CN103384831A

CN103384831A - 通过二价结合剂来检测多肽二聚体

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Publication number: CN103384831A
Application number: CN2011800682556A
Authority: CN
Inventors: M.杰尔格; D.海因德尔; A.默滕斯; C.鲁茨; M.希莱姆尔; M.索库波娃; C.萨斯特曼; M.塔克; J.范迪克
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: EP2659275A2; ES2656969T3; US20170275380A1; WO2012085069A2; WO2012085069A3; CA2817455C; US20130288267A1; HK1186770A1; EP2659275B1; JP2014507394A; CA2817455A1; CN103384831B; JP5913363B2

Abstract

本发明涉及能够结合多肽二聚体的二价结合剂，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中第一单价结合剂结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位，其中第二单价结合剂结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位，其中每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，且其中二价结合剂具有3x10^-5/秒或更低的K_解离。还公开了制备这类二价结合剂的方法以及这类二价剂在组织学染色规程中的用途。

Description

通过二价结合剂来检测多肽二聚体

发明背景

许多蛋白质，特别是许多膜结合的受体分子，作为单体是无活性的并且通过同和/或异二聚化被活化。在单一的、未二聚化分子的背景下特异性检测这类受体分子的同或异二聚体是一项巨大的挑战。

令人惊讶地，现已发现能提供一种二价结合剂，其能够结合同或异二聚体，并且同时展现出对同二聚体中包含的一种多肽或对异二聚体中包含的两种多肽中任一种没有显著结合。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及能够结合多肽二聚体的二价结合剂，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中第一单价结合剂结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位，其中第二单价结合剂结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位，其中每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，且其中二价结合剂具有3x10^-5/秒或更低的K_解离。

还公开了获得特异性结合多肽二聚体的二价结合剂的方法，该方法包括以下步骤：选出以5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位的第一单价结合剂，选出以5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位的第二单价结合剂，通过接头偶联两个单价结合剂，并选出具有3x10^-5/秒或更低的K_解离值的二价结合剂。

还描述并要求保护新的二价结合剂的用途，尤其是在免疫组化规程中的用途。

发明详述

在一个实施方案中，本发明涉及一种能够结合多肽二聚体的二价结合剂，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，

其中第一单价结合剂结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位，

其中第二单价结合剂结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位，

其中每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，并

其中所述二价结合剂具有3x10^-5/秒或更低的K_解离。

有时，单一的多肽就足以使蛋白质为活性的。然而，如上文指示的，经常需要两个或更多个多肽相互作用以允许蛋白质实施其特定功能。如果情况如此，那么在两条多肽链彼此联合的情况下所讨论的是例如蛋白质或多肽二聚体。二聚体形成自两条多肽链之间的相互作用得到和/或可以由配体的结合触发。通过氢键、离子键和不太常见的疏水性界面和链间二硫键使二聚体保持在一起。

受体同和/或异二聚化是细胞活性以及生理学和/或病理学过程调节中的一种极为重要的机制。

在本发明的含义中，如果两条多肽链联合并形成生物学有关的复合物，那么就存在二聚体。所述二聚体可以是膜结合的二聚体或者它可以是循环中存在的二聚体，即在生理学条件下稳定的两个多肽的复合物。在一个实施方案中，二聚体中的两条多肽链（如其天然存在的）并非共价连接，而是通过蛋白质-蛋白质相互作用保持在一起，例如基于离子桥或范德华力。

依照本发明的二价结合剂是正好包含两个单价结合剂的结合剂。

在一个优选的实施方案中，通过Biacore^TM SPR技术表征每个单价结合剂和二价结合剂的动力学速率特性，如在实施例中详述的。

如熟练技术人员会领会的，可以根据期望分离并纯化本发明中描述的二价结合剂。在一个实施方案中，本发明涉及分离的如本文中公开的二价结合剂。“分离的”二价结合剂是已经得到鉴定，并且与/从例如用于合成这类二价结合剂的试剂混合物分开和/或回收的二价结合剂。这类反应混合物的不想要的组分是例如没有在期望的二价结合剂中用尽的单价结合剂。在一个实施方案中，将所述二价结合剂纯化至大于80%。在一些实施方案中，将所述二价结合剂分别纯化至按重量计大于90%、95%、98%或99%。在两个单价结合剂都是多肽的情况下，例如容易在蛋白质检测中使用例如考马斯蓝或银染色剂通过还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE测定纯度。在核酸水平上评估纯度的情况下，应用大小排阻层析来将二价结合剂与副产物分开，并监测260nm处的OD以评估其纯度。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个/种或超过一个/种（即至少一个/种）该冠词的语法对象。举例而言，“一个/种抗体”指一个/种抗体或超过一个/种抗体。

如本文中使用的，术语“寡核苷酸”或“核酸序列”一般指短的、通常单链的多核苷酸，其包含至少8个核苷酸且至多约1000个核苷酸。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸会具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或30个核苷酸的长度。在一个优选的实施方案中，寡核苷酸会具有不超过200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸的长度。下文对多核苷酸给出的描述同等且完全适用于寡核苷酸。

术语寡核苷酸应当广义理解，且包括DNA和RNA以及其类似物和修饰。

例如，寡核苷酸可以含有在标准碱基脱氧腺苷（dA）、脱氧鸟苷（dG）、脱氧胞苷（dC）、脱氧胸苷（dT）、脱氧尿苷（dU）处携带取代基的经取代的核苷酸。这类经取代的核碱基的例子为：5-取代的嘧啶如5甲基dC、氨基烯丙基(aminoallyl)dU或dC、5-(氨乙基-3-丙烯酰亚氨(acrylimido))-dU、5-丙炔基-dU或-dC、5卤化的-dU或-dC；N取代的嘧啶如N4-乙基-dC；N取代的嘌呤如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG；8取代的嘌呤如8-[6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或-dA、8卤化的dA或dG、8-烃基dG或dA；和2取代的dA如2氨基dA。

寡核苷酸可以含有核苷酸或核苷类似物。即，可以通过使用核碱基类似物来交换天然存在的核碱基，所述核碱基类似物如5-硝基吲哚(Nitroindol)d核苷；3硝基吡咯d核苷、脱氧肌苷（dI）、脱氧黄苷（dX）；7脱氮-dG、-dA、-dI或-dX；7-脱氮-8-氮杂-dG、-dA、-dI或-dX；8-氮杂-dA、-dG、-dI或-dX；d间型霉素(Formycin)；假dU；假异dC；4硫代dT；6硫代dG；2硫代dT；异dG；5-甲基-异-dC；N8-连接的8-氮杂-7-脱氮-dA；5,6-二氢-5-氮杂-dC；和亚乙烯基-dA或吡咯并-dC。如对于熟练技术人员显而易见的，必须以如下的方式选择互补链中的核碱基，使得双链体形成是特异性的。如果例如在一条链（例如（a））中使用5-甲基-异-dC，那么必须在互补链（例如（a’））中使用异dG。

寡核苷酸主链可以修饰为含有经取代的糖残基、糖类似物、对核苷间磷酸酯模块的修饰，和/或是PNA。

寡核苷酸可以例如含有具有经取代的脱氧核糖的核苷酸，如2’-甲氧基、2’-氟、2’-甲基硒代、2’-烯丙氧基、4’-甲基dN（其中N是核碱基，例如A、G、C、T或U）。

糖类似物是例如木糖；2’,4’桥接的核糖如(2’-O，4’-C亚甲基)-（称为LNA的寡聚物）或(2’-O，4’-C亚乙基)-（称为ENA的寡聚物）；L-核糖、L-d-核糖、己糖醇（称为HNA的寡聚物）；环己烯基（称为CeNA的寡聚物）；阿卓糖醇(altritol)（称为ANA的寡聚物）；三环核糖类似物，其中C3’和C5’原子通过与环丙烷环融合的亚乙基桥连接（称为三环DNA的寡聚物）；甘油（称为GNA的寡聚物）；吡喃葡萄糖（称为同型(homo)DNA的寡聚物）；carbaribose（具有环戊烷(cyclopentan)而非四氢呋喃亚单位）；羟甲基-吗啉（称为吗啉代DNA的寡聚物）。

还已知大量的核苷间磷酸酯模块修饰不干扰杂交特性，并且这类主链修饰也可以与经取代的核苷酸或核苷酸类似物组合。例子是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)和甲基膦酸酯寡核苷酸。

PNA（具有不含磷酸和d-核糖的主链）也可以用作DNA类似物。

上文提述的经修饰的核苷酸、核苷酸类似物以及寡核苷酸主链修饰可以根据期望组合成本发明意义中的寡核苷酸。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。在本发明的意义中，多肽由至少5个通过α氨基肽键连接的氨基酸组成。

“靶多肽”是对其寻求测定或测量方法的感兴趣多肽。本发明的靶多肽是已知或怀疑形成同或异二聚体多肽复合物的多肽。

依照本发明，“单价结合剂”是以5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离在单个结合位点处与靶多肽相互作用的分子。优选地，动力学结合速率特性的生物物理表征，具体地依照朗缪尔(Langmuir)模型测定解离速率常数kd(1/s)通过基于生物传感器的表面等离振子共振光谱学分析。优选地，使用如在实施例中详细描述的Biacore^TM技术。

单价结合剂的例子是肽、肽模拟物、适体、镜铁聚体(Spiegelmer)、darpin、凝集素(lectine)、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、单域抗体（见Hey,T.等,TrendsBiotechnol23(2005)514-522）和单价抗体片段。

如对于熟练技术人员明显的，依照本发明的每个单价结合剂仅结合靶多肽上的单一表位。

在某些优选的实施方案中，单价结合剂是单价抗体片段，优选地自单克隆抗体衍生的单价片段。

单价抗体片段包括但不限于Fab、Fab’-SH（Fab’）、单域抗体、Fv和scFv片段，如下文提供的。

在一个优选的实施方案中，至少一个单价结合剂是单域抗体、单克隆抗体的Fab片段或Fab’片段。

也代表一个优选的实施方案的是，在本文中公开的二价结合剂中，两个单价结合剂都自单克隆抗体衍生，并且是Fab片段、或Fab’片段或Fab片段和Fab’片段。

单克隆抗体技术允许以特异性单克隆抗体或其片段的形式生成极端特异性的结合剂。在本领域中尤其公知的是通过用感兴趣的多肽免疫小鼠、家兔、仓鼠或任何其它哺乳动物来创建单克隆抗体或其片段的技术。另一种创建单克隆抗体或其片段的方法是使用sFv（单链可变区），特别是人sFv的噬菌体库（参见例如Griffiths等，美国专利No.5,885,793；McCafferty等，WO92/01047；Liming等，WO 99/06587）。

可以通过传统手段（如酶促消化）或通过重组技术来生成抗体片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134。

Fv是含有完整的抗原结合位点，并且缺乏恒定区的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类由紧密的、非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类的一个实施方案中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价连接，从而使得轻链和重链能以与双链Fv种类中的二聚体结构类似的二聚体结构联合。对于scFv的综述，参见例如Plueckthun,于：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编),Springer-Verlag,New York(1994),第269页-第315页；亦参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。一般而言，6个高变区(HVR)赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至单个可变域（或仅包含对抗原特异性的3个HVR的半个Fv）也具有识别并结合抗原的能力。

Fab片段含有重链和轻链可变域，且还含有轻链恒定域和重链第一恒定域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1域的羧基端增加了少数残基（包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸）而与Fab片段有所不同。Fab’-SH是本文中对其中的恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’的称谓。

已经开发出各种技术用于生成抗体片段。传统地，抗体片段经由对完整抗体的蛋白水解消化而衍生（参见例如Morimoto,K.等,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods24(1992)107-117；和Brennan等,Science229(1985)81-83）。例如，用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的各具有单一抗原结合位点的抗原结合片段，称作“Fab”片段，和一个残留的“Fc”片段，其名称反映了其容易结晶的能力。

还可以通过重组宿主细胞直接生成抗体片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌（E.coli）中表达并自其分泌，如此允许容易产生大量的这些片段。可以依照标准规程从抗体噬菌体库分离抗体片段。或者，可以直接从大肠杆菌回收Fab’-SH片段（Carter,P.等,Bio/Technology10(1992)163-167）。还可以使用哺乳动物细胞系统来表达并（如期望的话）分泌抗体片段。

在某些实施方案中，本发明的单价结合剂是单域抗体。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体（Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利No.6,248,516B1）。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。

两个单价结合剂之一，即第一单价结合剂，结合第一（靶）多肽上的表位。

依照本发明的“表位”，即靶多肽上由相应单价结合剂结合的结合位点，由氨基酸构成。所述氨基酸是天然存在的氨基酸并且可以携带一处或多处二级修饰。在一个实施方案中，所述氨基酸未经二级修饰。在一个实施方案中，所述结合剂结合线性表位，即由5至12个连续氨基酸的区段组成的表位，或者所述单价结合剂结合由靶多肽的空间排列形成的三级结构。由结合剂，例如由抗体的抗原识别位点或互补位识别的三级表位可以看作抗原分子的三维表面特征；这些特征精确地适合结合剂的相应结合位点，并且由此促进结合剂和靶多肽之间的结合。

在如本文中披露的二价结合剂中，第一单价结合剂结合第一多肽上的表位而第二单价结合剂结合第二多肽上的表位。多肽二聚体中的第一和第二多肽可以具有相同的序列，即此二聚体是同二聚体，或者第一和第二多肽可以是不同的，即此二聚体是异二聚体。

如上文提述的，对于许多受体分子，多肽同或异二聚体的分别形成是调节细胞信号传导和蛋白质活性的关键。这尤其对于膜结合受体，特别是所谓的受体酪氨酸激酶(RTK)是已知且正确的。如命名法已经提示，RTK胞内信号传导的至少一部分由这类RTK的胞内域的某个酪氨酸的磷酸化状态介导。如此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及结合受体多肽二聚体的二价结合剂。显然，这类二价结合剂在活性同或异二聚体受体多肽的检测中具有很大的效用。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及如上文中公开的二价结合剂，其中所述靶多肽二聚体选自由膜结合受体分子组成的组，优选选自通过两个受体酪氨酸激酶多肽联合形成的同或异二聚体。

在一些实施方案中，作为同或异二聚体一部分的RTK多肽选自下组：ALK，粘附相关激酶受体（例如Axl），ERBB受体（例如EGFR，ERBB2，ERBB3，ERBB4），红细胞生成素产生肝细胞(EPH)受体（例如EphA1，EphA2，EphA3，EphA4，EphA5，EphA6，EphA7，EphA8，EphB1，EphB2，EphB3，EphB4，EphB5，EphB6），成纤维细胞生长因子(FGF)受体（例如FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FGFR5），Fgr，IGFIR，胰岛素R，LTK，M-CSFR，MUSK，血小板衍生生长因子(PDGF)受体（例如PDGFR-A，PDGFR-B），RET，ROR1，ROR2，ROS，RYK，血管内皮生长因子(VEGF)受体（例如VEGFR1/FLT1，VEGFR2/FLK1，VEGF3），具有免疫球蛋白样和EGF样域的酪氨酸激酶(TIE)受体（例如TIE-1，TIE-2/TEK），Tec，TYRO10，胰岛素样生长因子(IGF)受体（例如INS-R，IGF-IR，IR-R），盘基菌蛋白域(DiscoidinDomain)(DD)受体（例如DDR1，DDR2），c-Met（MET）的受体，recepteurd’origine nantais(RON)；也称为巨噬细胞刺激1受体，Flt3fins相关酪氨酸激酶3(Flt3)，集落刺激因子1(CSF1)受体，c-kit（KIT，或SCFR）的受体和胰岛素受体相关(IRR)受体。

在一个实施方案中，作为同或异二聚体一部分的RTK选自下组：ERBB受体（例如EGFR，ERBB2，ERBB3，ERBB4），血小板衍生生长因子(PDGF)受体（例如PDGFR-A，PDGFR-B）和血管内皮生长因子(VEGF)受体及共受体（例如VEGFR1/FLT1，VEGFR2/FLK1，VEGF3，神经毡蛋白-1，神经毡蛋白-2），胰岛素样生长因子(IGF)受体（例如INS-R，IGF-IR，IR-R）和胰岛素受体相关(IRR)的受体。

在一个实施方案中，本发明涉及能够结合多肽二聚体的二价结合剂，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中第一单价结合剂结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位，其中第二单价结合剂结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位，其中每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，且其中二价结合剂具有3x10^-5/秒或更低的K_解离，且其中所述二聚体是选自下组的受体多肽二聚体：ERBB受体（例如EGFR，ERBB2，ERBB3，ERBB4）和血管内皮生长因子(VEGF)受体及共受体（例如VEGFR1/FLT1，VEGFR2/FLK1，VEGF3，神经毡蛋白-1，神经毡蛋白-2）。

在一个实施方案中，受体同和/或异二聚化涉及牵涉到VEGF信号传导的多肽。它包括血管内皮生长因子及其相应受体作为一个特定的例子（对于详情，参见Otrock,Z.等,Blood Cells,Molecules and Diseases:38(2007)258-268）。

VEGF信号传导经常代表生理性血管发生中的一个关键的限速步骤。血管发生是从原来存在的血管萌发新的血管。该过程对于胎儿发育和组织修复期间新血管的生长是重要的；然而，不受控的血管发生促进赘生性疾病和其它病症。该过程的成功执行取决于生长促进因子和生长抑制因子的平衡。血管发生的最特异性的和至关重要的调节物之一是VEGF。

VEGF家族包含7种分泌型糖蛋白，它们称为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(PlGF)和VEGF-F。VEGF家族成员结合其关联受体。迄今鉴定出的受体被称为VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和神经毡蛋白（NP-1和NP-2）。

VEGF-A通过与细胞表面受体相互作用来施加其生物学影响。这些受体是跨膜酪氨酸激酶受体，它们包括在血管内皮细胞上选择性表达的VEGF受体-1（VEGFR-1；Flt-1）和VEGFR-2（含有激酶插入域的受体/Flk-1），以及在血管内皮和神经元上表达的神经毡蛋白受体（NP-1和NP-2）。当VEGF-A与受体的胞外域结合时，在胞内受体酪氨酸激酶的二聚化和自磷酸化后激活下游蛋白质的级联。VEGFR-2看来是负责介导VEGF-A的促生血管效应的主要受体。

VEGFR-1（fms样酪氨酸激酶；Flt-1）由7个胞外免疫球蛋白(Ig)同源域、单个跨膜区和胞内酪氨酸激酶域构成。VEGFR-1以高亲和力结合VEGF-A、VEGF-B和PlGF。

VEGFR-2（KDR，人；Flk-1，小鼠）于1991年首次分离并称为含有激酶插入域的受体(KDR)。与VEGFR-1类似，VEGFR-2拥有具有7个免疫球蛋白(Ig)样域的胞外区、跨膜域和有约70个氨基酸插入的酪氨酸激酶域。VEGFR-2结合VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。

VEGFR-3（fms样酪氨酸激酶4，Flt4），内皮细胞受体酪氨酸激酶的一个成员，仅具有6个Ig同源域[121]。VEGFR-3优先结合VEGF-C和VEGF-D。

在配体结合时，VEGF受体1、2和3能形成活性同二聚体，并经由胞内酪氨酸激酶域施加其作用。然而，同二聚体形成并非是仅有的作用方式，而且所谓的神经毡蛋白作为共受体起着重要作用。

神经毡蛋白NP-1最初被鉴定为130至140kDa的细胞表面糖蛋白，其充当脑信号蛋白(semaphoring)/脑衰蛋白(collapsing)的受体，脑信号蛋白/脑衰蛋白是在轴突和神经元发育中充当抑制性导向信号的分泌和跨膜蛋白的大家族。NP-1结合VEGF-A、VEGF-B和PlGF，而NP-2结合VEGF-A、VEGF-C和PlGF。

NP-1充当共受体，其增强VEGF-A与VEGFR-2相互作用，与VEGFR-1形成复合物并增加体内肿瘤血管发生。为了研究此途径，需要对VEGFR-2/NP-1异二聚体进行特异性检测。

最近的研究已将NP-2与淋巴管发育关联起来。

如已在上文指出的，VEGF受体家族的成员只要是单体就无活性，然而，当结合配体并发生同和/或异二聚化时，诱导一批不同的生化途径，导致不同的作用模式。区分（无活性）单体和各种同和/或异二聚体的能力在阐明VEGF/VEGF受体系统的生理学作用模式和靶向该系统一或多个成员的药物的效果中具有极大的重要性。在一个实施方案中，本发明涉及能够结合多肽二聚体的二价结合剂，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中第一单价结合剂结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位，其中第二单价结合剂结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位，其中每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，且其中二价结合剂具有3x10^-5/秒或更低的K_解离，而且其中同和/或异二聚体是VEGF/VEGF受体系统的一部分。在一个实施方案中，这类结合剂中的一个单价结合剂结合选自下组的VEGF：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(PlGF)和VEGF-F，而另一单价结合剂结合选自下组的受体：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和神经毡蛋白（NP-1和NP-2）。或者，在一个实施方案中，这类结合剂具有结合选自VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的受体多肽的一个单价结合剂和结合神经毡蛋白（NP-1或NP-2）的另一个单价结合剂。

如论述的，用于构建本文中公开的二价结合剂的单价结合剂必须具有5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离。

优选地，第一单价结合剂特异性结合第一多肽上的表位。即，该结合剂结合不存在于第二靶多肽上的表位（如在异二聚体二价结合剂的情况下），或者其结合与第二靶多肽上存在的表位重叠或相同的表位（如在同二聚体二价结合剂的情况下）。

如果与任意其它肽上（例如在第二靶多肽上，如果第一和第二靶多肽不同的话）的任意（类似或完全不相关的）表位相比，所述结合剂对靶多肽上的表位具有低至少20倍的K_解离，那么承认对表位的特异性结合。如果单价结合剂仅特异性结合其中一个多肽时，那么承认异二聚体中的多肽不同。还优选第一单价结合剂对第一靶多肽上的表位的K_解离与任意其它多肽上的任意表位相比低至少30、40、50、80、90、95或至少100倍。

在一个优选的实施方案中，本文中披露的二价结合剂结合包含两个不同多肽的异二聚体。在此情况下，优选地，选择的第二单价结合剂具有的对第一靶多肽的K_解离与其对第二靶多肽结合的K_解离相比低至少20倍。还优选第二单价结合剂对第二靶多肽的K_解离与对第一靶多肽上的任意表位的K_解离相比至少低30、40、50、80、90、95或至少100倍。

如上文所提述的，依照本发明的二价结合剂会具有至多3x10^-5/秒或更低（即更好）的K_解离。

在一个实施方案中，在依照本发明的二价结合剂中，每个单价结合剂具有2x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离。

在一个实施方案中，在依照本发明的二价结合剂中，每个单价结合剂具有10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离。

由Ventana Medical Systems Inc.Tucson经销的自动免疫组织化学染色仪采用相当严格的清洗条件。在BenchMark

分析仪系列上使用的抗体应当具有至多5x10^-5/秒的K_解离以给出合理的染色强度。K_解离越低，染色强度也会越佳。本文中公开的二价结合剂具有至多3x10^-5/秒的K_解离。在另一个实施方案中，本文中公开的二价结合剂具有2x10^-5/秒或更小或还优选10^-5/秒或更小的K_解 _离。

在一个实施方案中，通过Biacore^TM SPR技术表征每个单价结合剂和二价结合剂的动力学速率特性，如实施例中详细描述的。

依照本发明的二价结合剂含有接头。所述接头可以共价连接两个单价结合剂或所述接头和单价结合剂可以由两个不同的特异性结合对a:a’和b:b’结合。

所述接头可以例如由合适的单体构成，所述单体连接在一起并通过共价键与两个单价结合剂连接。优选地，所述接头会含有糖模块、核苷酸模块、核苷模块和/或氨基酸。在某些优选的实施方案中，所述接头会基本上由核苷酸、核苷酸类似物或氨基酸组成。

优选地，经由结合对共价连接或结合两个单价结合剂的接头具有6至100nm的长度。还优选所述接头具有6至50nm或6至40nm的长度。在又一个优选的实施方案中，所述接头会具有10nm或更长或15nm或更长的长度。在一个实施方案中，依照本发明的二价结合剂中包含的接头具有介于10nm和50nm之间的长度。

理论上且通过复合方法，给定接头（a-S-b）的非核苷实体的长度可以通过使用与非核苷实体在化学上类似的化合物的已知键距和键角来计算。标准教科书中对一些分子汇总了这类键距：CRC Handbook of Chemistry andPhysics，第91版，2010-2011，第9部分。然而，确切的键距对于每种化合物有所变化。也存在着键角可变性。

因此，在这类计算中使用平均参数（容易理解近似值）是更实际的。

在间隔物或接头长度的计算中，下列近似值适用：a)为了计算非核苷实体的长度，使用130pm的平均键长及180°的键角，其不依赖于连接的原子的性质；b)单链中的一个核苷酸用500pm计算，且c)双链中的一个核苷酸用330pm计算。

数值130pm基于C(sp3)-C(sp3)-C(sp3)链的两个末端碳原子的距离计算，其中键角为109°28’，两个C(sp3)间的距离为153pm，这假定键角180°和两个C(Sp3)间的键距125pm转化成约250pm。考虑到杂原子如P和S以及sp2和sp1C原子也可以是间隔物的一部分，采用数值130pm。如果间隔物包含环状结构如环烃基或芳基，那么以类似的方式计算距离，其通过对所述环状结构中作为限定距离的原子的整条链的一部分的键计数进行。

如上文所提述的，所述接头可以共价连接两个单价结合剂，或所述接头和单价结合剂可以由两个不同的特异性结合对a:a’和b:b’结合。因此，也可以通过下述式I描绘结合多肽二聚体的依照本发明的二价结合剂：

A-a’:a-S-b:b’-B，

其中A是第一单价结合剂，其结合第一靶多肽的表位，其中B是第二单价结合剂，其结合第二靶多肽的表位，其中每个单价结合剂A和B具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，其中a’:a以及b:b’独立是结合对或a’:a和/或b:b’是共价结合的，其中a’:a和b:b’是不同的，其中S是间隔物，其中-代表共价键，其中接头a-S-b具有6至100nm的长度，且其中二价结合剂具有3x10^-5/秒或更小的K_解离。

由a-S-b组成的接头L具有6至100nm的长度。优选地，由a-S-b组成的接头L具有6至80nm的长度。还优选接头具有6至50nm或6至40nm的长度。在又一个优选的实施方案中，所述接头会具有10nm或更长或15nm或更长的长度。在一个实施方案中，所述接头具有介于10nm和50nm之间的长度。在一个实施方案中，a和b分别为结合对成员，并且各自具有至少2.5nm的长度。

间隔物S可以根据需要来构建，例如提供期望的长度以及其它期望的特性。所述间隔物可以例如完全或部分由天然存在的或非天然存在的氨基酸构成，由磷酸根-糖单元构成，例如无核碱基的DNA样主链，由糖-肽结构构成，或至少部分由糖类单元或至少部分由可聚合亚单位如二醇或丙烯酰胺构成。

可以根据期望改变依照本发明的化合物中的间隔物S的长度。为了容易地利用可变长度的间隔物（即库），优选能简单合成这类库的间隔物。间隔物的组合固相合成是优选的。由于不得不合成直至约100nm长度的间隔物，以如下的方式选择合成策略，即使得在固相合成期间以高效率装配单体合成建造部件。基于亚磷酰胺（酯）(phosphoramidite)作为单体构件块装配的脱氧寡核苷酸的合成完全满足此要求。在这类间隔物中，间隔物内的单体单元在每种情况下经由磷酸酯或磷酸酯类似物模块连接。

间隔物S可以含有游离的带正电荷或/和负电荷的多官能性氨基-羧酸基团，例如氨基、羧酸根或磷酸根。例如，电荷载体可以自三官能性氨基羧酸衍生，所述三官能性氨基羧酸含有a)一个氨基基团和两个羧酸根基团或b)两个氨基基团和一个羧酸根基团。这类三官能性氨基羧酸的例子是赖氨酸、鸟氨酸、羟赖氨酸、α,β-二氨基丙酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、羧基谷氨酸和对称的三官能性羧酸如那些记载于EP-A-0 618192或US-A-5,519,142中的。或者，三官能性氨基羧酸中的一个羧酸根基团a)可以用磷酸根、磺酸根或硫酸根基团替换。这类三官能性氨基酸的一个例子是磷酸丝氨酸。

间隔物S也可以含有不带电荷的亲水性基团。不带电荷的亲水性基团的优选例子是环氧乙烷或优选具有至少3个环氧乙烷单元的聚环氧乙烷基团、亚砜、砜、羧酸酰胺、羧酸酯、膦酸(phosphonic acid)酰胺、膦酸(phosphonicacid)酯、磷酸(phosphoric acid)酰胺、磷酸(phosphoric acid)酯、磺酸酰胺、磺酸酯、硫酸酰胺和硫酸酯基团。优选地，酰胺基团是伯酰胺基团，特别优选地，氨基酸侧链基团（例如氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺）中的羧酸酰胺残基。优选地，酯自亲水性醇，特别是C1-C3醇或二醇或三醇衍生。

在一个实施方案中，间隔物S由一类单体构成。例如，间隔物分别仅由氨基酸、糖残基、二醇、磷酸-糖单元构成或者它可以是核酸。

在一个实施方案中，所述间隔物是DNA。在一个优选的实施方案中，所述间隔物是DNA的L-立体异构体，亦称为β-L-DNA、L-DNA或镜像DNA。L-DNA的特征在于如下的优点，如正交(orthogonal)杂交行为（其意味着仅在L-DNA的两条互补单链间形成双链体，而在L-DNA的单链和互补DNA链之间不形成双链体）、核酸酶抗性和容易合成（即使较长间隔物）。如指出的，容易合成和间隔物长度的可变性对于间隔物库来说是重要的。可变长度的间隔物在鉴定依照本发明的二价双重结合剂中是极其有用的，所述二价双重结合剂具有最佳长度的间隔物，如此提供两个单价结合剂间的最佳距离。

间隔物构件块，顾名思义，可以用于将间隔模块引入间隔物S中或建造接头a-S-b的间隔物S。

有不同数目和种类的非核苷酸以及核苷酸间隔物构件块用于引入间隔模块。

许多不同非核苷酸双官能性间隔物构件块在文献中是已知的，并且许多种是商品化的。非核苷酸双官能性间隔物建造的选择影响着间隔物分子的电荷和柔性。

在双官能性间隔物构件块中，将用酸不稳定性保护基保护的羟基基团与亚磷酰胺基团连接。

在一个实施方案中，双官能性间隔物构件块是非核苷化合物。例如，这类间隔物是C2-C18烷基、烯基、炔基碳链，而所述烷基、烯基、炔基链可以用另外的亚乙氧基(ethyleneoxy)和/或酰胺模块或季铵化(quarternized)阳离子胺模块中断以增加接头的亲水性。也可以使用任选地用一个或两个C1-C6烃基基团取代的环状模块如C5-C6-环烃基、C4N、C5N、C4O、C5O杂环烃基、苯基作为非核苷双官能性间隔物模块。优选的双官能性构件块包括C3-C6烃基模块和三-至六-乙二醇链。表I显示了具有不同亲水性、不同刚性和不同电荷的核苷酸双官能性间隔物构件块的一些例子。一个氧原子与酸不稳定性保护基（优选为二甲氧三苯甲基）连接，而另一个是亚磷酰胺的一部分。

表I：非核苷酸双官能性间隔物构件块的例子

建造间隔物S或将间隔模块引入间隔物S中的一种简单方式是使用标准的D或L核苷亚磷酰胺构件块。在一个实施方案中，使用dT的单链区段。这是有利的，因为dT不携带碱基保护基。

可以利用杂交来改变间隔物长度（结合对成员a和b之间的距离）和间隔物的柔性，因为双链长度与单链相比是缩短的，并且双链比单链更具刚性。

在一个实施方案中，对于杂交使用用官能性模块X修饰的寡核苷酸。用于杂交的寡核苷酸可以具有一个或两个不与间隔物杂交的末端延伸和/或是内部分支的。可以将这类不与间隔物杂交（且不干扰结合对a:a’和b:b’）的末端延伸用于别的杂交事件。在一个实施方案中，与末端延伸杂交的寡核苷酸是经标记的寡核苷酸。此经标记的寡核苷酸可以再次包含末端延伸或是分支的以允许别的杂交，由此可以获得多核苷酸聚集物或树枝状聚合物(dendrimer)。优选地，使用聚寡核酸树枝状聚合物以产生多标记物或得到较高的X局部浓度。

在一个实施方案中，间隔物S具有1至100nm的主链长度。在本文中换言之，式I的基团a和b相隔介于1和100nm之间。在一个实施方案中，a和b各自分别是结合对成员，并且间隔物S具有1至95nm的主链长度。

“a’:a”以及“b:b’”各自独立地代表结合对或分别代表共价结合的a’:a和/或b:b’。

“a’:a”以及“b:b’”是不同的。该术语不同指示a与a’的结合（结合对内结合或共价偶联）不干扰另一对b与b’的结合对内结合或共价偶联，反之亦然。

在一个实施方案中，a’:a或b:b’是共价结合的，而另一个，即b:b’或a’:a分别代表结合对。

在一个实施方案中，a’:a和b:b’两者都是共价结合的。

a’:a和b:b’之间的偶联化学彼此不同，并且选自标准方案。根据结合配偶和间隔物的性质，选择合适的缀合化学。

在偶联(a’)与(a)中，即偶联A-(a’)与包含(a)的接头中使用的化学不干扰偶联(b)与(b’)中，即偶联(b’)-B与包含(b)的接头中使用的化学。如熟练技术人员会领会的，优选地，分别产生共价键a’:a以及b:b’的反应性位点(a)、(a’)、(b)和(b’)分别也不干扰单价结合剂上可能存在的任何官能团（式I的A和/或B）。

在至少一个单价结合剂是蛋白质、肽或肽模拟物的情况中，它可以携带一个或多个OH、COOH、NH₂和/或SH基团，其可能潜在地与某些偶联试剂起反应。可以通过选择例如表II中给出的偶联化学中的一种来避免这类（副）反应。

表II提供了对常规用于将A-(a’)和(b’)-B分别结合到(a)和(b)（两者都与接头（a-S-b）共价结合）的反应性基团的概述。

表II:

如果至少一个单价结合剂是多肽，那么上述双正交(bi-orthogonal)偶联化学是例如合适的。如果两个结合配偶分别没有携带某些反应性官能团，例如在作为单价结合剂A和B的两个适体的组合的情况下，那么在反应性位点(a’)、(a)、(b)和(b’)的选择中分别有更多的自由。因此，在上表中给出的相应反应性位点对外或与其组合，可以将氨基/活性酯（例如NHS酯）、和SH/SH或SH/马来酰亚胺基用于正交偶联。

如从上文例子中显而易见的，a’:a间和b:b’间的至少一个共价键分别不是α氨基肽键。还优选两个共价键都不是氨基肽键。

在一个实施方案中，a’:a和b:b’两者都是结合对。因此，在一个实施方案中，本发明涉及式I：A-a’:a-S-b:b’-B的至少双特异性结合剂；其中A是结合第一靶多肽的表位的第一单价结合剂，其中B是结合第二靶多肽上的表位的第二单价结合剂，其中每个单价结合剂A和B具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，其中a’:a以及b:b’独立地是结合对并且是不同的，其中S是间隔物，其中-代表共价键，其中接头a-S-b具有6至100nm的长度，且其中二价结合剂具有3x10^-5/秒或更小的K_解离。

在此实施方案中，分别地，a和a’是结合对a’:a的成员，而b和b’是结合对b:b’的成员。优选地，结合对的每个成员具有10kD或之下的分子量。在别的也优选的实施方案中，这类结合对的每个结合剂的分子量为8、7、6、5或4kD或之下。

在一个实施方案中，a’:a和b:b’是结合对，并且结合对a’:a和b:b’的成员选自由亮氨酸拉链域二聚体和杂交核酸序列组成的组。在一个实施方案中，这两个结合对都代表亮氨酸拉链域二聚体。在一个实施方案中，这两个结合对都是杂交核酸序列。

在a:a’或b’:b代表结合对的情况下，这类结合对（之内）的结合亲和力是至少10⁸ l/mol。这两个结合对是有差异的。对于结合对，如果交互结合，例如a以及a’与b或b’的结合是a:a’对内的亲和力的10%或更低，那么例如承认差异。还优选交互结合，即a以及a’分别与b或b’的结合是a:a’对内的亲和力的5%或更低，或者如果它是a:a’对内的亲和力的2%或更低。在一个实施方案中，该差异如此明显，以致与结合对内的特异性结合亲和力相比，交互（交叉反应性）结合是1%或更小。

术语“亮氨酸拉链域”用于指一种普遍公认的二聚化域，其特征在于在约35个残基的区段中每第七个残基处存在一个亮氨酸残基。亮氨酸拉链域是促进找到它的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在数种DNA结合蛋白中鉴定出来（Landschulz,W.H.等,Science240(1988)1759-1764），并且自此以后在多种不同蛋白质中找到。在已知的亮氨酸拉链中有天然存在的肽和其二聚化或三聚化的衍生物。适合于生成可溶性多聚体蛋白质的亮氨酸拉链域的例子记载于PCT申请WO 94/10308，并且自肺表面活性剂蛋白D(SPD)衍生的亮氨酸拉链记载于Hoppe,H.J.等,FEBS Lett.344(1994)191-195。

亮氨酸拉链域形成通过α螺旋卷曲螺旋保持在一起的二聚体（结合对）。卷曲螺旋每转具有3.5个残基，这意味着每第7个残基相对于螺旋轴占据等同的位置。卷曲螺旋内部的亮氨酸的规则排列通过疏水性和范德华相互作用使结构稳定化。

如果亮氨酸拉链域形成第一结合对（a’:a）和第二结合对（b:b’），那么这两个亮氨酸拉链序列是不同的，即序列a和a’不结合b和b’。亮氨酸拉链域可以从已知含有这类域的天然蛋白质如转录因子分离。一个亮氨酸拉链域可以例如来自转录因子fos，而第二个可以来自转录因子jun。亮氨酸拉链域还可以使用本领域中已知的标准合成和设计技术进行人工设计和合成。

在一个优选的实施方案中，结合对a’:a和b:b’的两个成员，即a、a’、b和b’都代表亮氨酸拉链域，并且间隔物S由氨基酸组成。在此实施方案中，容易地生成构建体a-S-b是有可能的。根据期望改变这类间隔物S的长度对于本领域技术人员是简单的。可以合成或重组生成这类多肽。

例如，可以依照标准技术在合适的宿主细胞中表达重组融合蛋白，其包含在N末端与亮氨酸拉链肽融合并且在C末端与亮氨酸拉链肽融合的间隔物多肽。可以将编码期望的肽间隔物的DNA序列在编码第一亮氨酸拉链域a的成员的序列和在相同阅读框中的编码第二亮氨酸拉链域b的成员的DNA序列之间插入。

在一个实施方案中，如果接头a-S-b是多肽，那么间隔物S一次或数次包含GGGGS（G4S）（SEQ ID NO:13）氨基酸序列基序。间隔物S也可以包含标签序列。所述标签序列可以选自通常使用的蛋白质识别标签如YPYDVPDYA（HA标签）（SEQ ID NO:14）或GLNDIFEAQKIEWHE（Avi标签）（SEQ ID NO:15）。

在一个优选的实施方案中，结合对（a’:a）和（b:b’）两者都是杂交核酸序列。

如命名法已经指示，a和a’以及b和b’分别彼此杂交。在一方面在a和a’中及在另一方面在b和b’中包含的核酸序列是不同的。换言之，结合对a’:a中的序列分别不结合结合对b:b’的序列，反之亦然。在一个实施方案中，本发明涉及式I的至少双重结合剂，其中结合对a:a’和b:b’均分别是杂交核酸序列，且其中不同结合对a’:a和b:b’的杂交核酸序列彼此不杂交。换言之，a和a’彼此杂交但不结合b或b’中的任一个或干扰其杂交，反之亦然。可以通过熔解点分析容易地监测杂交动力学和杂交特异性。如果a:a’对的熔解温度与同b或b’的任意可能组合（即a:b；a:b’；a’:b和a’:b’）相比分别高至少20℃，那么承认结合对（例如a:a’）的特异性杂交和非干扰（例如不干扰b或b’）。

形成结合对例如（a:a’）或任何其它基于核酸序列的结合对的核酸序列可以包含任何天然存在的核碱基或其类似物，并且可以具有如上文所描述的经修饰的或未修饰的主链，只要它能够经由多碱基配对形成稳定的双链体。稳定意味着双链体的熔解温度高于37℃。优选地，双链由两条完全互补的单链组成。然而，错配或插入是有可能的，只要给予于37℃的稳定性。

如熟练技术人员会领会，可以通过链间交联使核酸双链体进一步稳定化。数种合适的交联方法是熟练技术人员已知的，例如使用补骨脂素(psoralen)或基于硫代核苷的方法。

优选地，代表结合对成员的核酸序列由介于12和50个之间的核苷酸组成。还优选这类核酸序列会由介于15至35个之间的核苷酸组成。

RNA酶是普遍存在的，并且必须特别注意避免对基于RNA的结合对和/或间隔物序列的不想要的消化。尽管确实有可能使用例如基于RNA的结合对和/或间隔物，但基于DNA的结合对和/或间隔物代表一个优选的实施方案。

可以容易地设计适当的杂交核酸序列以提供超过两对正交互补的寡核苷酸，从而允许简单生成并使用超过两个结合对。在本发明的双重结合剂中使用杂交核酸序列的另一个优点是，可以将修饰容易地引入到核酸序列中。经修饰的构件块是商品化的，其例如允许简单合成包含功能性模块的接头。可以在任何期望的位置且在结构a和a’以及b和b’和/或S的任一种中容易地引入这类功能性模块，只要它们代表寡核苷酸。

在一个优选的实施方案中，依照式I的结合剂中包含的间隔物S是核酸。在一个优选的实施方案中，两个结合对均为杂交核酸序列，并且间隔物S也是核酸。在此实施方案中，由a-S-b组成的接头L是寡核苷酸。

在间隔物S以及序列a、a’、b和b’均为寡核苷酸序列的情况下，容易有可能提供并合成代表接头L的单一寡核苷酸，所述接头L包含S和结合对a’:a和b:b’分别的成员a和b。在单价结合剂A和B分别是多肽的情况下，可以分别将它们各自与杂交核酸序列a’和b’容易地偶联。可以以任何期望的方式容易地改变这类构建体中包含的间隔物S的长度。基于三种构建体a-S-b、A-a’和b’-B，可以依照标准规程分别通过a’:a和b:b’之间的杂交最容易地获得式I的结合剂。当使用不同长度的间隔物时，所得的构建体提供其它方面相同的、但在单价结合剂A和B之间具有不同的距离的双重结合剂。这允许最适的距离和/或柔性。

在一个优选的实施方案中，间隔物S以及序列a、a’、b和b’是DNA。

对映体L-DNA因其正交杂交行为、其核酸酶抗性和容易合成可变长度的寡核苷酸而著称。这种经由设计合适的间隔物而易于接头长度可变性对于优化如本文中公开的结合剂对其一种或多种抗原的结合是重要的。

在一个优选的实施方案中，接头L（=a-S-b）是对映体L-DNA或L-RNA。在一个优选的实施方案中，接头a-S-b是对映体L-DNA。在一个优选的实施方案中，a、a’、b和b’以及间隔物S是对映体L-DNA或L-RNA。在一个优选的实施方案中，a、a’、b和b’以及间隔物S是对映体L-DNA。

在一个实施方案中，间隔物S是寡核苷酸，并且在包含彼此可杂交的末端的两个部分中合成。在此情况下，可以通过使这些可杂交末端彼此杂交简单地构建间隔物S。所得的间隔物构建体包含寡核苷酸双链体部分。显然，在以所述方法构建间隔物的情况中，以如下的方式选择形成所述双链体的可杂交寡核苷酸实体的序列，即使得不能发生与结合对a:a’和b:b’的杂交或干扰结合对a:a’和b:b’。

如上文指示的，在一个实施方案中，依照本发明的二价结合剂结合多肽同二聚体。如果两个靶多肽形成同二聚体，那么优选将同一单价结合剂使用两次。在一个实施方案中，本发明涉及依照式I的能够结合蛋白质同二聚体的二价结合剂，其中S是多核苷酸间隔物，其中单价结合剂A结合第一靶多肽，其中第二单价结合剂（通常为B）也是A并且结合第二靶多肽，其中a’:a和b:b’均代表多核苷酸结合对。如对熟练技术人员明显的，由单价结合剂A结合的表位必须仅在靶多肽上一处存在，或者被两个不同的单价结合剂A和B分别识别的表位必须仅存在一处并且必须是重叠的以避免两个单价结合剂在单个单体靶多肽上的结合。在一个实施方案中，所述二价结合剂结合同二聚体并且两个单价结合剂结合重叠的表位。在一个实施方案中，所述二价结合剂结合同二聚体且两个单价结合剂结合相同表位。

在依照本发明的二价结合剂结合多肽同二聚体的情况下，还可以使用一种简化的方式来构建这类二价结合剂。在此实施方案中，可以将单价结合剂A仅偶联单独的一种可杂交多核苷酸（a’），而且接头可以构建为提供两端，每端可与构建体A-a’杂交。在此实施方案中，接头可以具有形式a-S-a。在本文中所给出的实施例中，这类特定接头被称为衔接头(adaptor)。

如提述的，在一个实施方案中，间隔物S是寡核苷酸并且在包含彼此可杂交的末端的两个部分中合成。在此情况下，可以通过将这些可杂交末端彼此杂交来简单地构建间隔物S，而且所得间隔物构建体包含寡核苷酸双链体部分。

如上文指示的，在一个实施方案中，依照本发明的二价结合剂结合多肽异二聚体。在两个靶多肽形成异二聚体的情况下，优选分别使用两个不同的结合对a’:a和b:b’。在一个实施方案中，本发明涉及依照式I的二价结合剂，本文中S是多核苷酸间隔物，其中单价结合剂A结合第一靶多肽，其中第二单价结合剂B结合第二靶多肽，其中A和B分别特异性结合第一和第二靶多肽，其中a’:a和b:b’均代表多核苷酸结合对，其中a’:a和b:b’不彼此结合或干扰。

如上文已经描述的，式I的单价特异性结合剂A和B可以是核酸。在本发明的一个实施方案中，a’、a、b、b’、A、B和S均为寡核苷酸序列。在该实施方案中，式I的亚单位A-a’、a-S-b和b’-B可以依照标准规程容易地且独立地合成，并且依照便利的标准规程通过杂交组合。

如上文详细讨论的，偶联可以是共价的，或者它可以经由特异性结合对进行。

如熟练技术人员会容易领会的，依照本发明的二价结合剂可以进一步修饰为携带一种或多种功能性模块。优选地，这类功能性模块X选自下组：结合基团、标记基团、效应器基团和反应性基团。

如果存在超过一个功能性模块X，那么每个这类功能性模块在每种情况下可以独立地为结合基团、标记基团、效应器基团或反应性基团。

在一个实施方案中，优选地，所述功能性模块X选自下组：结合基团、标记基团和效应器基团。

在一个实施方案中，基团X是结合基团。如对于本领域技术人员来说显然的，结合基团X会选择为对a’:a和b:b’没有干扰。

结合基团的例子是生物亲和性(bioaffine)结合对的配偶，其能与该生物亲和性结合对的另一配偶特异性相互作用。合适的生物亲和性结合对是半抗原或抗原和抗体；生物素或生物素类似物（如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素）和亲合素或链霉亲合素；糖和凝集素、寡核苷酸和互补的寡核苷酸、受体和配体（例如类固醇激素受体和类固醇激素）。在一个实施方案中，X是结合基团，并且与式I化合物的a’、a、b、b’或S的至少一种共价结合。优选地，生物亲和性结合对的较小配偶，例如生物素或其类似物、受体配体、半抗原或寡核苷酸与如上文限定的a’、a、S、b或b’中的至少一种共价结合。

在一个实施方案中，功能性模块X是选自下组的结合基团：半抗原；生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素；寡核苷酸和类固醇激素。

在一个实施方案中，功能性模块X是反应性基团。所述反应性基团可以选自任何已知的反应性基团，如氨基、硫氢基、羧酸根、羟基、叠氮基、炔基或烯基。在一个实施方案中，所述反应性基团选自马来酰亚胺基、琥珀酰亚氨基、二硫代吡啶基(Dithiopyridyl)、硝基苯基酯、六氟苯基酯。

在一个实施方案中，所述功能性模块X是标记基团。所述标记基团可以选自任何已知的可检测基团。熟练技术人员会选择适合于最佳灵敏度及最少猝灭的标记物数目。

标记基团可以选自任何已知的可检测基团。在一个实施方案中，所述标记基团选自染料如发光标记基团，如化学发光基团（例如吖啶酯或二氧杂环丁烷(dioxetane)或荧光染料例如荧光素、香豆素、罗丹明、嗪(oxazine)、试卤灵(resorufin)、花青(cyanine)、及其衍生物）、发光金属复合物（如钌或铕复合物）、如用于CEDIA（克隆酶供体免疫测定法(Cloned Enzyme DonorImmunoassay)，例如EP 0 061 888）的酶、微粒或纳米颗粒例如胶乳颗粒或金属溶胶、和放射性同位素。

在一个实施方案中，所述标记基团是发光金属复合物，并且化合物具有通式（II）的结构：

[M(L₁L₂L₃)]_n-Y-X_mA （II）

其中M是选自稀土或过渡金属离子的二价或三价金属阳离子，L₁、L₂和L₃是相同或不同的，且表示具有至少两个含氮杂环的配体，其中L₁、L₂和L₃经由氮原子结合金属阳离子，X是经由接头Y共价结合L₁、L₂和L₃配体中至少一种的反应性官能团，n是1至10，优选为1至4的整数，m是1或2，且优选是1，并且A指平衡电荷可能需要的反荷离子。

优选地，金属复合物是发光金属复合物，即在适当激发后经历可检测的发光反应的金属复合物。可以例如通过荧光或通过电化学发光测量检测所述发光反应。此复合物中的金属阳离子是例如过渡金属或稀土金属。优选地，所述金属为钌、锇、铼、铱、铑、铂、铟、钯、钼、锝、铜、铬、或钨。特别优选钌、铱、铼、铬和锇。最优选钌。

配体L₁、L₂和L₃是具有至少两个含氮杂环的配体。优选芳香族杂环如二吡啶基、二吡嗪基(bipyrazyl)、三吡啶基和菲酚基(phenanthrolyl)。特别优选地，配体L₁、L₂和L₃选自二吡啶和菲咯啉(phenanthroline)环系统。

另外，所述复合物可以含有一个或数个反荷离子A以平衡电荷。合适的带负电荷的反荷离子的例子是卤化物、OH-、碳酸根、烃基羧酸根例如三氟乙酸根、硫酸根、六氟磷酸根和四氟硼酸根基团。特别优选六氟磷酸根、三氟乙酸根和四氟硼酸根基团。合适的带正电荷的反荷离子的例子是单价阳离子如碱性金属和铵离子。

在又一个优选的实施方案中，所述功能性模块X是效应器基团。优选的效应器基团是治疗活性物质。

治疗活性物质具有其有效发挥作用的不同方式，例如在抑制癌症方面。它们能通过烷基化、通过交联、或通过对DNA的双链切割来损害DNA模板。其它治疗活性物质能通过嵌入阻断RNA合成。一些药剂是纺锤体毒物，如长春花生物碱，或抑制酶活性的抗代谢物，或激素和抗激素剂。效应器基团X可以选自烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、长春花生物碱、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、亚硝脲、激素和抗激素剂、和毒素。

目前较优选的烷化剂可以以环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、美法仑(Melphalan)、塞替派(Thiotepa)、异环磷酰胺(ifosphamide,ifosfamide)、氮芥例示。

目前较优选的抗代谢物可以以甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、6-硫鸟嘌呤、6-巯嘌呤(6-mercaptopurin)例示。

目前较优选的抗肿瘤抗生素可以以多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idorubicin，idarubicin)、nimitoxantron、更生霉素(dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素和普卡霉素(plicamycin)例示。

目前较优选的纺锤体毒物可以以美登素(maytansine)和美登木素生物碱(maytansinoids)例示，长春花生物碱和表鬼臼毒素可以以长春新碱(vincristin)、长春碱(vinblastin)、长春地辛(vindestin,vindesine)、依托泊苷(Etoposide)、替尼泊苷(Teniposide)例示。

目前较优选的亚硝脲可以以卡莫司汀(carmustin,carmustine)、洛莫司汀(lomustin,lomustine)、司莫司汀(semustin，semustine)、链佐星(streptozocin)例示。

目前较优选的激素和抗激素剂可以以肾上腺皮质类固醇类(adrenocorticorticoids)、雌激素类、抗雌激素类、妊娠素孕酮、芳香酶抑制剂、雄激素类、抗雄激素类例示。

其它优选的随机合成药剂可以以达卡巴嗪(dacarbazin)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、羟基脲、米托坦(mitotane)、丙卡巴肼(procarbazide,procarbazine)、顺铂、卡铂例示。

功能性模块X与例如（a’）、（a）、（b）、（b’）或S的至少一种共价或经由别的结合对结合。所述功能性模块X可以存在一次或数（n）次。（n）是整数，且是1或超过1。优选地，（n）介于1和100之间。还优选（n）是1-50。在某些实施方案中，n是1至10，或1至5。在其它实施方案中，n是1或2。

对于功能性模块X与a’、a、b、b’或S中至少一种的共价结合，可以使用任何合适的偶联化学。熟练技术人员可以容易地从标准方案中选出这类偶联化学。也有可能在合成a’、a、b、b’或S时通过使用合适的构件块掺入功能性模块。

在一个优选的实施方案中，功能性模块X与式I限定的结合剂的a、b、或S结合。

在一个优选的实施方案中，功能性模块X与式I限定的结合剂的间隔物S结合。

在一个优选的实施方案中，功能性模块X与式I限定的结合剂的a、b或S共价结合。

如果功能性模块X位于分别代表a、a’、b或b’的杂交寡核苷酸内，那么优选地，这类功能性模块结合至经修饰的核苷酸或附接于核苷间P原子（WO2007/059816）。将不干扰寡核苷酸杂交的经修饰核苷酸掺入那些寡核苷酸中。优选地，这类经修饰的核苷酸是C5取代的嘧啶或C7取代的7脱氮嘌呤。

可以用非核苷酸实体在内部或在5’或3’端修饰寡核苷酸，所述非核苷酸实体用于引入功能性模块。优选地，这类非核苷酸实体位于间隔物S内，即在两个结合对成员a和b之间。

用于构建间隔物的许多不同非核苷酸修饰剂构件块是文献中已知的，并且很多种是商品化的。对于功能性模块的引入，使用非核苷双功能性修饰剂构件块或非核苷三功能性修饰剂构件块作为用于末端标记的CPG或作为用于内部标记的亚磷酰胺（参见Wojczewski,C.等,Synlett10(1999)1667-1678）。

双功能性修饰剂构件块

双功能性修饰剂构件块将功能性模块或受保护的功能性模块（若必要的话）连接至亚磷酰胺基团以将该构件块在5’端（规则合成）或3’端（倒置合成）附接至生长的寡核苷酸链的末端羟基基团。

优选地，双功能性修饰剂构件块是非核苷化合物。例如，这类经修饰的构件块是C2-C18烷基、烯基、炔基碳链，而所述烷基、烯基、炔基链可以由别的亚乙氧基和/或酰胺模块中断以增加间隔物以及由此整个接头结构的亲水性。也可以使用环状模块如C5-C6环烃基、C4N、C5N、C4O、C5O杂环烃基、苯基（任选地用一个或两个C1-C6烃基基团取代的）作为非核苷双功能性修饰构件块。优选的经修饰的双功能性构件块包含C3-C6烃基模块和三-至六-乙二醇链。下文表III中给出了双功能性修饰剂构件块的非限制性但优选的例子。

表III：

三功能性修饰剂构件块

三功能性构件块连接(i)功能性模块或（若必要的话）受保护的功能性模块，(ii)亚磷酰胺基团，用以在寡核苷酸合成期间将报告物或功能性模块或（若必要的话）受保护的功能性模块与生长的寡核苷酸链的羟基基团偶联，以及(iii)用酸不稳定性保护基，优选用二甲氧三苯甲基保护基保护的羟基基团。在除去此酸不稳定性保护基后，释放出能与别的亚磷酰胺起反应的羟基基团。因此，三功能性构件块允许将功能性模块放置到寡核苷酸内的任意位置。三功能性构件块也是使用固体支持物例如可控多孔玻璃(CPG)合成的前提，其用于寡核苷酸的3’端标记。在此情况下，三功能性构件块经由C2-C18烷基、烯基、炔基碳链连接至功能性模块或（若必要的话）受保护的功能性模块，而所述烷基、烯基、炔基链可以用别的亚乙氧基和/或酰胺模块中断以增加间隔物以及由此整个接头结构的亲水性，并且包含经由可切割的间隔物附接于固相的羟基基团和用酸性不稳定性保护基保护的羟基基团。在除去此保护基后，释放出羟基基团，其然后能与亚磷酰胺起反应。

三功能性构件块可以是非核苷的或核苷的。

非核苷的三功能性构件块是C2-C18烷基、烯基、炔基碳链，而所述烷基、烯基、炔基任选地用别的亚乙氧基和/或酰胺模块中断以增加间隔物以及由此整个接头结构的亲水性。其它三功能性构件块为环状基团如C5-C6环烃基、C4N、C5N、C4O、C5O杂环烃基、苯基，其任选地用一个或两个C1-C6烃基基团取代。环状和非环状基团可以用一个-(C1-C18)烃基-O-PG基团取代，而所述C1-C18烃基包含(亚乙氧基)n、(酰胺)m模块，n和M彼此独立地=0-6，并且PG是酸不稳定性保护基。优选的三功能性构件块是C3-C6烃基、环烃基、C5O杂环烃基模块，其任选地包含一个酰胺键，并且用C1-C6烃基O-PG基团取代，其中PG是酸不稳定性保护基，优选为单甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、pixyl、吨基(xanthyl)，最优选二甲氧三苯甲基。

例如，表IV中汇总了非核苷三功能性构件块的非限制性但优选的例子。

表IV：非核苷三功能性修饰剂构件块的例子

核苷修饰剂构件块：

每当有必要与非修饰的寡核苷酸相比不影响寡核苷酸杂交特性时，使用核苷修饰剂构件块进行内部标记。因此，核苷构件块包含仍然能够与互补碱基杂交的碱基类似物或碱基。在式II中给出了标记化合物的通式，其用于标记依照本发明式I的结合剂中包含的a、a’、b、b’或S中的一种或多种的核酸序列。

式II：

其中PG是酸不稳定性保护基，优选为单甲氧三苯甲基、二甲氧三苯甲基、pixyl、吨基，最优选二甲氧三苯甲基，其中Y是C2-C18烷基、烯基、炔基，其中所述烷基、烯基、炔基可以包含亚乙氧基和/或酰胺模块，其中Y优选为C4-C18烷基、烯基、或炔基，并且含有一个酰胺模块，且其中X是可以与标记物结合的功能性模块。

可以针对这类取代选择特定的碱基位置以使对杂交特性的影响最小化。因此，下列位置对于取代是优选的：a)在天然碱基的情况中：在C5处取代的尿嘧啶；在C5或N4处取代的胞嘧啶；在C8或N6处取代的腺嘌呤以及在C8或N2处取代的鸟嘌呤，和b)在碱基类似物的情况中：在C7处取代的7脱氮A和7脱氮G；在C7处取代的7脱氮8氮杂A和7脱氮8氮杂G；在C7处取代的7脱氮氮杂2氨基A；在N1处取代的假尿嘧啶和在N2处取代的间型霉素。

表V中给出了核苷三功能性构件块的非限制性但优选的例子。

表V：

在表III、IV和V中，双功能性模块的末端氧原子之一或三功能性模块的末端氧原子之一是亚磷酰胺的一部分，其没有完全详细地显示但是对熟练技术人员来说是明显的。三功能性构件块的第二个末端氧原子用酸不稳定性保护基PG保护，如对上述式II限定的。

合成后修饰是将共价结合的功能性模块引入接头或间隔物分子中的另一种策略。在此办法中，通过在固相合成期间使用双功能性或三功能性构件块引入氨基基团。在从支持物切割并纯化后，氨基修饰的寡核苷酸与功能性模块的活化酯或双功能性试剂起反应，所述双功能性试剂中的一个官能团是活性酯。优选的活性酯是NHS酯或五氟苯基酯。

合成后修饰对于引入在固相合成和脱保护期间不稳定的功能性模块是特别有用的。例子是为了Staudinger连接用三苯基膦羧甲基(triphenylphosphincarboxymethyl)酯修饰（Wang,C.C.等,BioconjugateChemistry14(2003)697-701），用洋地黄毒苷修饰或使用商品化磺基SMCC引入马来酰亚胺基团。

在一个实施方案中，所述功能性模块X经由别的结合对与a’、a、b、b’或S中的至少一种结合。

优选地，可以与功能性模块X结合的别的结合对是亮氨酸拉链域或杂交核酸。在功能性模块X经由别的结合对成员与a’、a、b、b’或S中的至少一种结合的情况下，与X结合的结合对成员和结合对a’:a和b:b’分别都选择为具有不同特异性。结合对a:a’、b:b’和与X结合的结合对各自结合其相应的配偶（例如与其杂交）而不干扰任一种其它结合对的结合。

结合对成员与单价结合剂的共价偶联

根据结合剂的生物化学性质，有不同缀合策略。

在结合剂是50至500个氨基酸的天然存在的蛋白质或重组多肽的情况下，教科书中有描述蛋白质缀合物合成化学的标准规程，其是熟练技术人员可以容易地遵循的（Hackenberger,C.P.和Schwarzer,D.,Angew.Chem.,Int.Ed.,47(2008)10030-10074）。

在一个实施方案中，使用马来酰亚胺模块与蛋白质内半胱氨酸残基的反应。在例如使用抗体的Fab或Fab’片段作为单价结合剂的情况下，这是一种优选的偶联化学。或者，在一个实施方案中，实施结合对成员（分别是式I的a’或b’）与结合剂多肽C端末端的偶联。例如，可以如Sunbul,M.等,Organic&Biomolecular Chemistry7(2009)3361-3371）描述的那样实施蛋白质（例如Fab片段）的C端修饰。

一般地，结合对成员与单价多肽结合剂的位点特异性反应和共价偶联基于将天然的氨基酸转化成与蛋白质中存在的其它官能团的反应性具有正交反应性的氨基酸。例如，在罕见的序列背景内的特定半胱氨酸可以酶促转化成醛（参见Formylglycine aldehyde tag-protein engineering through a novelpost-translational modification(Frese,M.-A.等,ChemBioChem10(2009)425-427)）。还有可能通过利用某些酶与给定序列背景中的天然氨基酸的特异性酶促反应性来获得期望的氨基酸修饰（参见例如：Taki,M.等,ProteinEngineering,Design&Selection17(2004)119-126;Gautier,A.等,Chemistry&Biology15(2008)128-136；Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403使用蛋白酶催化的C-N键形成，而Mao,H.等,于J.Am ChemSoc.126(2004)2670-2671使用并且Proft,T.,于Biotechnol.Lett32(2010)1-10综述了分选酶(Sortase)介导的蛋白质连接）。

通过末端氨基酸与合适的修饰剂的选择性反应也可以实现结合对成员对单价多肽结合剂的位点特异性反应和共价偶联。

可以使用N端半胱氨酸与苄腈(benzonitril)的反应性（Ren,Hongjun等,Angewandte Chemie,International Edition48(2009)9658-9662）来实现位点特异性共价偶联。

天然的化学连接也可以依赖于C端半胱氨酸残基（Taylor,E.等,NucleicAcids and Molecular Biology22(2009)65-96）。

EP 1 074 563描述了一种缀合方法，其基于带负电荷的氨基酸区段内的半胱氨酸与位于带正电荷的氨基酸区段中的半胱氨酸的较快反应。

单价结合剂也可以是合成肽或肽模拟物。在化学合成多肽的情况下，可以在这类合成期间掺入具有正交化学反应性的氨基酸（de Graaf,A.J.等,Bioconjugate Chemistry20(2009)1281-1295）。由于极其多种正交官能团是所讨论的且可以引入合成肽中，这类肽与接头的缀合是标准化学。

为了获得单标记的蛋白质，可以通过层析将具有1:1化学计量的缀合物与其它缀合产物分开。通过使用经染料标记的结合对成员和带电荷的间隔物来促进此规程。通过使用这种经标记的且高度带负电荷的结合对成员，单缀合的蛋白质与非标记的蛋白质和携带超过一个接头的蛋白质容易地分开，因为可以利用电荷和分子量的差异进行分离。荧光染料对于从未结合的组分（如经标记的单价结合剂）纯化二价结合剂是有价值的。

因此，在一个实施方案中，优选使用用荧光染料标记（例如在合成期间与双功能性间隔物构件块组合使用双功能性或三功能性修饰剂构件块合成）的结合对成员（分别是式I的a’和/或b’）来形成本发明的二价结合剂。在一个优选的实施方案中，间隔物S以及序列a、a’、b和b’是DNA，并且分别用荧光染料标记a’或b’中的至少一种。在一个优选的实施方案中，间隔物S以及序列a,a’,b和b’是DNA，并且各自用不同荧光染料分别标记a’和b’两者。

在一个实施方案中，公开了生成二价结合剂的方法，所述二价结合剂特异性结合多肽二聚体。所述方法包括以下步骤：a)选择第一单价结合剂，其以5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合第一靶多肽，b)选择第二单价结合剂，其以5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合第二靶多肽，c)通过接头将两个单价结合剂偶联，并d)选择具有3x10^-5/秒或更小的K_解离值的二价结合剂。

使用本发明中公开的方法，现在相当容易生成各种各自包含不同长度的接头的二价结合剂，并选择具有期望结合特性（即K_解离值为3x10^-5/秒或更小）的那些二价结合剂。在一个实施方案中，如实施例2.8中公开的，通过Biacore^TM分析实施具有期望K_解离的二价结合剂的选择。

在一个实施方案中，本发明涉及形成依照本发明的二价结合剂的方法，其中将第一单价结合剂、第二单价结合剂、和接头分别共温育，由此形成具有3x10^-5/秒或更小的K_解离值的二价结合剂，所述第一单价结合剂以10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合第一靶多肽且与第一结合对的成员偶联，所述第二单价结合剂以10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合第二靶多肽且与第二结合对的成员偶联，其中第一和第二结合对彼此不干扰，所述接头包含间隔物以及与第一和第二结合对成员互补的结合对成员。

如熟练技术人员会领会的，K_解离是一项温度依赖性数值。在逻辑上，在同一温度测定两个单价结合剂以及依照本发明的二价结合剂的K_解离值。如会领会，优选地，于会使用二价结合剂（例如会实施测定法）的相同温度测定K_解离值。在一个实施方案中，于室温，即分别于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃建立K_解离值。在一个实施方案中，分别于4或8℃建立K_解离值。在一个实施方案中，于25℃建立K_解离值。在一个实施方案中，于37℃建立K_解离值。在一个实施方案中，于40℃建立K_解离值。在一个优选的实施方案中，于37℃进行K_解离测定，即每个单价结合剂的那些K_解离测定和双重结合剂的K_解离测定。

在一个实施方案中，上述方法进一步包括分离所述二价结合剂的步骤。

形成或装配依照本发明的二价结合剂的优选化学计量是1:1:1。

在一个优选的实施方案中，生成依照本发明的二价结合剂的方法利用L-DNA接头。在一个优选的实施方案中，生成依照本发明的二价结合剂的方法利用由DNA（优选L-DNA）组成的两个特异性结合对，和L-DNA接头。

可以依照现有技术规程通过大小排阻层析分析形成的二价结合剂的形成和化学计量。若期望的话，还可以通过SDS-PAGE分析形成的复合物。

若本发明中公开的二价结合剂具有3x10^-5/秒或更好的K_解离，则其在免疫组织化学染色规程中使用时在这类规程的各个温育步骤期间仅显著结合并且不被洗掉。此K_解离仅可以在两个单价结合剂都结合其相应结合位点的情况下实现。在仅在两个靶多肽之一上存在一个表位的情况下，即在多肽是单体而非二聚体的情况下，不会发现显著染色。如此，且这具有很大的优点，仅会在样品中存在多肽二聚体的情况下观察到免疫组织化学染色。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种组织学染色方法，所述方法包括以下步骤：a)提供细胞或组织样品，b)将所述样品与由两个单价结合剂组成的二价结合剂一起温育，所述两个单价结合剂经由接头彼此连接，其中第一单价结合剂结合第一多肽，第二单价结合剂结合第二多肽，每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，且其中所述二价结合剂具有3x10^-5/秒或更小的K_解离，并c)检测所述二价结合剂，由此针对感兴趣的多肽二聚体将所述样品染色。

依照本发明的二价结合剂在通过免疫组织化学方法对细胞或组织样品染色中的用途代表了又一个优选的实施方案。

更一般来讲，本发明涉及由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成的二价结合剂，该结合剂以满足（自动化）测定系统要求或更佳的K_解离结合靶多肽二聚体，其中(a)第一单价结合剂以高于（自动化）测定系统要求（低）至少10倍的K_解离结合第一靶多肽，(b)第二单价结合剂以高于（自动化）测定系统要求至少10倍的K_解离结合第二靶多肽，且(c)其中两种单价结合剂(a)和(b)的K_解离值的乘积至少是（自动化）测定系统要求的K_解离或更小。

一般而言，描述了用于获得二价结合剂的方法，所述二价结合剂以至少满足（自动化）测定系统的最低测定法要求或更佳的K_解离特异性结合包含两个靶多肽的多肽二聚体，所述方法包括以下步骤：(a)选择以高于（自动化）测定系统的最低测定法需要至少10倍的K_解离第一靶多肽的第一单价结合剂，(b)选择以高于（自动化）测定系统的最低测定法要求至少10倍的K_解离结合第二靶多肽的第二单价结合剂，其中步骤(a)和(b)中的两种单价结合剂的K_解离值的乘积至少是（自动化）系统要求的K_解离或更小，并(c)通过接头偶联这两个单价结合剂。

在一个实施方案中，所述自动化系统是由Ventana Medical Systems Inc.,Tucson销售的BenchMark

分析仪。

提供以下实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中列出。应理解的是，可以在不背离本发明的精神的前提下对所列规程做出修改。

序列表描述

1.抗体片段

SEQ ID NO:1V_H（单抗1.4.168）：

QCDVKLVESG GGLVKPGGSL KLSCAASGFT FSDYPMSWVR QTPEKRLEWV

ATITTGGTYT YYPDSIKGRF TISRDNAKNT LYLQMGSLQS EDAAMYYCTR

VKTDLWWGLA YWGQGTLVTV SA

SEQ ID NO:2V_L（单抗1.4.168）：

QLVLTQSSSA SFSLGASAKL TCTLSSQHST YTIEWYQQQP LKPPKYVMEL

KKDGSHTTGD GIPDRFSGSS SGADRYLSIS NIQPEDESIY ICGVGDTIKE

QFVYVFGGGT KVTVLG

SEQ ID NO:3V_H（单抗8.1.2）：

EVQLQQSGPA LVKPGASVKM SCKASGFTFT SYVIHWVKQK PGQGLEWIGY

LNPYNDNTKY NEKFKGKATL TSDRSSSTVY MEFSSLTSED SAVYFCARRG

IYAYDHYFDY WGQGTSLTVS S

SEQ ID NO:4V_L（单抗8.1.2）：

QIVLTQSPAI MSASPGEKVT LTCSASSSVN YMYWYQQKPG SSPRLLIYDT

SNLASGVPVR FSGSGSVTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQW STYPLTFGAG

TKLELK

2.ssDNA的序列

a)19聚体ssDNA（分别以3’端与抗肌钙蛋白T单抗b的Fab’或针对磷酸化IGF-1R的Fab’8.1.2共价结合）

5’-A GTC TAT TAA TGC TTC TGC-3’（SEQ ID NO:5）

b)17聚体ssDNA（分别以5’端与抗肌钙蛋白T单抗a的Fab’或针对IGF-1R的Fab’1.4.168共价结合）

5’-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’（SEQ ID NO:6）

c)互补的19聚体ssDNA（用作接头的一部分）

5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-3’（SEQ ID NO:7）

d)互补的17聚体ssDNA（用作接头的一部分）

5’-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（SEQ ID NO:8）

3.肌钙蛋白T表位的序列

SEQ ID NO:9=ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAE酰胺，其中U代表β-丙氨酸。（表位“A”针对抗体抗肌钙蛋白抗体a）

SEQ ID NO:10=SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKE酰胺，其中O代表氨基-三氧杂-辛酸。（表位“B”针对抗体抗肌钙蛋白抗体b）

4.IGF-1R/IR表位的序列

SEQ ID NO:11=FDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSST；IGF-1R(1340-1366)

SEQ ID NO:12=YEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS；hIR(1355-1382)

5.蛋白质接头和标签序列

SEQ ID NO:13=GGGGS基序（例如作为多肽接头的一部分）

SEQ ID NO:14=YPYDVPDYA（HA标签）

SEQ ID NO:15=GLNDIFEAQKIEWHE（Avi标签）

6.用于将二价结合剂汇编到多肽同二聚体的序列

SEQ ID NO:16=ACC TGC TGC TAT CTT GA；此寡核苷酸在5’端用FAM标记并且为了偶联经修饰以在3’端携带马来酰亚氨基。

SEQ ID NO:17=G CAG AAG CAT TAA TAG AC-T(生物素)-TGG ACG ACGATA GAA CT；接头寡核苷酸

SEQ ID NO:18=GTC TAT TAA TGC TTC TGC-C3-TGG ACG ACG ATAGAA CT；衔接头寡核苷酸

7.在用于免疫组化的针对HER2/HER3异二聚体的双重结合剂中使用的序列

SEQ ID NO:19=

EFEVQLQESGGGLVQPKGSLQLSCAASGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLE

WVARIRTESSDYATDYADSVKDRFIISRDDSQNMLYLQMNNLKSEDTAIY

YCVRSSGFDYWGQGTTLTVSSS；7.2.32可变区重链（HC）

SEQ ID NO:20=

DIQMTQSPSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHDNGNTYLHWFLQKPGQSPKL

LIYKVSNRFSGVPDRFGGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYFCSQGTHVPTF

GGGTKLEIK；7.2.32可变区轻链（LC）

SEQ ID NO:21=

EVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCRPSGYTFTDYNMHWVKQSHEKSLEWI

GYINPKNGIISYNQKFKDKATLTVNKSSRTAYMELRSLTSEDSAVYFCAGD

YWGQGTSVTVSS；4.1.43可变区重链（HC）

SEQ ID NO:22=

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPK

LLISKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSIHLPWT

FGGGTKLEIK；4.1.43可变区轻链（LC）

SEQ ID NO:23=KLLPETGGGSGS；分选酶切割标签

SEQ ID NO:24=

MGLFCSHPGDPLATTMGWSCIILFLVATATGVHSEFEVQLQESGGGLVQPK

GSLQLSCAASGFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRTESSDYATDYAD

SVKDRFIISRDDSQNMLYLQMNNLKSEDTAIYYCVRSSGFDYWGQGTTLT

VSSSKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSS

SVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLKL

(GGGGS)_XYPYDVPDYA(GGGGS)_XGTEVQLQQSGPVLVKPGASVKMSCRP

SGYTFTDYNMHWVKQSHEKSLEWIGYINPKNGIISYNQKFKDKATLTVN

KSSRTAYMELRSLTSEDSAVYFCAGDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLA

PGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLY

TLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKI；HC双重结合剂，X=1、2、3或4并且指示氨基酸序列基序Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（=GGGGS或G4S）存在1、2、3或4次。

SEQ ID NO:25=WDQDPPERGAPPST；人HER2(1223-1236)

SEQ ID NO:26=PLHPVPIMPTAGTTPDEDYEYMNRQR；人HER3(1242-1267)

SEQ ID NO:27=5’-(Gly)₄-氨基接头-(间隔物C3)3-AGT TCT ATC GTC GTCCA-荧光素-3’；17聚体寡聚体

SEQ ID NO:28=5’-荧光素-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(间隔物C3)3-氨基接头-`-(Gly)₄-3’；19聚体寡聚体

附图简述

图1 评估抗pIGF1-R双重结合剂装配效率的分析性凝胶过滤实验。图a、b和c显示了各种双重结合剂组分的洗脱谱（荧光素-ssFab’1.4.168，Cy5-ssFab’8.1.2和接头DNA（T=0）；ssFab’表示与单链寡核苷酸缀合的Fab’片段）。图d显示了在已经将形成二价结合剂需要的3种组分以1:1:1摩尔比混合后的洗脱谱。较粗的（底部）曲线代表在280nm处测量的吸光度，分别指示ssFab’蛋白质或接头DNA的存在。b）和d）中较细的顶部曲线（495nm处的吸光度）指示荧光素的存在，而a）中较细的顶部曲线和d）中的中部曲线（635nm处的吸光度）指示Cy5的存在。单一的双重结合剂组分的洗脱体积（VE_ssFab’ _1.4.168约15ml；VE_{ssFab’8.1.2}约15ml；VE_接头约16ml）与反应混合物的洗脱体积（VE_混合物约12ml）的比较表明双重结合剂装配反应是成功的（产率：约90%）。代表洗脱的双重结合剂的280nm主峰与495nm和635nm通道中的主峰很好地重叠，从而证明代表二价结合剂的峰中ssFab’8.1.2和ssFab’1.4.168两者的存在。

图2 Biacore^TM实验的示意图。示意性且例示性显示了溶液中的两种结合分子：T0-T-Dig（接头16）二价结合剂和T40-T-Dig（接头15）二价结合剂。这两种二价结合剂仅在其接头长度上不同（在两个杂交核酸序列之间中部洋地黄毒苷化的T，没有额外的T对40个额外的T（中部T-Dig每侧20个））。此外，使用ssFab’片段8.1.2和1.4.168。

图3 具有3种动力学的覆盖图的Biacore^TM传感图，其显示了与100nM ssFab’1.4.168或100nM ssFab’8.1.2对同一肽的结合特征相比100nM二价结合剂与固定化的肽pIGF-1R的相互作用，所述二价结合剂由在T40-T-Dig ssDNA接头（即接头15）上杂交的ssFab’8.1.2和ssFab’1.4.168组成。用双重结合剂构建体获得最高结合性能，这清楚地显示双重结合剂的协同结合效应提高对靶肽pIGF-1R的亲和力。

图4 具有3种动力学的覆盖图的Biacore^TM传感图，其显示了二价结合剂与固定化的肽pIGF-1R（磷酸化的IGF-1R）、IGF-1R或pIR（磷酸化的胰岛素受体）的相互作用，所述二价结合剂由在T40-T-Dig ssDNA接头（即接头15）上杂交的ssFab’8.1.2和ssFab’1.4.168组成。用pIGF-1R肽获得最高结合性能，这清楚地显示与例如磷酸化的胰岛素受体肽（pIR）相比，双重结合剂的协同结合效应提高对靶肽pIGF-1R的特异性。

图5 具有2种动力学的覆盖图的Biacore^TM传感图，其显示了100nM二价结合剂、以及没有接头DNA的100nM ssFab’8.1.2和100nM ssFab’1.4.168混合物的相互作用，所述二价结合剂由在T40-T-Dig ssDNA接头（即接头15）上杂交的ssFab’8.1.2和ssFab’1.4.168组成。仅用二价结合剂获得最佳结合性能，而没有接头的ssFab’混合物未显示可观察到的协同结合效应，尽管事实上这些ssFab’的总浓度已为200nM。

图6 Biacore^TM夹心式测定法的示意图。已经将此测定法用于调查这两种抗体在磷酸化的IGF-1R肽上的表位可达性。<MIgGFcy>R呈现了用于捕捉鼠抗体M-1.4.168的家兔抗小鼠抗体。然后，将M-1.4.168用于捕捉pIGF-1R肽。最后，M-8.1.2形成由M-1.4.168、所述肽和M-8.1.2组成的夹心物。

图7 Biacore^TM传感图，其显示了二抗8.1.2对pIGF-1R肽在这被Biacore^TM芯片上的抗体1.4.168捕获后的结合信号（粗线）。其它信号（细线）是对照信号：分别给出从上到下500nM8.1.2、500nM1.4.168；500nM靶物无关抗体<CKMM>M-33-IgG；和500nM靶物无关对照抗体<TSH>M-1.20-IgG的线。在任一种这些对照中没能检测出结合事件。

图8 Biacore^TM测定法的示意图，其呈现了传感器表面上的生物素化的双重结合剂。在流动池1（=FC1）（未显示）上捕获氨基-PEO-生物素。在FC2、FC3和FC4上将具有递增的接头长度的二价结合剂固定化（分别显示了在FC2（T0-bi=仅1个中部T-Bi）和FC4（T40-bi=1个中部T-Bi和上下游各20个T）上的双重结合剂）。分析物1：在肽的右手端含有M-1.4.168ssFab’表位的IGF-1R肽（顶部线），不存在M-8.1.2ssFab’磷酸表位，因为此肽不是磷酸化的；分析物2：含有M-8.1.2ssFab’磷酸表位（P）和M-1.4.168ssFab’表位的pIGF-1R肽（第二条线）；分析物3：pIR肽，其含有交叉反应性M-8.1.2ssFab’磷酸表位，但不含M-1.4.168的表位（第三条线）。

图9 双重结合剂实验的动力学数据。具有ssFab’8.1.2和ssFab’1.4.168的T40-T-Bi接头双重结合剂（=图中的T40）显示在与pIR（kd=3.70E-02/s）相比时低1300倍的对pIGF-1R的解离速率（kd=2.79E-05/s）。

图10 Biacore^TM传感图，其显示了T40-T-Bi双重结合剂对pIGF-1R肽（磷酸化的IGF-1R肽）的浓度依赖性测量。测定法设置如图8中绘出。以30nM、10nM、2次3.3nM、1.1nM、0.4nM、0nM注射pIGF-1R肽的浓度系列。在图9的表中给出了相应的数据。

图11 Biacore^TM传感图，其显示了T40-T-Bi双重结合剂对IGF-1R肽（非磷酸化的IGF-1R肽）的浓度依赖性测量。测定法设置如图8中绘出。以300nM、100nM、2次33nM、11nM、4nM、0nM注射IGF-1R肽的浓度系列。在图9的表中给出了相应的数据。

图12 Biacore^TM传感图，其显示了T40-T-Bi双重结合剂对pIR肽（磷酸化的胰岛素受体肽）的浓度依赖性测量。测定法设置如图8中绘出。以100nM、2次33nM、11nM、4nM、0nM注射pIR肽的浓度系列。在图9绘出的表中给出了相应的数据。

图13 结合IGF1受体的双重结合剂。将单抗1.4.168的两个Fab’片段与单链DNA缀合并与衔接头DNA和接头DNA杂交。如绘出的，接头DNA携带能够在免疫组化染色中检出的生物素标记。

图14 通过双重结合剂对IGF1受体的IHC检测。双重结合剂（1μg/mL）将稳定转染的表达IGF1受体的NIH3T3细胞染色（A）。无衔接头DNA的阴性（单价）对照（Fab’-ssDNA）被洗去且并不将细胞染色（B）。

图15用于HER2/HER3异二聚体检测的双重结合剂。所述双重结合剂由两个Fab片段组成，一个识别HER2（=本图中的<Her2>），一个识别HER3（=本图中的<Her3>）。通过由血凝素标签（HA）和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（G4S）氨基酸残基基序单元组成的肽接头将Fab片段连接起来。通过引入数个G4S单元（x=1、2、3、4……）可以容易地改变接头长度以优化用于二聚体检测的Fab片段之间的距离。实施例4中使用的双重结合剂具有两个G4S单元（x=1）。

实施例

实施例1：针对肌钙蛋白T的二价结合剂

1.1单克隆抗体和Fab’片段

使用在不同的、无重叠的表位（分别为表位A’和表位B’）结合人心脏肌钙蛋白T的两种单克隆抗体。在目前的Roche Elecsys^TM肌钙蛋白T测定法中使用这两种抗体，其中以夹心式免疫测定法形式检测肌钙蛋白T。

使用蛋白质化学的现有技术方法实施从培养上清液纯化单克隆抗体。

用预活化的木瓜蛋白酶（抗表位A’单抗）或胃蛋白酶（抗表位B’单抗）对纯化的单克隆抗体进行蛋白酶消化，得到F(ab’)₂片段，随后于37℃用低浓度的半胱胺(cysteamin)将其还原成Fab’片段，即分别为通式I（A-a’:a-S-b:b’-B）中的A和B。通过在Sephadex G-25柱（GE Healthcare）上将半胱胺与含有多肽的样品部分分开来停止反应。

1.2Fab’片段与ssDNA寡核苷酸的缀合

将Fab’片段分别与下文描述的活化的ssDNAa和ssDNAb寡核苷酸缀合。

分别制备Fab’片段-ssDNA缀合物A’’和B’’：

a)Fab’-抗肌钙蛋白T<表位A’>-ssDNA缀合物（=A’’）

对于Fab’-抗肌钙蛋白T<表位A’>-ssDNAa缀合物A’’的制备，使用SED IDNO:5的衍生物，即5’-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C(=SEQ IDNO:5)-XXX-Y-Z-3’，其中X=经由亚磷酰胺C3（3-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research））引入的亚丙基-磷酸酯，其中Y=经由3’-氨基修饰剂TFA氨基C-6lcaa CPG（ChemGenes）引入的3’-氨基修饰剂C6，且其中Z=经由磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚氨甲基]环己烷-1-羧酸酯（ThermoFischer）引入的4[N-马来酰亚氨甲基]环己烷-1-羧基。

b)Fab’-抗肌钙蛋白T<表位B’>-ssDNAb缀合物（=B’’）

对于Fab-抗肌钙蛋白T<表位B’>-ssDNA缀合物（B’’）的制备，使用SEQID NO:6的衍生物，即5’-Y-Z-XXX-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3’，其中X=经由亚磷酰胺C3（3-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research））引入的亚丙基-磷酸酯，其中Y=经由6-(4-单甲氧基三苯甲氨基(Monomethoxytritylamino))己基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺（Glen Research）引入的5’-氨基修饰剂C6，且其中Z=经由磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚氨甲基]环己烷-1-羧酸酯（ThermoFischer）引入的4[N-马来酰亚氨甲基]环己烷-1-羧基。

已经通过现有技术寡核苷酸合成方法分别合成SEQ ID NO:5或6的寡核苷酸。经由Y的氨基基团与在固相寡核苷酸合成过程期间掺入的Z的琥珀酰亚胺基基团的反应完成马来酰亚氨基团的引入。

上文显示的单链DNA构建体携带硫醇反应性马来酰亚氨基团，其与通过半胱胺处理生成的Fab’铰链区的半胱氨酸起反应。为了获得高百分比的单标记的Fab’片段，将ssDNA与Fab’片段的相对摩尔比保持较低。通过阴离子交换层析（柱：MonoQ,GE Healthcare）发生对单标记的Fab’片段（ssDNA:Fab’=1:1）的纯化。通过分析性凝胶过滤层析和SDS-PAG实现有效标记和纯化的验证。

1.3生物素化的接头分子

通过现有技术寡核苷酸合成方法并采用用于生物素化的经生物素化的亚磷酰胺试剂，已经合成了分别在ssDNA接头L1、L2和L3中使用的寡核苷酸。

接头1（=L1），一种没有间隔物的经生物素化的ssDNA接头1，具有以下组成：

5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T(生物素-dT)-TGG ACG ACG ATAGAA CT-3’。它分别包含SEQ ID NO:7和8的ssDNA寡核苷酸，并且通过使用生物素-dT(=T-Bi)(5’-二甲氧基三苯甲氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯酰基)-生物素基)-氨己基)-3-丙烯酰亚氨]-2’-脱氧尿苷-3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research）生物素化。

接头2（=L2），一种具有基于胸苷的11聚体间隔物的经生物素化的ssDNA，具有以下组成：

5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(生物素-dT)-T5TGG ACG ACGATA GAA CT-3’。它分别包含SEQ ID NO:7和8的ssDNA寡核苷酸、2次各为5个胸苷的寡核苷酸区段，并通过在间隔物中部使用生物素-dT(5’-二甲氧基三苯甲氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯酰基)-生物素基)-氨己基)-3-丙烯酰亚氨]-2’-脱氧尿苷-3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research）生物素化。

接头3（=L3），一种具有基于胸苷的31聚体间隔物的经生物素化的ssDNA接头3，具有以下组成：

5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(生物素-dT)-T15TGG ACGACG ATA GAA CT-3’。它分别包含SEQ ID NO:7和8的ssDNA寡核苷酸、2次各15个胸苷的寡核苷酸区段，并通过使用生物素-dT(5’-二甲氧基三苯甲氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯酰基)-生物素基)-氨己基)-3-丙烯酰亚氨]-2’-脱氧尿苷-3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research）生物素化。

1.4单价肌钙蛋白T结合剂A和B分别的表位

已经构建了合成肽，其个别分别对自抗肌钙蛋白T抗体a和b衍生的相应Fab’片段仅具有中等亲和力。

a)抗体a的表位A’包含于：

SEQ ID NO:9=ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAE酰胺，其中U代表β-丙氨酸。

b)抗体b的表位B’包含于：

SEQ ID NO:10=SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKE酰胺，其中O代表氨基-三氧杂-辛酸。

如熟练技术人员会领会的，有可能将这两种含有表位的肽以两种方式组合，并且已经通过线性组合表位A’和B’设计并制备了这两种变体。已经通过现有技术肽合成方法分别制备两种变体的序列，即表位A’-B’（=TnT-1）和B’-A’（=TnT-2）的线性序列。

与人心脏肌钙蛋白T序列（P45379/UniProtKB）上的初始表位相比已经分别修饰了表位A’和B’的序列以降低针对其的每种Fab的结合亲和力。在这些情况下，异二价结合效应的动力学是可见得更好的，例如通过用Biacore^TM技术分析结合亲和力实现。

1.5生物分子相互作用分析

对于此实验，于T=25℃使用Biacore^TM3000仪（GE Healthcare），Biacore^TMSA传感器嵌入该系统中。以100μl/分钟用50mM NaOH中的1M NaCl的3次1分钟注射和1分钟10mM HCl完成预条件化。

使用HBS-ET（10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05%Tween20）作为系统缓冲液。样品缓冲液与系统缓冲液相同。

在控制软件V1.1.1下驱动Biacore^TM3000系统。用7RU D-生物素使流动池1饱和。在流动池2上，将1063个RU的生物素化的ssDNA接头L1固定化。在流动池3上，将879个RU的生物素化的ssDNA接头L2固定化。在流动池4上，捕捉674个RU的生物素化的ssDNA接头L3。

然后，以600nM注射Fab’片段DNA缀合物A’’。将Fab’片段DNA缀合物B’’以900nM注射到系统中。将所述缀合物以2μl/分钟的流速注射3分钟。连续注射所述缀合物以监测每种Fab’片段DNA缀合物在其相应接头上的相应饱和信号。用单一Fab’片段DNA缀合物A’’、单一Fab’片段DNA缀合物B’’和存在于相应接头上的两种Fab’片段DNA缀合物A’’和B’’驱动Fab’组合。在已经通过Fab’片段DNA缀合物使接头饱和后产生稳定的基线，这是进一步动力学测量的先决条件。

将人工肽分析物TnT-1和TnT-2作为分析物以溶液注射到系统中以与表面呈现的Fab’片段相互作用。

以500nM注射TnT-1，以900nM的分析物浓度注射TnT-2。两种肽都以50μl/分钟注射4分钟结合时间。监测解离5分钟。通过在所有流动池上以50μl/分钟注射50mM NaOH1分钟完成再生。

使用Biaevaluation软件（V.4.1）测定动力学数据。依照线性朗缪尔1:1拟合模型来测定TnT-1和TnT-2肽自相应的表面呈现的Fab’片段组合的解离速率kd(1/s)。根据一级动力学方程：ln(2)/(60xkd)的解答来计算按分钟计的复合物半衰期。

结果：

表1和2中给出的实验数据分别表明分别与单价dsDNA Fab’A’’或B’’缀合物相比分析物（TnT-1或TnT-2）和各种异二价Fab’-Fab’二聚体A’’-B’’之间的复合物稳定性升高。在每张表中与第2行和第3行相比在第1行中看到此效果。

表1：使用TnT-1及各种长度的接头的分析数据

a)接头L1

Fab’片段DNA缀合物A’’	Fab’片段DNA缀合物B’’	kd(1/s)	t1/2解离(分)
				x	x	6.6E-03	1.7
x	-	3.2E-02	0.4
				-	x	1.2E-01	0.1

b)接头L2

Fab’片段DNA缀合物A’’	Fab’片段DNA缀合物B’’	kd(1/s)	t1/2解离(分)
				x	x	4.85E-03	2.4
x	-	2.8E-02	0.4
				-	x	1.3E-01	0.1

c)接头L3

Fab’片段DNA缀合物A’’	Fab’片段DNA缀合物B’’	kd(1/s)	t1/2解离(分)
				x	x	2.0E-03	5.7
x	-	1.57E-02	0.7

-

x

1.56E-02

0.7

表2：使用TnT-2及各种长度的接头的分析数据

a)接头L1

Fab’片段DNA缀合物A’’	Fab’片段DNA缀合物B’’	kd(1/s)	t1/2解离(分)
				x	x	1.4E-02	0.8
x	-	4.3E-02	0.3
				-	x	1.4E-01	0.1

b)接头L2

Fab’片段DNA缀合物A’’	Fab’片段DNA缀合物B’’	kd(1/s)	t1/2解离(分)
				x	x	4.9E-03	2.3
x	-	3.5E-02	0.3
				-	x	1.3E-01	0.1

c)接头L3

Fab’片段DNA缀合物A’’	Fab’片段DNA缀合物B’’	kd(1/s)	t1/2解离(分)
				x	x	8.0E-03	1.5
x	-	4.9E-02	0.2
				-	x	3.2E-01	0.04

亲合效应还取决于接头的长度。在表1下显示的子表中，即对于人工分析物TnT-1，包含31聚体间隔物的接头L3显示出最低的解离速率或最高的复合物稳定性。

在表2下显示的子表中，包含11聚体间隔物的接头L2对于人工分析物TnT-2显示出最低的解离速率或最高的复合物稳定性。

这些数据共同证明，本发明中给出的方法固有的接头长度灵活性具有很大的效用和优点。

实施例2：针对磷酸化IGF-1R的二价结合剂

2.1单克隆抗体开发（单抗8.1.2和单抗1.4.168）

a)小鼠的免疫

在第0、3、6、9周分别将BALB/C小鼠免疫。每次免疫使用100μg包含磷酸化肽pIGF-1R(1340-1366)（SEQ ID NO:11）的缀合物。此肽在第1346位酪氨酸处已经被磷酸化（=1346-pTyr），并且经由C端半胱氨酸与KLH偶联（=Aoc-Cys-MP-KLH-1340）以得到用于免疫的缀合物。在第0周和第6周分别在腹膜内实施免疫，在第3周和第9周，分别在小鼠身体各部位皮下实施免疫。

b)融合和克隆

依照Galfre G.和Milstein C.,Methods in Enzymology73(1981)3-46，将经免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。在此过程中，将经免疫小鼠的约1x10⁸个脾细胞与2x10⁷个骨髓瘤细胞a（P3X63-Ag8653，ATCC CRL1580）混合，并离心（以250g且于37℃持续10分钟）。然后，用无胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基将细胞清洗一次，并在50ml锥形管中以250g再次离心。弃去上清液，通过轻敲使细胞沉降物温和地松散，添加1ml PEG（分子量4000，Merck，Darmstadt），并通过移液混合。在37℃水浴中温育1分钟后，在4-5分钟的时段内于室温逐滴加入5ml无FCS的RPMI1640。再用10ml无FCS的RPMI1640重复此步骤。然后，添加25ml含有10%FCS的RPMI1640，接着是于37℃、5%CO₂持续30分钟的温育步骤。在以250g且于4℃离心10分钟后，将沉降的细胞在含有10%FCS的RPMI1640培养基中吸出，并在次黄嘌呤-重氮丝氨酸选择培养基（在RPMI1640+10%FCS中100mmol/l次黄嘌呤、1μg/ml重氮丝氨酸）中接种。将100U/ml的白介素6添加至培养基作为生长因子。7天后，用新鲜培养基更换该培养基。在第10天，对原代培养物测试特定抗体。依靠荧光激活细胞分选器在96孔细胞培养板中克隆阳性原代培养物。

c)从细胞培养上清液分离免疫球蛋白

将获得的杂交瘤细胞以1x10⁷个细胞的密度在CELLine 1000 CL烧瓶（Integra）中接种。一周两次收集含有IgG的杂交瘤细胞上清液。产率范围通常为每1ml上清液介于400μg和2000μg之间的单克隆抗体。使用蛋白质化学的常规方法（例如依照Bruck,C.,Methods in Enzymology121(1986)587-695）实施从培养物上清液纯化抗体。

2.2合成可杂交的寡核苷酸

依照标准方法合成下列氨基修饰的前体，其分别包含在SEQ ID NO:5和6中给出的序列。下面给出的寡核苷酸不仅包含所谓的氨基接头，而且还包含荧光染料。如熟练技术人员会容易领会的，此荧光染料非常便于促进寡核苷酸本身以及包含它们的组分的纯化。

a)5’-荧光素-AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(间隔物C3)3-C7氨基接头-；

b)5’-Cy5AGT CTA TTA ATG CTT CTG C-(间隔物C3)3-C7氨基接头-；

c)5’-氨基接头-(间隔物C3)3-AGT TCT ATC GTC GTC CA-荧光素-3’；

d)5’-荧光素-(βL AGT CTA TTA ATG CTT CTG C)-(间隔物C3)3-C7氨基接头-；（βL指示这是L-DNA寡核苷酸）和

e)5’-氨基接头-(间隔物C3)3-(βL-AGT TCT ATC GTC GTC CA)-荧光素-3’（βL指示这是L-DNA寡核苷酸）。

在ABI394合成仪上以10μmol规模以三苯甲基开启（对于5’氨基修饰）或三苯甲基关闭（对于3’氨基修饰）模式实施合成，其使用商品化的CPG作为固体支持物和标准的dA(bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺（SigmaAldrich）进行。

使用下列亚酰胺（酯）(amidite)、氨基修饰剂和CPG支持物在寡核苷酸合成期间分别引入C3间隔物、染料和氨基模块：

间隔物亚磷酰胺C3(3-(4,4’-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research）；

通过使用5’-氨基修饰剂C6(6-(4-单甲氧基三苯甲氨基)己基-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺（Glen Research）引入5’氨基修饰剂；

5’-荧光素亚磷酰胺6-(3’,6’-二特戊酰荧光素基(dipivaloylfluoresceinyl)-6-羰酰胺基(carboxamido))-己基-1-O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺（Glen Research）；

Cy5^TM亚磷酰胺1-[3-(4-单甲氧基三苯甲氧基)丙基]-1’-[3-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基亚磷酰胺基(phosphoramidityl)]丙基]-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羰花青氯化物(tetramethylindodicarbocyanine chloride)（Glen Research）；

LightCycler荧光素CPG500A（Roche Applied Science）；和

3’-氨基修饰剂TFA氨基C-6lcaa CPG500A（Chemgenes），

对于经Cy5标记的寡核苷酸，使用dA(tac)、dT、dG(tac)、dC(tac)亚磷酰胺（Sigma Aldrich），并于室温用33%氨水实施脱保护2小时。

通过使用β-L-dA(bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺（Chemgenes）合成L-DNA寡核苷酸。

通过两步规程实施经荧光素修饰的可杂交寡核苷酸的纯化：首先在反相HPLC上纯化寡核苷酸（Merck-Hitachi-HPLC；RP-18柱；梯度系统[A：0.1M(Et3NH)OAc(pH7.0)/MeCN95:5；B：MeCN]：3分钟，A中的20%B，12分钟，A中的20-50%B和25分钟，A中的20%B，流速为1.0ml/分钟，在260nm处检测）。将含有期望产物的级分（通过分析性RP HPLC监测）合并，并蒸发至干燥。（通过与20%醋酸一起温育20分钟将在5’端用单甲氧三苯甲基保护的烃基氨基基团修饰的寡核苷酸脱三苯甲基化）。将含有荧光素作为标记物的寡聚物通过在HPLC上的IEX层析再次纯化[Mono Q柱：缓冲液A：氢氧化钠（10mM/l；pH约12）；缓冲液B：1M溶解于氢氧化钠（10mM/l；pH约12）中的氯化钠，梯度：30分钟中从100%缓冲液A至100%缓冲液B，流动1ml/分钟，在260nm处检测]。通过透析将产物脱盐。

在反相HPLC上首次纯化（Merck-Hitachi-HPLC；RP-18柱；梯度系统[A：0.1M(Et3NH)OAc(pH7.0)/MeCN95:5；B：MeCN]：3分钟，A中的20%B，12分钟，A中的20-50%B和25分钟，A中的20%B，流速为1.0ml/分钟，在260nm处检测）后使用经Cy5标记的寡聚物。通过透析将寡聚物脱盐，并在Speed-Vac蒸发器上冻干以产生固体，将其于-24℃冷冻。

2.3可杂交寡核苷酸的活化

将来自实施例2的氨基修饰的寡核苷酸在0.1M硼酸钠缓冲液pH8.5缓冲液中溶解（c=600μmol），并与在来自Thermo Scientific的、在DMF中溶解的、18倍摩尔过量的磺基SMCC（磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚氨甲基]环己烷-1-羧酸酯（c=3mg/100μl）起反应。将反应产物对水彻底透析以除去磺基SMCC的水解产物4-[N-马来酰亚氨甲基]环己烷-1-羧酸酯。

通过蒸发将透析液浓缩，并直接用于与包含硫醇基团的单价结合剂缀合。

2.4合成在两端都包含可杂交寡核苷酸的接头寡核苷酸

通过标准方法在ABI394合成仪上以10μmol规模以三苯甲基开启模式，使用商品化dT-CPG作为固体支持物并使用标准的dA(bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺（Sigma Aldrich）来合成寡核苷酸。

通过使用商品化βL-dT-CPG作为固体支持物和β-L-dA(bz)、dT、dG(iBu)和dC(Bz)亚磷酰胺（Chemgenes）合成L-DNA寡核苷酸。

如实施例2.3下描述的，在反相HPLC上实施寡核苷酸纯化。将含有期望产物的级分（通过分析性RP HPLC分析/监测）合并，并蒸发至干燥。通过与80%醋酸一起温育15分钟实施脱三苯甲基化。通过蒸发除去醋酸。将剩余物在水中溶解，并冻干。

使用下列亚酰胺（酯）和CPG支持物在寡核苷酸合成期间引入C18间隔物、洋地黄毒苷和生物素基团：

间隔物亚磷酰胺18(18-O-二甲氧基三苯甲基六乙二醇(Dimethoxytritylhexaethyleneglycol)，1-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research）；

生物素-dT(5’-二甲氧基三苯甲氧基-5-[N-((4-叔-丁基苯酰基)-生物素基)-氨己基]-3-丙烯酰亚氨]-2’-脱氧尿苷-3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺（Glen Research）；

生物素亚磷酰胺1-二甲氧基三苯甲氧基-2-(N-生物素基-4-氨基丁基)-丙基-3-O-(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺和

5’-二甲氧基三苯甲基-5-[N-(三氟乙酰氨基己基)-3-丙烯酰亚氨]-2’-脱氧尿苷，3’-[(2-氰乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺，用于氨基修饰和用洋地黄毒苷-N-羟基-琥珀酰亚胺基酯的后标记(postlabeling)。

合成下列桥接构建体或接头：

接头1：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’

接头2：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T40)-TGG ACG ACG ATA GAACT-3’

接头3：5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(生物素-dT)-TGG ACGACG ATA GAA CT-3’

接头4：5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T5-(生物素-dT)-T5-TGGACG ACG ATA GAA CT-3’

接头5：5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(生物素-dT)-T20-TGGACG ACG ATA GAA CT-3’

接头6：5’-[B-L]G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T30-(生物素-dT)-T30-TGGACG ACG ATA GAA CT-3’

接头7：5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T5-(生物素-dT)-T5TG GAC GACGAT AGA ACT-3’

接头8：5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T10-(生物素-dT)-T10TGG ACGACG ATA GAA CT-3’

接头9：5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T15-(生物素-dT)-T15TGG ACGACG ATA GAA CT-3’

接头10：5’-GCA GAA GCA TTA ATA GAC T T20-(生物素-dT)-T20TGG ACGACG ATA GAA CT-3’

接头11：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-间隔物C18-(生物素-dT)-间隔物C18-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’

接头12：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔物C18)2-(生物素-dT)-(间隔物C18)2-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’

接头13：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔物C18)3-(生物素-dT)-(间隔物C18)3-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’

接头14：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(间隔物C18)4-(生物素-dT)-(间隔物C18)4-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’

接头15：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T20-(Dig-dT)-T20-TGG ACGACG ATA GAA CT-3’

接头16：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(Dig-dT)-TGG ACG ACG ATAGAA CT-3’

接头17：5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-(生物素-dT)-TGG ACG ACGATA GAA CT-3’

上述桥接构建体例子包含至少第一可杂交寡核苷酸和第二可杂交寡核苷酸。接头3至17分别在可杂交核酸区段外包含中部生物素化的或洋地黄毒苷化的胸苷，或由上文给出的长度的胸苷单元组成的间隔物。

分别地，5’可杂交寡核苷酸对应于SEQ ID NO:7，而3’可杂交寡核苷酸对应于SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:7的寡核苷酸会容易与SED ID NO:5的寡核苷酸杂交。SEQ ID NO:8的寡核苷酸会容易与SED ID NO:6的寡核苷酸杂交。

在上述桥接构建体例子中，[B-L]指示给出L-DNA寡核苷酸序列；间隔物C18、生物素和生物素dT分别指如自上文给定的构件块衍生的C18间隔物、生物素和生物素-dT；而带数字的T指示在给定位置处掺入接头中的胸苷残基的数目。

2.5双重结合剂构建体的装配

A)切割IgG并用ssDNA标记Fab’片段

在蛋白酶胃蛋白酶的帮助下切割纯化的单克隆抗体，产生F(ab’)₂片段，随后通过于37℃用低浓度的半胱胺处理将其还原成Fab’片段。经由在PD10柱上分离半胱胺停止反应。如依照实施例3生成的，用活化的寡核苷酸标记Fab’片段。此单链DNA（=ssDNA）携带硫醇反应性马来酰亚氨基团，其与Fab’铰链区的半胱氨酸起反应。为了获得高百分比的单标记的Fab’片段，将ssDNA与Fab’片段的相对摩尔比保持较低。通过离子交换层析（柱：Source15Q PE4.6/100，Pharmacia/GE）发生单标记的Fab’片段（ssDNA:Fab’=1:1）的纯化。通过分析性凝胶过滤和SDS-PAGE实现有效纯化的确认。

B)抗pIGF-1R双重结合剂的装配

抗pIGF-1R双重结合剂基于靶向IGF-1R胞内域的不同表位的两种Fab’片段：Fab’8.1.2检测所述靶蛋白的一个磷酸化位点（pTyr1346），而Fab’1.4.168检测一个非磷酸位点。所述Fab’片段已经与单链DNA（ssDNA）共价连接：Fab’1.4.168与包含SEQ ID NO:6且含有荧光素作为荧光标志物的17聚体ssDNA，而Fab’8.1.2与包含SEQ ID NO:5且含有Cy5作为荧光标志物的19聚体ssDNA共价连接。在下文中，将这些共价结合有17聚体或19聚体ssDNA的Fab’分别称为ssFab’1.4.168和ssFab’8.1.2。双重结合剂装配由与ssFab’片段的相应ssDNA杂交的接头（即包含两个互补ssDNA寡核苷酸（分别为SEQ ID NO:7和8）的桥接构建体）介导。可以通过使用间隔物（例如C18间隔物）或不同长度的DNA分别修改双重结合剂的两个ssFab’片段之间的距离。

对于装配评估，将双重结合剂组分ssFab’8.1.2、ssFab’1.4.168和接头构建体（I）（=实施例2.4的接头17）5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACTT(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’和（II）（=实施例2.4的接头10）5’-GCAG AAG CAT TAA TAG ACT-(T20)-T(-Bi)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAACT-3’于室温以等摩尔数量混合。在1分钟的温育步骤后，在分析性凝胶过滤柱（Superdex^TM200,10/300GL,GE Healthcare）上分析反应混合物。单一的双重结合剂组分的洗脱体积（V_E）与反应混合物的V_E的比较表明，已经成功形成双重结合剂（图1）。（两种接头中部的生物素化的胸苷（T-(Bi)）在这些实验中无功能。）

2.6评估抗pIGF-1R双重结合剂对固定化的IGF-1R和IR肽的结合的Biacore^TM实验

对于此实验，于T=25℃使用Biacore^TM2000仪（GE Healthcare），Biacore^TMSA传感器嵌入该系统中。以100μl/分钟用50mM NaOH中1M NaCl的3次1分钟注射和1分钟10mM HCl发生预条件化。

使用HBS-ET（10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05%Tween20）作为系统缓冲液。样品缓冲液与系统缓冲液相同。在控制软件V1.1.1下驱动Biacore^TM2000系统。

随后，在相应的流动池中在SA表面上捕捉生物素化的肽。在流动池2上捕获16个RU的IGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr;Glu(Bi-PEG-1340]酰胺（即1346酪氨酸磷酸化的SEQ ID NO:11的肽，其包含经由对应于第1340位的谷氨酸结合的PEG接头，且接头另一端是生物素化的）。在流动池3上捕获18个RU的IGF-1R(1340-1366);Glu(Bi-PEG-1340]酰胺（即1346酪氨酸非磷酸化的SEQ IDNO:11的肽，其包含经由对应于第1340位的谷氨酸结合的PEG接头，且接头另一端是生物素化的）。在流动池4上捕获20个RU的hIR(1355-1382)[1361-pTyr;Glu(Bi-PEG-1355]酰胺（即1361酪氨酸磷酸化的SEQ ID NO:12的肽，其包含经由对应于人胰岛素受体第1355位的谷氨酸结合的PEG接头，且接头另一端是生物素化的）。最后，将所有流动池用d-生物素饱和。

对于双重结合剂形成，使用如实施例2.5中描述的装配方案。当仅用两种ssFab’之一实施个别运行时，接头DNA的存在或缺乏不影响结合或解离曲线（数据未显示）。

将溶液中100nM分析物（在这些实验中即为二价双重结合剂）以50μl/分钟注射240秒结合时间，并监测解离500秒。通过以50μl/分钟用80mM NaOH使用1分钟注射步骤完成有效再生。流动池1充当参照。使用空白缓冲液注射代替抗原注射以通过缓冲液信号扣除作为数据的双重参照。

在每个测量循环中，将溶液中的下列分析物之一在所有4个流动池上注射：分别地，100nM ssFab’8.1.2、100nM ssFab’1.4.168、100nM ssFab’8.1.2和100nM ssFab’的混合物、100nM由在接头III（5’-G CAG AAG CAT TAA TAGACT-T(20)-T(-Dig)-(T20)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’（=实施例2.4的接头15））上杂交的ssFab’8.1.2和ssFab’1.4.168组成的二价结合剂、和100nM由在接头（IV）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(-Dig)-TGG ACG ACGATA GAA CT-3’（=实施例2.4的接头16））上杂交的ssFab’8.1.2和ssFab’1.4.168组成的二价结合剂。（上述接头中的中部胸苷的洋地黄毒苷化（T(-Dig)）与这些实验无关。）

信号以时间依赖性的Biacore^TM传感图监测。

报告点设置于分析物结合相结束（结合后期，BL）和分析物解离相结束（稳定性后期，SL）以监测每种相互作用的应答单位信号高度。依照线性1:1朗缪尔拟合使用Biacore^TM评估软件4.1计算解离速率kd(1/s)。根据公式ln(2)/(60xkd)计算按分钟计的复合物半衰期。

传感图（图2-5）显示了，当以双重结合剂（=二价结合剂）形式使用ssFab’1.4.168和ssFab’1.4.168时，pIGF-1R结合的特异性和复合体稳定性都增加，这大概是由于根本的协同结合效应所致。单独的Fab’1.4.168显示对pIR肽没有交叉反应性，但不区分IGF-1R的磷酸化的和未磷酸化的形式（这两种情况下T1/2_解离=3分钟）。然而，Fab’8.1.2仅与IGF1-R肽的磷酸化型式结合，但展现出一些不期望的与磷酸化胰岛素受体的交叉反应性。所述双重结合剂完全区分pIGF-1R肽和其它两种肽（参见图4），并且如此帮助克服非特异性结合的问题。注意到特异性增加在应用没有接头DNA的两种Fab’时都是丧失的（图5）。双重结合剂对pIGF-1R肽的亲和力增加表现为与个别Fab’和省略接头DNA的Fab’混合物相比解离半衰期延长（图3和图5）。尽管具有两种不同DNA接头长度的测试双重结合剂共享对靶物结合特异性和亲和力的总体正面影响，但是较长的接头（具有T40-T-Dig作为间隔物的（III））（即实施例2.4的接头15）表现为就两种标准而言都是有利的。

2.7Biacore^TM测定法M-1.4.168-IgG和M-8.1.2-IgG的夹心物

使用Biacore^TM T100仪（GE Healthcare），将Biacore^TM CM5传感器嵌入该系统中。通过以100μl/分钟用0.1%SDS、50mM NaOH、10mM HCl和100mMH₃PO₄注射1分钟对传感器进行预条件化。

系统缓冲液是HBS-ET（10mM HEPES pH7.4150mM NaCl1mM EDTA0.05%Tween

20）。样品缓冲液是系统缓冲液。

在控制软件V1.1.1下驱动Biacore^TM T100系统。依照制造商的用法说明书经由EDC/NHS化学，分别在流动池1、2、3和4上以10000个RU固定化10mM醋酸钠pH4.5中30μg/ml的多克隆家兔IgG抗体<IgGFCγM>R（JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.）。最后，用1M乙醇胺封闭传感器表面。于13℃驱动整个实验。

在<IgGFCγM>R表面上以10μl/分钟捕捉500nM一级单抗M-1.004.168-IgG达1分钟。将3μM含有IgG片段混合物（IgG类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的）的封闭溶液以30μl/分钟注射5分钟。将肽IGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr;Glu（Bi-PEG-1340]酰胺于300nM以30μl/分钟注射3分钟。将300nM二抗M-8.1.2-IgG以30μl/分钟注射。使用10mM甘氨酸-HClpH1.7以50μl/分钟将传感器再生3分钟。

图6描述了测定法设置。在图7中给出了测量结果。该测量清楚地指示，两种单克隆抗体都能同时结合其相应靶肽上的两个不同的、无关的表位。这是任何以产生协同结合事件为目的的后续实验的先决条件。

2.8在传感器表面上的Biacore^TM测定法双重结合剂

于T=25℃使用Biacore^TM3000仪（GE Healthcare），Biacore^TM SA传感器嵌入该系统中。以100μl/分钟用50mM NaOH中的1M NaCl的3次1分钟注射和1分钟10mM HCl将系统预条件化。

系统缓冲液是HBS-ET（10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05%Tween

20）。样品缓冲液是系统缓冲液。

在控制软件V4.1下驱动Biacore^TM3000系统。

在参照流动池1上捕获124个RU的氨基-PEO-生物素。在不同的流动池上捕获1595个RU的生物素化的14.6kDa T0-Bi37聚体ssDNA接头（I）（5’-G CAGAAG CAT TAA TAG ACT-T(-Bi)-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3’）（=实施例2.4的接头17）和1042个RU的生物素化的23.7kDa T40-Bi77聚体ssDNA接头（II）（5’-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-T(20)-(生物素-dT)-(T20)-TGGACG ACG ATA GAA CT-3’=实施例2.4的接头10）。

将300nM ssFab’8.1.2和300nM ssFab’1.004.168以50μl/分钟注射到系统中达3分钟。作为对照，仅注射300nM ssFab’8.1.2或300nM ssFab’1.004.168以测试每种ssFab的动力学贡献。作为对照，注射缓冲液代替ssFab。以浓度阶梯0nM、4nM、11nM、33nM（两次）、100nM和300nM分别将溶液中游离的肽pIR(1355-1382)[1361-pTyr]酰胺和IGF-1R(1340-1366)酰胺以50μl/分钟注射到系统中达4分钟。在另一组实验中，为了测量对肽pIGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr]酰胺的亲和力，使用0nM、0.4nM、1.1nM、3.3nM（两次）、10nM和30nM的浓度阶梯。

以50μl/分钟监测解离5.3分钟。在每个浓度阶梯后用12秒的25mM NaOH脉冲使系统再生，并重新加载ssFab’配体。

图8示意性描绘了Biacore^TM仪上的测定法设置。图9中给出的表显示了此办法的量化结果。图10、11和12绘出了使用T40双重结合剂来自此测定法设置的例示性Biacore^TM结果。

图9中的表表明双重结合剂概念的益处。与具有192分钟和30pM的T0双重结合剂（即具有实施例2.4的接头16的双重结合剂）相比，T40双重结合剂（具有实施例2.4的接头10，即具有T20-生物素-dT-T20间隔物的接头的双重结合剂）产生改善2倍的抗原复合物半衰期（414分钟）和改善3倍的亲和力（10pM）。这支撑优化接头长度以产生最佳协同结合效应的必要性。

T40双重结合剂（即包含T40-Bi接头（实施例2.4的接头10）的双重结合剂）展现出对磷酸化IGF-1R肽的10pM亲和力（图9中的表，图10）。这是对磷酸化胰岛素受体肽（24nM）的2400倍亲和力改善和对非磷酸化的IGF-1R肽的100倍改善。

因此，实现了通过组合两种不同的且分开的结合事件来提高特异性和亲和力的目的。

从针对磷酸化IGF-1R肽的解离速率来看，协同结合效应尤其变得明显，其中相对于单独的单价结合剂8.1.2为0.5分钟和单独的单价结合剂1.4.168为3分钟，双重结合剂显示414分钟抗原复合体半衰期。

此外，在与单一Fab’杂交的构建体相比时，完全装配的构建体大致将其解离速率kd(1/s)相乘（图10、11、12和图9中的表）。令人感兴趣地，在与单一的Fab’相互作用事件相比时，结合速率ka（1/Ms）也略微增加，这可能是由于构建体的分子柔性升高所致。

与个别（单价）Fab’分子形成比较，使用强烈清洗规程的诊断系统的确应当采用T40双重结合剂的高性能。杂交的构建体（即依照本发明的二价结合剂）产生特异性的且相当稳定的结合事件，而单价结合剂更快地解离，例如它们被更快地洗去。

实施例3：结合胰岛素样生长因子1的同二聚体形式的二价结合剂

胰岛素样生长因子1受体(IGF1-R)属于酪氨酸激酶受体家族并且被IGF1活化。该受体是同二聚体。

IGF1-R单体由经由二硫桥共价连接的跨膜β亚基和胞外α亚基组成。两个单体由两单体α亚基之间的二硫桥共价连接。IGF1受体在癌症、衰老和胰岛素信号传导中起着重要作用。

我们开发出的二聚体结合剂包含两个相同的Fab’片段。这两个Fab’片段在各自使用时只以较低的复合物稳定性结合其靶肽（IGF1-R）。为了产生二价结合剂，将Fab’片段缀合到可杂交的寡核苷酸。使用能够与接头DNA以及该寡核苷酸杂交的衔接头DNA作为桥与Fab’-DNA和接头DNA杂交，从而提供稳定的二价结合剂，其特征还在于对于采用的单价结合剂具有合适的距离（在图13中给出示意图）。在自动化的免疫组化染色系统（VentanaBenchMarkXT）中测试此抗IGF1-R双重结合剂。

3.1开发针对IGF1受体的低亲和力单克隆抗体

a)小鼠免疫

用肽IGF1R(1340-1366)[1346-pTyr;Aoc-Dys-MP-KLH-1340]酰胺将Balb/c小鼠免疫（给出未磷酸化氨基酸序列为SEQ ID NO:11）。初始免疫剂量为100μg。在4、8和12周后用100μg免疫原进一步免疫小鼠。

b)融合和克隆

依照Galfre G.和Milstein C.,Methods in Enzymology73(1981)3-46，将前述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。在此过程中，将经免疫小鼠的约1x10⁸个脾细胞与2x10⁷个骨髓瘤细胞（P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580）混合，并以250g且于37℃离心10分钟。弃去上清液，通过轻敲使细胞团粒松散。在37℃水浴中于1分钟内逐滴添加1ml PEG（分子量4000，Merck，Darmstadt）。然后，在5分钟内逐滴加入5ml无FCS的RPMI1640，接着再于10分钟内逐滴加入10ml无FCS的RPMI1640。下一步，添加25ml含有10%FCS、100mmol/l次黄嘌呤、1μg/ml重氮丝氨酸和50u IL-6的RPMI1640，并将细胞于37℃、5%CO₂温育60分钟，然后以250g离心10分钟。将细胞团粒在30mL含有10%FCS、100mmol/l次黄嘌呤、1μg/ml重氮丝氨酸和50u IL-6的RPMI1640中重悬，并于37℃、5%CO₂温育。

c)从细胞培养上清液分离免疫球蛋白

在约10天后测试原代培养物的抗原特异性。通过荧光激活细胞分选器在96孔细胞培养板中克隆阳性原代培养物。在随后在24孔板、6孔板和T75瓶（Corning）中在有Nutridoma补充物（Roche）的Hyclone培养基（TheromoScientific）中生长后，最终在CeLLine生物反应器（Integra biosciences）中依照制造商的用法说明书培养表达期望的低亲和力抗体的杂交瘤细胞。最有希望的抗体称为单抗1.4.168。

d)单抗1.4.168的生物物理表征

使用Biacore^TM技术通过表面等离振子共振调查单抗1.4.168和IGF1受体之间的相互作用的动力学特性。

于T=25℃使用Biacore^TM T100仪（GE Healthcare），Biacore^TM CM5传感器嵌入该系统中，通过用0.1%SDS,50mM NaOH,10mM HCl和100mMH₃PO₄以100μl/分钟注射1分钟将该系统预条件化。系统缓冲液为HBS-ET（10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05%Tween

20）。样品缓冲液为系统缓冲液。

在控制软件V1.1.1下驱动Biacore^TM T100系统。依照制造商的用法说明书经由EDC/NHS化学，在流动池1、2、3、4上以8000个RU固定化10mM醋酸钠pH4.5中30μg/ml的多克隆家兔IgG抗体<IgGFCγM>R（JacksonImmunoResearch Laboratories Inc.）。最后，用1M乙醇胺封闭传感器表面。

在<IgGFCγM>R表面上以10μl/分钟捕捉250nM单抗M-1.004.168-IgG达1分钟。

将肽IGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr;Glu(Bi-PEG-1340]酰胺的900nM、300nM、150nM、50nM、17nM、6nM和0nM浓度系列用作溶液中分析物，并以100μl/分钟注射3分钟结合时间。以100μl/分钟监测解离10分钟。作为对照，对一个浓度阶梯分析两次以确保测定的可重复性。流动池1充当参照池。使用空白缓冲液注射代替抗原注射以通过缓冲液信号扣除提供数据的双重参照。使用10mM甘氨酸pH1.7以10μl/分钟的3分钟注射使捕获系统再生。

依照1:1二元朗缪尔相互作用模型，使用Biacore^TM T100评估软件V.1.1.1来评估数据以计算结合速率常数ka[1/Ms]、解离速率常数kd[1/s]和所得亲和力常数K_D[M]。单抗1.4.168的解离速率常数为3.6x10^-31/s，并且因此在具有低复合体稳定性的抗体范围内，需要我们的双重结合剂办法。

此外，使用表面等离振子共振来测定抗原特异性。于T=25℃使用Biacore^TM2000仪（GE Healthcare），Biacore^TM SA传感器嵌入该系统中，并通过以100μl/分钟用50mM NaOH中的1M NaCl的3次1分钟注射和1分钟10mM HCl完成预条件化。系统缓冲液为HBS-ET（10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05%Tween

20）。样品缓冲液为系统缓冲液加1mg/ml CMD（羧甲基右旋糖苷，Sigma）。

随后，在相应的流动池中在SA表面上捕捉生物素化的肽。最后，将流动池用2μM d-生物素饱和。将杂交瘤克隆培养上清液以1:2稀释，并以50μl/分钟注射2分钟，监测解离5分钟。用10mM Gly/HCl,pH1.7以30μl/分钟注射1.5分钟来再生。流动池1充当参照。使用空白缓冲液注射代替抗原注射以通过缓冲液信号扣除提供数据的双重参照。依照Biacore^TM评估软件1.1.1来评估数据。在注射时间结束时测量信号高度，即结合后期（RU）。下表3清楚地显示，单抗1.4.168同样好地识别磷酸化和未磷酸化的IGF-1R肽（SEQ IDNO:11），但其不与磷酸化的胰岛素受体肽（SEQ ID NO:12）相互作用。

表3：特异性测定

FC=流动池；配体=在SA包被的芯片上分别捕获的生物素和生物素化的肽，

RU=共振单位（与SA表面上作为配体捕获的bi-肽的质量相关），分析物=溶液中的单抗1.4.168，结合后期（RU）=在分析物注射阶段结束时的信号高度。

3.2抗体纯化、Ig切割和Fab’片段的产生

a)纯化

首先通过用2N醋酸至最终pH4.75的酸沉淀来纯化单抗1.4.168。在15分钟的温育时间和以4℃、13,000rpm离心后，用1M K₃PO₄将上清液缓冲至pH7.0。然后，进一步通过硫酸铵沉淀（30.5g/100mL）来纯化抗体。在以9000rpm于4℃离心30分钟后，弃去上清液并将团粒重悬于10mM柠檬酸钠、20mMNaCl,pH5.5。然后将抗体对10mM柠檬酸钠、20mM NaCl，pH5.5透析并在4℃,13,000rpm离心30分钟，弃去细胞团粒。通过在平衡于10mM柠檬酸钠，20mM NaCl，pH5.5中的SP sepharose柱（GE healthcare）上进行的离子交换层析进一步纯化抗体。用20mM至250mM的NaCl梯度在6个柱体积内洗脱抗体。用级分收集器收集洗脱物并通过HPLC和SDS-PAGE来分析含有蛋白质的级分以正鉴定抗体。合并含有抗体的级分并依照制造商的用法说明书通过超滤（Amicon Ultra10kDa MWCO）浓缩，并对50mM磷酸钾，150mM NaCl，pH7.5透析。

b)木瓜蛋白酶消化产生Fab’2分子

将纯化的抗体用25mU木瓜蛋白酶/mg IgG于37℃切割80分钟。通过加入0.1倍反应体积的270mM碘乙酰胺(iodine acetamide)、75mM磷酸钾、150mMNaCl和2mM EDTA来使反应猝灭。之后，将反应混合物对10mM磷酸钾、20mM NaCl，pH7.0透析。然后通过DEAE离子交换层析纯化Fab’₂。将DEAE柱（GE healthcare）用10mM磷酸钾、20mM NaCl，pH7.0平衡，并在加载透析过的反应混合物后，用10mM磷酸钾、1M NaCl，pH7.0洗脱Fab’₂。进一步地，通过免疫亲和层析纯化Fab’₂，其流过加载有多克隆抗木瓜蛋白酶抗体的柱和随后的加载有针对M-Fcγ的多克隆抗体的柱。将PBS用作运行缓冲液。用Amicon Ultra 10 kDa MWCO离心滤器浓缩最终流过物并通过SDS-PAGE测定纯度。

c)还原Fab’2并产生Fab’片段

在37℃于热混合器（Eppendorf）中在15mM半胱胺、25mM磷酸钾、5mMEDTA，pH6.5中还原Fab’₂60分钟。在平衡于100mM磷酸钾、2mM EDTA，pH6.3中的Sephadex G25P10柱（GE Healthcare）上，通过在大小排阻层析凝胶过滤中将Fab’从半胱胺分开来终止反应。用25mM KPO₄、2mM EDTA，pH6.5洗脱Fab’。

3.3Fab’片段的DNA标记

将在实施例3.2中获得的Fab’片段与ssDNA-马来酰亚胺衍生物（SEQ IDNO:16）以1:1摩尔比缀合20分钟。此ssDNA序列能够与接头和衔接头寡核苷酸上发现的互补序列分别杂交。通过加入过量半胱氨酸-HCL（用于猝灭未缀合的DNA-马来酰亚胺），接着加入过量的N-甲基马来酰亚胺（猝灭游离半胱氨酸-SH基团）来猝灭反应。之后，将Fab’对20mM Tris pH7.6透析。然后在用Source Q柱（GE Healthcare）的离子交换层析中将单标记的Fab’与多标记的Fab’分开。将该柱在20mM Tris pH7.6中平衡并用NaCl梯度洗脱Fab’-DNA缀合物。流速为2ml/分钟并以介于400和700mM NaCl之间的盐浓度洗脱Fab’-DNA缀合物。用级分收集器收集单标记的Fab’-DNA缀合物并通过超滤（Amicon Ultra10kDa MWCO）浓缩，并对10mM HEPES、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05%Tween20，pH7.4透析。

3.4形成包含两个抗IGF1-R Fab’片段的二价结合剂

在室温以等摩尔量混合来自实施例3.3的用ssDNA接头标记的Fab’片段、接头DNA（SEQ ID NO:17）和衔接头DNA（SEQ ID NO:18）以允许形成二价同二聚体结合剂（见图13）。在1分钟温育步骤后，在分析性凝胶过滤柱（Superdex^TM200,10/300GL,GE Healthcare）上分析反应混合物。Fab’-DNA缀合物的浓度为2.5μM，DNA接头和DNA衔接头的浓度各为1.25μM。

3.5研究双重结合剂形成的分析性大小排阻层析

使用GE Healthcare Superdex20010/300GL分析性大小排阻层析柱以0.5ml/分钟的流速实施分析性大小排阻层析。将PBS用作运行缓冲液并且在每次运行中注射100μL样品。通过Fab’-DNA缀合物与Fab’-DNA、接头DNA和衔接头DNA的三重复合物之间在保留时间中的差异确立经由DNA杂交形成的双重结合剂（表4）。在2:1:1比率的Fab’-DNA、接头DNA和衔接头DNA观察到最有效的双重结合剂形成。

通过在280nm（芳香族吸收）和495nm（荧光素吸收）处吸光度中的变化来监测保留时间。

表4：针对IGF1受体的双重结合剂的分析性大小排阻层析

样品	保留时间（分）
		Fab’-DNA缀合物	30
衔接头DNA	32
		接头DNA	32
Fab’-DNA缀合物+接头DNA	26
		Fab’-DNA缀合物+接头DNA+衔接头DNA	22

保留时间以每次运行的洗脱谱中所得峰的最大吸光度（280nm）测量。Fab’-DNA缀合物、接头DNA和衔接头DNA的三重复合物以比单独的各组分以及Fab’-DNA和接头DNA的复合物更短的保留时间洗脱，指示更高的分子量以及因此三重复合物形成。

3.6免疫组化染色

将NIH3T3细胞稳定转染以过表达人IGF1受体。依照标准规程将转染的细胞固定并包埋于石蜡块中。用切片机（HM355S,Thermo Scientific）产生该块的3μm切片并转移到显微镜载玻片上用于Ventana BenchMark

XT系统中的自动化IHC染色。使用来自Ventana的商品化试剂实施染色规程。将细胞去石蜡化并用标准的CC1缓冲液（Ventana）处理以进行抗原修复。将100μL抗体稀释缓冲液（Ventana）中的1μg/ml双重结合剂、或无衔接头DNA的双重结合剂手动滴定到载玻片上并温育32分钟。将细胞用100μL苏木精II（Ventana）复染色4分钟，用100μL蓝染试剂（Ventana）复染色8分钟。双重结合剂检测基于XT iview DAB检测试剂盒（Ventana），不同之处是将试剂盒的iview DAB生物素化二抗用反应缓冲液（Ventana）取代，因此试剂盒的链霉亲合素-HRP缀合物仅识别生物素化的接头DNA。通过光学显微术分析染色。仅双重结合剂将细胞染色，而无衔接头DNA的Fab’-DNA/DNA接头复合物（其不能杂交到双重结合剂中）被洗去且并未将IGF1受体阳性细胞染色（图14）。

论述：用IGF1受体抗原免疫小鼠以用于抗体开发。通过表面等离振子共振表征最有希望的抗体（单抗1.4.168）的动力学特性和特异性。然后纯化、切割并用17聚体DNA序列标记该抗体。通过分析性大小排阻层析确认Fab’-DNA、接头DNA与衔接头DNA之间的杂交，然后将双重结合剂用于稳定转染的细胞上的自动化IHC染色（Ventana BenchMark

XT）。仅双重结合剂将细胞阳性染色，而单独的Fab’-DNA/接头DNA复合物（无衔接头DNA）被洗去，因此并未染色。双重结合剂的两个结合元件对同二聚体受体的协作结合最可能导致充足的高复合物稳定性以抵抗IHC仪器上的严格清洗，这与单独的单一结合元件的情况是不同的（见图14）。

实施例4：在免疫组化中用双重结合剂检测HER2/HER3异二聚体

Her受体的受体酪氨酸激酶家族由以下4个成员组成：HER1、HER2、HER3和HER4。在配体结合时，根据配体和4个家族成员各自的表达水平，受体以各种方式二聚化成同或异二聚体以触发不同的信号转导途径。例如，HER3在分别结合其配体神经调节蛋白1(NRG1)或神经调节蛋白2(NRG2)时经历构象改变，HER3二聚化域暴露且其能与其它Her受体相互作用。二聚化域在HER2HER2中是组成性暴露的，如此它不需要由特定配体活化来诱导其二聚化。因此，NRG1或NRG2对HER3的刺激能触发其与HER2HER2的寡聚化。在二聚化时，HER2的组成性活性酪氨酸激酶域将缺乏功能性酪氨酸激酶域的HER3磷酸化。

能够提供检测HER2/HER3异二聚体的双重结合剂。开发出具有在所附权利要求中限定的范围以内的解离速率常数的针对HER3和HER2的单克隆抗体。进一步地，在免疫组化中验证抗体在癌细胞系、异种移植物和肿瘤组织中的靶物识别。使用标准的分子生物学方法将所选抗体测序，并使用重组蛋白质表达生成双重结合剂的库。然后在用福尔马林固定和石蜡包埋的癌细胞上筛选具有不同长度的接头的双重结合剂。在包埋前，所述细胞或者是饥饿后的，或者是已经用人NRG1刺激以诱导HER2/HER3异二聚化的。在自动化免疫组化染色系统（Ventana BenchMark

XT）中评估对异二聚化的检测。筛选中的阳性命中定义为将受刺激的细胞（存在HER2/HER3二聚体）而非饥饿细胞（无异二聚体）染色的双重结合剂。

开发在限定的解离速率常数范围内针对HER3和HER2的单克隆抗体

a)小鼠免疫

用HER3(1243-1267)[KLH-MP-Cys-UZU-1243]酰胺和HER2(1223-1236)[KLH-MP-Cys-UZU]酰胺将SJL、Balb/c和NMRI小鼠免疫。初始免疫剂量为100μg。在6周和10周后用100μg免疫原进一步免疫小鼠。

b)融合和克隆

依照Galfre G.和Milstein C.,Methods in Enzymology73(1981)3-46，将前述小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。在此过程中，将经免疫小鼠的1x10⁸个脾细胞与2x10⁷个骨髓瘤细胞（P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580）混合，并以250g且于37℃离心10分钟。弃去上清液，通过轻敲使细胞团粒松散。在37℃水浴中于1分钟内逐滴添加1ml PEG（分子量4000，Merck，Darmstadt）。然后，在5分钟内逐滴加入5ml无FCS的RPMI1640，接着再于10分钟内逐滴加入10ml无FCS的RPMI1640。下一步，添加25ml含有10%FCS、100mmol/l次黄嘌呤、1μg/ml重氮丝氨酸和50u IL-6的RPMI1640，并将细胞于37℃、5%CO₂温育60分钟，然后以250g离心10分钟。将细胞团粒在30mL含有10%FCS、100mmol/l次黄嘌呤、1μg/ml重氮丝氨酸和50u IL-6的RPMI1640中重悬，并于37℃、5%CO₂温育。然后将细胞悬浮液转移至96孔板并在37℃、5%CO₂温育。

c)从细胞培养上清液分离免疫球蛋白

在约10天后测试原代培养物的抗原特异性。通过荧光激活细胞分选器在96孔细胞培养板中克隆阳性原代培养物。在随后在24孔板、6孔板和T75瓶（Corning）中在有Nutridoma补充物（Roche）的Hyclone培养基（TheromoScientific）中生长后，最终在CeLLine生物反应器（Integra biosciences）中依照制造商的用法说明书培养表达期望的低亲和力抗体的杂交瘤细胞。

d)单克隆抗体的生物物理表征

使用Biacore^TM技术通过表面等离振子共振动力学筛选调查单克隆抗体与HER2或HER3之间的相互作用的动力学特性。

使用在软件版本V1.1控制下的Biacore^TM A100仪。Biacore^TM CM5芯片嵌入该仪器中，并依照制造商的用法说明书在流体力学上编址并条件化。作为运行缓冲液，使用HBS-EP缓冲液（10mM HEPES(pH7.4)，150mM NaCl，1mM EDTA，0.05%(w/v)P20）。将多克隆家兔抗小鼠IgG Fc捕捉抗体在10mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)中以30μg/ml以10,000个RU固定化于流动池1、2、3和4中的点1、2、4和5。经由NHS/EDC化学共价固定化抗体。此后，用1M乙醇胺溶液使传感器失活。使用点1和5进行测定，并使用点2和4作为参照。在施加到传感器芯片前，将含有单抗的杂交瘤上清液在HBS-EP缓冲液中以1:2稀释。将稀释的溶液以30μl/分钟的流速施加1分钟。此后立即以30μl/分钟的流速注射分析物，即在链霉亲合素上单一嫁接的人_HER3(1242-1267)-Bi-PEG-酰胺（SEQ ID NO:26）或人_HER2(1223-1236)-Bi-PEG-酰胺（SEQ ID NO:25）达2分钟。此后，记录信号达5分钟解离时间。通过以30μl/分钟的流速注射10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.7)2分钟使传感器再生。依照朗缪尔模型，根据制造商的用法说明书使用评估软件来计算解离速率常数kd(1/s)。选定的单克隆抗体与分别地HER2、HER3以位于本专利权利要求的边界内的解离速率常数相互作用。抗体必须与其表位特异性结合，即抗HER2抗体不与HER3相互作用，反之亦然。

选出的针对HER3的抗体称作7.2.32（分别地，在SEQ ID NO:19中显示的可变区重链和SEQ ID NO:20中显示的可变区轻链），并且其解离速率常数测定为2.3x10^-3 1/s，因此在双重结合剂方法需要的范围内。选出的针对HER2的抗体称作4.1.43（分别地，在SEQ ID NO:21中显示的可变区重链和SEQ IDNO:22中显示的可变区轻链），并且其解离速率常数为9.63x10^-41/s，如此也在双重结合剂方法需要的范围内。

在免疫组化中表征选出的单克隆抗体

选出的针对HER2和HER3的单克隆抗体不仅必须以特定范围内的解离速率常数结合其靶物，而且其还必须在免疫组化中确立为适合用作双重结合剂的基础。首先，必须确保两种单克隆抗体在免疫组化中仍识别其抗原。这可以通过对福尔马林固定和石蜡包埋的瞬时转染后过表达重组HER1、HER2、HER3或HER4的HEK293染色来实现。必须使用与抗HER2和抗HER3抗体相同的方案，用Ventana BenchMark

自动化免疫组化平台来实施染色。例如，可以用ultraview DAB试剂盒实施染色，其中使用CC1标准品，抗体温育时间在37℃为32分钟，使用ultraWash选项，用苏木精II复染色4分钟，并用蓝染试剂复染色8分钟。此外，要在HER2和HER3表达水平已知的异种移植物和肿瘤组织上使用相同的染色方案来验证抗体。另外，使用标准的分子生物学规程从杂交瘤克隆获得重链和轻链的氨基酸序列。

开发识别HER2和HER3的双重结合剂

a)开发使用肽接头的双重结合剂

我们开发出由两个Fab片段（由接头甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸（G4S）单元连接）和血凝素标签（YPYDVPDYA）组成的双重结合剂（图15）。可以通过向接头中掺入不同数目的G4S单元容易地改变接头长度。接头可以含有2个至8个G4S单元。使用编码Fab_7.2.32-接头Fab_4.1.43重链（在SEQ ID NO:24中显示）的融合蛋白的质粒（HC双重结合剂）和两种编码Fab轻链的质粒在HEK293细胞中瞬时表达后表达双重结合剂。所有质粒还在抗体编码序列上游编码用于胞外运输的信号序列。将密码子使用优化以用于重组真核生物表达，然后合成相应DNA（Geneart）并使用BamHI/XbaI限制性位点克隆到pUC载体中。将接头序列由HindIII/KpnI限制性位点侧接以允许使用标准的分子生物学方法容易地交换质粒的接头序列。

用质粒转染悬液中的HEK293-F细胞以瞬时表达重组双重结合剂。总体而言，依照制造商的用法说明书使用293-Free^TM转染试剂（Novagen），以1:1:1的比率用质粒HC-双重结合剂（编码SEQ ID NO:24中显示的蛋白质序列）、LC_7.2.32（编码SEQ ID NO:20中显示的蛋白质序列）和LC_4.1.43（编码SEQID NO:22中显示的蛋白质序列）转染50mL存活>90%的1x10⁶个细胞/ml。转染后，将HEK293-F细胞在130rpm、37℃和8%CO₂温育7天。然后将细胞于4℃以8000rpm离心20分钟。使用0.22μm Steriflip（Millipore）真空过滤系统进一步将含有双重结合剂的上清液过滤，等分试样并在液氮中速冻，储存于-20℃。

b)开发使用基于DNA的接头的双重结合剂

为了生成基于经由DNA接头杂交的双重结合剂，将重组Fab片段表达为编码分选酶切割识别序列（SEQ ID NO:23）的融合蛋白。接着，用17聚体（SEQID NO:27中显示的用于4.1.43标记的寡聚物）和19聚体（SEQ ID NO:28中显示的用于7.2.32标记的寡聚物）寡聚物分子位点特异性地标记重组蛋白，然后其能与可获的接头DNA库杂交。

在转肽酶反应中使用分选酶的DNA-寡聚物缀合

分选酶是一种原核蛋白水解酶，其还具有转肽酶活性（Ton-That等,PNAS1999）。本文中，此酶催化LPXTG基序和附接于DNA-寡聚物的甘氨酸残基之间的转肽酶反应。

在HEK293细胞中表达7.2.32和4.1.43的重组Fab片段。依照制造商的用法说明书使用293-Free^TM转染试剂（Novagen），以1:1的比率用编码7.2.32或4.1.43的重链和轻链的质粒转染400mL存活>90%的1x10⁶个HEK293细胞/ml。

蛋白质表达为融合蛋白并且在Fab片段的轻链携带C末端6xHIS标签，在重链携带C末端分选酶切割序列。此外，7.2.32在分选酶切割标签上游携带HA标签。

在转染后，将HEK293-F细胞在37℃和8%CO₂温育7天。然后将细胞在4℃以8000rpm离心20分钟。使用0.22μm Steriflip（Millipore）真空过滤系统将含有重组蛋白的上清液进一步过滤。

通过镍亲和柱层析和使用

explorer FPLC系统的制备性凝胶过滤，使用标准纯化方法来纯化Fab片段。通过SDS-PAGE和分析性凝胶过滤来评估纯度。

使用10μM重组分选酶、50μM Fab片段和200μM寡聚物在50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、5mM CaCl₂的缓冲液中于37℃过夜实施标记。接着，将标记反应液在20mM Tris pH8.0中稀释10倍并施加到在20mM Tris pH8.0中平衡的Resource Q离子交换柱（GE Healthcare）。将带强负电荷的寡聚物和寡聚物-Fab片段用20mM Tris pH8.0和1M NaCl的高盐梯度洗脱，并由此与在低盐浓度洗脱的分选酶和未标记的Fab片段分开。沿循495nm处的吸光度（检测寡聚物的荧光素标记）来监测洗脱。将含有寡聚物和Fab-寡聚物的洗脱级分合并，并在HiLoad16/60柱Superdex200柱（GE Healthcare）上，使用20mM Tris8.0、200mM NaCl作为平衡和运行缓冲液，通过制备型凝胶过滤将Fab-寡聚物与未缀合的寡聚物分开。使用分析性凝胶过滤和SDS-PAGE来评估终产物的纯度，并且仅会将>90%纯的终产物用在双重结合剂的装配中。

通过分析性凝胶过滤研究双重结合剂的装配。

在分别的实验中，将等摩尔比的7.2.32-Fab-19聚体和4.1.43-Fab-17聚体缀合物与每一种接头分子（实施例2.4中显示的接头3-14）混合。然后使用分析性凝胶过滤研究双重结合剂的装配。

使用GE Healthcare Superdex 200 10/300GL分析性大小排阻层析柱，以0.5ml/分钟的流速实施分析性大小排阻层析。将20mM Tris pH8.0,200mMNaCl用作运行缓冲液并在每次运行中注射100μL样品。Fab-寡聚物缀合物和接头的浓度为2.5μM。通过在280nm（芳香族吸收）和495nm（荧光素吸收）处吸光度中的变化来监测保留时间。通过Fab’-寡聚物缀合物、Fab’-寡聚物和接头复合物与两个Fab片段和接头的三重复合物之间在保留时间中的差异确立经由DNA杂交形成双重结合剂。

生成用福尔马林固定并石蜡包埋的MCF-7细胞

已知MCF-7癌细胞系表达中等水平的HER2和HER3，但不表达HER1（DeFazio等,Int.J.Cancer,87,487-498(2000)），因此它是检测HER2/HER3异二聚化的诱导的一种优选研究模型。此外，已使用其它方法在受刺激的MCF-7细胞中检测到HER2/HER3异二聚体（Mukherjee等,PLOS One6(1),2011）。

使用有2mM L-谷氨酰胺（Gibco）和10%FCS的RPMI1640（Gibco）来培养MCF-7细胞，并将它们在T175cm2烧瓶中生长至光学汇合。将汇合的细胞在RPMI1640（2mM L-谷氨酰胺，无FCS）中饥饿约18小时。然后，用20nMNRG1-β1（Peprotech）在37℃刺激细胞15分钟。作为阴性对照，将细胞在37℃在无FCS的新鲜细胞培养基中保留15分钟无刺激。如描述的用福尔马林固定细胞并包埋于石蜡中（Defazio-Eli等,Breast Cancer Res13(2):R44(2011)）。

由于HER3的磷酸化仅在配体结合后发生，因此对磷酸化HER3的染色应当显示出在经处理和未经处理的MCF-7细胞中HER3的活化状态中的差异，这还可以指示HER2/HER3异二聚化的不同水平。在福尔马林固定并石蜡包埋的MCF-7细胞上，使用对磷酸化HER3特异的21D3（Cell Signaling）抗体在免疫组化染色中验证NRG1-β1对HER3的刺激。依照标准方案实施人工免疫组化染色，其将EDTA缓冲液（Thermo Scientific）用于抗原修复，将Ultra VisionLP大体积检测系统（Thermo Scientific）用于用DAB+色原体（Dako）进行的抗原检测。仅被NRG1-β1刺激的MCF-7细胞对于磷酸化HER3是阳性染色的，而未受刺激的细胞染色阴性。

检测MCF-7细胞中的HER2/HER3异二聚体

在Ventana BenchMark

XT系统上实施免疫组化染色。经由“桥连抗体”抗HA标签抗体C29F4（Cell Signaling）发生对具有肽接头的双重结合剂的检测。使用Optiview DAB检测试剂盒（Ventana）检测抗HA标签抗体的Fc部分。可以使用Optiview放大试剂盒（Ventana）放大检测信号。经由所述“桥连抗体”抗HA标签抗体C29F4（靶向7.2.32重链C末端的HA标签），或经由能充当基于链霉亲合素的iVIEW DAB检测试剂盒（Ventana）的检测标签的接头分子的生物素标记，发生对具有基于DNA的接头的双重结合剂的检测。在分别的实验中制备双重结合剂的库，其通过将等摩尔比的7.2.32-Fab-19聚体和4.1.43-Fab-17聚体与实施例2.4中显示的每一种接头（接头3-14）混合来进行。

用切片机（HM355S,Thermo Scientific）产生MCF-7细胞块的3.5μm切片并转移到显微镜载玻片上。在自动化的BenchMark

XT染色系统中，将细胞去石蜡化并用CC1缓冲液处理32分钟以进行抗原修复。对于筛选，将每种双重结合剂在Ventana抗体稀释液中稀释，并将100μL在1:1和1:1000之间的各种稀释物手动施加到载玻片上，在37℃温育16分钟。将抗HA标签抗体C29F4（Cell Signaling）在Ventana抗体稀释液中以1:400稀释并转移至分配器。抗HA抗体具有“桥连抗体”的功能，因为其结合双重结合剂的HA标签并且同时可以使用Ventana Optiview DAB检测试剂盒的抗家兔检测系统检测其Fc部分。作为后固定剂，施加100μL桥连抗体并温育32分钟。然后，依照制造商的推荐应用Optiview检测和放大试剂。在明视野显微术中分析染色。

筛选的阳性命中是仅染色经NRG1-β1处理的具有诱导的HER2/HER3异二聚化的MCF-7细胞，而不染色未经处理的MCF-7细胞（仅为HER2和HER3单体）阴性对照的双重结合剂。此外，加入表位肽，即25μg/ml在SEQ ID NO:25中显示的HER2(1223-1236)或25μg/ml在SEQ ID NO:26中显示的HER3(1242-1267)以抑制双重结合剂的两个结合位点之一抑制染色，因为HER2/HER3异二聚体仅在双重结合剂的两个臂均可自由接近的情况下才会是可检出的。

Claims

1.一种能够结合多肽二聚体的二价结合剂，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，

a)其中第一单价结合剂结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位，

b)其中第二单价结合剂结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位，

c)其中每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，且

d)其中所述二价结合剂具有3x10^-5/秒或更低的K_解离。

2.权利要求1的二价结合剂，其中所述单价结合剂中至少一个是单链抗体、或单克隆抗体的Fab片段或Fab’片段。

3.权利要求1的二价结合剂，其中所述单价结合剂均自单克隆抗体衍生，且是Fab片段、或Fab’片段、或Fab片段和Fab’片段。

4.权利要求1-3中任一项的二价结合剂，其中所述二价结合剂具有10^-5/秒或更低的K_解离。

5.权利要求1-4中任一项的二价结合剂，其中所述接头具有6至100nm的长度。

6.权利要求1-5中任一项的二价结合剂，其中所述接头为L-DNA接头。

7.一种用于获得特异性结合多肽二聚体的二价结合剂的方法，该方法包括以下步骤：

a)选择出以5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位的第一单价结合剂，

b)选择出以5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位的第二单价结合剂，

c)通过接头偶联两个单价结合剂，并

d)选则出具有3x10^-5/秒或更低的K_解离值的二价结合剂。

8.权利要求7的方法，其中所述接头是L-DNA。

9.权利要求7或8的方法，其进一步包括步骤e)分离所述二价结合剂。

10.权利要求1-6中任一项的二价结合剂或权利要求7-9中任一项的方法，其中所述多肽二聚体是同二聚体。

11.权利要求10的二价结合剂，其中两个单价结合剂结合重叠的表位。

12.权利要求10的二价结合剂，其中两个单价结合剂结合同一表位。

13.权利要求1-6中任一项的二价结合剂或权利要求7-9中任一项的方法，其中所述多肽二聚体是异二聚体。

14.一种用于多肽二聚体的组织学染色方法，该方法包括以下步骤：

a)提供细胞或组织样品，

b)将所述样品与能够结合多肽二聚体的二价结合剂温育，该结合剂由经由接头彼此连接的两个单价结合剂组成，其中第一单价结合剂结合所述二聚体中包含的第一靶多肽的表位，其中第二单价结合剂结合所述二聚体中包含的第二靶多肽的表位，其中每个单价结合剂具有范围为5x10^-3/秒至10^-4/秒的K_解离，且其中所述二价结合剂具有3x10^-5/秒或更低的K_解离，并

c)检测所述二价结合剂，由此针对所述多肽二聚体将所述样品染色。

15.权利要求1-6中任一项的二价结合剂在细胞或组织样品染色中的用途。