CN103372203A - 一种抗原组合物及其制备方法和用途以及肿瘤疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗原组合物的制备方法,该制备方法包括如下步骤:(1)将黑色素瘤细胞的可溶蛋白和肺腺癌细胞的可溶蛋白混合,得到肿瘤抗原蛋白;或者将黑色素瘤细胞和肺腺癌细胞混合并提取可溶蛋白,得到肿瘤抗原蛋白;(2)将所述肿瘤抗原蛋白与不成熟树突状细胞接触;(3)将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞;(4)分离所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。另一方面,本发明还提供了上述制备方法得到的抗原组合物。另一方面,本发明还提供了上述抗原组合物在制备肿瘤疫苗中的用途。另一方面,本发明还提供了一种肿瘤疫苗,该肿瘤疫苗包括上述抗原组合物和免疫佐剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地,涉及一种抗原组合物、该抗原组合物的制备方法、该抗原组合物的用途和一种肿瘤疫苗。
背景技术
目前常规的肿瘤治疗手段,即手术、放疗和化疗,花费昂贵,治疗周期漫长,并且在肿瘤患者身体和心里上都会造成严重的伤害。相对于传统的治疗策略,免疫治疗具备自体治疗、对机体不造成损伤及杀灭肿瘤谱广等特点,特别适合清除少量残存的肿瘤细胞,尤其是放疗或化疗很难杀灭的静止期肿瘤细胞。
细胞膜泡是细胞产生的一种囊泡结构,直径在30-100nm之间,具有稳定性好、能够长期储存等特点。来源于树突状细胞的细胞膜泡是近年来发现的适用于免疫治疗的生物膜结构。大量基础研究证明,负载肿瘤抗原的树突状细胞产生的细胞膜泡具有很好的免疫原性,能够在体内有效激活T淋巴细胞细胞毒反应,杀伤肿瘤细胞,并产生长期的免疫记忆。临床I期研究显示该类细胞膜泡能够有效延长肿瘤患者的生存期,提高肿瘤患者的生存率,提示细胞膜泡可以应用于肿瘤免疫治疗当中。
然而,肿瘤免疫治疗在临床应用中存在一些问题,例如,一是治疗过程复杂;其次,治疗成本较高;三是难以彻底清除机体肿瘤。为了克服这些障碍,目前已经开发出一系列预防型的肿瘤疫苗,譬如预防宫颈癌的人乳头状瘤病毒(HPV)疫苗和预防肝癌的乙型肝炎病毒(HBV)疫苗。但是这些预防型疫苗的预防对象为引起肿瘤的相关病毒,而非肿瘤本身,而且仅能够预防单一类型肿瘤的发生,应用范围有限。目前尚未有基于肿瘤自身的非病毒类预防型疫苗进入临床试验阶段以及同时预防多种肿瘤发生的疫苗研究的报道。鉴于此,开发一种针对肿瘤本身,并且能够同时预防多种肿瘤发生的新型疫苗具有一定的必要性。
发明内容
为了克服现有肿瘤疫苗不能同时预防多种肿瘤发生的缺陷,本发明提供了一种可预防多种肿瘤发生的细胞膜泡疫苗及其制备方法。
本发明的发明人发现,利用肿瘤细胞来源的肿瘤抗原蛋白和树突状细胞来源的细胞膜泡,制备负载多种肿瘤抗原蛋白的细胞膜泡,具有相互促进的效果,能够更加高效且广谱地激发体内抗原特异性免疫反应,从而实现对多种肿瘤的预防作用,并且能取得更好的肿瘤预防效果。由此得到本发明。
为了实现上述目的,一方面,本发明提供一种抗原组合物的制备方法。该制备方法包括如下步骤:(1)将黑色素瘤细胞的可溶蛋白和肺腺癌细胞的可溶蛋白混合,得到肿瘤抗原蛋白;或者将黑色素瘤细胞和肺腺癌细胞混合并提取可溶蛋白,得到肿瘤抗原蛋白;(2)将所述肿瘤抗原蛋白与不成熟树突状细胞接触;所述不成熟树突状细胞具有CD11c阴性、CD80阴性、CD86阴性、MHC class I H-2Kd阴性和MHC class II I-Ad阴性的表面标记表型并且具有抗原呈递活性;(3)将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞;所述成熟树突状细胞具有CD11c阳性、CD80阳性、CD86阳性、MHC class I H-2Kd阳性和MHC class II I-Ad阳性的表面标记表型;(4)分离所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。
另一方面,本发明还提供了上述制备方法得到的抗原组合物。
另一方面,本发明还提供了上述抗原组合物在制备肿瘤疫苗中的用途。
另一方面,本发明还提供了一种肿瘤疫苗,该肿瘤疫苗包括上述抗原组合物和免疫佐剂。
本发明的上述技术方案,能够有助于预防多种肿瘤发生。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本发明,但并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是实施例1得到成熟树突状细胞的细胞膜泡的透射电镜图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
本发明提供了一种抗原组合物的制备方法,该制备方法包括如下步骤:(1)将黑色素瘤细胞的可溶蛋白和肺腺癌细胞的可溶蛋白混合,得到肿瘤抗原蛋白;或者将黑色素瘤细胞和肺腺癌细胞混合并提取可溶蛋白,得到肿瘤抗原蛋白;(2)将所述肿瘤抗原蛋白与不成熟树突状细胞接触;所述不成熟树突状细胞具有CD11c阴性、CD80阴性、CD86阴性、MHC class I H-2Kd阴性和MHC class II I-Ad阴性的表面标记表型并且具有抗原呈递活性;(3)将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞;所述成熟树突状细胞具有CD11c阳性、CD80阳性、CD86阳性、MHC class I H-2Kd阳性和MHC class II I-Ad阳性的表面标记表型;(4)分离所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。
其中,所述黑色素瘤细胞是指来自黑色素瘤的肿瘤细胞,可以通过原代分离得到,也可以通过商购获得,并且可以用常规的细胞培养方法进行培养扩增。同样地,所述肺腺癌细胞是指来自肺腺癌的肿瘤细胞,可以通过原代分离得到,也可以通过商购获得,并且可以用常规的细胞培养方法进行培养扩增。典型地,所述黑色素瘤细胞可以为购自ATCC的商品号为CRL-6475的细胞;所述肺腺癌细胞可以为购自ATCC的商品号为CRL-1642的细胞。
其中,所述可溶蛋白是指可在生理条件下可溶于水的蛋白;典型地,可以在磷酸盐缓冲液中将细胞破碎并除去不溶物,即可得到所述可溶蛋白的溶液。所述磷酸盐缓冲液可以为常规用于细胞工程的各种磷酸盐缓冲液,本发明没有特别的要求。
其中,所述不成熟树突状细胞是指尚未进行抗原呈递活动的树突状细胞,它的制备方法和鉴别方法是本领域人员熟知的,例如文献“LangenkampA,等.自然(Nature)2000,1,311-316”中所描述的。当树突状细胞具有CD11c阴性、CD80阴性、CD86阴性、MHC class I H-2Kd阴性和MHC class II I-Ad阴性的表面标记表型时,即认为该树突状细胞为不成熟树突状细胞,具有上述表面标记表型的树突状细胞在存活时,均具有抗原呈递活性。
其中,成熟树突状细胞是指已经完成抗原呈递的树突状细胞,具有CD11c阳性、CD80阳性、CD86阳性、MHC class I H-2Kd阳性和MHC classII I-Ad阳性的表面标记表型的树突状细胞即可认为是成熟树突状细胞。
本发明中,未做相反说明的情况下,细胞的表面标记表现均是通过流式细胞术进行确定的。
根据本发明的制备方法,其中,典型地,所述不成熟树突状细胞可以来自树突状细胞系DC2.4和/或原代骨髓单核细胞。其中,树突状细胞系DC2.4是购自南方细胞技术有限公司的商品号为CCL-01的细胞;所述原代骨髓单核细胞可以通过从离体骨髓中分离并培养获得。原代骨髓单核细胞可以通过常规的诱导培养方法产生不成熟树突状细胞,例如文献(Langenkamp A,等.自然(Nature)2000,1,311-316)中记载的方法。
根据本发明的制备方法,其中,优选情况下,步骤(1)中,将黑色素瘤细胞的可溶蛋白和肺腺癌细胞的可溶蛋白混合时,所述黑色素瘤细胞的可溶蛋白和所述肺腺癌细胞的可溶蛋白的重量比可以为1∶0.1-10,更优选为1∶0.5-2;或者,将黑色素瘤细胞和肺腺癌细胞混合并提取可溶蛋白时,所述黑色素瘤细胞和所述肺腺癌细胞的细胞数目比为1∶0.1-10,更优选为1∶0.2-2。
根据本发明的制备方法,其中,优选情况下,步骤(2)中,相对于106个所述不成熟树突状细胞,所述肿瘤抗原蛋白的用量为1-100μg,更优选为10-20μg。所述肿瘤抗原蛋白的用量可以根据常规的蛋白定量方法来确定,例如Bradford法。
其中,将所述肿瘤抗原蛋白与不成熟树突状细胞接触的条件可以为常规的细胞培养条件,本发明没有特别的要求,优选情况下,接触的温度可以为4-42℃,时间可以为1-96h。
根据本发明的制备方法,其中,步骤(3)中,将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞的条件可以为常规的可诱导树突状细胞发育的条件,例如文献(Langenkamp A,等.自然(Nature)2000,1,311-316)中记载的条件,优选情况下,该条件包括:将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞与细菌脂多糖接触。
其中,细菌脂多糖是常规的免疫刺激剂,可以通过商购获得,它的用量没有特别的要求,进一步优选情况下,相对于106个与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞,细菌脂多糖的用量为1-500μg,更优选为10-100μg。
其中,将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞与细菌脂多糖接触可以在常规的细胞培养条件下进行,例如在4-42℃的温度下进行,该接触的时间没有特别的要求,只要能将不成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞即可,典型地,该接触的时间可以为1-96h。
根据本发明的制备方法,其中,步骤(4)中,分离所述成熟树突状细胞的细胞膜泡的方法可以为常规的分离细胞膜泡的方法,如差速离心法和/或密度梯度离心法,例如文献(Trajkovic K,等.科学(Science),2008,319,1244-1247)中记载的分离膜泡的方法,优选情况下,包括如下步骤:(a)在匀浆盐缓冲液中,将所述成熟树突状细胞以0.0005-0.0055英寸的匀浆间隙进行匀浆,得到匀浆产物;所述磷酸盐缓冲液为含有12-16mM的磷酸钠、135-139mM的氯化钠、2-4mM的氯化钾和8-12mM的乙二胺四乙酸的水溶液,pH值为7.5-8.5;(b)将所述匀浆产物在400-600×g的离心速度下离心5-15分钟,得到第一上清液;(c)将所述第一上清液在9000-10000×g的离心速度下离心25-35分钟,得到第二上清液;(d)将所述第二上清液在90000-110000×g的离心速度下离心60-80分钟,得到的沉淀即为所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。其中,0.0005-0.0055英寸的匀浆间隙可以通过使用Dounce匀浆器实现。
根据本发明的制备方法,其中,所述磷酸盐缓冲液和/或所述匀浆缓冲液中可以含有蛋白酶抑制剂。
本发明还提供了如上所述的制备方法得到的抗原组合物。
本发明还提供了如上所述的抗原组合物在制备肿瘤疫苗中的用途。
本发明还提供了一种肿瘤疫苗,该肿瘤疫苗包括如上所述的抗原组合物和免疫佐剂。
根据本发明的肿瘤疫苗,其中,所述抗原组合物和免疫佐剂的重量比可以为常规的比例,例如1∶0.1-10。
根据本发明的肿瘤疫苗,其中,所述免疫佐剂为非甲基化CpG二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG ODN 1826,即序列如SEQ ID NO.1所示(5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′)的核酸)、错位双链核糖核酸(poly(I):poly(C12U)dsRNA,可购自Macgene公司,货号为tlrl-pic-5)和粒细胞集落刺激因子(GM-CSF,可购自PeproTech公司,货号为315-03)中的一种或多种。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。下述实施例中,磷酸缓冲液的成分为137mM的氯化钠,2.7mM的氯化钾,4.3mM的磷酸氢二钠和1.4mM的磷酸二氢钠,pH值为7.4-7.6。
实施例1
本实施例按照以下步骤制备本发明的抗原组合物。
(1)将黑色素瘤细胞(购自ATCC的商品号为CRL-6475的细胞)在RPMI 1640培养基(购自HyClone,牌号SH30809.01B,且含10%体积的胎牛血清)中,在37℃和5%体积的CO2浓度下培养至基本长满细胞瓶的底部,除去培养基,刮下细胞并悬浮于磷酸缓冲液中,得到黑色素瘤细胞悬液(用磷酸缓冲液调节黑色素瘤细胞悬液的体积,使得细胞浓度为5×106个/mL),用超声波处理黑色素瘤细胞悬液(相对于1mL的被超声波处理的液体,超声波的功率为12W;超声波的频率为20kHz,超声波的处理时间为180s),以破碎细胞,然后将超声波处理后的物料在10000×g的速度下离心30分钟,弃去沉淀,上清液即为黑色素瘤细胞的可溶蛋白的溶液(用磷酸缓冲液调节体积,使得蛋白浓度为5μg/μl)。
将肺腺癌细胞(购自ATCC的商品号为CRL-1642的细胞)在RPMI 1640培养基(购自HyClone,牌号SH30809.01B,且含10%体积的胎牛血清)中,在37℃和5%体积的CO2浓度下培养至基本长满细胞瓶的底部,除去培养基,刮下细胞并悬浮于磷酸缓冲液中,得到肺腺癌细胞悬液(用磷酸缓冲液调节肺腺癌细胞悬液的体积,使得细胞浓度为5×106个/mL)。用超声波处理肺腺癌细胞悬液(相对于1mL的被超声波处理的液体,超声波的功率为12W;超声波的频率为20kHz,超声波的处理时间为180s),以破碎细胞,然后将超声波处理后的物料在10000×g的速度下离心30分钟,弃去沉淀,上清液即为肺腺癌细胞的可溶蛋白的溶液(用磷酸缓冲液调节体积,使得蛋白浓度为5μg/μl)。
将黑色素瘤细胞的可溶蛋白的溶液和肺腺癌细胞的可溶蛋白的溶液等体积混合,即得到肿瘤抗原蛋白。
(2)按照文献(Langenkamp A,等.自然(Nature)2000,1,311-316)中记载的方法,处死小鼠并从小鼠骨髓中分离骨髓单核细胞,培养于RPMI 1640培养基(购自HyClone,牌号SH30809.01B,且含10%体积的胎牛血清)中,培养基含有500U/mL白介素4(购自PeproTech,牌号AF-214-14)和1000U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(购自PeproTech,牌号AF-315-03),在37℃和5%体积的CO2浓度下培养,直至细胞表现出CD11c阴性、CD80阴性、CD86阴性、MHC class I H-2Kd阴性和MHC class II I-Ad阴性的表面标记表型(约为开始培养的第6天),加入肿瘤抗原蛋白,1×106个不成熟树突状细胞加入肿瘤抗原蛋白共10μg,继续培养6h。加入细菌脂多糖(购自Sigma,商品号110M4086V,终浓度为100μg/mL),继续培养直至细胞具有CD11c阳性、CD80阳性、CD86阳性、MHC class I H-2Kd阳性和MHC class II I-Ad阳性的表面标记表型(约需要24h),通过将培养液400×g离心5分钟收集沉淀得到成熟树突状细胞。
(3)用磷酸缓冲液洗涤成熟树突状细胞,重悬细胞于匀浆缓冲液(含有14mM磷酸钠,137mM氯化钠,3mM氯化钾,10mM乙二胺四乙酸的水溶液,pH值为8.0)中,浓度为5×106个细胞/mL,使用Dounce匀浆器匀浆细胞30次,得到匀浆产物。将所述匀浆产物在500×g的离心速度下离心10分钟,得到第一上清液;将所述第一上清液在8000×g的离心速度下离心30分钟,得到第二上清液;将所述第二上清液在100000×g的离心速度下离心70分钟,得到的沉淀即为所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。
所述成熟树突状细胞的细胞膜泡即为本发明的抗原组合物。
按照文献(Kovar M,等.美国科学院院报(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America)2006,103,11671-11676)中所述的方法,在透射电镜下观察本实施例得到成熟树突状细胞的细胞膜泡,结果如图1所示,说明得到的细胞膜泡疫苗的粒径大小为30-100nm。
制备实施例1
将实施例1制得的抗原组合物与免疫佐剂(非甲基化CpG二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG ODN 1826,即序列如SEQ ID NO.1所示(5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′)的核酸,订购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)按照重量比1∶1混合,得到本发明的肿瘤疫苗。
测试实施例1
本测试实施例中,将制备实施例1得到的肿瘤疫苗作为实验疫苗。将不含肿瘤疫苗的生理盐水作为对照疫苗;向小鼠(C57BL/J6小鼠,购自北京维通利华公司,雄性,体重18-26g)脚背皮下注射50μl制备实施例1得到的肿瘤疫苗(每微升疫苗含有0.2μg抗原组合物、0.2μg免疫佐剂非甲基化CpG二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG ODN 1826),对小鼠进行免疫(第0天)。7天以后再次注射相同剂量的细胞膜泡疫苗,进行加强免疫。加强免疫7天后(第14天),将免疫小鼠随机分为两组,分别皮下接种小鼠黑色素瘤细胞和小鼠肺腺癌细胞,然后,按照文献(Ahmed F,等.分子药剂学(MolecularPharmaceutics)2006,3,340-350)中的方法测定肿瘤的大小,结果如表1所示,肿瘤抑制率是指无肿瘤的小鼠占全部接种小鼠的比例,证明本发明的肿瘤疫苗能够同时有效预防小鼠黑色素瘤和小鼠肺腺癌的发生。
表1
实施例2
本实施例按照以下步骤制备本发明的抗原组合物。
(1)将黑色素瘤细胞(购自ATCC的商品号为CRL-6475的细胞)在RPMI 1640培养基(购自HyClone,牌号SH30809.01B,且含10%体积的胎牛血清)中,在37℃和5%体积的CO2浓度下培养至基本长满细胞瓶的底部,除去培养基,刮下细胞并悬浮于磷酸缓冲液中,得到黑色素瘤细胞悬液(用磷酸缓冲液调节黑色素瘤细胞悬液的体积,使得细胞浓度为5×106个/mL)。
将肺腺癌细胞(购自ATCC的商品号为CRL-1642的细胞)在RPMI 1640培养基(购自HyClone,牌号SH30809.01B,且含10%体积的胎牛血清)中,在37℃和5%体积的CO2浓度下培养至基本长满细胞瓶的底部,除去培养基,刮下细胞并悬浮于磷酸缓冲液中,得到肺腺癌细胞悬液(用磷酸缓冲液调节肺腺癌细胞悬液的体积,使得细胞浓度为5×106个/mL)。
将黑色素瘤细胞和肺腺癌细胞悬液等体积混合,用超声波处理混合后的物料(相对于1mL的被超声波处理的液体,超声波的功率为12W;超声波的频率为20kHz,超声波的处理时间为180s),以破碎细胞,然后将超声波处理后的物料在10000×g的速度下离心30分钟,弃去沉淀,上清液即为肿瘤抗原蛋白的溶液(用磷酸缓冲液调节体积,使得蛋白浓度为5μg/μl)。
(2)按照文献(Langenkamp A,等.自然(Nature)2000,1,311-316)中记载的方法,将树突状细胞系DC2.4(购自南方细胞技术有限公司的商品号为CCL-01的细胞),培养于RPMI 1640培养基(购自HyClone,牌号SH30809.01B,且含10%体积的胎牛血清)中,培养基含有500U/mL白介素4(购自PeproTech,牌号AF-214-14)和1000U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(购自PeproTech,牌号AF-315-03),在37℃和5%体积的CO2浓度下培养,该细胞表现出CD11c阴性、CD80阴性、CD86阴性、MHC class IH-2Kd阴性和MHC class II I-Ad阴性的表面标记表型(约为开始培养的第6天),加入肿瘤抗原蛋白,1×106个不成熟树突状细胞加入肿瘤抗原蛋白共10μg,继续培养6h。加入细菌脂多糖(购自Sigma,商品号110M4086V,终浓度为100μg/mL),继续培养直至细胞具有CD11c阳性、CD80阳性、CD86阳性、MHC class I H-2Kd阳性和MHC class II I-Ad阳性的表面标记表型(约需要24h),通过将培养液400×g离心5分钟收集沉淀得到成熟树突状细胞。
(3)用磷酸缓冲液洗涤成熟树突状细胞,重悬细胞于匀浆缓冲液(含有14mM磷酸钠,137mM氯化钠,3mM氯化钾,10mM乙二胺四乙酸的水溶液,pH值为8.0)中,浓度为5×106个细胞/mL,使用匀浆器匀浆细胞30次,得到匀浆产物。将所述匀浆产物在500×g的离心速度下离心10分钟,得到第一上清液;将所述第一上清液在8000×g的离心速度下离心30分钟,得到第二上清液;将所述第二上清液在100000×g的离心速度下离心70分钟,得到的沉淀即为所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。
所述成熟树突状细胞的细胞膜泡即为本发明的抗原组合物。
按照与实施例1相同的测量方法,利用透射电镜测得本实施例得到的细胞膜泡疫苗的粒径大小为30-100nm。
制备实施例2
将实施例2制得的抗原组合物与免疫佐剂(错位双链核糖核酸(poly(I):poly(C12U)dsRNA),购自Macgene公司,货号为tlrl-pic-5)按照重量比1∶1混合,得到本发明的肿瘤疫苗。
测试实施例2
本测试实施例中,将制备实施例2得到的肿瘤疫苗作为实验疫苗。将不含肿瘤疫苗的生理盐水作为对照疫苗;向小鼠(C57BL/J6小鼠,购自北京维通利华公司,雄性,体重18-26g)脚背皮下注射50μl制备实施例2获得的细胞膜泡疫苗(每微升疫苗含有0.2μg抗原组合物、0.2μg免疫佐剂非甲基化CpG二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG ODN 1826),对小鼠进行免疫(第0天)。7天以后再次注射相同剂量的细胞膜泡疫苗,进行加强免疫。加强免疫7天后(第14天),将免疫小鼠随机分为两组,分别皮下接种小鼠黑色素瘤细胞和小鼠肺腺癌细胞,然后,按照文献(Ahmed F,等.分子药剂学(MolecularPharmaceutics)2006,3,340-350)中的方法测定肿瘤的大小,结果表2所示,肿瘤抑制率是指无肿瘤的小鼠占全部接种小鼠的比例,证明本发明的肿瘤疫苗能够同时有效预防小鼠黑色素瘤和小鼠肺腺癌的发生。
表2
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本发明的思想,其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种抗原组合物的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
(1)将黑色素瘤细胞的可溶蛋白和肺腺癌细胞的可溶蛋白混合,得到肿瘤抗原蛋白;或者将黑色素瘤细胞和肺腺癌细胞混合并提取可溶蛋白,得到肿瘤抗原蛋白;
(2)将所述肿瘤抗原蛋白与不成熟树突状细胞接触;所述不成熟树突状细胞具有CD11c阴性、CD80阴性、CD86阴性、MHC class I H-2Kd阴性和MHC class II I-Ad阴性的表面标记表型并且具有抗原呈递活性;
(3)将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞;所述成熟树突状细胞具有CD11c阳性、CD80阳性、CD86阳性、MHC classI H-2Kd阳性和MHC class II I-Ad阳性的表面标记表型;
(4)分离所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其中,步骤(1)中,所述黑色素瘤细胞的可溶蛋白和所述肺腺癌细胞的可溶蛋白的重量比为1∶0.1-10;或者,所述黑色素瘤细胞和所述肺腺癌细胞的细胞数目比为1∶0.1-10。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其中,步骤(2)中,相对于106个所述不成熟树突状细胞,所述肿瘤抗原蛋白的用量为1-100μg。
4.根据权利要求1、2或3所述的制备方法,其中,步骤(3)中,将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞的条件包括:将与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞与细菌脂多糖接触;相对于106个与肿瘤抗原接触后的不成熟树突状细胞,细菌脂多糖的用量为1-500μg。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的制备方法,其中,步骤(4)中,分离所述成熟树突状细胞的细胞膜泡的方法包括如下步骤:
(a)在匀浆缓冲液中,将所述成熟树突状细胞以0.0005-0.0055英寸的匀浆间隙进行匀浆,得到匀浆产物;所述匀浆缓冲液为含有12-16mM的磷酸钠、135-139mM的氯化钠、2-4mM的氯化钾和8-12mM的乙二胺四乙酸的水溶液,pH值为7.5-8.5;
(b)将所述匀浆产物在400-600×g的离心速度下离心5-15分钟,得到第一上清液;
(c)将所述第一上清液在9000-10000×g的离心速度下离心25-35分钟,得到第二上清液;
(d)将所述第二上清液在90000-110000×g的离心速度下离心60-80分钟,得到的沉淀即为所述成熟树突状细胞的细胞膜泡。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其中,所述不成熟树突状细胞来自树突状细胞系DC2.4和/或原代骨髓单核细胞。
7.权利要求1-6中任意一项所述的制备方法得到的抗原组合物。
8.权利要求7所述的抗原组合物在制备肿瘤疫苗中的用途。
9.一种肿瘤疫苗,该肿瘤疫苗包括权利要求7所述的抗原组合物和免疫佐剂。
10.根据权利要求9所述的肿瘤疫苗,其中,所述免疫佐剂为非甲基化CpG二核苷酸寡脱氧核苷酸、错位双链核糖核酸和粒细胞集落刺激因子中的一种或多种。
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