CN103374622A

CN103374622A - 桥本甲状腺炎基因无创检测试剂盒

Info

Publication number: CN103374622A
Application number: CN 201210126705
Authority: CN
Inventors: 李为为; 姜丽
Original assignee: DECODING (SHANGHAI) PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: DECODING (SHANGHAI) PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2013-10-30

Abstract

本发明提供了一种检测桥本甲状腺炎基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与桥本甲状腺炎发生密切相关的2个单核苷酸多态性位点的基因型，从基因层面来评估桥本甲状腺炎发病的风险级别，提早预防桥本甲状腺炎疾病的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。

Description

桥本甲状腺炎基因无创检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种桥本甲状腺炎的基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估桥本甲状腺炎发生的风险级别，并且指导桥本甲状腺炎高危人群提早预防和治疗。

背景技术

桥本甲状腺炎（HT）是一类临床上较为常见的自身免疫性甲状腺炎,表现为血清中出现自身抗体和甲状腺内淋巴细胞浸润的慢性炎症反应,是一种辅助T淋巴细胞1型(Th1)介导的自身免疫性疾病。HT与Graves病(GD)均属于常见的自身免疫性甲状腺疾病(AITD)。目前认为，AITD的发病机制是由多种环境与遗传因素相互作用产生的自身免疫应答引起。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)是活化T 细胞表面所表达的一种膜融合蛋白,对T 细胞的活化起关键的负性调节作用,因此CTLA-4 基因成为自身免疫性疾病的一个侯选易感基因。过去的研究显示, CTLA-4基因与A ITD 包括HT、GD密切相关。位于第一外显子区CTLA-4 ( 49 )A /G 多态性已经成为疾病研究的热点。

白细胞介素（interleukin，IL）-4是一种重要的细胞因子，它可以诱导Th2的生长分化及IgG、IgE分泌型B细胞的增殖,是使免疫反应趋向Th2细胞反应的关键细胞因子。王勇等2010年通过对49 例桥本氏甲状腺炎初诊患者血清中IL-4 和IL-8 水平检测发现，桥本氏甲状腺炎组血清中IL-4 水平明显低于正常对照组(P＜0.05)，IL-8 水平则明显高于正常对照组(P＜0.01)，IL-4、IL-8 水平与FT3、FT4 没有相关性，说明白细胞介素IL-4 和IL-8 参与了桥本氏甲状腺炎的发病过程，并且IL-4、IL-8 水平的改变并非由甲状腺功能状态所致。龚莹、蒋玲通过研究IL-1α、IL- 4、IL- 6、TNFα基因多态性与自身免疫性甲状腺疾病的关系发现，在中国山东地区汉族人群中，桥本氏甲状腺炎患者和正常人之间存在IL-4(-590)等位基因和基因型频率分布的差异，桥本氏甲状腺炎患者IL- 4(-590)位置启动子区t等位基因频率下降，可能使IL-4总的转录活性减低，通过免疫炎症反应导致桥本氏甲状腺炎发病。国外也有学者进一步证实HT患者甲状腺内不能表达或表达微弱的IL- 4mRNA。IL-4属辅助T细胞2(TH2)类细胞因子，IL-4水平的下降支持HT发病过程中细胞因子的反应类型以辅助T细胞1( TH1)类占优势的观点，细胞免疫增强，并促进甲状腺细胞凋亡，最终导致甲状腺功能减退。CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个SNPs可以作为HT的独立危险因素进行基因检测。

通过分子诊断检测与HT发生密切相关的基因位点就可以提前评估受检者患HT的风险，提早预防和治疗。因此，建立简单、快速的HT易感基因无创检测方法，能够检测出HT疾病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患HT的高危人群，有针对性的进行健康指导，对于保障人类安全健康具有非常重要的意义。

发明内容

基于CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估桥本甲状腺炎发病风险级别，本发明提供一种桥本甲状腺炎基因无创检测试剂盒。

该试剂盒包括：

检测CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；

PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O等）；

PCR产物纯化组件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O等）；

DNA测序反应组件（包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等）。

本发明试剂盒的组分和含量包括：

PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM特异性引物对（每条引物各0.25ul）；ddH2O 19.175ul。

PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶 0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul。

测序反应体系：25%BigDye mix 1ul；3.2uM DNA测序引物1ul；125mM EDTA溶液1ul；100%乙醇溶液 15ul；70%乙醇溶液30ul；HIDI溶液8ul；ddH2O 2ul。

本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20℃。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1. 检测试剂盒的使用

1、抽提DNA模板

刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。

2、PCR扩增反应

使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对：

（1）CTLA4（A49G）正向引物：5'CTGAACACCGCTCCCATAAA3'

CTLA4（A49G）反向引物：5'GAATACAGAGCCAGCCAAGC3'

（2）IL-4（C-509T）正向引物：5'CCTGCTGGGACCCAAACTA3'

IL-4（C-509T）反向引物：5'ACAGGTGGCATCTTGGAAAC5'

PCR扩增的反应体系为：10×PCR 反应缓冲液 2.5ml；25mM的dNTP 混合液0.2ml、5U/ul Taq酶0.125ml、DNA模板1ml(12-15ng左右)、20uM正向引物反向引物各0.25ml、ddH2O 19.175ml；

反应条件为：94℃ 4分钟变性和酶激活，94℃ 30秒变性，55℃ 30秒退火，72℃ 1分钟延长，循环28次，最后72℃延长5分钟以上。

3、PCR扩增产物纯化

使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，1U/ul SAP酶0.75ul，10U/ul ExoI酶0.375ul，去离子水3.875ul。

在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37℃、15min，72℃、20min。

4、DNA测序反应

使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物：

（1）CTLA4（A49G）测序引物：5'CTGAACACCGCTCCCATAAA3'

（2）IL-4（C-509T）测序引物：5'CCTGCTGGGACCCAAACTA3'

反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物1ul，25%Bigdye mix1ul,3.2uM DNA测序引物 1ul，去离子水2ul。

在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98℃2min，进行25个循环的96℃ 30s，55℃30s,60℃ 4min。

反应结束后加入125mM EDTA溶液1ul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min；在4℃,3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul，3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入测序仪中。

5、基因型分析

熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。

实施例2. 为人群进行桥本甲状腺炎基因检测的服务

1.采样及抽提DNA

由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。

2.基因型检测

使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这2个SNPs位点的基因型。

3. 桥本甲状腺炎高危人群风险评估分析

通过对受检者SNPs基因型的分析，出具桥本甲状腺炎风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的 SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读桥本甲状腺炎基因无创检测报告单。

序列表

<110> 解码（上海）生物医药科技有限公司

<120> 桥本甲状腺炎基因无创检测试剂盒

<130> 20120327

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> CTLA4（A49G）正向引物

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> CTLA4（A49G）正向引物

ctgaacaccg ctcccataaa 20

<210> CTLA4（A49G）反向引物

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> CTLA4（A49G）反向引物

gaatacagag ccagccaagc 20

<210> IL-4 C-509T正向引物

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> IL-4 C-509T正向引物

cctgctggga cccaaacta 19

<210> IL-4 C-509T反向引物

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> IL-4 C-509T反向引物

Acaggtggca tcttggaaac 20

<210> CTLA4（A49G）测序引物

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> CTLA4（A49G）测序引物

ctgaacaccg ctcccataaa 20

<210> IL-4 C-509T测序引物

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> IL-4 C-509T测序引物

cctgctggga cccaaacta 19

Claims

1.一种筛查桥本甲状腺炎高危人群的基因无创检测试剂盒，其特征在于：检测CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这2个SNPs位点的DNA片段的引物对。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的DNA测序引物是针对CTLA4基因上A49G、IL-4基因上C-509T的2个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述2个SNPs位点基因型的DNA测序引物。

4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的2对特异性引物序列如下：

（1）CTLA4（A49G）正向引物：5'CTGAACACCGCTCCCATAAA3'

CTLA4（A49G）反向引物：5'GAATACAGAGCCAGCCAAGC3'

（2）IL-4（C-509T）正向引物：5'CCTGCTGGGACCCAAACTA3'

IL-4（C-509T）反向引物：5'ACAGGTGGCATCTTGGAAAC5'。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的2条DNA测序引物序列如下：

（1）CTLA4（A49G）测序引物：5'CTGAACACCGCTCCCATAAA3'

（2）IL-4（C-509T）测序引物：5'CCTGCTGGGACCCAAACTA3'。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括：

（1）PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液2.5ul，25mM dNTP混合液0.2ul，5U／ul Taq DNA聚合酶 0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH₂O 19.175ul

（2）PCR产物纯化体系：1 U／ul SAP酶0.75ul，10 U／ul ExoI酶0.375ul，ddH₂O 3.875ul

（3）测序反应体系：25% BigDye mix1ul，3.2uM DNA测序引物1ul，125mM EDTA溶液1ul，100%乙醇溶液15ul，70%乙醇溶液30ul，HIDI溶液8ul，ddH₂O 2ul

本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。