CN103376320B - 检测大肠杆菌o157:h7的荧光免疫层析试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测大肠杆菌O157:H7的荧光免疫层析试纸条，它是采用以下步骤的方法制备而成的：1）制备水溶性核壳结构的CdTe/CdS量子点；2）用CdTe/CdS量子点标记大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体；3）将CdTe/CdS量子点标记的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体涂覆于玻璃纤维素膜上形成结合垫，大肠杆菌O157:H7多克隆抗体与羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线，在pvc底板上将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装成荧光免疫层析试纸条。本发明的荧光免疫层析试纸条检测大肠杆菌O157:H7的检测速度快，灵敏度高，特异性强，试纸条的稳定性好。<!--1-->

Description

检测大肠杆菌O157:H7的荧光免疫层析试纸条

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种检测大肠杆菌O157:H7的荧光免疫层析试纸条及其应用。

背景技术

大肠杆菌O157:H7是一种肠道致病菌，它主要是通过摄入被污染的食物或水，或与带菌动物接触使人感染，严重可致死亡。大肠杆菌O157:H7感染已逐渐成为威胁人类健康的重要公共卫生问题，建立快速、灵敏度高的检测方法是防控大肠杆菌O157:H7感染的关键。

量子点是一种新型的纳米材料，具有优良的荧光特性。与其它的免疫学分析法相比，基于量子点的免疫分析法在特异性、敏感性和准确性方面具有巨大的优势，在食品微生物检测中有广阔的应用前景。目前还没有关于利用量子点标记的免疫层析试纸条检测大肠杆菌O157:H7的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测大肠杆菌O157:H7的量子点免疫层析试纸条。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测大肠杆菌O157:H7的荧光免疫层析试纸条，它是采用以下步骤的方法制备而成的：

1）制备水溶性核壳结构的CdTe/CdS量子点；

2）用CdTe/CdS量子点标记大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体；

3）将CdTe/CdS量子点标记的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体涂覆于玻璃纤维素膜上形成结合垫，大肠杆菌O157:H7多克隆抗体与羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线，在pvc底板上将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装成荧光免疫层析试纸条。

优选的：所述水溶性核壳结构的CdTe/CdS量子点是采用无机水相合成法，以巯基丙酸为稳定剂在水溶液中合成的，合成的条件是：Cd²⁺与Te^2-的摩尔比为Cd²⁺与Te^2-的摩尔比为3~7∶1，巯基丙酸与Cd²⁺的摩尔比为1.5~3.5∶1，反应体系的pH值为7~11，温度为80~100℃，CdTe核的回流时间为0.5~2.5h；CdS壳的回流时间为0.5~2.5h。

进一步优选的合成条件是：Cd²⁺与Te^2-的摩尔比为5∶1，巯基丙酸与Cd²⁺的摩尔比为2.5∶1，反应体系的pH值为9，温度为95℃，CdTe核的回流时间为1h；CdS壳的回流时间为1h。

优选的：步骤2）中所述大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体的标记方法是：以EDC·HCl和NHS为偶联剂，先将CdTe/CdS量子点表面配体的羧基活化，然后在pH为7.4，0.01mol/LPBS缓冲体系中，37℃摇床避光反应1.5h，100μLCdTe/CdS量子点与80μL1mg/mL抗大肠杆菌O157:H7多克隆抗体反应。

所述的荧光免疫层析试纸条在大肠杆菌O157:H7快速检测中的应用。

本发明的有益效果是：本发明荧光免疫层析试纸条检测大肠杆菌O157:H7的检测速度快，灵敏度高（灵敏度比胶体金试纸条高10倍），特异性强，试纸条的稳定性好。

附图说明

图1是透射电镜（TEM）对实验制备的CdTe/CdSQDs进行的结构表征，CdTe/CdSQDs为近球形颗粒，粒径分布较均匀，平均粒径约为3nm。

图2是核壳量子点在优化条件下的荧光强度，荧光强度为726.4。

图3是CdTe/CdS量子点偶联兔IGg前后的琼脂糖凝胶电泳，1泳道为CdTe/CdS量子点，2泳道为共价偶联的量子点-抗体，3泳道为直接偶联的量子点-抗体，4泳道为兔IgG；

图4是量子点与抗体偶联前后的荧光图谱。曲线b、c分别代表共价偶联和直接偶联的偶联物，相比未偶联抗体的量子点a，荧光发射峰轻微红移；偶联后，荧光强度减小，共价偶联得到的偶联物的荧光强度比直接偶联强。

图5是不同pH值对量子点-抗体偶联物的影响。随pH值的增大，量子点-抗体偶联物的荧光强度先增大后减小，当pH为7.4时，荧光强度最大。

图6是不同温度和时间对量子点-抗体偶联物的影响。反应温度不同，偶联物荧光最高峰出现的时间不同，25℃反应体系中荧光最高峰出现在2.5h处，37℃反应体系中荧光最高峰出现在1.5h处。反应初的2h内，37℃反应体系中偶联物的荧光强度明显高于25℃反应体系，之后荧光强度略低于25℃反应体系。

图7是免疫层析试纸条组装示意图。

图8是免疫层析试纸条结果判定标准图。

图9是试纸条的检测限图，1-8号大肠杆菌O157:H7抗原浓度依次为10⁹CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL和10²CFU/mL。

图10是试纸条属间特异性试验图，1号大肠杆菌O157:H7、2号白色念珠菌ATCC90028、3号金黄色葡萄球菌ATCC25923、4号副溶血性弧菌ATCC17802、5号单增李斯特菌标准菌株ATCC15313、6号产气肠杆菌CMCC45103、7号奇异变形杆菌CMCC49005、8号阪崎肠杆菌ATCC51329、9号甲型副伤寒沙门氏菌ATCC50001、10号鲍氏志贺氏菌。

图11是试纸条属内特异性试验图，1号大肠杆菌O157:H7的不同分离株、2号大肠杆菌O157:H7抗原、3号大肠杆菌ATCC25922、4号大肠杆菌ATCC35218、5号大肠杆菌ATCC8099、6号实验室分离大肠杆菌1、7号实验室分离大肠杆菌2。

图12是试纸条的稳定性图，1-6号试纸条的保存时间分别为：1d，7d，14d，21d，28d，35d。

图13是试纸条检测人工模拟样品的图，1号为空白样品，2-8号大肠杆菌O157:H7抗原浓度依次为10⁹CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1水溶性核壳量子点的制备及条件优化

采用无机水相合成法，以巯基丙酸为稳定剂在水溶液中合成CdTe/CdS核壳量子点。通过单因素实验对CdTe/CdS量子点的制备条件进行优化，得到各影响因素的最优水平为：Cd²⁺与Te^2-的摩尔比为5:1，稳定剂MPA与Cd²⁺的摩尔比为2.5:1，反应体系pH为9，反应温度为95℃，CdTe核的回流时间为1h；CdS壳的回流时间为1h。在此条件下，合成CdTe/CdS的荧光强度为726.41，较初始条件，荧光强度增大50.10%，量子点的粒径约为3.0nm，分散性好，相较CdTe量子点，核壳结构的CdTe/CdS量子点的荧光强度、稳定性大大提高(图1、2)。

水溶性核壳量子点的详细制备方法和步骤是：

1．碲氢化钠前驱液的制备

在反应瓶中加入3mL纯净水，加盖密封，插入针头使其与大气相通，通入N₂排出O₂，10~15min后，依次加入100.0mgNaHB₄和63.8mg碲粉，40℃水浴和磁力搅拌下进行反应，直至碲粉完全反应，上层溶液变为澄清的紫色，下层有白色沉淀。反应方程式如下：

4NaBH₄+2Te+7H₂O=2NaHTe+Na₂B₄O₇↓+14H₂↑

2．CdTe核的合成

称取91.34mgCdCl₂·2.5H₂O溶于100.0ml高纯水中加入到250ml的三口烧瓶中，通入N₂排出O₂，磁力搅拌下，加入适量的巯基丙酸，用1mol/L的NaOH调节pH至10，30min后新鲜制备的NaHTe溶液0.6mL加入氮气保护的CdCl₂溶液中，搅拌20min后，升高水浴温度至95℃，开始计时，加热一定时间后得到CdTe核溶液，溶液浓度以Te^2-计为1×10^-3mol/L。

3．CdTe/CdS量子点的制备

配制0.05mol/L的硫代乙酰胺溶液，将1mL硫代乙酰胺溶液缓慢加入制得的CdTe核溶液中，反应不同的时间得到不同壳层厚度的CdTe/CdS量子点。反应在95℃，磁力搅拌及氮气保护下进行。

实施例2大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体的标记和荧光免疫层析试纸条的制备

1）量子点标记大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体的条件

以EDC·HCL和NHS为偶联剂共价偶联，取100μL的量子点，分别加入40μL0.1mol/LEDC·HCl和20μL0.1mol/LNHS，补充pH7.4，0.01mol/L的PBS至总体积800μL，室温下活化15min，然后加入80μL的浓度为1mg/mL的兔lgG，混合液在37℃摇床中避光反应1.5h，最后用100μL1mg/mL的甘氨酸终止反应，置于4℃过夜。

反应混合液用100k的超滤膜进行反复超滤，除去未与大肠杆菌O157:H7多克隆抗体偶联的CdTe/CdS量子点，收集超滤膜上的CdTe/CdS-抗体偶联物(图3)，溶于pH7.4，0.01mol/L的PBS中，4℃避光保存备用。

本实施例中的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体是由大肠杆菌O157:H7菌株做抗原，采用多次皮下注射新西兰大白兔并按常规方法制备得到，本实施例中所使用的大肠杆菌O157:H7菌株保藏于美国菌种保藏中心（ATCC），菌株编号为：ATCC51659，任何公众都可以通过商业途径向其购买。

2）玻璃纤维素膜和硝酸纤维素膜的处理

将玻璃纤维素膜浸泡在玻璃纤维素膜处理液（3%BSA，0.2%吐温-20，5%蔗糖的pH7.4的PBS缓冲液）中30min，取出于37℃烘干。将量子点-抗体偶联物均匀的铺在玻璃纤维素膜上面，干燥后密封保存备用。大肠杆菌O157:H7多克隆抗体抗体包被在硝酸纤维素膜上形成检测带，相距约1cm处，用羊抗兔IgG包被在硝酸纤维素膜上形成质控带。

3）荧光免疫层析试纸条的组装

将样品垫、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴在pvc底板上，相接处的两个部分都重叠2mm，便于免疫层析反应的进行(图7)。

实施例3样品的测试和结果判断

将样品液滴加到样品垫上，或将样品垫一端插入样品液中，免疫层析结束后，在紫外灯下照射判定结果，若检测线（C线）和质控线（T线）同时出现黄色荧光带，则为阳性结果；若C线出现荧光带，T线不出现荧光带，则为阴性结果；若C线和T线都不出现荧光带，或者T线出现荧光带而C线不出现荧光带，则判定为试纸条失效(图8)。

1）检测限：将大肠杆菌O157:H7纯培养物热灭活后分别稀释到不同浓度，分别滴加到样品垫，进行层析反应，在紫外灯下照射判定结果，考察试纸条的检测限。结果显示，当大肠杆菌O157:H7的浓度为10⁴CFU/mL时，试纸条检测线有较浅的荧光条带，确定试纸条对大肠杆菌O157:H7纯培养的检测限为10⁴CFU/mL(图9)。

2）试纸条的属外特异性：将试纸条与不同来源的大肠杆菌O157:H7和大肠杆菌其它群的菌株反应。以热灭活方法分别处理不同的大肠杆菌培养液，调节浓度至10⁸CFU/mL，进行免疫层析反应，在紫外灯下照射判定结果。结果显示，试纸条与大肠杆菌O157:H7反应强烈，不与其它细菌真菌反应，具有良好的特异性(图10、图11)。

3）试纸条的稳定性：将制备好的试纸条置于密封铝箔中室温储藏，分别于7d，14d，21d，28d，35d后检测试纸条的有效性，以判断试纸条的稳定性。结果显示试纸条在35d内仍然可以有效检测，但是21d之后，检测限有所下降，为10⁵CFU/mL。试纸条具有较好的稳定性(图12)。

4）人工模拟实验：将大肠杆菌O157:H7人工污染到空白样品(牛肉)中，取25g空白样品加入225mL肉汤培养基中，充分混和匀浆，取不同稀释度的菌悬液分别加入到空白样品匀浆中，人工污染的匀浆液中大肠杆菌O157:H7的浓度依次为10⁹CFU/mL-10³CFU/mL，将人工污染样品液滴加到样品垫上，或将样品垫一端插入人工污染样品液中，免疫层析结束后，在紫外灯下照射判定结果。结果显示，当大肠杆菌O157:H7的浓度为10⁵CFU/mL时，试纸条检测线有明显的荧光条带，确定试纸条对大肠杆菌O157:H7人工模拟样品的检测限为10⁵CFU/mL(图13)。

当然，只要采用了相应的抗体，按照本发明相同的方法制成的荧光免疫层析试纸条同样可以快速检测其他致病菌（如沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等）。

Claims (1)

1.一种检测大肠杆菌O157:H7的荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备水溶性核壳结构的CdTe/CdS量子点；

2)用CdTe/CdS量子点标记大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体；

3)将CdTe/CdS量子点标记的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体涂覆于玻璃纤维素膜上形成结合垫，大肠杆菌O157:H7多克隆抗体与羊抗兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线，在pvc底板上将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装成荧光免疫层析试纸条，

所述水溶性核壳结构的CdTe/CdS量子点是采用无机水相合成法，以巯基丙酸为稳定剂在水溶液中合成的，合成的条件是：Cd²⁺与Te^2-的摩尔比为5∶1，巯基丙酸与Cd²⁺的摩尔比为2.5∶1，反应体系的pH值为9，温度为95℃，CdTe核的回流时间为1h；CdS壳的回流时间为1h，

所述大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体的标记方法是：以EDC·HCl和NHS为偶联剂，先将CdTe/CdS量子点表面配体的羧基活化，然后在pH为7.4，0.01mol/LPBS缓冲体系中，37℃摇床避光反应1.5h，100μLCdTe/CdS量子点与80μL1mg/mL抗大肠杆菌O157:H7多克隆抗体反应。