CN103397014A

CN103397014A - 一种纳米固定化纤维素酶的制备方法

Info

Publication number: CN103397014A
Application number: CN2013103471312A
Authority: CN
Inventors: 李书润; 廖文强; 危岩
Original assignee: BEIJING WECARES BIOPHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2013-08-09
Filing date: 2013-08-09
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-09
Also published as: CN103397014B

Abstract

本发明涉及生物化工领域，公开一种纳米固定化纤维素酶的制备方法，包含以下步骤：搅拌下向正硅酸乙酯加入HCl溶液，经过水解得到透明溶液；将透明溶液冷却，回收乙醇，控制透明溶液乙醇的体积百分含量＜1%；在搅拌下向透明溶液加入葡萄糖溶液，再加入纤维素酶柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，最后调节pH值接近中性后，转入4-10℃成胶；将成胶得到的湿胶研磨，水洗除去葡萄糖，水洗后的混合液进行抽滤得到白色的凝胶，将凝胶进行干燥，研磨，过筛备用。本发明所述方法制备的纳米固定化纤维素酶，实验显示反复使用多次后，酶活力几乎保持不变，可用于纤维素乙醇的规模化生产。

Description

一种纳米固定化纤维素酶的制备方法

技术领域

本发明涉及生物化工领域，特别涉及一种纳米固定化纤维素酶的制备方法。

背景技术

国际原油价格的不断攀升和全球污染问题的日益加重，世界各国都在不遗余力地研发新能源，而生物乙醇是被普遍看好的新型燃料。进入21世纪，利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗，引起了各国政府和研究机构的重视，这其中的关键是纤维素酶的成本问题。

由于纤维素酶发酵活力较低，因此其应用成本也较高。纤维素酶相比其他糖苷水解酶类，比活力至少要低1～2个数量级，从而造成酶的作用效率较低。另外由于天然纤维素酶多为一次性直接使用，使用成本高，阻碍了该转化过程的工业化。这是限制纤维素酶商业化大规模生产纤维素乙醇的瓶颈问题，也是纤维素酶研究的热点与难点。

尽管目前现有的技术可以制备纤维素乙醇，但在生产过程中使用的酶尤其是纤维素酶不能回收、不能重复使用、酶成本太高，导致无法进行规模化生产。

目前针对这一问题的解决方案是，通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量，从而提高酶的发酵水平。还可以通过改善发酵条件和工艺，如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式，进而对其进行有效改造；或者通过筛选新的产酶菌种，发现具有开发潜力的新酶源。但不论如何改进工艺、优选菌株，都不能无限制的提高酶活力。另外，自由酶本身存在局限性，如稳定性差、不易储存、不能回收反复使用等。因此，从纤维素酶本身入手解决纤维素乙醇生产时酶成本过高的瓶颈的方案已经收到限制。

采用纤维素酶的固定化，有利于酶的回收和再利用，有望解决该酶生产应用的实际问题。固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在：首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。固定化纤维素酶的以上优点使得纤维素乙醇生产过程中酶成本显著降低，有望实现纤维素乙醇商业化生产。

目前应用的固定化纤维素酶方法，存在以下问题：使用表面活性剂：戊二醛、氨水、醋酸、聚乙烯醇、span80等；需要低温冷冻、或者高温；且需要反复冻融；酶活性保留率低，约在40%左右；这些不足，导致制备固定化纤维素酶时，制备过程复杂、环境不友好、不能工业化生产。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种纳米固定化纤维素酶的制备方法，通过控制制备方法中的参数，使制得的纳米固定化纤维素酶相对自由酶活性在85%以上，且所述方法制备的纳米固定化纤维素酶可多次回收使用且酶活性几乎保持不变。

本发明所述纳米固定化纤维素酶的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：搅拌下向正硅酸乙酯加入HCl溶液，经过水解得到透明溶液；

步骤2：将水解得到的透明溶液冷却，回收乙醇，控制透明溶液乙醇的体积百分含量＜1%；

步骤3：在搅拌下向透明溶液加入葡萄糖溶液，再加入纤维素酶柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，最后加入碱性溶液调节pH值为中性，转入4-10℃成胶；

步骤4：将成胶得到的湿胶研磨，水洗除去葡萄糖，将水洗后的混合液进行抽滤得到白色的凝胶，将凝胶进行干燥，研磨，过筛备用。

本发明所述纳米纤维素酶的制备过程为：

首先在常温下以盐酸为催化剂将正硅酸乙酯水解，水解完毕之后得到无色透明的溶胶，采用抽真空的方式回收水解过程中产生的副产物乙醇，然后在搅拌下依次加入模版葡萄糖溶液、纤维素酶缓冲溶液，最后加入氢氧化钠溶液调节体系的pH值到中性，放置生成凝胶，当凝胶化完成之后，把凝胶研磨粉碎，再用水进行洗涤以除去凝胶体系中的葡萄糖模版，最终得到固定化有纤维素酶的纳米介孔材料。

反应原理如下：

正硅酸乙酯在酸或碱催化下的水解反应方程式为：

5Si(OC₂H₅)₄+12H₂O→5SiO₂+12C₂H₅OH

在本发明的实施例中，研究了制备方法残留乙醇对纳米纤维素酶酶活性的影响，保持其他条件不变，分别控制回收乙醇后透明溶液中乙醇体积百分含量为0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10%，制备得到的纳米纤维素酶进行酶活性测定，结果显示，当控制回收乙醇后透明溶液中乙醇含量小于1%时，纳米固定化纤维素酶相对自由酶活性在85%以上。

作为优选，本发明所述制备方法步骤1中正硅酸乙酯与HCl的摩尔比为100-200:1。

更优选地，步骤3纤维素酶柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液，葡萄糖与正硅酸乙酯的质量比为1：3-5。

更优选地，步骤3所述碱性溶液选自NaOH、KOH或氨水溶液。

步骤4所述干燥为埋在干燥的硅胶中干燥，过筛为过40目筛。

本发明还提供根据所述制备方法制备的纳米固定化纤维素酶。

在本发明中，纳米纤维素酶的活性测试采用滤纸酶活力测定，通常以滤纸酶活力(filter paper activity，FPA)代表纤维素酶的总活力，按照国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定，以国际单位IU表示。试管中放入1×6cm whatman No.l滤纸(约50mg)一条，加入0.5mL适当稀释的纤维素酶液和1mL柠檬酸缓冲液(pH4.8)，于50℃保温振荡30min。空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变。反应结束后用DNS法(3,5-二硝基水杨酸)测定所得的还原糖含量。

一个滤纸酶活力国际单位(FPIU)等于酶促反应中每分钟生成1.0umol葡萄糖(以还原糖表示)所需的酶量，其关系见以下公式：

本发明所述方法生产纳米纤维素酶无需高温、高压，环境友好，不产生环境污染；当控制回收乙醇后透明溶液中乙醇含量小于1%时，所制得的纳米固定化纤维素酶相对自由酶活性在85%以上；可多次回收使用且酶活性几乎保持不变，且实现重复使用方法简易，便于规模化工业化生产；另外，本发明所述方法生产纳米纤维素酶产生的副产品乙醇，可进行回收，补偿纳米纤维素酶的生产成本。

本发明所述方法生产的纳米纤维素酶经实验显示，反复使用10次，酶活力几乎保持不变，实现了纳米纤维素酶的高酶活回收使用，可用于纤维素乙醇生产。

基于这项核心技术，解决了目前纤维素乙醇所用纤维素酶成本高昂的问题，实现纤维素乙醇的商业化生产。本发明所述方法制备的固定化纳米纤维素酶在较高的温度下发挥作用，并能反复使用，为今后固定化酶的工业化生产开辟了广阔的前景。

附图说明

图1示本发明所述固定化纳米纤维素酶重复利用的得糖率和酶活性；

图2示残留本发明所述方法中体系乙醇含量与固定化纳米纤维素酶的酶活性关系。

具体实施方式

本发明公开了一种纳米固定化纤维素酶的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：本发明所述纳米固定化纤维素酶的制备

材料正硅酸乙酯（TEOS），国药试剂集团，纯度＞99%

纤维素酶（Cellulase），Sigma Aldrich，10000U/g

D-葡萄糖（D-Glucose），阿拉丁试剂，＞99%

准确称取正硅酸乙酯（TEOS）32.0g于100ml的烧杯中，在搅拌下加入2.5ml，0.5M的HCl溶液，经过剧烈搅拌后，约15min后可以正硅酸乙酯水解得到透明的溶液，将水解后得到的透明溶液在4℃冰箱中冷却降温，再转入三角瓶中用高真空系统回收水解过程中得到的乙醇，当整个体系的质量下降为原来的50%时（此时溶液内乙醇的含量＜1%），停止抽真空，把溶液转入100ml烧杯中，在搅拌下加入葡萄糖溶液（2.0g葡萄糖溶解于10ml水中），再加入10mg/ml的纤维素酶柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1.0ml，最后加入3.0ml的0.4M NaOH溶液，调节pH值接近中性，然后转入4℃冰箱中成胶48小时。成胶完成之后，把得到的湿胶研磨打碎，于250ml烧杯中加入150ml水搅拌洗涤，水洗两次以除去模版物葡萄糖，水洗后的混合液进行抽滤得到白色的凝胶，用滤纸包裹后把凝胶埋在干燥的硅胶中进行干燥，干燥72小时，最后将干燥好的凝胶研磨过40目筛子，装袋备用。

实施例2：本发明所述制备方法中体系残留乙醇对纳米固定化纤维素酶酶活性的影响

参照实施例1，保持其他条件不变，分别控制回收乙醇后透明溶液中乙醇含量为0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10%，制备得到的纳米纤维素酶进行酶活性测定，结果见下表。

体系残留乙醇%	0.5	1.0	2.0	5.0	10
						纳米酶相对自由酶活性%	87.5	85	64	32	5

以上结果显示，当控制回收乙醇后透明溶液中乙醇含量小于1%时，纳米酶相对自由酶活性在85%以上。

实施例3：本发明所述纳米固定化纤维素酶活性测试

通常以滤纸酶活力(filter paper activity，FPA)代表纤维素酶的总活力，按照国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定，以国际单位IU表示。试管中放入1×6cm whatman No.l滤纸(约50mg)一条，加入0.5mL适当稀释的纤维素酶液和1mL柠檬酸缓冲液(pH4.8)，于50℃保温振荡30min。空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变。反应结束后用DNS法测定所得的还原糖含量。

一个滤纸酶活力国际单位(FPIU)等于酶促反应中每分钟生成1.0umol葡萄糖(以还原糖表示)所需的酶量。则有：

准确称取干燥研磨过筛的纳米纤维素酶粉末1.000g，然后按照前文测试方法A中所描述进行活性测定，测定过程中要及时振荡酶解体系。所用自由纤维素酶实测活性为7500U/g，测得本次纳米纤维素酶的活性为7030U/g。

实施例4：本发明所述纳米固定化纤维素酶用于秸秆爆破料制备葡萄糖

爆破秸秆料（含水率46.4%）为酶解底物。设定2组：自由纤维素酶组和纳米纤维素酶组。每升反应体系底物为53.6g（干重），酶解温度为50℃，恒温，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，0.1M，pH为4.8，酶解时间72h，恒温振荡器振荡频率为150r/min。自由纤维素酶组，葡萄糖得糖率为209mg/dL；纳米纤维素酶组，葡萄糖得糖率为265mg/dL；还原糖含量测定采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法。

得糖量的测试结果显示，在投入酶量相同的情况下，纳米纤维素酶的活性没有降低，表明在采用秸秆爆破料作为酶解底物的情况下，纳米纤维素酶能够起到相应活性，可以顺利进行纤维素底物的酶解过程。

实施例5：本发明所述纳米固定化纤维素酶回收反复使用

实施例3中，纳米纤维素酶通过离心（4℃，8000rpm，10分钟）回收重复使用10次，每次的得糖率和纳米酶相对自由酶的活性见图1，显示重复回收使用10次后，酶活性几乎保持不变。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种纳米固定化纤维素酶的制备方法，包含以下步骤：

步骤3：在搅拌下向透明溶液加入葡萄糖溶液，再加入纤维素酶柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，最后用碱性溶液调节pH值为中性，转入4-10℃成胶；

步骤4：将成胶得到的湿胶研磨，水洗除去葡萄糖，水洗后的混合液进行抽滤得到白色的凝胶，将凝胶进行干燥，研磨，过筛备用。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，正硅酸乙酯与HCl的摩尔比为100-200:1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3纤维素酶柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3葡萄糖与正硅酸乙酯的质量比为1：3-5。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述碱性溶液选自NaOH、KOH或氨水溶液。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述干燥为埋在干燥的硅胶中干燥。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4所述过筛为过40目筛。

8.根据权利要求1-7任一项制备方法制备的纳米固定化纤维素酶。