CN103397033B - 分离的寡核苷酸rno-miR-181a及其在脑线粒体损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离的寡核苷酸、一种用于确定生物样本存在脑损伤的试剂盒和一种用于确定生物样本存在脑损伤的系统。其中所述分离的寡核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。通过利用本发明的试剂盒和系统可以有效地筛选生物样本是否存在脑线粒体损伤。

Description

分离的寡核苷酸rno-miR-181a及其在脑线粒体损伤中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及分离的寡核苷酸、用于确定生物样本存在脑线粒体损伤的试剂盒和用于确定生物样本存在脑线粒体损伤的系统。

背景技术

微波辐射的生物危害越来越受到国内外学者的广泛关注。已有研究证实，脑是微波辐射的敏感靶器官。神经元因其功能特殊性，对能量降低极为敏感。线粒体结构和功能与能量代谢密切相关，也是微波辐射最早累及的靶点之一。研究表明，30mW/cm²微波辐射可引起大鼠脑组织结构破坏，线粒体结构损伤和功能障碍。上述改变以7天损伤显著，14天呈恢复趋势。

但目前微波辐射致脑线粒体损伤的生物标志物研究鲜见，特别是miRNA的标志物研究尚属空白。因此，迫切需要开发出一种特异、敏感的微波辐射致脑线粒体损伤相关的miRNA生物标志物。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够确定生物样本存在脑线粒体损伤的miRNA生物标志物，该miRNA生物标志物具有高特异性和高敏感性的特点。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO：1所示的序列。根据本发明的实施例，发明人确定了生物样本存在脑线粒体损伤的miRNA生物标志物，该miRNA生物标志物具有如SEQ ID NO：1所示的序列，并且确定了该miRNA生物标志物与线粒体能量代谢、氨基酸合成代谢、脂肪酸运输代谢、TCA循环、糖酵解、解耦连蛋白和凋亡等线粒体相关过程密切相关。

其中，上述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示：AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种用于确定生物样本存在脑线粒体损伤的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含探针，所述探针特异性识别具有如SEQ ID NO：1所示序列的所述的寡核苷酸。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地确定生物样品是否存在脑线粒体损伤。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于确定生物样本存在脑线粒体损伤的系统。根据本发明的实施例，所述用于确定生物样本存在脑线粒体损伤的系统包括取样设备，用于从生物体收集生物样本；核酸提取设备，所述核酸提取设备与所述取样设备相连，用于从所述生物样本获取核酸样品；检测设备，所述检测设备与所述核酸提取设备相连，用于确定所述核酸样品中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量；和分析设备，所述分析设备与所述检测设备相连，用于基于具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量确定所述生物体是否存在脑线粒体损伤。利用该系统，能够有效地确定生物样品是否存在脑线粒体损伤，从而可以有效地筛选存在脑线粒体损伤的生物样品。

另外，根据本发明的实施例的分离的寡核苷酸，还可以具有如下附加的技术特征，所述寡核苷酸为RNA。由此，可以直接将生物样本中提取分离出完整无降解的RNA，经过荧光标记，利用生物芯片杂交技术进行芯片扫描和分析，从而确定生物体是否存在脑线粒体损伤。

根据本发明实施例的确定生物样本存在脑线粒体损伤的试剂盒，还可以具有如下附加的技术特征，所述探针是以芯片的形式提供的。由此，将上述从生物样品中分离的寡核苷酸与具有最新更新生物序列信息的芯片进行杂交，进行全面筛选从而可以确定生物样本是否存在脑线粒体损伤的生物标记物。

根据本发明实施例的确定生物样本存在脑线粒体损伤的系统，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述检测设备为核酸杂交芯片。由此，将上述从生物样品中分离的寡核苷酸与具有最新更新生物序列信息的芯片进行杂交并进行扫描和分析，进行全面筛选从而可以确定生物样本存在脑线粒体损伤的生物标记物。

根据本发明的实施例，所述核酸样品为所述生物样本的总RNA。由此，可以直接将生物样本中提取分离出完整无降解的RNA，经过荧光标记，利用生物芯片杂交技术进行芯片扫描和分析，从而确定生物体是否存在脑线粒体损伤。

根据本发明的实施例，所述分析设备适于将所述核酸样品中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量与预定参数进行比较，并且基于核酸样品中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量与所述预定参数的差异确定所述生物体是否存在脑线粒体损伤。由此，可以将待测生物样本中的具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量与已知生理状态正常的生物样本的预定参数进行比较，从而确定两组样本中的具有如SEQ IDNO：1所示的序列的核酸分子的含量的差异，从而确定待测生物样本中是否存在脑线粒体损伤。

根据本发明的实施例，所述预定参数是正常生物样本的具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量，其中，基于待测核酸样品中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量低于所述预定参数，确定所述生物体是否存在脑线粒体损伤。由此，可以准确有效地确定待测生物样本中具有如SEQ ID NO：1所示的序列的核酸分子的含量低于预定参数的倍数，并根据统计学分析筛选出待测样本中是否存在脑线粒体损伤。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的大鼠脑组织结构经过30mW/cm2微波辐射的变化，其中：

1A为假辐射组大鼠脑组织结构，

1B为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第1天组大鼠脑组织结构，

1C为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第7天组大鼠脑组织结构，

1D为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第14天组大鼠脑组织结构，

1E为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第28天组大鼠脑组织结构；

图2是是根据本发明实施例的大鼠脑组织超微结构经过30mW/cm²微波辐射的变化，其中：

2A是假辐射组大鼠脑组织超微结构，

2B为30mW/cm²辐射后恢复常规喂养的第7天组大鼠脑组织超微结构；

图3为根据本发明实施例的大鼠脑组织总RNA琼脂糖凝胶电泳图，其中，

1～3为微波辐射后恢复常规喂养的第7天假辐射组脑组织总RNA；

4～6为微波辐射后恢复常规喂养的第7天30mW/cm₂微波辐射组脑组织总RNA；

图4显示了大鼠脑组织miRNA芯片杂交扫描图及局部放大图；

图5显示了30mW/cm²微波辐射后恢复常规喂养的第7天大鼠脑组织miRNA表达谱中rno-miR-181a的结果；

图6显示了30mW/cm²微波辐射后恢复常规喂养的第7天差异表达的miRNA的聚类分析图；

图7显示了30mW/cm²微波辐射后恢复常规喂养的第7天大鼠脑组织的rno-miR-181a实时荧光定量PCR检测结果；和

图8显示了恢复常规喂养的第7天rno-miR-181a预测靶基因文氏图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1对大鼠进行微波辐射

将56只体重为220±20克的二级雄性Wistar大鼠（军事医学科学院），随机分为假辐射组和微波辐射组。采用军事医学科学院微波辐射源对上述大鼠进行全身均匀辐射，微波辐射源地平均功率密度为30mW/cm²，隔日辐射1次，共3次，每次10分钟。假辐射组置于辐射盒中，不予辐射。

实施例2大鼠脑组织结构观察

将辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射后恢复常规喂养的第1天、7天、14天及28天，采用腹腔注射1%戊巴比妥钠（30毫克/公斤）对大鼠进行麻醉后，取脑组织，并用10%缓冲福尔马林固定1周后，采用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为3微米，脱蜡至蒸馏水，Harris苏木素染核，70%盐酸乙醇分化，1%乙醇伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜观察并摄像。结果见图1。

假辐射组大鼠脑组织呈正常形态结构，神经元轮廓清晰，多呈圆形，细胞核大而圆，着色较浅，位于细胞中央，胞质弱嗜酸性。微波辐射后脑组织基本病理改变为：组织水肿、疏松；神经元呈不同程度的变性、坏死，主要表现为锥体细胞核固缩成三角形蓝色质块，胞体皱缩呈梭形，颗粒细胞变化较轻，间质毛细血管扩张；部分胶质细胞固缩变形，胞浆深染；血管周间隙增宽。其动态变化规律为：辐射后恢复常规喂养的第1天，脑组织见部分神经元固缩，血管周间隙稍增宽，7天内病变进行性加重，神经元胞体变小，胞核呈三角形和梭形，血管周间隙明显增宽，14天呈恢复趋势，28天基本恢复。表明微波辐射可造成脑组织结构破坏。

实施例3大鼠脑组织线粒体超微结构观察

将辐射组与假辐射组大鼠分别于辐射后恢复喂养的第7天进行处死，分离新鲜脑组织，取1mm³脑组织，迅速放入2.5%戊二醛固定2小时，1%锇酸后固定2小时，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂包埋，半薄切片定位后，制作超薄切片（厚70纳米），醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄像。结果见图2。

由图2中结果可见，假辐射组脑神经元胞质内富含线粒体，其结构完整。辐射后恢复常规喂养的第7天，脑神经元线粒体肿大，主要呈基质型肿胀改变，即线粒体变大变圆，基质变浅、嵴变短变少甚至消失，偶见极度肿胀，即线粒体转化为小空泡状结构。

实施例4大鼠脑组织线粒体制备

用刀片切碎脑组织后，加入裂解液后涡旋震荡5秒，利用匀浆机进行匀浆；以3000rpm速度离心10分钟；取上清后继续以11000rpm速度离心10分钟；取沉淀加入纯化液，混匀后以16000rpm速度离心45分钟；小心抽取中间乳黄色样品带加入保存液，混匀后以11000rpm速度离心10分钟，所得沉淀即为提纯线粒体，分装后置-20摄氏度保存，保存时间不超过2周。以上步骤均在4摄氏度条件下进行。

采用BCA法测定线粒体蛋白浓度。计算所需工作液量，按以下公式计算：（标准孔+待测孔）×平行对照孔数×每孔加入工作液量（50份A液:1份B液）。配制标准液及样品液后向96孔板内每孔加入200微升工作液，每孔再加入10微升标准液或待测品，振荡30秒后，将其在37摄氏度放置30分钟，然后利用酶标仪进行检测，基于所获得的OD值计算出该样品的蛋白浓度。

实施例5大鼠脑组织线粒体腺苷酸含量检测

于0.10毫升线粒体悬液中加入0.20毫升冰冷的1.60摩尔/升的高氯酸，静置5分钟进行破膜；然后以16000rpm速度离心10分钟；取上清液后用2.5摩尔/升的K₂CO₃调节酸碱性至pH6.5；然后以16000rpm速度离心10分钟，吸取上清液后，置于-20摄氏度冰箱中保存。以上操作过程均在4摄氏度条件下完成。用HPLC检测腺苷酸。测得的数据为被测腺苷酸所占的峰面积（A样）。根据标准品峰面积（A标）和浓度（C标）比，可计算出被测腺苷酸的浓度（C样）:C样(毫克/毫升)=C_标×A_样/A_标将测得的数据经蛋白浓度换算，得到脑组织中腺苷酸的含量。结果见表1。

表1微波辐射对大鼠脑组织线粒体腺苷酸含量影响(g/g prot)

由表1中结果可知，微波辐射后脑线粒体ATP含量与假辐射组相比，于辐射后恢复常规喂养的第7天内逐渐减少，以辐射后恢复常规喂养的第7天减少显著（P<0.01），辐射后恢复常规喂养的第14天恢复，AMP和ADP含量于辐射后恢复常规喂养的第7天显著升高（P<0.01或P<0.05）。

实施例6大鼠脑组织线粒体能量代谢酶活性检测

6.1SDH

将100微升脑组织匀浆加入比色杯底部，快速将试管中已预温好的染色剂倒入比色杯中，在600纳米处分别测定显色反应进行5秒和65秒的OD值，记录△OD值＝OD_5秒－OD_65秒值计算酶活性。结果见表2，微波辐射后恢复常规喂养的第7天内大鼠脑组织线粒体SDH活性显著下降（P<0.05或P<0.01），辐射后恢复常规喂养的第14天恢复。

6.2MAO

将200微升脑组织匀浆加入测定管中，再加入6.6毫升染色液后，混匀，连续抽提2分钟，然后以3500rpm速度离心10分钟，取上清，在242纳米处测定吸光度。结果见表2，微波辐射后恢复常规喂养的第7天内大鼠脑组织线粒体MAO活性升高，以辐射后恢复常规喂养的第7天升高显著（P<0.01），辐射后恢复常规喂养的第14天恢复。

表2微波辐射对大鼠脑组织线粒体SDH和MAO活性影响

实施例7大鼠脑组织miRNA表达谱筛选

7.1大鼠脑组织总RNA质检

将辐射组与假辐射组大鼠分别于微波辐射后恢复常规喂养的第7天分离大鼠脑组织（7天假辐射组标记为A，7天30mW/cm²组标记为B，每组各3个样品），进行总RNA抽提和质量检测。完整无降解的RNA进行miRNA的荧光标记、miRCURYTM LNA Array芯片（丹麦Exqion公司）杂交、芯片扫描和分析，结果见表3及图3。

表3大鼠脑组织内总RNA含量及浓度

注：A1～A3为微波辐射后恢复常规喂养第7天假辐射组大鼠脑组织总RNA；B1～B3为微波辐射后恢复常规喂养第7天30mW/cm²组大鼠脑组织总RNA。

从表3中结果可见，提取的大鼠脑组织总RNA的OD_260/280比值均在1.8～2.1之间，OD_260/230比值均大于1.8。图3可见，总RNA中18s和28s核糖体RNA电泳条带均较清晰、明亮，并且28s条带比18s明亮。以上结果表明提取的大鼠脑组织总RNA成份比较完整，无降解，无污染，可进行后续的芯片杂交实验。

7.2miRNA芯片样品杂交信号相关性

采用杂交信号相关性来初步判断miRNA芯片杂交实验的质量和样品之间的差异。结果见表4。

表4大鼠脑组织miRNA芯片杂交信号相关系数

	A1	A2	A3
				A1	1	0.96996	0.959635
A2	0.96996	1	0.982319
				A3	0.959635	0.982319	1
	B1	B2	B3
				B1	1	0.936445	0.956784
B2	0.936445	1	0.987826
				B3	0.956784	0.987826	1

注：A1～A3为微波辐射后恢复常规喂养的第7天假辐射组大鼠脑组织总RNA；B1～B3为微波辐射后恢复常规喂养的第7天经过30mW/cm²微波辐射组大鼠脑组织总RNA。

由表4可见，同一组内大鼠脑组织的相关系数较高，表明组内差异小，实验重复性好。

7.3大鼠脑组织miRNA差异表达谱

采用Exiqon公司研发的miRCURYTM LNA miRNA芯片（Hy3^TM单色荧光基团标记）对上述6个大鼠脑组织的miRNA表达情况进行检测，每只大鼠脑组织使用一张芯片。从图4的芯片扫描图及局部放大图可观察到芯片的光点清晰、各点距均匀，规则，无背景色干扰。将扫描结果转换成数字数据保存，并进一步进行计算分析。

将恢复常规喂养的第7天的30mW/cm²微波辐射组大鼠脑组织miRNA表达谱与假辐射组大鼠脑组织miRNA表达谱进行比较。对原始数据进行中值标准化后，以两组荧光信号强度比值大于1.5定为上调，小于0.7为下调。结果发现，30mW/cm²微波辐射后恢复喂养的第7天，显著上调的miRNA有12个，显著下调的miRNA有73个。图5显示rno-miR-181a显著下调，倍数Fc为0.065853，P=0.000473。

热图（heat map）能够显示miRNA之间以及样品之间的双向聚类分析。图6每行代表同一个miRNA，每列代表同一个样品。左侧为miRNA的聚类树状图，上端为样品的聚类树状图。根据聚类分析图可显示每个样品中各miRNA的相对表达水平。从图6中可见，各组内大鼠脑组织rno-miR-181a表达相似性高，表明重复性好，个体差异小。但30mW/cm²微波辐射组与假辐射组相比，大鼠脑组织miRNA表达谱有着较为明显的差别，表明其表达量呈现不同，显著下调。

实施例8芯片rno-miR-181a表达验证

8.1反转录

将辐射组与假辐射组大鼠于微波辐射后恢复常规喂养的第7天分离大鼠脑组织，并提取脑组织总RNA，按照Gene Expression Master Mix（美国Invitrogen公司）说明配制反转录混合反应液：

试剂名称	体积（1个反应）
		100mM dNTP混合物	0.075微升
MultiscribeTM酶	0.5微升
		10×反转录缓冲液	0.75微升
Rnase抑制剂	0.095微升
		无核酸酶水	2.08微升
反转录引物	1.5微升
		RNA样品	2.5微升
总体积	7.5微升

反应条件为16摄氏度30分钟，42摄氏度30分钟，85摄氏度5分钟。反应结束后，放入-80摄氏度保存。

8.2实时荧光定量PCR

按照MicroRNA Reverse Transcription Kit（美国Invitrogen公司）说明配制实时荧光定量PCR反应体系：

反应条件为50摄氏度2分钟，95摄氏度10分钟，95摄氏度15秒，60摄氏度1分钟，进行50个循环，并绘制扩增曲线。

图7显示了Real-time PCR方法检测脑组织rno-miR-181a的表达情况。与假辐射组相比，30mW/cm²组辐射后恢复常规喂养的第7天，rno-miR-181a的表达显著降低（P<0.01），与芯片结果一致。

实施例9rno-miR-181a靶基因预测与功能分析

9.1rno-miR-181a靶基因预测

通过miRbase(www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)、miRanda(www.microrna.org/microrna/home.do)以及miRDB(mirdb.org/miRDB/)3个数据库对rno-miR-181a的靶基因进行预测，选择两个或两个以上数据库共有的靶基因。通过Gene Ontology(http://www.geneontology.org/)对靶基因进行功能分类分析。

图8显示了通过miRbase、miRanda以及miRDB数据库对rno-miR-181a的靶基因进行预测。从图8可见，miRanda预测到1039个靶基因，miRbase预测到776个靶基因，miRDB预测到269个靶基因，其中3个数据库共有的靶基因有30个。

9.2rno-miR-181a靶基因功能分析结果

表5rno-miR-181a靶基因功能分析（线粒体相关）

表5显示了应用GO注释系统对rno-miR-181a靶基因进行功能分类，可见其中与线粒体结构功能密切相关的基因主要包括：Timp3、Prkcd、Oat、Nnt、Acsl1、IDH1、PDHB、Atp1b1、Arl1、Acat2、Fbp2、Sdhaf2、Ucp3、Sult1c2a、Arf2、Atp2b4、Atp2b1、Cox5b、Atp1b3、Cox7b、Atp5s和Atp6v1g2。它们主要参与了与线粒体能量代谢、氨基酸合成代谢、脂肪酸运输代谢、TCA循环、糖酵解、解耦连蛋白和凋亡等线粒体相关过程。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.探针在制备药物中的用途，其中所述药物用于确定经过微波辐射的大鼠是否存在脑线粒体损伤，其中所述探针特异性识别如SEQ ID NO：1所示的序列的寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述探针是以芯片的形式提供的。