CN103399091A - 一种乳品蛋白质掺假的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳品蛋白质掺假的检测方法,所述检测方法利用液相色谱检测与分析技术,得到标准乳样品蛋白质的氨基酸高压液相色谱图谱“指纹”图谱信息,建立特征的氨基酸“指纹”图谱库,形成原料乳蛋白质的质量评价标准,判断待测样品中蛋白质是否掺假。本发明将氨基酸分析引入研究,通过超高压液相色谱分析方法,得到一种全面、准确的蛋白质掺假鉴别方法,识别率高。
Description
技术领域
本发明涉及食品质量评价领域,具体地说,涉及一种乳品蛋白质掺假的检测。
背景技术
牛乳的蛋白质是含氮的有机化合物,乳中的氮含量包括蛋白态氮(protein nitrogen,PN)和非蛋白态氮(Non-protein nitrogen,NPN),其中前者占95%,后者占5%。乳品企业蛋白质的检测方法仍以“凯氏定氮”法为主,该方法的缺点是费时耗力,而且破坏样品,而更为关键的一点在于,其以含氮量来换算蛋白质含量,使其难以判断乳品中的氮含量,究竟来源于蛋白态氮还是非蛋白态氮,因此,无法分辨出是否有外源加入的非蛋白态氮,难以判断乳品中的蛋白质是否掺假。
目前,乳品掺假的检测分为两种方法。
第一种检测方法是采用GC/MS检测分析方法识别一种或者几种掺假物质,如果没有检测到掺假物质,则说明没有掺假。但是这种检测方法需要事先对掺假物质有充分的了解,不适用于对不明掺假物的检测,也就是说这种检测方法只适用于对低含量特定掺假物的检测,但是非蛋白氮(NPN)以任何一种物质的加入(三聚氰胺及其类似物、尿素、硝酸铵等廉价高氮物质,还包括一些体内其它含氮物质,如核酸、尿酸、肌酐等)都会引起蛋白值的虚高,形式的多样性,决定了在乳品的蛋白质分析中,单单用GC/MS检测三聚氰胺及其类似物就会以偏盖全。此方法从主观上存在对目标物进行预先假设的盲区,对未来还可能出现的含氮或者不含氮未知物的掺假物将不能判定,因为当假蛋白已改头换面时,不可避免的又会出现重大的食品安全漏检事故。因此,如今以氮含量为基础的乳蛋白测定方法亟需被高选择性、高专一性的测定方法所替代,且新方法也应该具有高准确性、高精确性。
第二种检测方法是从真蛋白含量入手,对乳蛋白成分进行识别及纯度的定量。这种方法的优点是对已经或者未知的掺假物都能够检测。如果真蛋白的含量已经达标,也就没有必要违法添加“非蛋白”物质了。找到可靠的测定真蛋白含量的方法是彻底堵住非蛋白氮的唯一方法,乳品检测实验室从真蛋白的测定入手,检测结果如果与真蛋白信息相一致,原料乳的质量即可通过检验,如果真蛋白不达标或者与真蛋白信息不相一致,转而采用凯氏定氮或者GC等方法确认,以找到“非蛋白”的存在形式,从根本上使得乳蛋白的掺假无机可乘。
随着检测技术的发展,液相色谱、气相色谱、质谱、流变学特性、感官特性等也用于乳品检测中,但是往往费用较高,针对某一类已知检测物的检测效果较佳,普及率并不高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种乳品蛋白质掺假的检测方法。
为了实现本发明目的,本发明首先提供一种乳品蛋白质掺假的检测方法,所述检测方法利用液相色谱检测与分析技术,得到标准乳样品蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱信息,建立特征的氨基酸“指纹”图谱库,形成原料乳蛋白质的质量评价标准,判断待测样品中蛋白质是否掺假。
具体地,所述检测方法包括如下步骤:
1)检测分析标准乳样品的氨基酸种类及含量,绘制蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱及含量线性模型;
2)检测分析待测样品的氨基酸种类及含量,绘制蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱及含量线性模型;
3)与步骤1)得到的结果进行对比分析,判断是否掺假。
其中,所述步骤1)与步骤2)通过高效液相色谱进行检测。
进一步地,所述步骤1)与步骤2)包括如下步骤:
(1)利用盐酸对样品进行水解;
(2)对步骤(1)的水解样进行中和;
(3)对步骤(2)得到的样品进行高效液相色谱检测。
更进一步地,所述步骤(1)将200μL乳样+1800μL盐酸,使得盐酸的终浓度达到6M。盐酸由于有气相及液相两种形式,而且水解完成后比较容易挥发而应用广泛,水解条件为:6M盐酸110℃下水解20h或者24h,比较耗时。提高水解温度至150℃,可将水解时间缩短为3.5h。
所述步骤(2)将6M NaOH与步骤(1)的水解样等体积混合进行样品的中和。
通过检测,步骤1)得到的结果为:标准乳样的蛋白质含量2.86~3.61g/100ml,平均含量为3.22g/100ml。
标准乳样的超高压液相色谱图如图2所示,根据氨基酸标准曲线(如图3所示)计算出标准乳样的氨基酸种类及含量。
各种氨基酸的平均值如表1所示:
表1标准乳样的氨基酸含量
标准乳样中蛋白质含量(Foss120红外光谱仪测定结果)与氨基酸含量(UPLC测定结果)回归分析结果为:Protein=3.224His+0.249Ser+14.755Arg-0.106Gly+0.937Asp-0.278Glu-1.024Thr-5.442Ala-0.69Pro+4.041Cys+0.425Lys-2.27Tyr+0.626Met-2.622Val+3.076Ile-0.769Leu+0.658Phe。
本发明还提供了前述的检测方法在检测乳品蛋白质掺假中的应用。
本发明还提供了一种建立蛋白质氨基酸“指纹”图谱的方法,所述方法包括如下步骤:
a)6M盐酸条件下对标准乳样品进行水解,水解温度为150℃,水解时间为3.5h;
b)对步骤a)的水解样进行中和;
c)对中和后的标准乳样品进行高效液相色谱检测,绘制蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱。
本发明还提供了上述方法建立的蛋白质氨基酸“指纹”图谱。
本发明的有益效果在于:蛋白质是一种有机高分子复合体,由多个氨基酸通过肽键互相连接而成。乳蛋白发生改变,氨基酸的含量及种类必然发生某些改变,且不同的乳蛋白氨基酸组成是不同的。本发明将氨基酸分析引入研究,通过超高压液相分析方法,得到一种全面、准确的蛋白质掺假鉴别方法,识别率高。
附图说明
图1为氨基酸标准品的高压液相色谱“指纹”图谱;
图2为原料乳氨基酸的高压液相色谱“指纹”图谱;
图3为氨基酸标准品的标准曲线;
图4为掺入动物水解蛋白的掺假乳样超高压液相色谱“指纹”图谱;
图5为掺入三聚氰胺的掺假乳样超高压液相色谱“指纹”图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1氨基酸分析
1.仪器与试剂
Waters ACQUITY高压液相色谱系统,包括带流动池的光电二极管阵列(PDA)检测器,2μL定量环,配置Empower色谱工作站(美国waters公司);AccQ.TagTM Ultra Column色谱柱(2.1×100mm,1.7μm);
氨基酸标准品;试剂均为色谱纯;娃哈哈纯净水(使用之前过滤)。
2.标准样品来源
原料乳样为2010年11月至2011年11月期间采自北京三元乳品股份有限公司牛场,共收集有效500份样品。
3.原料乳氨基酸色谱数据的采集
3.1乳样的水解
200μL乳样+1800μL盐酸,使得盐酸的终浓度达到6M。盐酸由于有气相及液相两种形式,而且水解完成后比较容易挥发而应用广泛,水解条件为:6M盐酸110℃下水解20h或者24h,比较耗时。提高水解温度至150℃,可以适当缩短水解时间为3.5h。
3.2水解样的中和
6M NaOH与水解样等体积混合进行样品的中和。
4高压液相色谱的测定
4.1氨基酸标准品的衍生
(1)微量移液器将以下的组分转移到完全回收的样品瓶;
a移取70μL AccQ.Tag Ultra硼酸盐缓冲剂;
b加入10μL氨基酸标准样;
c加入20μL重建的AccQ.Tag Ultra试剂。
注:重建的AccQ.Tag Ultra试剂的方法:1)将恒温加热仪预热至55℃;2)轻叩衍生剂样品瓶,确保所有的AccQ.Tag Ultra试剂位于样品瓶的底部,然后打开样品瓶盖;3)通过吸取然后废弃1ml稀释剂样品瓶中的AccQ.Tag Ultra试剂来润洗洁净的微量进样器。重复两次;4)从稀释剂样品瓶中吸取1.0ml试剂稀释剂,将其转移到装有AccQ.Tag Ultra试剂粉的衍生剂中,盖紧瓶盖;5)漩涡混合10s;6)将样品瓶2A置于恒温加热仪的顶部,直至AccQ.Tag Ultra试剂粉溶解,加热试剂不得超过10min。
(2)盖上样品瓶的瓶盖,漩涡混合几秒钟;
(3)在室温下放置1min;
(4)在恒温加热仪中以55℃加热10min;
(5)从加热仪中取出样品瓶
4.2标准乳样的衍生
其衍生步骤同4.1,(1)中b改为加入10μL中和后的标准乳样;
4.3色谱条件
柱子的平衡:等体积的硼酸盐缓冲盐与乙腈以0.2ml/min的流速在55℃下平衡30min;
进样体积:1μL;
样品温度:20℃;
柱温:55℃;
柱子:AccQ.TagTM Ultra Column2.1×100mm
流速:0.7mL/min
梯度如表2所示。
表2氨基酸UPLC色谱条件
4.4数据分析
氨基酸标准品的高压液相色谱图如图1所示,氨基酸标准曲线如图3所示(各氨基酸种类的线性均很好,仅以组氨酸为例给出图示),各氨基酸保留时间如表3:
表3氨基酸标准品种类及保留时间
500份乳样为北京三元食品股份有限公司从牛场通过在线取样设备现场取样,标准乳样的超高压液相色谱图如图2所示,根据氨基酸标准曲线(如图3所示)计算出标准乳样的氨基酸种类及含量。
500个有效样本的蛋白质含量2.86~3.61g/100ml,平均含量为3.22g/100ml。
各种氨基酸的平均值如表4所示:
表4500份乳样的氨基酸含量
500份原料乳样中蛋白质含量(Foss120红外光谱仪测定结果)与氨基酸含量(UPLC测定结果)回归分析结果为:Protein=3.224His+0.249Ser+14.755Arg-0.106Gly+0.937Asp-0.278Glu-1.024Thr-5.442Ala-0.69Pro+4.041Cys+0.425Lys-2.27Tyr+0.626Met-2.622Val+3.076Ile-0.769Leu+0.658Phe。
结论:应用超高压液相色谱技术集合数据分析技术对原料乳蛋白质真伪进行掺假判定,本发明首次使用氨基酸分析作为原料乳蛋白质掺假的全面评价指标,达到掺假判断的目的,为乳蛋白产假的快速检测提供了一种新的方法。上述方法同样适用于掺假物为乳源蛋白质或者非乳源蛋白质。
实施例2水解条件的优化
目前较为普遍的水解条件为:6M盐酸110℃下水解20h或者24h,但是比较耗时,使得检测结果滞后。提高水解温度至150℃,缩短水解时间为3.5h,20组样品对比两种水解条件,经统计分析,其结果显示17种氨基酸含量差异均不显著(p<0.05)。乳蛋白水解后氨基酸的回收率可以达到90±2%,故确定水解条件为150℃,3.5h
实施例3检测样品A
1.仪器与试剂
Waters ACQUITY高压液相色谱系统,包括带流动池的光电二极管阵列(PDA)检测器,2μL定量环,配置Empower色谱工作站(美国waters公司);AccQ.TagTM Ultra Column色谱柱(2.1×100mm,1.7μm);
氨基酸标准品;试剂均为色谱纯;娃哈哈纯净水(使用之前过滤)。
2.待测乳样A氨基酸色谱数据的采集
2.1乳样的水解
200μL乳样+1800μL盐酸,使得盐酸的终浓度达到6M。水解温度至150℃,水解时间为3.5h。
2.2水解样的中和
6M NaOH与水解样等体积混合进行样品的中和。
2.3高压液相色谱的测定
2.3.1待测乳样的衍生
(1)微量移液器将以下的组分转移到完全回收的样品瓶;
a移取70μL AccQ.Tag Ultra硼酸盐缓冲剂;
b加入10μL中和后的待测乳样;
c加入20μL重建的AccQ.Tag Ultra试剂。
注:重建的AccQ.Tag Ultra试剂的方法:1)将恒温加热仪预热至55℃;2)轻叩衍生剂样品瓶,确保所有的AccQ.Tag Ultra试剂位于样品瓶的底部,然后打开样品瓶盖;3)通过吸取然后废弃1ml稀释剂样品瓶中的AccQ.Tag Ultra试剂来润洗洁净的微量进样器。重复两次;4)从稀释剂样品瓶中吸取1.0ml试剂稀释剂,将其转移到装有AccQ.Tag Ultra试剂粉的衍生剂中,盖紧瓶盖;5)漩涡混合10s;6)将样品瓶2A置于恒温加热仪的顶部,直至AccQ.Tag Ultra试剂粉溶解,加热试剂不得超过10min。
(2)盖上样品瓶的瓶盖,漩涡混合几秒钟;
(3)在室温下放置1min;
(4)在恒温加热仪中以55℃加热10min;
(5)从加热仪中取出样品瓶
2.3.2色谱条件
柱子的平衡:等体积的硼酸盐缓冲盐与乙腈以0.2ml/min的流速在55℃下平衡30min;
进样体积:1μL;
样品温度:20℃;
柱温:55℃;
柱子:AccQ.TagTM Ultra Column2.1×100mm
流速:0.7mL/min
梯度如表所示。
2.4数据分析
待测乳样A的超高压液相色谱图如图4所示,与实施例1中标准乳样的超高压液相色谱图(图2)进行比对,发现待测乳样A在羟脯氨酸位置(保留时间:1.64min)出峰,而羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸,在正常胶原蛋白中含量约为13.4%,在其他的蛋白质中则不存在,非原料乳蛋白质中存在的氨基酸。由此可以判断待测乳样A为蛋白质掺假的样品。
进一步分析可知,如若原料乳中添加了动物水解蛋白,则会以羟脯氨酸为标志物,动物水解蛋白为动物皮革毛发等经水解成可溶性肽链,其掺入牛乳可以提高乳蛋白的表现含量。
实施例4检测样品B
方法与实施例3相同,待测乳样B的超高压液相色谱图如图5所示,蛋白质含量为3.8g/100ml。与实施例1中标准乳样的超高压液相色谱图(图2)进行比对,发现待测乳样B的各种氨基酸的含量明显降低,不同于标准乳样的检测结果,而其蛋白质含量却高于标准乳样的蛋白质含量(2.86~3.61g/100ml),由此可以判断待测乳样B为蛋白质掺假的样品。
进一步分析可知,添加三聚氰胺会使得蛋白质测定含量增加。三聚氰胺(C3H6N6)俗称密胺,蛋白精,是一种含氮杂环有机化合物,其氮含量可以达到66%。添加三聚氰胺会使得蛋白质测定含量增加,同时作为一种白色结晶粉末,无味,掺假后不容易被发现。但是三聚氰胺对身体有害,不可用于食品加工或者食品添加物三聚氰胺添加到牛奶中后,在制作的过程中会产生三聚氰酸。添加了三聚氰胺的原料乳,在氨基酸检测中各种氨基酸的含量均会明显降低,即以氨基酸的显著降低为标志(如图5所示)。
综上所述,本发明将氨基酸分析引入研究,通过超高压液相色谱分析方法得到标准乳样品蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱信息,建立特征的氨基酸“指纹”图谱库,形成原料乳蛋白质的质量评价标准,从而能够准确判断待测样品中的蛋白质是否掺假。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,如原料乳的来源(不同季节、不同地域、不同品种)使得氨基酸的含量及种类存在各种各样的改变,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种乳品蛋白质掺假的检测方法,其特征在于,所述检测方法利用液相色谱检测与分析技术,检测分析标准乳样品,得到标准乳样品蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱信息,建立特征的氨基酸“指纹”图谱库,形成原料乳蛋白质的质量评价标准,判断待测样品中蛋白质是否掺假。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括如下步骤:
1)检测分析标准乳样品的氨基酸种类及含量,绘制蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱及含量线性模型;
2)检测分析待测样品的氨基酸种类及含量,绘制蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱及含量线性模型;
3)与步骤1)得到的结果进行对比分析,判断是否掺假。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述步骤1)与步骤2)通过高效液相色谱进行检测。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法,其特征在于,所述步骤1)与步骤2)包括如下步骤:
(1)利用盐酸对样品进行水解;
(2)对步骤(1)的水解样进行中和;
(3)对步骤(2)得到的样品进行高效液相色谱检测。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述步骤(1)为6M盐酸条件下,水解温度为150℃,水解时间为3.5h。
6.权利要求1-5任意一项所述的检测方法在检测乳品蛋白质掺假中的应用。
7.一种建立蛋白质氨基酸“指纹”图谱的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
a)6M盐酸条件下对标准乳样品进行水解,水解温度为150℃,水解时间为3.5h;
b)对步骤a)的水解样进行中和;
c)对中和后的标准乳样品进行高效液相色谱检测,绘制蛋白质的氨基酸高效液相色谱“指纹”图谱。
8.权利要求7所述方法建立的蛋白质氨基酸“指纹”图谱。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant |