CN103374624A - 钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒 - Google Patents
钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与钙磷代谢调节能力发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型从基因层面来评估钙磷代谢调节能力相关疾病的发病风险级别，提早预防相关疾病的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确、可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种钙磷代谢调节能力的基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估钙磷代谢调节能力相关疾病的风险级别，并且指导人群提早预防和治疗。
背景技术
钙和磷是人体内含量最丰富的无机元素。其中99%的钙和86%的磷以羟磷灰石的形式存在于骨和牙齿当中，其余分布于体液和软组织中，以溶解状态存在。钙和磷的代谢在许多方面是相互联系的，机体从食物中摄取钙和磷，又把它们从尿和粪中排泄，成人每日摄取和排泄量大致相等，处于动态平衡之中。血钙和血磷分别指血浆中所含的钙和磷。血钙和血磷含量的相对稳定依赖于钙、磷的吸收与排泄、钙化及脱钙间的相对平衡，而这些平衡又主要受维生素D3、甲状旁腺素和降钙素等激素的调节。维生素D3功能的实现需要通过与活化的细胞核内受体，即维生素D受体（VDR）相结合。VDR编码的蛋白与维生素D结合，使人体重要的钙调节激素骨化三醇发挥生物活性，促进肠道对钙的吸收，并且调节骨的无机盐代谢。
众多研究发现，钙磷代谢调节能力具有较高的遗传倾向，通过分子诊断检测与钙磷代谢调节能力密切相关的基因位点就可以提前评估受检者钙磷代调节能力的遗传风险，提早预防和治疗。当携带风险基因型时，VDR基因编码的蛋白的活性降低，且数量也减少，减少机体对磷钙的吸收利用，钙磷代谢调节能力降低。2006年黄振武等对青年女性膳食钙的吸收与VDR基因Fok I酶切多态性间关系进行了探讨，进一步佐证了人类(儿童) VDR基因Fok I酶切多态性与机体膳食钙的吸收存在一定的关联。Morrison NA等观察了VDR等位基因多态性与血清骨钙素的关系，结果发现，限制性内切酶BsmI 和Apa I等酶切VDR基因产生的不同基因型，可以预测血清骨钙素水平，因此认为，VDR基因的多态性可以预测骨转换。
由于VDR基因型的多态性与骨密度(bone mineral density，BMD)之间存在一定的相关性，而且影响青少年骨量的形成，因此可将ＶＤＲ基因型作为遗传标志物，预测成年后的骨量，对骨量形成不利的基因型可采取一定的干预措施，以便成年后达到较高骨质峰值。 有关研究表明，VDR基因变异与骨质疏松、骨质疏松性骨折、骨性关节炎、乳腺癌、前列腺癌、甲状旁腺激素分泌亢进、糖尿病和冠心病等也有相关性。识别不同基因型，对不同个体要有针对性地进行补钙，也可根据不同基因型采取相应的干预措施达到预防和延缓某些疾病发生的目的。
因此，建立简单、快速的钙磷代谢调节能力易感基因无创检测方法，能够检测出钙磷疾病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患相关疾病的高危人群，有针对性的进行指导，对于降低疾病发生、特别是保障青少年和妇女群体的安全健康具有非常重要的意义。
发明内容
基于VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估钙磷调节能力疾病的风险级别，本发明提供一种钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒。
该试剂盒包括：
检测VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O等）；
PCR产物纯化组件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O等）；
DNA测序反应组件（包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等）。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM特异性引物对（每条引物各0.25ul）；ddH2O 19.175ul。
PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶 0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。
测序反应体系：25%BigDye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100%乙醇溶液 15ul；70%乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH2O 2ul。
本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1. 检测试剂盒的使用
1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对：
（1）VDR（BsmI）正向引物：5'AATACCTATTTGCTGGTTTGC3'
VDR（BsmI）反向引物：5'CTCCCTCTTCTCACCTCTAACC3'
（2）VDR（FokI）正向引物：5'CCAGCTATGTAGGGCGAATC3'
VDR（FokI）反向引物： 5'CAGCCTTCACAGGTCATAGCA3'
（3）VDR（ApaI）正向引物：5'CACGGAGAAGTCACTGGAGG3'
VDR（ApaI）反向引物：5'TCTCATTGCCAAACACTTCG3'
PCR扩增的反应体系为：10×PCR 反应缓冲液 2.5ml；25mM的dNTP 混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板1ml(12-15ng左右)、20uM正向引物反向引物各0.25ml、ddH2O 19.175ml；
反应条件为：94℃ 4分钟变性和酶激活，94℃ 30秒变性，55℃ 30秒退火，72℃ 1分钟延长，循环28次，最后72℃延长5分钟以上。
3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，1U/ul SAP酶0.75ul，10U/ul ExoI酶0.375ul，去离子水3.875ul。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15min，72℃、20min。
4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物：
（1）VDR（BsmI）测序引物：5'AATACCTATTTGCTGGTTTGC3'
（2）VDR（FokI）测序引物：5'CCAGCTATGTAGGGCGAATC3'
（3）VDR（ApaI）测序引物：5'CACGGAGAAGTCACTGGAGG3'
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物1ul，25%Bigdye mix1ul,3.2uM DNA测序引物 1ul，去离子水2ul。
在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃2min，进行25个循环的96℃ 30s，55℃30s,60℃ 4min。
反应结束后加入125mM EDTA溶液1ul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min；在4℃,3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul，3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测序仪中。
5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2. 为人群进行预防钙磷调节能力相关疾病的基因无创检测服务
1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提
2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
3.钙磷调节能力低下高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具钙磷调节能力风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读钙磷调节能力基因无创检测报告单。
序列表
<110> 解码（上海）生物医药科技有限公司
<120> 钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒
<130> 20120424
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> VDR（BsmI）正向引物
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（BsmI）正向引物
aatacctatt tgctggtttg c 21
<210> VDR（BsmI）反向引物
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（BsmI）反向引物
ctccctcttc tcacctctaa cc 22
<210> VDR（FokI）正向引物
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（FokI）正向引物
ccagctatgt agggcgaatc 20
<210> VDR（FokI）反向引物
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（FokI）反向引物
cagccttcac aggtcatagc a 21
<210> VDR（ApaI）正向引物
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（ApaI）正向引物
cacggagaag tcactggagg 20
<210> VDR（ApaI）反向引物
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（ApaI）反向引物
tctcattgcc aaacacttcg 20
<210> VDR（BsmI）测序引物
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（BsmI）测序引物
aatacctatt tgctggtttg c 21
<210> VDR（FokI）测序引物
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（FokI）测序引物
ccagctatgt agggcgaatc 20
<210> VDR（ApaI）测序引物
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> VDR（ApaI）测序引物
cacggagaag tcactggagg 20
Claims (6)
1.一种筛查钙磷代谢调节能力正常与否的基因无创检测试剂盒，其特征在于：检测VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是针对VDR基因上BsmI(rs1544410)、FokI(rs10735810)和ApaI(rs7975232-731236)的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下：
（1）VDR（BsmI）正向引物：5'AATACCTATTTGCTGGTTTGC3'
VDR（BsmI）反向引物：5'CTCCCTCTTCTCACCTCTAACC3'
（2）VDR（FokI）正向引物：5'CCAGCTATGTAGGGCGAATC3'
VDR（FokI）反向引物： 5'CAGCCTTCACAGGTCATAGCA3'
（3）VDR（ApaI）正向引物：5'CACGGAGAAGTCACTGGAGG3'
VDR（ApaI）反向引物：5'TCTCATTGCCAAACACTTCG3'。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下：
（1）VDR（BsmI）测序引物：5'AATACCTATTTGCTGGTTTGC3'
（2）VDR（FokI）测序引物：5'CCAGCTATGTAGGGCGAATC3'
（3）VDR（ApaI）测序引物：5'CACGGAGAAGTCACTGGAGG3'。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：
（1）PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5ul，25mM dNTP混合液0.2ul，5U／ul Taq DNA聚合酶 0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH2O 19.175ul
（2）PCR产物纯化体系：1 U／ul SAP酶0.75ul，10 U／ul ExoI酶0.375ul，ddH2O 3.875ul
（3）测序反应体系：25% BigDye mix1ul，3.2uM DNA测序引物1ul，125mM EDTA溶液1ul，100%乙醇溶液15ul，70%乙醇溶液30ul，HIDI溶液8ul，ddH2O 2ul
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN 201210126735 CN103374624A (zh) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | 钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒 |
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| CN 201210126735 CN103374624A (zh) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | 钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒 |
Publications (1)
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|---|---|
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| CN 201210126735 Pending CN103374624A (zh) | 2012-04-27 | 2012-04-27 | 钙磷代谢调节能力基因无创检测试剂盒 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN108342460A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-07-31 | 上海美丽人生医疗科技有限公司 | 钙吸收相关基因vdr基因多态性检测试剂盒 |
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-
2012
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131030 |