造模前、造模第9天,末次给药2小时眼眶采血20µl,抗凝,全自动细胞计数仪检测血常规。
(三)脏器指数检测
颈椎脱臼处死小鼠,打开胸腔及腹腔,依次剪取胸腺、脾脏,称量重量(g)并记录,按照下列公式分别计算胸腺指数和脾脏指数。
脾脏指数=脾脏重量(g)/小鼠体重(g)
胸腺指数=胸腺重量(g)/小鼠体重(g)
(四)免疫学分型检测:抗凝外周血用0.83% NHCl3裂解红细胞后,加入相应抗体进行避光孵育,加入PBS终止反应并用200目滤网过滤,送流式细胞仪(EPICS ALTRA,BeckmanCoulter,美国)进行检测,用EXPO32软件采集数据并用EXPO32 Analyze软件分析数据。分别检测CD4、CD8、CD40、CD80/86等指标,并设一抗二抗阴性对照。
(五)免疫相关细胞因子检测:取外周血检测肿瘤坏死因子TNF-α,干扰素IFN-Ύ。
统计方法
所有数据用均数±标准差表示。采用SPSS统计软件包,首先进行正态性检验,符合正态分布的数据,均数比较用单因素方差分析,若方差齐,两两比较采用最小显著差法,若方差不齐则采用Dunnett’s T3检验行两两比较;如不符合正态分布,则用非参数检验进行统计分析。
结果
3.1 对体重食水:
表9 本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型食量、水量的影响(g/100g体重)
表10本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型体重的影响(±s)
组别 | 造模前 | 造模后 | 治疗后 |
空白对照组 | 25.83±3.66 | 28.5±3.85 | 28.58±4.1 |
模型组 | 25.42±2.97 | 23.4±3.13△△ | 27.7±2.95 |
司坦唑醇组 | 24.92±3.32 | 22.75±3.52 | 25.91±4.37 |
低剂量组 | 26.33±3.94 | 22.75±3.39 | 27.25±4.22 |
中剂量组 | 25.33±3.73 | 21.18±3.87 | 25.45±5.24 |
高剂量组 | 25.00±3.28 | 21.2±3.46 | 25.22±3.63 |
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
由表9、10可见,造模后,小鼠的食量、水量、体重与空白组相比均有所下降,体重下降非常明显(P<0.05);各给药组上述指标下降程度均小于模型组,但与模型组无明显的统计学差异。
3.2 对外周血常规指标的影响:
表11 本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型血球计数的影响
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
如表11所示,造模前各组动物血常规指标没有明显差异;动物造模后,与空白对照组相比,各造模组小鼠血常规指标均有不同程度的下降,其中模型组WBC 、RBC 、HCT 、HGB、MCH、PLT与空白组相比有显著差异(P<0.01~0.05);除司坦唑醇组HGB升高与模型组有统计学差异(P<0.05)外,各治疗组虽有逆转上述各指标变化的趋势,但与模型组相比均无统计学差异。治疗14天后,模型组与空白组相比WBC 、RBC 、HCT 、HGB、PLT仍有显著差异(P<0.01),与模型组相比,各治疗组血常规指标有不同程度的改善,其中鲨肝醇组上述指标均明显改观,具有显著统计学差异(P<0.01~0.05),本发明药物低、中、高剂量组对HCT ,低、高剂量组RBC 、HGB的作用与模型组相比有显著的统计学差异(P<0.01~0.05)。
3.3 对脏器指数的影响:
表12本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型的筛选研究脏器指数(±s)
组 别 | 动物数(只) | 胸腺 | 脾脏 |
空白对照组 | 12 | 0.2308±0.0762 | 0.6850 ±0.4671 |
模型组 | 10 | 0.1641±0.0438 | 0.9504±0.3929△△ |
司坦唑醇组 | 11 | 0.1842±0.0519 | 0.8402±0.2799 |
低剂量组 | 12 | 0.1792±0.0323 | 0.7412±0.1478* |
中剂量组 | 11 | 0.1778±0.0470 | 0.8083 ±0.2804 |
高剂量组 | 9 | 0.1767±0.0244 | 0.8122±0.1552 |
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
由表12可见,与正常组相比,模型组小鼠胸腺指数显著降低,脾脏指数显著增大(P<0.01)。各治疗组胸腺指数降低幅度小于模型组,但与模型组均无明显统计学差异。各治疗组小鼠脾脏指数均小于模型组,其中本发明药物高、中、低剂量组对脾脏指数的降低作用与模型组比差异显著(P<0.05)。
3.4 对免疫学分型的影响:
表13本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型的筛选研究流式指标(±s)
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01; 与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01
由表13可见,与空白对照组相比,模型组CD4+降低、CD8+升高、CD4+/CD8+降低、CD80+升高、CD86降低、CD80+/CD86+升高,其中CD4+/CD8+、CD80+/CD86+变化具有显著性统计学差异(P<0.01,P<0.05);各治疗组虽有改变上述变化的明显趋势,其中本发明药物低剂量对CD86+,低、中剂量对CD80+/CD86+的作用与模型组相比具有显著的统计学差异(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。
3.5 对免疫相关细胞因子的影响:
表14 本发明药物对乙酰苯肼所致小鼠贫血模型免疫指标的影响(±s)
组 别 | 动物数(只) | TNF-α | INF-Ύ |
空白对照组 | 7 | 5.83±9.74 | 533.35±800.79 |
模型组 | 8 | 32.04±21.42△△ | 1855.54±1064.01△△ |
司坦唑醇组 | 10 | 19.9±18.25 | 1815.46±1087.2 |
低剂量组 | 8 | 12.01±5.06* | 1399.19±1166.99 |
中剂量组 | 8 | 13.47±17.83* | 1563.01±724.83 |
高剂量组 | 8 | 4.04±2.61** | 1710.72±1214.06 |
注:与模型对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与空白对照组比较:△P<0.05,△△P<0.01。
由表14可见,与空白对照组相比,模型组TNF-α、IFN- Ύ显著升高(P<0.01,P<0.01);各治疗组TNF-α、IFN- Ύ指标升高程度均小于与模型组,本发明药物低、中、高剂量组均可以显著降低TNF-α水平(P<0.05,P<0.05,P<0.01),作用强度随剂量增大而增强,呈现出一定的剂量依赖关系。
4 结论
本发明药物对于改善乙酰苯肼所致小鼠红细胞减少性贫血有一定的防治作用。
讨论
APH是一种强氧化剂,一方面可在体内产生苯二嗪自由基、引起膜脂质过氧化反应产生代谢终产物MDA等,另一方面可在红细胞膜代谢过程中破坏SOD,G6PD和GSH等组成的抗氧化保护系统,从而诱导氧化性溶血,造成溶血性贫血:红细胞和血红蛋白明显减少,网织红细胞代偿性增多,肝脾肿大。大多数文献报道单用乙酰苯肼造模可致白细胞升高。本试验结果显示,乙酰苯肼模型组与对照组比较,红细胞数及血红蛋白显著降低,因此本实验利用皮下注射乙酰苯肼成功复制出小鼠贫血模型。
免疫器官主要包括骨髓、胸腺、腔上囊等中枢免疫淋巴样组织和脾脏、淋巴结、黏膜和皮肤相关的淋巴组织等外周免疫淋巴器官,它们的发育状况直接影响着机体免疫力。免疫器官是免疫细胞的发源地,造血干细胞在此发育分化为各类成熟的免疫细胞,胸腺是机体内重要的免疫器官,脾脏既是免疫器官,也与造血有一定联系,当机体失血时,脾脏可代偿性地造血,致使脾脏体积扩大,质量增加。因此以胸腺指数和脾脏指数作为小鼠免疫功能的观察指标,观察对小鼠免疫功能的影响。结果显示,本发明药物能够改善小鼠胸腺指数和脾脏指数,可能对小鼠胸腺和脾脏的形态大小产生影响,能够增强小鼠胸腺和脾脏的免疫活性,对免疫抑制所致小鼠血虚后的免疫功能具有一定作用。
再生障碍性贫血AA属于Th1细胞功能亢进的疾病, AA时CD4+细胞主要是向Th1分化的,后者进一步促进细胞毒性CD8+细胞的活化,最终导致骨髓造血功能的衰竭。AA时T细胞T细胞的功能异常,过度激活的CD8+T和CD4+Th1分泌大量的细胞因子IFN-γ和TNF-α,通过诱导造血干细胞的凋亡、抑制血细胞新生或促进吞噬细胞的吞噬等过程,直接或间接导致骨髓衰竭。本实验数据显示本发明药物可以减少IFN-γ和TNF-α分泌,改善T细胞功能紊乱。
本发明药物中含有鹿茸、海马、淫羊藿、蛇床子、淫羊藿、韭菜子、覆盆子、菟丝子、川楝子、金樱子等多味中药具有性激素样作用,可以刺激肾上腺皮质功能,增高血红蛋白含量。现代研究表明, 枸杞子、肉苁蓉等药可增加小鼠肝、脾脱氧核糖核酸的合成作用.增强免疫力,使小鼠胸腺、脾脏增重,腹腔巨噬细胞吞噬活性增强,血清溶血素抗体及脾细胞溶血空斑增加,对小鼠外周血淋转率增高,掺入淋巴细胞量增加,对小鼠迟发型超敏反应也增强。因此本发明药物的免疫调节功能与其补血活血功效密切相关。
综上所述,本发明药物能够改善化学物质所致贫血小鼠的造血功能,同时具有一定的免疫增强功能,从而达到扶正固本之功效。
具体实施方式
实施例1:胶囊剂的制备
组方:
菟丝子250g、枸杞子138g、五味子46g、蛇床子35g、金樱子35g、韭菜子35g、巴戟天35g、肉苁蓉35g、生地黄46g、川牛膝35g、淫羊藿70g、覆盆子35g、人参25g、鹿茸16g、海马21g、川楝子23g;
制备方法:
a、按比例称取蛇床子、菟丝子、五味子、淫羊藿,加3208ml70%乙醇,回流提取3次,每次2小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得醇提浸膏;
b、将步骤a醇提后的药材残渣与比例量的枸杞子、生地黄、覆盆子、金樱子、韭菜子、巴戟天、川楝子合并,加6732ml水煎煮2次,每次2小时,滤过,合并滤液,与步骤a所得醇提浸膏混合,减压浓缩至在60℃测定相对密度为1.28,得浸膏;
c、按比例称取人参、鹿茸、海马、肉苁蓉、川牛膝,粉碎成细粉与步骤b所得浸膏混合均匀,60-70℃干燥,粉碎,过筛,填充胶囊,得胶囊757粒。
实施例2:片剂的制备
组方:
菟丝子250g、枸杞子150g、五味子45g、蛇床子30g、金樱子30g、韭菜子30g、巴戟天30g、肉苁蓉30g、生地黄45g、川牛膝30g、淫羊藿70g、覆盆子30g、人参20g、鹿茸19g、海马20g、川楝子20g。
制备方法:
a、按比例称取蛇床子、菟丝子、五味子、淫羊藿,加2765ml70%乙醇,回流提取3次,每次1小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得醇提浸膏;
b、将步骤a醇提后的药材残渣与比例量的枸杞子、生地黄、覆盆子、金樱子、韭菜子、巴戟天、川楝子合并,加5110ml水煎煮1次,3小时,滤过,合并滤液,与步骤a所得醇提浸膏混合,减压浓缩至在60℃测定相对密度为1.30,得浸膏;
c、按比例称取人参、鹿茸、海马、肉苁蓉、川牛膝,粉碎成细粉与步骤b所得浸膏混合均匀,60-70℃干燥,粉碎,过筛,加入1%硬脂酸镁,压片,得760片片剂。
实施例3:丸剂的制备
组方:
菟丝子350g、枸杞子100g、五味子60g、蛇床子20g、金樱子50g、韭菜子50g、巴戟天20g、肉苁蓉50g、生地黄60g、川牛膝20g、淫羊藿100g、覆盆子20g、人参35g、鹿茸10g、海马35g、川楝子15g。
制备方法:
a、按比例称取蛇床子、菟丝子、五味子、淫羊藿,加5300ml70%乙醇,回流提取1次,3小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得醇提浸膏;
b、将步骤a醇提后的药材残渣与比例量的枸杞子、生地黄、覆盆子、金樱子、韭菜子、巴戟天、川楝子合并,加10140ml水煎煮3次,每次1小时,滤过,合并滤液,与步骤a所得醇提浸膏混合,减压浓缩至在60℃测定相对密度为1.25,得浸膏;
c、按比例称取人参、鹿茸、海马、肉苁蓉、川牛膝,粉碎成细粉与步骤b所得浸膏混合均匀,60-70℃干燥,粉碎,过筛,制成丸剂,得丸320g。
实施例4:颗粒剂的制备
组方:
菟丝子150g、枸杞子200g、五味子30g、蛇床子50g、金樱子20g、韭菜子20g、巴戟天50g、肉苁蓉20g、生地黄30g、川牛膝50g、淫羊藿40g、覆盆子50g、人参15g、鹿茸25g、海马15g、川楝子35g。
制备方法:
a、按比例称取蛇床子、菟丝子、五味子、淫羊藿,加2430ml70%乙醇,回流提取2次,每次1.5小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得醇提浸膏;
b、将步骤a醇提后的药材残渣与比例量的其余药材合并,加8800ml水煎煮3次,每次1小时,滤过,合并滤液,与步骤a所得醇提浸膏混合,减压浓缩至在60℃测定相对密度为1.29,得浸膏;
c、将步骤b所得浸膏与300g糊精与200g蔗糖粉混合均匀,60-70℃干燥,粉碎,过筛,制粒,得700g颗粒剂。
实施例5:散剂的制备
组方:
菟丝子250g、枸杞子150g、五味子45g、蛇床子30g、金樱子30g、韭菜子30g、巴戟天30g、肉苁蓉30g、生地黄45g、川牛膝30g、淫羊藿70g、覆盆子30g、人参20g、鹿茸19g、海马20g、川楝子20g。
制备方法:
按比例称取组方中药材,混合粉碎成细粉,即得823g散剂。
实施例6:汤剂的制备
组方:
菟丝子250g、枸杞子150g、五味子45g、蛇床子30g、金樱子30g、韭菜子30g、巴戟天30g、肉苁蓉30g、生地黄45g、川牛膝30g、淫羊藿70g、覆盆子30g、人参20g、鹿茸19g、海马20g、川楝子20g。
制备方法:
按比例称取组方中药材,加水至没过药材,浸泡15分钟后,加热至水开,继续小火煎煮30分钟,过滤,药渣再次加水至没过药材,再次煎煮30分钟,滤过,合并滤液,即得4320g汤剂。
Claims (7)
1.一种中药组合物在制备治疗再生障碍性贫血的药物中的应用,该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
菟丝子150-350、枸杞子100-200、五味子30-60、蛇床子20-50、金樱子20-50、韭菜子20-50、巴戟天20-50、肉苁蓉20-50、生地黄30-60、川牛膝20-50、淫羊藿40-100、覆盆子20-50、人参15-35、鹿茸10-25、海马15-35、川楝子15-35。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
菟丝子150、枸杞子200、五味子30、蛇床子50、金樱子20、韭菜子20、巴戟天50、肉苁蓉20、生地黄30、川牛膝50、淫羊藿40、覆盆子50、人参15、鹿茸25、海马15、川楝子35。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
菟丝子350、枸杞子100、五味子60、蛇床子20、金樱子50、韭菜子50、巴戟天20、肉苁蓉50、生地黄60、川牛膝20、淫羊藿100、覆盆子20、人参35、鹿茸10、海马35、川楝子15。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
菟丝子250、枸杞子138、五味子46、蛇床子35、金樱子35、韭菜子35、巴戟天35、肉苁蓉35、生地黄46、川牛膝35、淫羊藿70、覆盆子35、人参25、鹿茸16、海马21、川楝子23。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
菟丝子250、枸杞子150、五味子45、蛇床子30、金樱子30、韭菜子30、巴戟天30、肉苁蓉30、生地黄45、川牛膝30、淫羊藿70、覆盆子30、人参20、鹿茸19、海马20、川楝子20。
6.如权利要求1-5中任一项所述的应用,其特征在于所述治疗再生障碍性贫血的药物的剂型为汤剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂或丸剂。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述胶囊剂的制备方法包含如下步骤:
a、按比例称取蛇床子、菟丝子、五味子、淫羊藿,加6-10倍量70%乙醇,回流提取1-3次,每次1-3小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇至无醇味,得醇提浸膏;
b、将步骤a醇提后的药材残渣与比例量的枸杞子、生地黄、覆盆子、金樱子、韭菜子、巴戟天、川楝子合并,加7-12倍量水煎煮1-3次,每次1-3小时,滤过,合并滤液,与步骤a所得醇提浸膏混合,减压浓缩至在60℃测定相对密度为1.25-1.30,得浸膏;
c、按比例称取人参、鹿茸、海马、肉苁蓉、川牛膝,粉碎成细粉与步骤b所得浸膏混合均匀,60-70℃干燥,粉碎,过筛,填充胶囊。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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