CN103379916B - 呼吸道合胞病毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对呼吸道合胞病毒（RSV）的疫苗。更具体而言，本发明涉及包含RSV编码的小疏水（SH）蛋白的胞外域的重组亚单位疫苗。SH的胞外域称为SHe。优选地，该胞外域作为寡聚体呈递、甚至更优选作为五聚体呈递。本发明还涉及抗该胞外域或对该胞外域特异的抗体，及其在保护个体免受RSV感染和/或治疗受感染的个体中的用途。
Description
本发明涉及针对呼吸道合胞病毒（RSV）的疫苗。更具体而言，本发明涉及包含RSV编码的小疏水（SH）蛋白的胞外域的重组亚单位疫苗。SH的胞外域称为SHe。优选地，该胞外域作为寡聚体、甚至更优选作为五聚体存在。本发明还涉及抗该胞外域或对该胞外域特异的抗体，及其在保护个体免受RSV感染和/或治疗受感染的个体中的用途。
在工业化国家，RSV感染是婴儿住院的首要原因。原发性RSV感染（通常发生在2岁以下）后，对RSV的免疫仍不完善，可以发生再感染。此外，RSV可以在老年人中引起严重疾病，且在非大流行年通常与比甲型流感更高的死亡率相关（Falsey等,1995）。WHO估计的人群中的总体年感染率估计为六千四百万例，死亡数字为160000；仅在美国，每年有85000至144000名婴儿因RSV感染而住院（http://www.who.int/vaccine_research/diseases/ari/en/index2.htmlupdate2009）。
RSV隶属于副黏液病毒科（Paramyxoviridae）肺病毒亚科（Pneumovirinae）肺病毒属（Pneumovirus）；在人类中，存在A和B两个亚型。除人RSV外，存在牛变体。人RSV的基因组长约15200个核苷酸，且是负义RNA分子。RSV基因组编码11种已知的蛋白质：糖蛋白（G）、融合蛋白（F）、小疏水蛋白（SH）、核蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、基质蛋白（M）、M2ORF-1蛋白（M2-1）、M2ORF-2蛋白（M2-2）、非结构蛋白1（NS1）和非结构蛋白2（NS2）。G、F和SH是跨膜表面蛋白；N、P、L、M、M2-1是核壳体相关蛋白，而NS1和NS2是非结构蛋白。M2-2作为结构蛋白或非结构蛋白的身份未知。（Hacking和Hull,2002）。RSV亚型在G、F、N和P蛋白的抗原特性上显示差异（Ogra,2004）。
RSV感染后形成可在血清及一些其他体液中检测到的特异性IgG和IgA。几项研究已证明，抗体应答主要针对主要的RSV跨膜蛋白质F和G；已知仅F和G特异性抗体具有体外RSV中和活性。对F蛋白的抗体应答通常在A和B亚型之间交叉反应，而对G蛋白的抗体应答具有亚型特异性（Orga,2004）。与F和G不同，认为跨膜蛋白质SH无免疫原性（Gimenez等,1987;Tsutsumi等,1989），在一些候选疫苗中，为了获得不可回复的减毒疫苗，甚至删除了SH（Karron等,2005）。
宿主免疫反应似乎在疾病病理中发挥显著作用，这一事实使得预防RSV感染的疫苗的研发复杂化。早期用福尔马林灭活的RSV接种儿童的尝试显示，与未接种的对照相比，接种的儿童在随后暴露于病毒时经历更严重的疾病（Kapikian等,1969）。已测试了活减毒疫苗，但在临床研究中通常显示过度减毒或减毒不足（Murata,2009）。
认为使用一种免疫原性蛋白质或免疫原性蛋白质的组合的亚单位疫苗更安全，因为它们不能回复或突变为烈性病毒。已研发了基于纯化的F蛋白的候选疫苗，并在啮齿类棉鼠和人类中进行了测试，显示安全，但仅具有中等免疫原性（Falsey和Walsh,1996；Falsey和Walsh,1997；Groothuis等1998）。相似地，F、G和M蛋白的混合物的临床试验已在II期中止（ADISinsight临床数据库）。备选方法由人RSVG蛋白的抗原结构域与链球菌G蛋白的清蛋白结合结构域的C端的重组遗传融合组成（BBG2Na；Power等,2001）。BBG2Na的研究直至健康志愿者中的III期临床试验，但是，由于在一些免疫的志愿者中出现了非预期的3型超敏反应副作用（紫癜），该试验不得不终止（Meyer等,2008）。
最近的发展是用嵌合重组病毒作为RSV抗原的载体。通过在BPIV-3基因组中用来自HPIBV-3的同源基因取代F和HN基因来改造嵌合重组牛/人丙型副流感病毒3（rB/HPIV-3）。然后用得到的嵌合rB/HPIV-3毒株来表达HRSVF和G基因（Schmidt等,2002）。此疫苗目前处于临床研究中。
对于RSV引起的严重疾病，仅有限数目的预防和治疗选择可用。最广泛使用的干预基于衍生自小鼠单克隆抗体1129的人源化单克隆抗体的被动免疫预防（Beeler和vanWykeCoelingh,1989）。此抗体对RSVF蛋白特异，且中和A和B亚型病毒。重组人源化抗体1129称为palivizumab（也称为Synagis），用于在RSV感染时处于出现并发症的高风险的婴儿的预防性治疗。以月为基础肌内施用该抗体来在因早熟、慢性肺病或血流动力学上显著的先天性心脏病而处于风险的婴儿中降低RSV感染的风险（Bocchini等,2009）。一些研究已报道了用palivizumab预防RSV的可接受的成本-效果比（Prescott等,2010）。
由于市场上没有获批准的疫苗，仍存在研发和获得安全且有效的RSV疫苗的未得到满足的需要。令人惊奇地，我们发现，尤其是在它作为寡聚体、优选作为五聚体存在于载体上时，小疏水蛋白SH的胞外部分（胞外域）（称为SHe）可以安全地用于针对RSV感染的接种。此外，抗SHe的多克隆或单克隆抗体还可以预防性或治疗性地分别用于预防或治疗RSV感染。
本发明的第一方面是包含呼吸道合胞病毒（RSV）的小疏水（SH）蛋白的胞外域和载体的免疫原性组合物。在一个优选实施方案中，RSV是人A亚型或人B亚型毒株，在另一优选实施方案中，RSV是牛RSV。SH蛋白为本领域技术人员已知，包含64（RSV亚型A）、65（RSV亚型B）个氨基酸残基，或者对于牛RSV，包含81、77或72个氨基酸残基。在一个优选实施方案中，对于亚型A，SH的胞外域（SHe）由23个羧基端氨基酸组成（SEQIDN°1），对于亚型B，SH的胞外域（SHe）由24个羧基端氨基酸组成（SEQIDN°2）。优选地，该胞外域的序列选自SEQIDN°1（胞外域亚型A）和SEQIDN°2（胞外域亚型B）或其变体。本文所用的变体意指序列可以携带一个或多个突变，如缺失、插入或取代。优选地，该突变是取代。甚至更优选地，该变体具有在BLASTp比对（Altschul等,1997）中测量的80%同一性、优选85%同一性、甚至更优选90%同一性、最优选95%同一性。优选地，该变体包含序列NKLC/SEY/HK/NXF（SEQIDN°3）。优选的变体在SEQIDN°4-SEQIDN°16中列出。在另一优选实施方案中，该胞外域由SEQIDN°17（牛RSVSH的胞外域）或其如上文定义的变体组成。优选地，该变体包含序列NKLCXXXXXHTNSL（SEQIDN°18）。优选的变体在SEQIDN°19-30中列出。载体分子是与SH蛋白异源的分子；载体可以是本领域技术人员已知适合用于呈递抗原的任意载体，且包括但不限于病毒样颗粒，如HBcore（Whitacre等,2009）及衍生自组装的病毒壳体或外壳蛋白的其他VLP。还可以使用任意其他分子构建体，只要它可以有效地将抗原呈递至免疫系统，如五聚体软骨寡聚基质蛋白（comp；McFarlane等,2009）、血小板反应蛋白（Thromobospondins）3和4（Malashkevich等,1996）、细菌AB5型毒素的B亚基（例如霍乱毒素或大肠杆菌（E.coli）热不稳定毒素的亚基；Williams等,2006）、五聚体色氨酸拉链（Liu等,2004）、五聚体苯丙氨酸拉链（Liu等,2006）或四聚体GCN4衍生亮氨酸拉链（tGCN4；DeFilette等,2008）和Lpp-56（Shu等,2000）。载体可以具有蛋白质性质，以及具有非蛋白质性质。作为非限制性实例，非蛋白质性质的实例是脂质体、CLIPSTM构建体（Timmerman等,2007）和三甲基壳聚糖（Slütter等,2010）。优选地，该载体通过在一个支架上呈递多个SHe分子、通过在多聚化支架上呈递一个SHe或通过二者的组合来将SHe作为寡聚体、甚至更优选作为五聚体呈递。SHe寡聚体可以作为线性重复单位、或作为形成寡聚复合体的单个SHe单位、或作为二者的组合呈递。优选地，该载体是寡聚体载体（二聚体，至多为十聚体）。甚至更优选地，该载体是五聚体载体。在一个具体实施方案中，可以用SH的跨膜结构域（优选不含胞质结构域）作为寡聚化结构域，可选地进一步与载体融合或连接。并非所有载体分子都应负载SHe；实际上，作为非限制性实例，可以设想，六聚体载体只有5个单位负载SHe，从而在六聚体载体复合体上呈递五聚体SHe复合体。胞外域可以与载体遗传连接，形成融合蛋白；两个结构域可以直接融合，或者它们可以通过铰链序列或间隔区序列连接。如本文所使用，在遗传融合的构建体中，铰链序列是将两个结构域连接在一起的氨基酸序列；优选地，该序列以柔性方式连接两个结构域；优选地，该铰链序列短于150个氨基酸、甚至更优选短于100个氨基酸、甚至更优选短于50个氨基酸、最优选短于20个氨基酸。本文所用的间隔区指短于15个氨基酸的短铰链序列。在优选实施方案中，铰链序列包含序列(Gly-Ser)n，n等于1、2、3、…、20。在另一优选实施方案中，用免疫球蛋白基因的铰链（如人IgG1的铰链区）作为铰链序列。在遗传连接的情况下，该连接可以发生在SHe的氨基端以及羧基端。
备选地，将该胞外域与载体化学连接。化学连接为本领域技术人员已知，且包括但不限于通过将肽共价连接至载体表面上的反应位点而与该载体缀合的肽。得到的结构是缀合物。载体表面上的反应位点是具有化学活性或可以活化，且对于与肽的共价连接在空间上可及的位点。优选的反应位点是氨基酸赖氨酸的ε氮。共价连接指存在生理条件下对水解稳定的共价键。优选地，共价键对可以在生理条件下发生的其他反应（包括加合物形成、氧化和还原）稳定。通常，用双功能试剂来达到抗原肽与载体的连接（Hermanson,1996）。SHe中任意适宜的残基都可以用于与化学载体的连接；优选地，SHe通过其氨基端或羧基端与载体连接。
还在另一实施方案中，胞外域通过非共价相互作用与载体连接，该非共价相互作用如但不限于疏水相互作用、协同氢键相互作用或范德瓦尔斯相互作用。
本发明的另一方面是本发明的免疫原性组合物作为疫苗的用途。本发明的另一方面是本发明的免疫原性组合物在制备用于防御RSV感染的疫苗中的用途。优选地，该RSV选自RSV亚型A和RSV亚型B。可以通过本领域技术人员已知的任意途径来对待治疗的个体施用该疫苗，该途径包括但不限于鼻内、腹膜内、肌内和真皮内施用。优选地，接种后在RSV感染时不存在疾病症状的增强。该疫苗可以用于动物或用于人类。优选的动物用途是用于通过接种来保护牛或其他牛科（Bovidae）动物免受与人RSV相关的牛呼吸道病毒（如但不限于牛RSV）感染。防御RSV感染涵盖预防性和治疗性用途二者。更具体而言，该疫苗的优选用途是用于预防性目的。本文所用的“疫苗的制备”意指可以通过加入适宜的赋形剂来优化本发明的免疫原性组合物，或者，作为非限制性实例，可以配制它来增加疫苗的货架期或改善疫苗的药物特征。
本发明的另一方面是疫苗，其包含本发明的免疫原性组合物或本发明的免疫原性组合物的组合。实际上，作为非限制性实例，可以混合包含RSV亚型A的SHe和RSV亚型B的SHe的免疫组合物来获得具有更宽特异性的疫苗。该疫苗可以用于人用或兽用。除免疫组合物外，该疫苗可以包含一种或多种其他化合物，如佐剂。优选地，该疫苗是用于保护人类免受RSV感染，或者在动物中保护动物免受与人RSV相关的动物呼吸道病毒（如但不限于牛RSV）感染的疫苗。
本发明的另一方面是本发明的免疫原性组合物在检测和/或纯化抗RSV的胞外域的抗体中的用途。可以在用本发明的免疫原性组合物接种个体后分离这类抗体；备选地，类似的抗体和/或产生抗体的细胞还可以从RSV感染的人或动物个体获得，并在本领域已知的正确研发后用来产生SHe特异性抗体，优选人型抗体，其可以用于上述预防性或治疗性目的。
本发明的另一方面是用于从动物产生血液、血浆和/或血清的方法，该血液、血浆和/或血清包含一种或多种抗RSV的SHe结构域的抗体或产生抗RSV的SHe结构域的抗体的细胞，该方法包括：（a）将本发明的免疫原性组合物递送至该动物；和（b）从该动物获得血液、血浆和/或血清，其中该血液、血浆和/或血清包含一种或多种抗RSV的SHe结构域的抗体或产生抗RSV的SHe结构域的抗体的细胞，或产生该抗体的细胞。优选地，该动物是非人动物。本文所用的血浆是去除血细胞后的血液的液体级分；血清是去除去除凝血因子I和其他凝血因子(bloodclothingfactor)后的血浆。如上文所示，可以用本发明的免疫原性组合物来分离特异性抗SHe抗体。
本发明的另一方面是包含RSV抗体且用本发明的方法获得的血液、血浆和/或血清在防御RSV感染和/或治疗RSV感染中的用途。如上文所述，防御RSV感染涵盖预防性和治疗性用途二者。实际上，可以对人或动物施用包含抗体的血清，从而提供针对RSV感染的被动免疫。该血清可以是包含血清的药物组合物的部分，其中用适宜的赋形剂配制和/或混合该血清。因此，本发明的另一方面是药物组合物，其包含用本发明的方法获得的血清。
本发明的另一方面是抗RSVSH蛋白的胞外域的RSV抑制性单克隆抗体。本文所用的RSV抑制性意指，在感染时，在适宜的动物模型中测量，与未处理的动物相比，处理的动物中肺病毒效价更低。优选地，该单克隆抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
本发明的另一方面是药物组合物，其包含本发明的抗RSVSH蛋白的胞外域的单克隆抗体。实际上，可以用免疫的非人动物的器官（优选该动物的脾）或来自免疫的动物或人个体的血液样品作为起始物质来产生单克隆抗体和衍生物，如但不限于单链抗体、多价抗体或与抗病毒化合物连接的抗体。该单克隆抗体和衍生物用于被动免疫或用于治疗RSV感染。
附图简述
图1：A，A亚型人RSV（hRSV）SH胞外域（SEQIDN°1）、B亚型人RSVSH胞外域（SEQIDN°2）和牛RSV（bRSV）SH胞外域（SEQIDN°17）的氨基酸序列。B，Flag-COMPcc-She的氨基酸序列（SEQIDN°35）。前九个氨基酸表示N端Flag标记。斜体字表示的氨基酸（AA）表示大鼠COMP的卷曲螺旋结构域（AA25-72）。下划线的AA表示RSVA小疏水蛋白的胞外域（SHe）。C，Flag-COMPcc-SHe五聚体蛋白质的示意图。D，COMPcc-SHe五聚体蛋白质的示意图。
图2：Flag-COMPcc-SHe的纯化及其相对分子量的测定。A，在superdex75柱上进行凝胶过滤时醛缩酶（1）、伴清蛋白（2）、清蛋白（3）、chymatrysinagen（4）、核糖核酸酶A（5）和Flag-COMPcc-SHe（6和7）的洗脱曲线。B，凝胶过滤后的Flag-COMPcc-SHe（图A的峰6）的SDS-PAGE分析的考马斯蓝染色。C，用来校准凝胶过滤柱的蛋白质、它们的相对分子量（Mr）、它们从柱洗脱时的体积（Ve）和计算的Kav（Kav=(Ve-V0)/(Vtot-V0)，V0=柱无效体积=9.05，Vtot=柱床体积=19.816）的概述。根据它的Ve及图D中所示的校准曲线来计算存在于峰6中的Flag-COMPcc-SHe的Mr。D，用来纯化五聚体Flag-COMPcc-SHe的superdex75凝胶过滤柱的校准曲线。
图3：用Flag-COMPcc-SHe与LTR192G组合接种Balb/c小鼠诱导SHe特异性抗体。A、B和C，用所示疫苗第一次、第二次或第三次免疫后存在于混合的小鼠血清中的SHe肽特异性IgG抗体的基于ELISA的测定。D，存在于用PBS、M2e-tGCN4/LTR192G或Flag-COMPcc-SHe/LTR192G接种的小鼠的混合血清中的SHe肽特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体。
图4：图3的图注中的Flag-COMPcc-SHe接种诱导可以识别细胞表面的SH胞外域的抗体。A，用不同稀释度的接种Flag-COMPcc-SHe的小鼠的血清染色的表达GFP和RSVSH的HEK293T细胞的流式细胞术分析。B，用来自接种Flag-COMPcc-SHe或M2e-tGCN4（阴性对照）的小鼠的血清染色的表达GFP和RSVSH的HEK细胞的流式细胞术分析。C，用来自接种Flag-COMPcc-SHe或M2e-tGCN4的小鼠的血清染色的表达GFP和萤光素酶的HEK细胞的流式细胞术分析。
图5：Flag-COMPcc-SHe接种抑制RSV复制。攻击后4天，处死所示组的小鼠，通过空斑检测来测定病毒肺效价。图表显示每只小鼠的每个肺的空斑形成单位的数目。空斑检测的检测极限为每个肺10PFU。Flag-COMPcc-SHe接种的小鼠和M2e-tGCN4接种的小鼠之间RSV肺效价的差异高度显著（***p≤0.0005）。
图6：Flag-COMPcc-SHe接种未在RSV感染时诱导增强的疾病。图表显示每只小鼠的相对体重，其计算为处死日（感染后4天）的体重与病毒感染日的体重之间的比值乘以100。
图7：SHe(cc4s)肽与mHBc病毒样颗粒的免疫显性环的化学连接。凝胶上方所示不同化学连接阶段的mHBc的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析：mHBc=纯化的mHBc，mHBc-SMBS+sMBS=加入化学接头Sulfo-MBS后的mHBc，mHBc-SMBS=大小排阻层析后的mHBc-SMBS，mHBC-SHe(cc4s)+SHe(cc4s)=与SHe(cc4s)肽孵育后纯化的mHBc-SMBS，mHBC-SHe(cc4s)=通过大小排阻层析纯化后的与mHBcVLP连接的SHe。
图8：mHBc-SHe(cc4s)保持其VLP构象。图表表示通过动态光散射测定的mHBc-SHe（cc4s）及良好描述的M2e-mBHcVLP1604的大小分布。大小分布表示为体积的函数。
图9：SHe-tGCN4的纯化。通过一系列柱层析步骤（阴离子交换、疏水相互作用和凝胶过滤层析）纯化后，对SHe-tGCN4进行SDS-PAGE分析，然后进行考马斯蓝染色。左图和右图分别表示还原（存在β-巯基乙醇）或非还原（缺乏β-巯基乙醇）条件下的SDS-PAGE分析。箭头指示单体和二聚体SHe-tGCN4蛋白质。
图10：SHe-tGCN4和mHBc-SHe(cc4s)接种都诱导SHe肽特异性抗体。A，数字表示通过SHe肽ELISA分析的第一次免疫、第一次加强免疫（加强）和第二次加强免疫（加强2）后存在于所示组的小鼠的混合血清中的SHe特异性IgG抗体的效价。B，数字表示通过肽ELISA测定的第二次加强免疫后存在于所示组的小鼠的混合血清中的SHe特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的效价。
图11：SHe-tGCN4和mHBc-SHe（cc4s）接种都减少肺RSV复制。攻击后3天，处死小鼠来通过QRt-PCR测定病毒肺效价。上图表示基因组RSVRNA的相对表达，对存在于所示组中每只小鼠的样品中的GADPHmRNA水平归一化。显示接种组之间的统计学差异。下图（B）与上图（A）相同，但还包含来自接种PBS的小鼠的结果。
图12：mHBc-SHe（cc4s）和tGCN4-SHe接种都不在RSV感染时诱导增强的疾病。数字显示所示每个组的小鼠的平均相对体重，其计算为所示日的体重和感染日（第0天）的体重之间的比值乘以100。
图13：3D11和3G8是分别属于IgG1和IgG2a亚型的两种SHe特异性单克隆Ab。图表显示1μg/μl的3D11和3G8单克隆抗体的稀释系列在通过鼠IgG1或小鼠IgG2a特异性二抗检测的ELISA测定中与SHe肽的结合。
图14：3D11和3G8mAb与在其细胞表面表达RSVSH蛋白的活细胞上的RSVSH胞外域结合。A，3D11和3G8mAb及匹配各同种型的对照抗体与表达GFP和RSVSH蛋白的Hek293T细胞的结合的流式细胞术分析。B，3D11和3G8mAb与表达与RSVSH蛋白或对照蛋白（萤光素酶）组合的GFP的Hek293T细胞的结合的流式细胞术分析。
图15：3D11和3G8mAb与RSV感染细胞的细胞表面的结合。用0.5MOI的RSVA2感染Vero细胞。转染24小时后，固定细胞，透化，并用3D11或3G8与多克隆抗-RSV血清组合染色来鉴定感染和未感染的细胞。上图表示免疫染色的概览（DAPI核着色剂、3D11和多克隆RSV血清），包括感染和未感染的细胞。下图表示上图中所示感染细胞的共焦图像。
图16：SHe特异性单克隆抗体被动免疫在小鼠中降低RSV感染。在RSV攻击前一天和RSV攻击后一天经鼻内施用来用PBS、SHe特异性3G8mAb或同种型对照抗体处理Balb/c小鼠。每个符号表示RSV攻击后4天单只小鼠的肺病毒效价。（**p≤0.01）。
图17：用KLH-SHe与弗氏不完全佐剂组合腹膜内接种Balb/c小鼠诱导SHe特异性抗体，并减少RSV复制。A，用所示疫苗第三次免疫（加强2）后存在于单只小鼠的血清中的She特异性IgG抗体的基于ELISA的测定。B，存在于用KLH-SHe接种的小鼠的混合血清中的SHe特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的基于ELISA的测定。C，KLH-SHe接种未在RSV感染时诱导增强的疾病。图表显示每只小鼠的相对体重，其计算为处死日（感染后5天）的体重和病毒感染日的体重之间的比值乘以100。接种KLH-SHe的小鼠和接种KLH的小鼠之间相对体重的差异显著（p≤0.005，Mann-WhitneyU检验）。D，KLH-SHe接种削弱了RSV复制。用106PFURSV攻击后5天，处死所示组的小鼠，制备肺匀浆来通过空斑检测测定病毒肺效价。图表显示每只小鼠的每个肺的空斑形成单位的数目。空斑检测的检测极限是每个肺20PFU。接种KLH-SHe的小鼠和接种KLH的小鼠之间RSV肺效价的差异显著（p≤0.005，Mann-WhitneyU检验）。E，对于接种KLH-SHe的小鼠，高效价的SHe特异性血清抗体与RSV复制的减少强相关。图表显示每只接种KLH-SHe的小鼠的SHe特异性血清IgG抗体的效价，及可以在感染后5天检测到的PFU/肺的数目。在图表中，显示最佳拟合曲线（上图）及其R2（确定系数）。
图18：用KLH-SHe与LTR192G组合鼻内接种Balb/c小鼠诱导SHe特异性抗体，并减少RSV复制。A，用所示疫苗第三次免疫（加强2）后存在于单只小鼠的血清中的SHe特异性IgG抗体的基于ELISA的测定。B，存在于用KLH-SHe接种的小鼠的混合血清中的SHe特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的基于ELISA的测定。C和D，存在于单只小鼠的BAL液中的SHe特异性IgG和IgA抗体的基于ELISA的测定，该小鼠用所示疫苗接种，并在收集BAL液前5天用RSV感染。E，KLH-SHe接种削弱了RSV复制。用106PFURSV攻击后5天，处死所示组的小鼠来通过空斑检测测定病毒肺效价。图表显示每只小鼠的每个肺的空斑形成单位的数目。空斑检测的检测极限是每个肺20PFU。接种KLH-SHe的小鼠和接种KLH的小鼠之间RSV肺效价的差异显著（p≤0.005，Mann-WhitneyU检验）。F，对于接种KLH-SHe的小鼠，存在于BAL液中的高效价SHe特异性IgG抗体与RSV复制的减少强相关。图表显示每只接种KLH-SHe的小鼠的SHe特异性BALIgG抗体的效价，及可以在感染后5天检测到的PFU/肺的数目。在图表中，显示最佳拟合曲线及其R2（确定系数）。
图19：KLH-SHe免疫血清被动免疫在小鼠中减少RSV感染。A，用所示疫苗第三次免疫（加强2）后存在于单只小鼠的血清中的SHe特异性IgG抗体的基于ELISA的测定。B，KLH-SHe免疫血清被动免疫在小鼠中减少RSV感染。RSV攻击前一天和RSV攻击后一天，对小鼠鼻内施用来自接种KLH-SHe或KLH的小鼠的血清或PBS。用106PFURSV攻击后5天，处死所示组的小鼠，制备肺匀浆来通过空斑检测测定病毒肺效价。图表显示每只小鼠的每个肺的空斑形成单位的数目。空斑检测的检测极限是每个肺20PFU。接种KLH-SHe的小鼠和接种KLH的小鼠之间RSV肺效价的差异显著（p≤0.05，Mann-WhitneyU检验）。C，KLH-SHe血清被动免疫未在RSV感染时诱导增强的疾病。图表显示每只小鼠的相对体重的平均值+/-SEM，其计算为特定日的体重和第一次被动免疫日的体重之间的比值乘以100。用KLH-SHe血清处理的小鼠和用KLH血清处理的小鼠之间相对体重的差异显著（p≤0.005，Mann-WhitneyU检验）。
图20：SHeB肽与mHBc病毒样颗粒的免疫显性环的化学连接。mHBcVLP、与SMBS异双功能交联剂连接的mHBcVLP（mHBc-SMBS）及纯化的具有化学连接的SHeB肽的mHBc-SMBSVLP（mHBc-SHeB）的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。
图21：接种mHBc-SHeB的小鼠的血清与RSVB感染细胞的表面的结合。用RSVB临床分离株感染Vero细胞或进行模拟感染。感染后72小时，固定细胞，透化或不透化。按所示用接种mHBc-SHeB的小鼠的血清或用接种KLH的小鼠的血清染色感染和模拟感染的细胞。用连接Alexa488的抗-小鼠IgG抗体来分析mHBc-B或KLH血清抗体与细胞的结合。A，对于显微镜分析，还用核染料DAPI染色细胞。B，对于流式细胞术分析，还用山羊抗-RSV血清染色未透化的细胞来鉴定RSVB感染的细胞。用连接Alexa633的抗-山羊IgG抗体来测定山羊抗-RSV血清抗体与细胞的结合。图表表示所示细胞的Alexa488强度/Alexa633强度等值线图。
图22：接种mHBc-SHeB诱导SHe特异性抗体，并减少RSVB诱导的肺炎。A，第一（免疫）、第二（加强1）和第三次mHBc-SHeB免疫（加强2）后存在于小鼠的混合血清中的SHeB和SHeA特异性IgG抗体的基于ELISA的测定。B，存在于接种KLH-SHe的小鼠的混合血清中的SHe特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体的基于ELISA的测定。C和D，存在于接种所示疫苗的单只小鼠的血清中的SHeB（C）和SHeA（D）IgG抗体的基于ELISA的测定。E，存在于RSV感染的已接种所示疫苗的小鼠的BAL液中的总细胞数。与接种mHBc的小鼠的BAL液相比，接种mHBc-SHe的小鼠的BAL液中存在显著少的细胞（p≤0.05,Mann-WhitneyU检验）。F，存在于BAL液中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的数目。与接种mHBc的小鼠的BAL液相比，接种mHBc-SHe的小鼠的BAL液中存在显著少的CD8+T细胞（p≤0.05,Mann-WhitneyU检验）。
图23：LPP(5)-SHe蛋白的表达和纯化。A，LPP(5)-SHe蛋白的表达。用1mM1-硫代-β-d-半乳吡喃糖苷（IPTG）刺激pLH36-HisDEVD-LPP(5)-SHe转化的大肠杆菌细胞或不刺激。4小时后，通过超声处理后离心（13000xg，30分钟，4℃）来制备粗提取物。通过SDS-PAGE及使用SHe特异性3G8单克隆抗体的Western印迹来分析上清。B，纯化的LPP(5)-SHe蛋白的分析。纯化后，通过SDS-PAGE、考马斯蓝染色（左）及使用SHe特异性3G8单克隆抗体的Western印迹（右）来分析LPP(5)-SHe蛋白。
图24：接种棉鼠的方案。组号指：
组1：6只棉鼠（CR），未接种，且在第+63天用RSV攻击（感染对照）；
组2：6CR，在第0天按2.04x105PFU/CR用RSV-Tracy鼻内接种；
组3：各6CR，用KLH-SHe+IFA腹膜内（IP）接种；
组4：各6CR，用KLH+IFA腹膜内接种（载体对照）；
组5：各6CR，用Vero细胞中培养的RSV-Bernett（1:10福尔马林灭活（FI））肌内（IM）接种（攻击时免疫恶化的阳性对照）。
实施例
实施例的材料和方法
克隆和质粒构建
pLT32Flag-COMPcc-SHe表达质粒的构建。在Genscript订购包含Flag-COMPcc-SHe（图1B）的编码序列的质粒（SEQIDN°31）。将Flag-COMPcc-SHe编码序列作为NdeI/NotI片段连接入NdeI/NotI打开的pLT32H细菌表达载体（Mertens等,1995）。
pCAGGS-Etag-SH表达载体的构建。按厂家的说明用高纯度RNA组织试剂盒（Roche,Mannheim）制备RSVA2感染的Hep-2细胞的总RNA。cDNA合成后，用以下正向和反向引物扩增RSVA2SH编码序列(5’ATAAGAAAGCGGCCGCTATGGAAAATACATCCATAACAATAG3’；5’GAAGATCTCTATGTGTTGACTCGAGCTCTTGGTAACTCAAA3’）。用NotI和BglII消化PCR产物，并连接入NotI/BglII打开的pCAGGS-PTB-Etag表达载体（Cornelis等,2005）。得到的载体pLT32-Flag-COMPcc-SHe按照布达佩斯条约于2010年11月8日以保藏号LMBP6817保藏于BCCM（BCCM/LMBP:Technologiepark927,9052兹维纳尔德,比利时）。
之前已描述了pCAGGS-Luc表达载体的构建（Schepens等,2005；称为pCAGGS-HIF-RLuc）。
pLT32mHBc表达载体的构建。在Geneart订购了之前由Jegerlhener等作为“ab1”质粒的部分描述的mHBc编码序列（SEQIDN°32）（DeFilette等,2005；Jegerlehner等,2002）。将此编码序列作为NdeI/NotI片段克隆入NdeI/NotI打开的pLT32H细菌表达载体。
pLT32SHe-tGCN4-Flag表达载体的构建。为了构建pLT32SHe-tGCN4，通过融合PCR来将SHe编码序列与tGCN4-Flag序列融合。用引物5’GGAATTCCATATGAACAAGTTATGTGAGTACAACG3’和5’GATTTGTTTTAAACCTCCTGTATTTACTCGTGCCCGAGGCAA3’及模板质粒扩增用于融合PCR的SHe片段，该模板质粒在Geneart订购（SEQIDN°33），且包含RSVA2SH胞外域（NKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT）的编码序列（SEQIDN°40）。用引物5’CCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGA3’和5’TATTAACCCTCACTAAAGGGAAGG3’及模板质粒扩增用于融合PCR的GCN4片段，该模板质粒包含tGCN4编码序列，该编码序列在C端与3个连续的Flag标记序列的编码序列融合（SEQIDN°34；DeFilette等,2008）。用引物5’GGAATTCCATATGAACAAGTTATGTGAGTACAACG3’和5’TATTAACCCTCACTAAAGGGAAGG3’来融合两种PCR片段。将此融合PCR产物作为NdeI/HindIII片段克隆入NdeI/HindIII打开的pLT32H细菌表达载体。得到的pLT32SHe-tGCN4-Flag按照布达佩斯条约于2010年11月8日以保藏号LMBP6818保藏在BCCM（BCCM/LMBP:Technologiepark927,9052兹维纳尔德,比利时）。
之前已描述了PLT32M2e-tGCN4表达载体的构建（DeFilette等,2008）。
pLH36-HisDEVD-LPP(5)-SHe表达质粒的构建。在Genscript订购了包含LPP(5)色氨酸拉链编码序列的质粒，该色氨酸拉链编码序列与SH胞外域编码序列融合，并由GlyGly接头的编码序列分开。用以下正向和反向引物（5'GCGAAATGGGATCAGTGGAGCAGC-3'；5'AATATAGGATCCCTAGGTCGCCCAGTTATCCCAGCG-3'）扩增此编码序列，磷酸化，并用BamHI消化。通过使用所述PCR片段、BamHI/PstI消化的pLT32质粒片段和EcoRV/PstI消化的pLH36片段的三点连接来构建pLH36-HisDEVD-LPP-SHe。SEQIDN°49中显示所构建的pLH36-HisDEVD-LPP(5)-SHe质粒的序列。
SHe-tGCN4、M2e-tGCN4、Flag-COMPcc-SHe、mHBc和LPP(5)-SHe的表达和纯化
于28℃在LB（培养基）中培养pLT32SHe-tGCN4转化的大肠杆菌的30ml预培养物，并用来接种1升新鲜培养基。A600为0.6-0.8时，用1mm异丙基-1-硫代-β-d-半乳吡喃糖苷处理细胞，再孵育4小时，然后通过离心（6000×g，20分钟，4℃）收集。将细菌沉淀重悬在20mlpH8的Tris-HCl缓冲液（50mMTris-Hcl、50mMNaCl和1mMEDTA）中，并超声处理。通过离心（20,000×g，1小时，4℃）来沉淀细菌碎片。将上清加样至用含50mMNaCl的Tris-HCl缓冲液（缓冲液A）预平衡的DEAE琼脂糖柱。洗涤后，通过0-40%缓冲液B（50mMTris-Hcl、1MNaCl）和40-100%缓冲液B的两步梯度来洗脱结合的蛋白质。混合含有SHe-tGCN4的级分，调节至25%硫酸铵饱和，并加样至用25%硫酸铵、50mmTris-HCl、pH8预平衡的苯基-琼脂糖柱。用两步梯度洗脱结合的蛋白质。用0-40%和40-100%50mMTris-HCl缓冲液pH8（缓冲液A）进行两步洗脱。将含有SHe-tGCN4的级分加样至Superdex75柱。在磷酸缓冲盐溶液（PBS）中进行凝胶过滤，混合含有SHe-tGCN4的级分，并保存在-70℃。
除用Q琼脂糖柱代替DEAE琼脂糖柱进行阴离子交换层析外，flag-COMPcc-SHe的表达和纯化与SHe-tGCN4相同。
之前已描述了M2e-tGCN4的表达和纯化（DeFilette等,2008）。
除用SephacrylS400柱代替Superdex75柱进行凝胶过滤层析外，mHBc的表达和纯化与SHe-tGCN4相同。
LPP(5)-SHe的表达和纯化。于28℃在含氨苄青霉素的LB培养基中培养pLH36-HisDEVD-LPP(5)-SHe转化的大肠杆菌细胞的30ml预培养物，并用来接种3升新鲜培养基。A600为0.6-0.8时，用1mM异丙基-1-硫代-β-d-半乳吡喃糖苷处理细胞，再孵育4小时，然后通过离心（6000×g，20分钟，4℃）收集。将细菌沉淀重悬在300ml含20mMNaH2PO4/Na2HPO4、300mMNaCl和5mM咪唑的pH7.5的缓冲液中，并超声处理。通过离心（20,000×g、1小时、4℃）来沉淀细菌碎片。将上清上样至用含5mM咪唑的缓冲液预平衡的镍-琼脂糖柱上。洗涤后，通过分步（50mM、100mM、200mM和400mM）咪唑梯度来洗脱结合的蛋白质。混合含有LPP(5)-SHe的级分，脱盐，并在Q-琼脂糖柱上进一步纯化。将样品加样至用含50mMNaCl的Tris-HCl缓冲液（缓冲液A）预平衡的DEAE琼脂糖柱上。洗涤后，通过0-40%缓冲液B（50mMTris-Hcl、1MNaCl）和40-100%缓冲液的两步梯度来洗脱结合的蛋白质。将含LPP(5)-SHe的级分加样至Superdex75柱上。在磷酸缓冲盐溶液（PBS）中进行凝胶过滤，含有LPP(5)-SHe的级分
佐剂
用热不稳定大肠杆菌肠毒素的脱毒突变体LTR192G来进行鼻内（i.n.）施用；此制备物由J.Clements博士（DepartmentofMicrobiologyandImmunology,TulaneUniversityMedicalCenter,NewOrleans,LA,USA）惠赠（Norton等,2010）。
She-HBc颗粒的化学连接和表征
在Pepscan（Pepscan,Lelystad）订购了SHe（cc4s），SHe（cc4s）是化学合成、HPLC纯化的SHe肽，其中用丝氨酸取代天然存在的半胱氨酸，并在其N端添加半胱氨酸。按照厂家的说明，通过使用异双功能sulfo-MBS（Pierce）的化学连接来将SHe（cc4s）肽经其N端半胱氨酸残基与HBcVLP表面的mHBc的免疫显性环中的赖氨酸融合。简言之，将溶解在200μlPBS中的400μgmHBc与Sulfo-MBS（终浓度为1mg/ml）孵育1小时。通过大小排阻层析去除未结合的Sulfo-MBS分子后，将连接sulfo-MBS的mHBcVLP稀释在2mlH2O中。随后，加入100μlSHe（cc4s）肽（溶解在100mlPBS中），并在室温孵育1小时，以允许肽与mHBcVLP交联。最后，通过大小排阻层析去除游离的SHe（cc4s）肽。通过SDS-PAGE后的考马斯蓝染色来测试纯度和交联效力。
细胞
Hep-2细胞（ATCC,CCL-23）、Vero细胞（ATCC,CCL-81）、HEK293T细胞（M.Hall博士惠赠）和A549细胞（ATCC,CCL-185）培养在补充了10%热灭活胎牛血清（FCS）、1%青霉素、1%链霉素、2mML-谷氨酰胺、非必需氨基酸（Invitrogen,Carlsbad,Carlifornia）和1mM丙酮酸钠的DMEM培养基中。
小鼠和病毒
无特定病原的雌性BALB/c小鼠获自CharlesRiver（CharlesRiverWiga,Sulzfeld,德国）。动物居住在12小时明/暗周期的温控环境中；食物和水随意取用。在动物房中适应1周后，在8周龄时免疫小鼠。
动物设施在FlemishGovernmentLicenseNumberLA1400091下运转。所有实验均在法律（1993年11月14日的EuropeanDirectiveandBelgianRoyalDecree）规定和InstitutionalEthicalCommitteeonExperimentalAnimals批准的条件下进行。
通过在含1%FCS的生长培养基的存在下按0.1MOI感染单层Vero细胞来繁殖RSVA2（RSV的A亚型）（ATCC,Rockville）。感染后5至7天，收集细胞和生长培养基，混合，并通过离心（450xg）来澄清。为了浓缩病毒，在10%聚乙二醇（PEG6000）的存在下4℃孵育澄清的上清4小时。离心（3000xg，30分钟）后，将沉淀重悬在含20%蔗糖的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，分装，并保存在-80℃。
鼻内免疫和感染
对于鼻内免疫或感染，通过异氟烷轻度麻醉小鼠。用于施用疫苗+佐剂或病毒的最终体积为50μl（每个鼻孔25μl）。疫苗+佐剂配制在PBS中，而病毒接种物配制在HBSS中。
通过空斑检测来测定肺病毒效价
攻击后3至4天，处死小鼠。无菌条件下取出小鼠肺，并用HeidolphRZR2020匀浆器在1ml含10%蔗糖的HBSS中匀浆30秒。随后通过在4℃离心来澄清肺匀浆，并用于Hep-2细胞上的病毒滴定。用50μl系列1:3稀释物在96孔板中的肺匀浆在补充了青霉素和链霉素的无血清OPTIMEM培养基（Invitrogen）中感染单层Hep-2细胞。4小时后，用含2%FCS的DEMEM培养基洗涤细胞两次，并在50μl叠层培养基（overlaymedium）（含1%FCS、0.5%琼脂糖的完全DEMEM培养基）中37℃孵育5天。通过在琼脂糖叠层顶部加入50μl4%多聚甲醛溶液来固定细胞。4℃过夜固定后，去除叠层培养基和多聚甲醛溶液，用PBS洗涤细胞两次，并用含1%BSA的PBS（PBS/BSA）封闭。随后，加入多克隆山羊抗RSV血清（AB1128，ChemiconInternational）（1/4000）。用PBS/BSA洗涤3次后，用缀合hrp的抗山羊IgG抗体（SC2020,SantaCruz）孵育细胞30分钟。通过用含0.01%Triton-X100的PBS/BSA洗涤4次并用PBS洗涤1次来去除未结合的抗体。最后，用TrueBlue过氧化物酶底物（KPL,Gaithersburg）来显示空斑。计数不同稀释度的空斑，对于每个稀释度，按以下计算每个肺（1ml）的PFU的数目：存在于该稀释度中的空斑数x稀释度x20（=1000μl总上清体积/用来感染稀释系列的第一个孔的上清的50μl体积）。然后将PFU/肺的数目计算为针对不同稀释度计算的PFU/肺的平均数。由于重复测试匀浆肺的每个上清，将PFU/肺的最终数目计算为这些重复的平均值。
通过qRT-PCR测定肺病毒效价
为了通过qRT-PCR测定肺RSV负荷，按上文所述制备并澄清肺匀浆。通过按照厂家的说明使用高纯度RNA组织试剂盒（Roche,Mannheim）来从这些肺匀浆制备总RNA。用六聚体引物和TranscriptorFirstStrandcDNA合成试剂盒（Roche,Mannheim）来制备cDNA。用qRT-PCR来测定基因组RSVMcDNA的相对水平，该qRT-PCR使用对RSVA2M基因的基因组RNA特异的引物（5’TCACGAAGGCTCCACATACA3’和5’GCAGGGTCATCGTCTTTTTC3’）及5’端用荧光素（FAM）标记、3’端附近用暗的淬灭染料标记的核苷酸探针（#150UniversalProbeLibrary,Roche）。通过qRT-PCR来测定GADPHmRNA的相对量，该qRT-PCR使用对小鼠GADPH特异的引物（5’TGAAGCAGGCATCTGAGGG3’和5’CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG3’）及LightCycler480SYBRGreenIMaseterMix（Roche）。将每个肺匀浆的基因组RSVRNA的相对量计算为RSVM基因RNA的相对量和小鼠GADPHmRNA的相对量之间的比值。
肽ELISA
每次免疫后2周，从侧尾静脉采集血样。通过心脏穿刺阿氟丁麻醉的动物来进行最后的采血。使血液在37℃凝固30分钟，通过从随后的两次离心取上清来获得血清。
使用来自组的混合血清，通过ELISA测定血清抗体效价。为了测定M2e或SHe特异性抗体效价，分别用50μl50mM碳酸氢钠缓冲液pH9.7中的2μg/mlM2e肽溶液或2μg/mlSHe肽溶液包被微量滴定板（typeIIF96MaxiSorp,Nunc），并在37℃过夜孵育。洗涤后，用200μl含1%BSA的PBS封闭平板1小时。孵育1小时后，再次洗涤平板。将不同血清样品的1/3稀释的系列（从1/100稀释开始）加样至肽包被的平板上。用过氧化物酶标记的抗小鼠同种型IgG1或IgG2a的抗体（SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.,Birmingham,AL,USA）检测结合的抗体，该过氧化物酶标记的抗体1/6000稀释在PBS+1%BSA+0.05%Tween20中。洗涤后，用TMB底物（四甲基联苯胺，Sigma-Aldrich）孵育微量滴定板5分钟。通过加入等体积的1MH3PO4来终止反应，并测量450nm吸光度。终点效价定义为产生背景O.D.值（免疫前血清）2倍的O.D.值的最高稀释度。
流式细胞术分析
用所示表达载体转染Hek293T细胞。24小时后，用不含酶的解离缓冲液（Invitrogen,Carslbad,California）脱附细胞，用PBS洗涤1次，并在含1%BSA的PBS（Hek293T）中孵育1小时。随后，按所示浓度用所示血清或抗体孵育细胞。1小时后，用PBS/BSA洗涤细胞3次，并用抗-小鼠IgGalexa633第二抗体孵育30分钟。用PBS/BSA洗涤细胞4次后，用BectonDickinsonLSRII流式细胞仪分析细胞。根据侧向散射信号的峰表面、前向散射信号的峰表面和峰高及绿色荧光信号的峰表面来选择仅表达GFP的细胞。最后，在这些GFP阳性单细胞中测量alexa633荧光信号。
免疫染色
在无血清培养基的存在下模拟感染的Vero细胞或用0,5MOI的RSVA2感染的Vero细胞。4小时后，洗去游离的病毒，在含1%FCS的生长培养基中孵育细胞。16小时后，用PBS洗涤细胞1次，并用2%多聚甲醛固定20分钟。随后，用PBS洗涤细胞2次，并用0,2%Triton-X100去垢剂透化5分钟。用PBS洗涤1次后，在PBS/BSA中封闭细胞。1小时后，按5μg/ml的终浓度加入She特异性3G8单克隆抗体或同种型对照抗体。用PBS/BSA洗涤细胞2次后，加入多克隆抗RSV山羊血清。1小时后，用PBS/BSA洗涤细胞3次。通过使用分别用alexa488和alexa568荧光染料标记的抗-小鼠和抗-山羊IgG抗体来分析所示抗体与细胞的结合。用Zeiss共焦显微镜记录染色细胞的共焦图像。
产生SHemAb的杂交瘤的产生
通过杂交瘤技术（Kohler和Milstein1975）来产生产生SHe特异性单克隆抗体（mAb）的稳定杂交瘤细胞。简言之，从单只小鼠衍生SHe特异性杂交瘤，该小鼠按3周的间隔用10μg以allhydrogel（BrenntagBiosector）为佐剂的SHe-tGCN4疫苗腹膜内免疫3次。融合前3天，用相同的制剂再次加强小鼠额外的时间，分离脾细胞，然后在PEG1500（RocheDiagnosticsGmbH,德国）的存在下与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合。将融合的细胞培养在补充了10%胎牛血清、10%BMcondimedH1（RocheDiagnosticsGmbH,德国）、2mML-谷氨酰胺和24μMβ-巯基乙醇和1xHAT补充物（Invitrogen,Carlsbad,Carlifornia）的RPMI1640培养基中。通过SHe肽Elisa筛选来鉴定分泌SHe特异性抗体的杂交细胞（hybrid），并在通过有限稀释法进行两轮亚克隆后获得产生单克隆抗体的杂交细胞。在A蛋白-琼脂糖柱（electricalengineeringbiosciences）上纯化单克隆抗体。
得到的杂交瘤已根据布达佩斯条约保藏于BCCM（BCCM/LMBP:Technologiepark927,9052兹维纳尔德,比利时），3G8以保藏号LMBP7795CB于2010年11月8日保藏，3D11以保藏号LMBP7796CB于2010年11月10日保藏。
实施例1：Flag-COMPcc-She的设计、表达和纯化
SH蛋白作为五聚体表达在RSV病毒粒子的表面和RSV感染细胞的质膜上。SH的五聚体组织通过SH跨膜结构域来组织，该跨膜结构域寡聚为5个平行α-螺旋的卷曲螺旋。为了将RSVA的C端SH胞外域（SHe）作为模拟其天然构象的五聚体呈递，将SHe遗传融合至大鼠软骨寡聚基质蛋白（COMPcc）的短的五聚体卷曲螺旋结构域，其也由5个平行α-螺旋组成（Malashkevich等,1996；图1）。将Flag标记融合至COMP的N端，得到Flag-COMPcc-SHe。将Flag-COMPcc-SHe克隆在pLT-32（Mertens等,1995）表达载体中，在大肠杆菌中表达，并纯化。凝胶过滤分析显示，Flag-COMPcc-SHe作为55-60kDa的复合体洗脱，表明11kDa的Flag-COMPcc-SHe蛋白确实寡聚为五聚体（图2）。
实施例2：Flag-COMPcc-SHe接种诱导SHe特异性抗体并防御RSV感染
为了测试用Flag-COMPcc-SHe接种是否可以引起针对RSV感染的保护，我们使用了BALB/c小鼠RSV感染模型。用25μgFlag-COMPcc-SHe与1μg大肠杆菌热不稳定肠毒素LTR192G佐剂组合鼻内免疫BALB/c小鼠三次。用PBS和与四聚体GNC4支架融合的甲型流感M2胞外域（M2e-tGNC4）（DeFilette等,2008）作为阴性对照。每两周进行免疫。用单次RSV感染（5X105PFU）作为阳性对照。在每次免疫后的第一周和第二周之间，采集血液来考查SHe特异性IgG抗体的诱导。首先通过SHe肽ELISA来测试SHe特异性抗体的存在。用M2e肽ELISA作为阴性对照。图3证明，诱导了SHe肽特异性IgG抗体，并分别在用Flag-COMPcc-SHe第二和第三次免疫后加强。三次连续的Flag-COMPcc-SHe/LTR192G免疫产生高水平的IgG2aSHe特异性抗体，但仅产生低水平的IgG1SHe特异性抗体，显示Th1取向/驱动的免疫反应。在接种PBS或M2e-tGCN4/LTR192G的小鼠中检测不到SHe特异性IgG抗体（图3A、B和C）。如预期，在接种Flag-COMPcc-SHe/LTR192G或PBS的小鼠的血清数据中检测不到M2e特异性抗体。用M2e-tGCN4免疫的小鼠累积了高效价的M2e特异性IgG2a抗体，与之前的结果一致（DeFilette等,2008）。
随后，我们通过流式细胞术考查了存在于Flag-COMPcc-SHe免疫血清中的SHe特异性抗体是否可以结合在其表面表达RSV-SH蛋白的细胞。用GFP表达载体与SH表达载体（pCAGGS-Etag-SH）组合或与萤光素酶表达载体（pCAGGS-Luc）组合作为阴性对照来转染HEK-293T细胞。转染后24小时，脱附细胞，用不同稀释度的Flag-COMPcc-SHe或M2e-tGCN4免疫血清染色，并通过流式细胞术分析。图4显示，与M2e-tGCN4免疫血清不同，来自接种Flag-COMPcc-SHe的小鼠的血清特异性结合表达在活细胞表面上的SH蛋白。
为了测试Flag-COMPcc-SHe/LTR192G接种是否可以引出针对RSV感染的保护，在最后一次免疫后9周用1X106PFURSVA2攻击小鼠。感染后4天，处死小鼠来通过空斑检测测定病毒肺效价。图5显示，与接种PBS和M2e-tGCN4的小鼠相比，用Flag-COMPcc-SHe接种减少了RSV复制。在攻击前用活RSV感染的小鼠中检测不到病毒。
众所周知，用福尔马林灭活的病毒或RSVG蛋白接种可以通过诱导失衡的Th2免疫反应来在感染时诱导疾病的增强，导致显著的发病率（Prince等,1986）。为了测试接种Flag-COMPcc-SHe是否也诱导疾病的增强，我们监测了RSV攻击之前和之后的体重（图6）。RSV攻击后未在任意小鼠组中观察到体重减轻。这强烈表明，接种Flag-COMPcc-SHe未导致RSV感染时疾病的增强。
实施例3：mHBc-SHe的设计、构建和纯化
乙型肝炎病毒核心蛋白质（HBc）病毒样颗粒（VLP）可以将抗原作为密集阵列呈递。这样，HBc-VLP可以诱导针对所呈递的抗原的强烈体液免疫应答（Boisgerault等,2002）。因此，作为将SHe作为五聚体呈递的备选方式，将SH胞外域呈递在mHBc-VLP的免疫显性区环中。通过将SHe肽与mHBc化学连接来获得HBc-SHe-VLP，mHBc是HBc的突变体，其中在HBc免疫显性区的顶部引入赖氨酸（DeFilette等,2005）。为了能够进行化学连接，在SHe的N端添加半胱氨酸残基。此外，用丝氨酸残基取代存在于SHe肽的4位上半胱氨酸残基。此肽称为SHe-CC4S。通过大小排阻层析纯化mHBc-SHe-VLP后，通过SDSPAGE来检查交联的程度。图7显示，约50%的HBc蛋白质与SHe-CC4S肽化学连接。较慢的迁移条带很可能代表连接了2至3个SHe（cc4s）肽的mHBc单体。为了测试连接SHeCC4S的mHBc蛋白质是否仍组装为预期大小（30-34nm）的VLP，对产生的mHBc-SHe颗粒及作为全功能参考的1604M2e-HBcVLP进行了动态光散射分析。图8显示，mHBc-SHe-CC4S的大小分布与1604M2e-HBc对照的大小分布重叠，最大为30nm，其符合所报道的HBcVLP的大小（Clarke等,1987）。
实施例4：SHe-tGCN4-Flag的设计、构建和纯化
继将SHe肽呈递在mHBcVLP的表面上之后，还将SHe与tGCN4融合，已知tGCN4诱导针对融合肽（RefmarinaGCN4）的强烈体液应答。分别将SHe和Flag标记与tGCN4编码序列的5’端和3’端遗传连接，并克隆入PLT32表达载体。在大肠杆菌中表达后，通过阴离子交换、疏水相互作用和凝胶过滤层析来纯化重组SHe-tGCN4-Flag（图9）。
实施例5：接种mHBc-SHe（CC4S）和SHe-tGCN4诱导SHe特异性抗体并防御RSV感染
为了测试用mHBc-SHe（CC4S）和SHe-tGCN4接种是否可以引起针对RSV感染的保护，用10μgmHBc-SHe（CC4S）和SHe-tGCN4与1μgLTR192G佐剂组合鼻内接种BALB/c小鼠三次。用PBS和空mHBc（后者与1μgLTR192G组合）作为阴性对照。每3周进行免疫。用单次RSV感染（5.105PFU）作为阳性对照。在每次免疫后的第二周和第三周之间，采集血液来考查SHe特异性IgG抗体的诱导。通过SHe肽ELISA来测试She特异性抗体的存在。图10A证明，诱导了SHe肽特异性IgG抗体，并分别在用mHBc-SHe（CC4S）和SHe-tGCN4第二和第三次免疫后加强。三次连续的Flag-COMPcc-SHe/LTR192G免疫产生高水平的IgG2aSHe特异性抗体，稍低水平的IgG1SHe特异性抗体，显示Th1取向/驱动的免疫反应（图10B）。
为了测试用mHBc-SHe（CC4S）或SHe-tGCN4接种是否可以妨碍RSV感染，在最后一次加强免疫后3周用5.106PFURSV-A2攻击小鼠。攻击后3天，处死小鼠来通过QPCR测定肺RSV-A2水平。图11显示，用mHBc-SHe（CC4S）或SHe-tGCN4接种的所有小鼠或预先用RSV感染的小鼠具有比用mHBc接种的小鼠低的肺基因组RSVRNA水平。这些数据确认了我们之前的观察结果，基于黏膜SHe的接种可以部分保护小鼠免受RSV复制。显著地，用空mHBc与LTR192G佐剂组合接种的所有小鼠都显示比用不含LTR192G佐剂的PBS免疫的小鼠低的RSV水平。这可以解释为LTR192G对小鼠先天免疫系统的作用。已显示大肠杆菌热不稳定肠毒素通过先天印记来提供针对肺病毒感染（包括RSV）的一般保护（参考Williams和Hussel2004）。LTR192G的先天印记对肺病毒复制的作用似乎是暂时的，因为当病毒感染发生在最后一次LTR192G施用后9周时，TLR192R对RSV复制的影响强烈降低。同样，没有一只小鼠显示显著的体重减轻，表明在通过VLP或tGCN4呈递时，用SHe接种不在攻击时诱导疾病的增强（图12）。
实施例6：SHe特异性单克隆抗体的产生和测试
为了考查可以与感染的细胞相互作用的SHe特异性抗体是否可以提供针对RSV感染的保护，我们基于SHe-TGCN4免疫小鼠研发了RSVSHe特异性单克隆抗体。选择了产生在ELISA中与SHe肽有效结合的抗体的一个IgG1（3D11）亚型杂交瘤和一个IgG2a（3G8）亚型杂交瘤，亚克隆，并用于抗体产生。通过A蛋白亲和层析纯化3D11和3G8，并通过ELISA测定对SHe的结合效力。图13显示3D11和3G8可以结合包被的SHe肽，且分别属于IgG1和IgG2a亚型。
由于抗体可以识别并通过ADCC或CDC杀死感染细胞来防御病毒感染，我们考查了SHe特异性mAb3D11和3G8是否可以识别细胞表面的SH。因此，用RSVSH表达载体或用对照萤火虫萤光素酶载体（Schepens等,2005）（二者都与GFP表达载体组合）转染Hek293T细胞。转染后24小时，用不同浓度的SHe特异性单克隆抗体（3D11和3G8）或同种型匹配的流感M2e特异性抗体（14C2IgG1和IG2aM2e特异性mAb）染色活细胞。用来自Flag-COMPcc-SHe免疫小鼠的多克隆血清作为阳性对照。图14证明，Flag-COMPcc-SHe多克隆血清以及3D11和3G8mAb二者都可以容易地与表达SH的细胞结合，但不与对照细胞结合。相反，IgG1和IgG2a流感M2e特异性抗体都不能与表达SH的细胞结合。这些数据清楚地证明，3D11和3G8都可以识别表达在细胞表面的SH的胞外域。
感染过程中，RSVSH蛋白主要表达在ER、高尔基体和细胞膜。因此，为了更直接地考查RSVSH特异性抗体是否可以通过表达在感染细胞表面的SH来识别这些细胞，我们进行了RSV感染的细胞和模拟感染的细胞的免疫染色。用0.05MOI的RSV感染或模拟感染人A549肺上皮细胞。感染后24小时，固定细胞，并用SHe特异性mAb3D11或3G8与多克隆抗-RSV免疫血清组合染色。图15显示，SHe特异性mAb3D11和3G8可以容易地识别感染细胞的细胞膜上及细胞核附近（可能对应于ER和高尔基体）的SH。这表明，SHemAb通过识别RSV感染细胞来防御RSV感染。这样，本文描述的SHemAbs3D11和3G8可以用作预防性或治疗性处理。
实施例7：使用SHe特异性mAB3G8的被动免疫减少了RSV复制
为了测试SHe特异性抗体是否可以在体内减少RSV复制，用SHe特异性单克隆抗体被动免疫小鼠。在RSV攻击前一天和RSV攻击后一天对小鼠鼻内施用SHe特异性3G8单克隆抗体、同种型对照抗体或PBS。RSV攻击后3天，采集血液来针对mAb在所处理的小鼠的血清中的存在进行测试。RSV攻击后4天，处死小鼠来测定肺中病毒效价。肽ELISA证明，用各抗体处理的小鼠的血清中存在低浓度的SHe特异性抗体和同种型对照抗体（数据未显示）。图16显示，与用PBS或同种型对照单克隆抗体处理的小鼠相比，接受SHe特异性单克隆抗体的小鼠具有降低的肺RSV效价。这些数据表明，鼻内施用SHe特异性抗体可以在小鼠中减少RSV感染。
实施例8：SHe-KLH的构建
为了测试在经其他途径、用其他佐剂、用其他载体施用基于SHe的疫苗时，此疫苗是否也可以防御RSV感染，用匙孔槭血蓝蛋白（KLH）作为载体，腹膜内测试了疫苗。将马来酰亚胺活化的KLH（Pierce）化学连接至对应于RSVASH胞外域的肽（CGGGSNKLSEYNVFHNKTFELPRARVNT（SEQIDN°50）；对应于RSVASH胞外域（She）的序列下划线）。为了促进定向化学连接，在RSVASHe肽的N端添加CysGlyGlyGlySer接头。此外，用丝氨酸残基取代存在于天然RSVASHe中的半胱氨酸残基。按照厂家的说明（Pierce）进行化学连接。通过大小排阻层析分离交联的KLH-SHe蛋白。
实施例9：用KLH-SHe腹膜内接种减少了小鼠中的RSV复制
为了测试用基于SHe的疫苗腹膜内（I.P.）接种是否可以引出针对RSV感染的保护，用20μgKLH-SHe或KLH各自与50μl弗氏不完全佐剂（Milipore）组合腹膜内接种Balb/c小鼠（每组6只小鼠）三次。用不含佐剂的PBS接种作为附加阴性对照。在接种后的第二和第三周之间，采集血液来测定SHe特异性IgG抗体的诱导。通过SHe肽ELISA来测定和定量SHe特异性抗体的存在。图17（A-B）证明，3次连续的KLH-SHe接种诱导高水平的IgG1和IgG2a两种亚型的SHe特异性IgG抗体。在来自接种PBS或KLH的小鼠的血清中检测不到SHe特异性IgG抗体。此外，流式细胞术分析显示，衍生自用KLH-SHe腹膜内接种的小鼠的血清可以特异性结合在其表面表达RSVSH蛋白的HEK293T细胞，而免疫前血清不结合。
为了测试腹膜内KLH-SHe接种是否可以减少RSV感染，在最后一次接种后4周用1.106PFU的RSV-A2感染接种的小鼠。攻击后5天，处死小鼠来通过空斑检测测定肺RSV-A2效价。图17D显示，可以在接种SHe-KLH的小鼠肺中检测到比接种KLH的小鼠肺中显著少的病毒（P>0,005,Mann-WhitneyU检验）。在接种KLH-SHe的小鼠中，在感染后第5天，更高效价的血清SHe特异性IgG抗体与更低水平的肺RSV强相关（R2=0,95），这一观察结果表明，KLH-SHe接种减少RSV复制由SHe特异性抗体介导（图17E）。在感染日和处死日监测所有小鼠的体重。图17C显示，用KLH-SHe接种的小鼠获得了显著多于用KLH接种的小鼠的体重（P>0,005,Mann-WhitneyU检验）。这些数据证明，用基于SHe的疫苗腹膜内接种可以减少RSV复制而不诱导发病率。此外，这些数据显示，继mHBc、tGCN4和COMPcc之后，KLH也可以用作基于SHe肽的疫苗的蛋白质载体。此外，这些数据显示，继Titermax之后，弗氏不完全佐剂也可以用作适合的载体来诱导SHe特异性免疫。
实施例10：用KLH-SHe鼻内接种减少了小鼠中的RSV复制
为了测试用KLH-SHe鼻内接种是否可以引出针对RSV感染的保护，用20μgKLH-SHe或KLH各自与1μgLTR192G佐剂组合鼻内接种Balb/c小鼠（每组6只小鼠）三次。用不含佐剂的PBS接种作为附加阴性对照。在接种后的第二和第三周之间，采集血液来考查SHe特异性IgG抗体的诱导。通过SHe肽ELISA来测试SHe特异性抗体的存在。图18（A-B）证明，3次连续的KLH-SHe接种诱导IgG1和IgG2a两种亚型的SHe特异性IgG抗体。在来自接种PBS或KLH的小鼠的血清中检测不到SHe特异性IgG抗体。此外，流式细胞术分析显示，衍生自用KLH-SHe血清鼻内接种的小鼠的血清可以特异性结合在其表面表达RSVSH蛋白的HEK293T细胞，而免疫前血清不结合。
为了测试腹膜内KLH-SHe接种是否可以减少RSV感染，在最后一次接种后9周用1.106PFU的RSV-A2感染接种的小鼠。攻击后5天，处死小鼠来收集BAL（支气管肺泡灌洗）液（3ml）。通过空斑检测来测定所收集的BAL液中的RSV-A2效价。图18E显示，可以在接种KLH-SHe的小鼠肺中检测到比接种KLH的小鼠肺中显著少的病毒（P>0,05,Mann-WhitneyU检验）。通过SHe肽ELISA来分析SHe特异性IgA和IgG抗体在所收集的BAL液中的存在。此分析显示，与接种PBS和KLH的小鼠不同，接种KLH-SHe的小鼠的BAL液含有IgG和IgASHe特异性抗体二者（图18C-D）。存在于接种KLH-SHe的小鼠的BAL液中的IgGSHe特异性抗体的水平与各小鼠的血清中IgGSHe特异性抗体的水平相关。在接种KLH-SHe的小鼠中，在感染后第5天，存在于BAL液中的更高效价的SHe特异性IgG抗体与更低水平的肺RSV效价强相关（R2=0,97），这一观察结果表明，KLH-SHe接种减少RSV复制由SHe特异性抗体介导（图18E）。这些数据证明，用基于SHe的疫苗鼻内接种可以减少RSV复制而不诱导发病率。此外，这些数据确认，继mHBc、tGCN4和COMPcc之后，KLH也可以用作基于SHe肽的疫苗的蛋白质载体。
实施例11：KLH-SHe免疫血清的被动转移在小鼠中防御RSV感染
为了进一步考查用基于SHe的疫苗接种的小鼠中RSV复制的减少是否可以由RSVSHe特异性抗体介导，进行了被动转移实验。用20μgKLH-SHe或KLH（二者都与75μl弗氏不完全佐剂组合）腹膜内接种Balb/c小鼠。作为附加阴性对照，用不含佐剂的PBS接种小鼠。SHe肽ELISA显示，用KLH-SHe接种的所有小鼠的血清都含有高水平的SHe特异性IgG抗体。最后的采血后，混合各组的小鼠的血清，并在56℃热灭活30分钟。为了测试KLH-SHe血清是否可以防御RSV感染，在RSV攻击（2.105PFU）（第0天）前一天（第-1天）和后一天（第1天）对小鼠鼻内施用40μlKLH或KLH-SHe血清。包含用PBS处理的小鼠作为附加对照。每天监测所有小鼠的体重（图19C）。感染后5天，处死小鼠来制备肺匀浆。空斑检测分析证明，用KLH-SHe血清处理的小鼠的肺匀浆包含比源自用KLH血清处理的小鼠的肺匀浆少约40倍（病毒效价的平均值之比）的复制型病毒（图19B）。KLH血清处理的小鼠的肺RSV效价与PBS处理的小鼠的肺RSV效价没有不同，这一观察结果显示，施用对照血清不影响小鼠中的肺RSV复制。
实施例12：mHBc-SHeB的构建
虽然在其亚型内高度保守，但RSVB病毒的SHe氨基酸序列与RSVA亚型病毒的序列不同。因此，为了防御RSVB病毒，基于SHe的疫苗最有可能需要包含RSVBSHe氨基酸序列。
通过将共有的RSVBSHe肽（SHeB：CGGGSNKLSEHKTFSNKTLEQGQMYQINT（SEQIDN°51））与mHBc病毒样颗粒化学连接来构建RSVBSHe疫苗。为了促进化学连接，在RSVBSHe肽的N端添加CysGlyGlyGlySer接头。此外，用丝氨酸残基取代存在于天然RSVBSHe中的半胱氨酸残基。将从RSVBShe肽与mHBc的化学连接得到的免疫原命名为mHBc-SHeB。通过大小排阻层析纯化mHBc-SHeBVLP后，通过SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯蓝染色来分析交联的程度。图20显示，超过一半的HBc单体与至少一个SHe肽交联。
实施例13：用mHBc-SHeB免疫小鼠诱导与RSVB感染的细胞表面结合的SHeB特异性Ab
为了测试mHBc-SHeBVLP是否具有免疫原性，用20μgmHBc-SHeB与50μlTitermax（Sigma）组合皮下免疫一只BALB/c小鼠3次。按2周的间隔进行这3次免疫。在每次免疫前1天和最后一次免疫后2周进行采血。为了测试mHBc-SHeB免疫血清是否可以识别表达在感染细胞表面的RSVBSH蛋白，模拟感染Vero细胞或用RSVB病毒的临床分离株（由Dr.MarcvanRanst,UniversityofLeuven,Leuven,Belgium惠赠）感染Vero细胞。感染后72小时，固定细胞，用0,2%TritonX-100透化或不透化。然后用mHBc-SHeB免疫血清（1/100稀释）或对照免疫血清（1/100稀释）染色细胞，该对照免疫血清衍生自用KLH（KLH血清）与弗氏不完全佐剂组合接种的BALB/c小鼠。通过免疫荧光显微术或流式细胞术来分析样品。图21A和B显示，mHBc-SHeB免疫血清可以与透化和未透化的RSVB感染细胞结合，但不与未感染的细胞结合。相反，对照免疫血清不与RSVB感染的细胞结合。这证明，用mHBc-SHeB接种小鼠诱导可以识别RSVB感染细胞（最有可能通过与表达在RSVB感染的细胞表面的RSVBSH蛋白结合）的血清抗体。
实施例14：mHBc-SHeB免疫减少小鼠中的RSV复制
为了测试mHBc-SHeB接种是否可以保护小鼠免受RSVB感染，用以50μl弗氏不完全佐剂作为佐剂的mHBc或mHBc-SHeBVLP免疫两个6只小鼠的组。作为附加对照，用PBS接种6只小鼠。腹膜内进行接种，接种三次，间隔3周。每次免疫后2周进行采血。通过用SHeA或SHeB作为包被肽的肽ELISA来测定SHe特异性抗体的诱导。此分析证明，在所有小鼠中，3次连续的mHBc-SHeB免疫诱导高效价的IgG1和IgG2a两种亚型的RSVBShe特异性IgG抗体（图22A-C）。mHBc-SHeB免疫血清还与SHeA肽结合，但结合的程度较低（图22A、B和D）。
我们实验室及其他实验室之前的实验已显示，不能或几乎不能从RSVB感染的小鼠挽救复制型病毒。然而，我们可以观察到，用临床RSVB分离株感染在BALB/c小鼠中诱导肺炎和体重减轻（数据未显示）。因此，我们测试了mHBc-SHeB接种是否可以保护小鼠免受RSVB诱导的肺炎。用2.106PFU的RSVB临床分离株鼻内攻击小鼠后6天，进行支气管肺泡灌洗（BAL）。用模拟感染的小鼠作为阴性对照来分析BAL细胞浸润。按Bogaert等,2011所述通过流式细胞术来针对免疫细胞浸润分析BAL液。图22E-F显示，RSVB感染导致免疫细胞的肺浸润，尤其是CD8+T淋巴细胞，已知其在小鼠中负责RSV诱导的发病率。但是，与接种PBS或mHBc的小鼠相比，接种mHBc-SheB的小鼠显示显著低的肺细胞浸润。这些数据证明，mHBc-SHeB接种减少RSV相关的免疫病。
实施例15：LPP(5)-SHe蛋白的设计、表达和纯化
作为将SHe作为五聚体呈递的另一蛋白质支架，我们使用了Liu等所述的五聚体色氨酸拉链(LPP(5))，其衍生自大肠杆菌LPP-56脂蛋白（Liu等,2004）。将LPP(5)色氨酸拉链的编码序列与SHe编码序列遗传融合，并克隆入Mertens等,1995所述的含有六组氨酸肽和胱天蛋白酶切割位点的大肠杆菌表达载体（pLH36）。将此表达质粒命名为pLH36-HisDEVD-LPP-SHe（SEQIDN°49）。从此质粒表达产生嵌合LPP(5)-SHe蛋白（SEQIDN°52）（MHHHHHHPGGSDEVDAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWATGGNKLCEYNVFHNKTFELPRARVNT；His标记下划线，接头表示为斜体，DEVD胱天蛋白酶切割位点表示为斜体+下划线，五聚体LPP色氨酸拉链表示为黑体，RSVASH胞外域表示为黑体+斜体）。在大肠杆菌中诱导表达后，通过随后的镍亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析来纯化LPP(5)-SHe蛋白。图23证明，无论是在粗细胞提取物中（23A），还是作为纯化的蛋白质（24B），LPP(5)-SHe蛋白都可被She特异性3G8单克隆抗体识别。
实施例16：棉鼠免疫
为了证明疫苗在独立的动物模型中的效力，使用了棉鼠。棉鼠（Sigmondonhispidus）易受RSV感染（Prince等,1978）。使用了各有6只棉鼠的5个组。两组动物用100μgKLH（载体对照）或100μgKLH-SHe（即衍生自RSV-A的SHe肽与作为载体的KLH的化学缀合物）腹膜内（i.p.）免疫。用弗氏不完全佐剂配制KLH和KLH-SHe疫苗抗原，并用来在第0、21和42天免疫棉鼠。第三组动物在明矾佐剂的存在下用福尔马林灭活的RSV（FI-RSV）肌内免疫。后一组作为诱导疫苗增强的疾病的阳性对照，该疫苗增强的疾病在随后用RSV攻击时变得明显。第四组在第0天用2.04x105空斑形成单位/棉鼠的RSV-Tracy感染，并作为防御随后的攻击的阳性对照。第五组棉鼠在攻击日之前保持不处理，作为用RSV攻击的对照。图24中显示接种的方案。
在每次免疫前及攻击日收集血清。在第63天，用2.04x105空斑形成单位的RSV-Tracy鼻内攻击棉鼠。在100微升的体积中鼻内施用攻击病毒，同时用异氟烷轻度麻醉动物。在第68天，收集血清，处死所有动物来收集肺进行病毒滴定和组织病理学分析。将每个肺分为两份来进行组织病理学分析和病毒滴定。将左肺结扎，用于组织病理学分析。用3ml含15%甘油的Iscove's培养基灌洗右肺叶。将灌洗液保存在冰上直至滴定。此外，用2ml（每个鼻孔1ml）相同的培养基制备鼻灌洗液。
通过HEp2细胞上的空斑检测来测定肺和鼻灌洗液中的病毒负荷。用灌洗液样品的系列稀释感染细胞90分钟。去除接种物后，用含抗生素的MEM中的2%甲基纤维素覆盖细胞。在CO2培养箱中37℃孵育6天后，用0.1%结晶紫/10%福尔马林溶液复染空斑，并在室温下放置24小时。
对于组织病理学分析，用10%中性缓冲福尔马林灌注左肺。然后用切片机处理固定的肺组织来产生切片，用苏木精和伊红染色切片，并针对组织病理学损伤的程度进行评分。
通过肽ELISA及通过微量中和测定来针对抗-SHe和抗-RSV中和性抗体的存在测定血清样品。对于肽ELISA，用含2μgSHe肽的50μl0,1M碳酸盐缓冲液pH9,6在37℃过夜包被平板。包被后，用含3%（w/v）奶粉的PBS封闭平板，然后加入棉鼠血清的3倍系列稀释液。用缀合辣根过氧化物酶的第二抗体和四甲基联苯胺底物来检测保留的SHe特异性棉鼠IgG。样品中的终点抗-SHe肽IgG效价定义为吸光度比免疫前血清的吸光度高至少2倍的最高稀释度。
用HEp2细胞在96孔微量滴定板中针对RSV-A和-B测定中和性抗体效价。将血清样品的系列稀释液与固定量的接种病毒混合。中和性抗体效价定义为观察到>50%的细胞病理效应降低的血清稀释度。此细胞病理效应指细胞的破坏，且在用10%中性缓冲福尔马林固定并用结晶紫染色后通过目检来测定。结果显示，用弗氏佐剂中的KLH-SHe接种的动物产生中和性抗体，且明显受保护，而载体对照显示没有一点保护。
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Claims (13)
1.免疫原性组合物在制备用于防御或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗中的用途，其中所述免疫原性组合物包含分离的呼吸道合胞病毒的小疏水蛋白的胞外域及载体。
2.权利要求1的用途，其中所述分离的胞外域作为寡聚体呈递。
3.权利要求1或2的用途，其中所述胞外域由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2组成。
4.权利要求3的用途，其中所述胞外域与所述载体遗传连接。
5.权利要求3的用途，其中所述胞外域与所述载体化学连接。
6.权利要求1的用途，其中所述载体是寡聚体。
7.权利要求6的用途，其中所述寡聚体是五聚体。
8.权利要求1的用途，其中所述载体选自软骨寡聚基质蛋白(comp)、Lpp-56和病毒样颗粒。
9.血液、血清和/或血浆在制备用于预防或治疗RSV感染的药物中的用途，其中所述血液、血清和/或血浆通过将如权利要求1-8中任一项定义的免疫原性组合物递送至动物；和从所述动物获得含有一种或多种抗-RSV抗体的血清而获得。
10.RSV抑制性单克隆抗体在制备用于预防或治疗RSV感染的药物中的用途，其中所述RSV抑制性单克隆抗体抗RSVSH蛋白的胞外域。
11.疫苗，其包含如权利要求1-8中任一项定义的免疫原性组合物，可选地含有佐剂。
12.权利要求11的疫苗，其中所述疫苗用于人用。
13.权利要求11的疫苗，其中所述疫苗用于兽用。
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