CN103370415A - Hbv治疗 - Google Patents
Hbv治疗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103370415A CN103370415A CN2011800628848A CN201180062884A CN103370415A CN 103370415 A CN103370415 A CN 103370415A CN 2011800628848 A CN2011800628848 A CN 2011800628848A CN 201180062884 A CN201180062884 A CN 201180062884A CN 103370415 A CN103370415 A CN 103370415A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- effector
- ddrnai
- sequences
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 29
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 457
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 192
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 186
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 167
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims abstract description 166
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 159
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 204
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 203
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 62
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 60
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 59
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 56
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 29
- 108700024845 Hepatitis B virus P Proteins 0.000 claims description 17
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 17
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 14
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 10
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 abstract description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 86
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 43
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 43
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 42
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 25
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 9
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 7
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 6
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 3
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- -1 nucleoside phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102100030802 Beta-2-glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 101150003160 X gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 108010023562 beta 2-Glycoprotein I Proteins 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 230000008935 histological improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059193 Acute hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000018616 Apolipoproteins B Human genes 0.000 description 1
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100490563 Caenorhabditis elegans adr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057573 Chronic hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 208000000857 Hepatic Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 102100034523 Histone H4 Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical class C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 102000001851 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010015340 Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein-1 Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007584 Prealbumin Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 235000013647 Prunus pensylvanica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007942 Prunus pensylvanica Species 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 108010048889 Thyroxine-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009488 Thyroxine-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108091026822 U6 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N Vitamin D2 Natural products C1CCC2(C)C(C(C)C=CC(C)C(C)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000037628 acute hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 101150084233 ago2 gene Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002061 ergocalciferol Drugs 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000054584 human Y acceptor Human genes 0.000 description 1
- 108700023876 human Y acceptor Proteins 0.000 description 1
- 231100000003 human carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 238000007449 liver function test Methods 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N mifepristone Chemical compound C1([C@@H]2C3=C4CCC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]3CC[C@@]([C@]3(C2)C)(O)C#CC)=CC=C(N(C)C)C=C1 VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000005582 sexual transmission Effects 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000004877 small RNA loading onto RISC Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N vitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/[C@H](C)C(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C MECHNRXZTMCUDQ-RKHKHRCZSA-N 0.000 description 1
- 235000001892 vitamin D2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011653 vitamin D2 Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Electrical Discharge Machining, Electrochemical Machining, And Combined Machining (AREA)
- Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Control Of Eletrric Generators (AREA)
Abstract
本发明提供了RNA干扰(RNAi)制剂、所述RNAi制剂用于治疗个体中乙型肝炎感染的应用、以及包含所述RNAi制剂的药物组合物。所述RNAi制剂或表达它们的构建体用于抑制至少一种乙型肝炎病毒(HBV)基因的表达,其中每一制剂包括与转录自一个靶区域的预测序列互补或基本互补的效应器序列。在本发明的一些实施方式中,所述制剂具有多于一种效应器序列;其中多效应器可以靶定HBV基因中的相同区域、相同基因和/或不同HBV基因的不同(可能地重叠)区域。
Description
技术领域
本发明涉及一种RNA干扰(RNAi)制剂和所述RNAi制剂在治疗个体乙型肝炎感染中的应用,以及包含本发明的RNAi制剂的药物组合物。
背景技术
肝炎是“肝脏发炎”的泛称,其具有多种原因。病毒原因是其中最常见的,并且可以由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒引起。乙型肝炎病毒(HBV)尤其是一种严重并常见的肝脏传染病,在世界范围内感染了数百万人口。
HBV是属于嗜肝DNA病毒科的嗜肝性DNA病毒。该病毒基因组的全长大约是3.2kb,有四个开放阅读框(ORF),包括:表面抗原(“S基因”)、核心抗原(“C基因”)、DNA聚合酶(“P基因”)和被称为“X基因”的未确定功能的基因。
目前现存人口中超过20亿人已经在他们生命的某些时候感染了HBV,其中大约3亿5千万人仍然是慢性感染状态并且成为该病毒的携带者。HBV感染可以引起急性和慢性的乙型肝炎,并可能最终导致发展成慢性肝功能不全、肝硬化和肝细胞癌。此外,HBV携带者可以经年传播该疾病。
HBV通过皮肤或肠胃外接触感染的体液或血液而传播。最常见的感染途径是通过母亲和其孩子间的垂直传播以及在成人中通过性传播或共用静脉针或穿耳设备而传播。但是,很多急性HBV感染的病例并没有可追踪的感染途径。
具有慢性HBV感染的人(“携带者”-全世界大约3.5~4亿人)比非携带者有12~300×更高的发展肝细胞癌的风险,并且全球范围内,HBV引发世界原发性肝癌的60~80%。每年,在超过4百万的急性临床病例中,有大约25%(即,全世界范围内一百万人口)死于慢性活动型肝炎、肝硬化或HBV诱导的肝癌。因此,HBV被列为仅次于烟草的第二大已知的人类致癌物。
尽管抗HBV疫苗已经广泛使用了几十年,人群中HBV的患病率依然很高。在大多数的慢性感染的病患中,目前对慢性HBV感染的治疗仅限于对病毒基因表达和复制的抑制作用。例如,拉米夫定抑制HBV在携带者中的复制,但是如果治疗终止,效果将可逆。此外,长期拉米夫定治疗的主要缺陷是病毒抗药性的发展,通常在治疗6个月后发展。抗药性通常与HBV聚合酶基因的高度保守的催化区域中的变异相关。
出于这些原因,仍然需要新的治疗制剂以治疗HBV感染。本发明提供一种RNA干扰(RNAi)制剂以及该RNAi制剂在治疗个体乙型肝炎感染中的应用。
RNAi途径由酶Dicer起始,所述酶将双链RNA(dsRNA)分子分解成约20~25个核苷酸的短片段(通常被称为siRNA)。每个片段的双链之一(已知被称为指导链或活性链)然后通过结合argonaute蛋白家族的一个成员而与RNA诱导的沉默复合体(RISC)整合。在整合至RISC之后,所述指导链与它的目标mRNA碱基配对,被认为是通过抑制mRNA翻译(通过停止翻译机制)和/或诱导mRNA的分解而抑制目标,从而阻碍它用作翻译模板。
尽管由Dicer产生的片段是双链的,仅指导链指导基因沉默。另一条更通常被称为过客链、携带链或*链的反指导链往往在RISC活化作用中降解(Gregory R,Chendrimada T,Cooch N,Shiekhattar R(2005)."Human RISCcouples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing".Cell123(4):631-40)。RISC装配被认为是通过一种酶指导,所述酶选择将dsRNA的Dicer产物中哪一条链置于RISC中。所述链通常是5’末端与其互补序列较不严谨配对的链,同样表现出在5’位置对A的明显偏向,而对U较少偏向,以促进与一些argonaute蛋白的结合(Schwarz DS,Hutvágner G,Du T,Xu Z,Aronin N,Zamore PD(2003)."Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex".Cell115(2):Frank F,Sonenberg N,Nagar(2010)“Structural basis for5'-nucleotide base-specific recognition of guide RNA by human AGO2”.Nature.465(7299):818-22)。
说明书中对任何现有技术的参考不是且不应当被认为是对以下内容的确认或任何形式的建议:该现有技术在澳大利亚或任何其它管辖区形成公知常识的一部分,或者该现有技术可以被合理地预期为本领域技术人员可以确定、理解或认为有关联。
发明内容
本发明的发明人已经发现,可以靶定乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的特定序列以抑制该病毒。通过靶定一个或多个基因的特定区域,那些基因的表达被抑制,有效地“沉默”所述基因。这表现出靶定细胞中HBV表达,以治疗HBV感染的新机会。
在本发明的一个方面,提供了DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂(是RNA分子),以及表达盒或构建体以在细胞中(包括体内)表达所述制剂,用于抑制至少一个乙型肝炎病毒(HBV)基因表达,其中所述制剂包括一种效应器序列(将在下文进一步描述),所述效应器序列的长度是至少17个核苷酸,与从靶区域转录的预测序列互补或基本上互补,所述靶区域选自SEQ IDNO:1-19中任意一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸。在另一种实施方式中,所述靶区域是选自SEQ ID NO:20-27中任意一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸的序列。
所述效应器序列被引导至靶RNA序列的靶区域,其中所述靶序列是靶基因的转录本。因此,通过与包含所述靶区域的靶基因的转录本在序列上充分互补,所述效应器序列而被引导至靶区域。具有包含所述效应器序列的双链部分的RNAi制剂,如ddRNAi制剂,可以因此由于包含所述靶区域的靶基因序列而“抑制靶基因序列的表达”。因此,在感染HBV的细胞中,由于所述效应器的序列(下文定义为“效应器”)与靶基因的预测mRNA靶序列的(至少)一个区域基本上互补,所述RNAi制剂能够抑制靶基因序列的表达。这可以用以下短序列图解:
5’ATTGCG3’-基因的DNA靶序列
5’AUUGCG3’-来自所述基因的转录的mRNA靶区域/序列
3’UAACGC5’-效应器序列-与预测的mRNA靶序列的一个区域基本互补。
典型地,靶区域是基因的mRNA的一个区域,所述基因计划中将被沉默或使其表达(在转录或翻译水平)降低。
设计所述制剂使得它同样包含效应器互补序列,即,与所述效应器序列基本互补的序列,使得它将易于退火从而形成双链RNA片段——需要的互补度将在下文更具体解释。此外,所述双链片段的一个末端通常将通过环序列连接以形成“发夹”样结构。这也被认为是“中断的反向重复”结构,因为编码这样的RNA序列的DNA包含所述靶基因的所述区域的反向重复,所述区域被转录成效应器序列,被编码所述环的填充序列或间隔子序列阻断。
在本发明的一些形式中,所述制剂具有多于一种效应器序列。多种效应器可以靶定HBV基因的同一区域,相同基因和/或不同HBV基因的不同(可能重叠)区域。RNAi制剂,如ddRNAi制剂,可以包含2种或3种不同的效应器序列。如上文所解释的,所述ddRNAi制剂包含对于每一条效应器序列的效应器互补序列,因此形成效应器-效应器互补序列对(即,第一效应器-第一效应器互补序列对,第二效应器-第二效应器互补序列对等)。这些对可以是(但不必须是)彼此相邻,只要所述RNAi制剂可以折叠以使得每一对退火。多种其它的因素暗示了所述效应器和效应器互补序列沿着所述RNAi制剂的长度的一种或另一种顺序。因此,本发明的实施方式包括一种或多种以下内容:
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第二效应器序列,第二效应器互补序列和第一效应器互补序列;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第二效应器序列,第三效应器序列,第三效应器互补序列,第二效应器互补序列和第一效应器互补序列;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第一效应器互补序列,第二效应器序列和第二效应器互补序列;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第一效应器互补序列,第二效应器序列,第二效应器互补序列,第三效应器序列和第三效应器互补序列;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第二效应器序列,2~100个非自身互补核苷酸的序列,第二效应器互补序列和第一效应器互补序列;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,2~100个非自身互补核苷酸的序列,第一效应器互补序列,第二效应器序列,2~100个非自身互补核苷酸的序列和第二效应器互补序列。
如本领域技术人员所理解的以及如附图所例示的,所述制剂中,任何具体的效应器序列都可以与其互补序列在位置上互换。在上文所述的每一实施方式的具体形式中,每一个效应器序列的长度至少是17个核苷酸,并包括选自来自SEQ ID NO:1-19或SEQ ID NO:20-27的任何一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。所述效应器序列可以全部是相同的,或者全部不同,或者是其组合,例如序列是SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸的2个效应器序列和序列是SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸的1个效应器序列。
优选地,所述效应器序列选自SEQ ID NO:1-19或SEQ ID NO:20-27的任何一条序列中的任何连续11、12、13、14、15或16个核苷酸;最优选地,选自SEQ ID NO:1-19或SEQ ID NO:20-27的任何一条序列中的17个或更多个连续核苷酸。通常,所述效应器互补序列的长度与其对应的效应器序列的长度相同或大致相同(即,±15%核苷酸长度)。
在其它实施方式中,所述dsRNA由退火形成双链体的2个分离的RNA链组成。ddRNAi制剂可以由插入至任何合适载体或ddRNAi构建体的DNA表达盒表达。因此,本发明的多个方面提供一种ddRNAi表达盒,包括:
·一条或多条启动子序列;
·一条或多条DNA序列,优选地所述DNA序列是编码SEQ ID NO:1-19或SEQ ID NO:20-27的任何一条序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸;
·一条或多条DNA序列,所述DNA序列编码一种或多种效应器互补序列;
·一条或多条终止子序列;
以及可选地,
·一条或多条编码环序列的DNA序列;和
·一条或多条增强子序列。
在一些实施方式中,一个启动子与多个效应器编码区域可操作地连接,使得所述启动子可以驱动它们表达,而在其它实施方式中,每一个效应器编码区域与其本身的启动子可操作地连接。在具有多个启动子的构建体中,这些启动子可以是全部相同或不同。优选的启动子是U6和H1。
同样提供ddRNAi表达构建体,ddRNAi表达盒插入至所述ddRNAi表达构建体中用于表达。此外,当所述构建体的载体骨架与递送系统相容时,所述ddRNAi表达构建体同样是递送构建体。
本发明还提供siRNA制剂,包括一条长度至少是17个核苷酸的序列,所述序列选自SEQ ID NO:1-19或SEQ ID NO:20-27的任何一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸,以及一条与所述序列互补的序列,两条序列形成双链体并能够抑制HBV基因的表达。
本发明还提供治疗个体中急性或慢性HBV感染的方法、减少个体中HBV病毒负荷的方法、降低个体中与HBV感染相关的症状的严重度的方法和降低HBV的传染性的方法,这些方法包括施用治疗有效量的本发明的ddRNAi构建体、ddRNAi制剂或siRNA制剂,其中所述ddRNAi构建体、ddRNAi制剂或siRNA制剂抑制一种乙型肝炎病毒(HBV)基因(优选地,至少是HBV的聚合酶基因)中的一个或多个靶定序列的表达。
本发明还提供一种药物组合物,包括本发明的ddRNAi制剂、ddRNAi表达盒、ddRNAi构建体或siRNA制剂,以及一种药物学可接受的载体或稀释剂。
附图说明
图1A-F例示了本发明的一些ddRNAi制剂的结构。
图2显示了沿着HBV聚合酶基因所获得的642个siRNA克隆的分布,其中短线表示个体的全部siRNA靶(EsT)克隆。
图3是siRNA表达盒(SEC)和它们的相对应的合成siRNA对HBV聚合酶mRNA水平的RNAi功效的比较,以证实由HBV聚合酶表达3的SEC抑制获得的初始筛选结果。
图4是用源自EsT库的501个siRNA序列对HBV聚合酶抑制筛选的结果。
图5A是前100个最有效的siRNA序列(如在图4中大规模筛选中所鉴定的)沿着HBV聚合酶基因的分布的图示。图5B图示了任何给定的序列是如何绘制至HBV聚合酶基因。所显示的是SEQ ID NO:1-3所基于的区域。
图6是5个单独的表达盒和由它们编码的RNAi制剂以及由Dicer加工后的效应器序列的示意图。所述表达盒基于SEQ ID NO:3、9、12、13和23。
图7是具有多个效应器序列表达盒的示意图,所述表达盒包括(a)多条效应器序列,每条效应器序列可操作地与独立的启动子和终止子序列连接,以表达以短发夹RNAi(shRNAi)制剂形式的单独的RNAi制剂(图7A);或者(b)可操作地与一个启动子连接的第一效应器序列和可操作地与一个终止子连接的第三效应器序列,以表达单一的多个茎环RNAi制剂。所述表达盒基于SEQID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6。
图8是多个效应器序列表达盒的示意图,所述表达盒基于SEQ ID NOS:1、4和6,其产生单一的长发夹RNAi制剂。
图9例示了SEQ ID NO:1~14和20~27在转染至HepG22.2.15细胞之后的基因敲减功效。通过qRT-PCR分析聚合酶基因mRNA来测量敲减功效。siNC是负对照,是一种在HBV中没有已知的靶序列的siRNA;正常的是在未转染细胞中的聚合酶mRNA水平,标准化为1的水平。
图10A和B显示了细胞中荧光素酶活性(+/-SD,n=4),所述细胞在表3和4中列出的条件下用不同量的化学合成的靶向pGL-23的siRNA23(A)或者shRNA23表达构建体(B)转染。在图10A中,siNC既用作负对照,也用于调整加入至细胞中的siRNA的总量,以避免由不相等的转染造成的可能的人造数据;siRNA GL3用作负对照,使得是siRNA靶定荧光素酶基因。在图10B中,pUC57既用作正对照,也用于调整加入至细胞中的质粒DNA的总量,以避免由不相等的转染造成的可能的人造数据。表达基于GL3siRNA的荧光素酶shRNA的质粒用作正对照。
具体实施方式
定义
如本文中所使用的,除非另有说明,术语“包含”及该术语的变化形式,如“包括”、“含有”、“组成”不意味着排除其它添加剂、组分、整数或步骤。
术语“RNA干扰”或“RNAi”通常指由细胞的细胞质中的双链RNA(dsRNA)分子启动的RNA依赖的基因沉默过程。所述dsRNA减少了靶核酸序列的表达,所述靶核酸序列可能是DNA,它的RNA表达产物被减少,或者是RNA,所述dsRNA分子与所述RNA基本或完全同源。
“双链RNA”或“dsRNA”表示能够抑制与其具有同源性的靶核酸序列的表达的双链RNA分子。在一些实施方式中,所述dsRNA是发夹或茎环结构,其中一个双链体区域可选地通过至少一个核苷酸连接,并被称为“发夹RNA”或“短发夹RNAi制剂”或“shRNA”。所述双链体在效应器序列和与所述效应器序列互补的序列(在本文中被称为“效应器互补序列”)之间形成。通常,所述效应器互补序列的长度与其相应的效应器序列的长度相同。如将在下文所解释的,所述效应器序列与靶核酸序列互补。
“效应器序列”是当RISC复合体的一部分与HBV靶核苷酸序列结合时,从而靶定该序列用于被细胞破坏的核苷酸序列。它与在背景技术章节中讨论的“指导”链类似。所述效应器序列通过与靶区域的转录本在序列上互补或基本互补而“靶向于”所述靶区域,使得具有包含所述效应器序列的双链部分的RNA制剂抑制靶基因序列的表达。
所述“效应器互补序列”与在背景技术部分中讨论的过客链类似,并与所述效应器充分互补使得其与所述效应器序列退火。可能地,所述效应器互补序列将是与所述靶基因序列类似的序列,但不必要必须是。
术语“RNAi制剂”指得到RNAi的dsRNA序列。该术语可以与“小干扰RNA”(siRNA制剂)和小发夹RNA(shRNAi或hpRNAi制剂)互换使用。
所述RNAi制剂的双链或双链体区域的长度至少是17个碱基对,通常的范围是17~30个碱基对。可以在细胞外通过化学或酶学合成RNAi制剂,然后递送至细胞,或者可以在细胞中通过合适的载体体内表达(见,如美国专利6,573,099,WO2004/106517和WO99/49029,这些文献通过引用的方式结合至本文)。
术语“DNA指导的RNAi制剂”或“ddRNAi制剂”指转录自DNA表达盒(“ddRNAi表达盒”)的RNAi制剂。所述转录自表达盒的ddRNAi制剂可以转录为能够自退火成具有通过至少2个核苷酸连接的双链体区域的发夹结构的单一RNA,或者转录为具有多个shRNA域的单一RNA,或转录为多个转录本,每一个均能折叠为单一shRNA。
所述ddRNAi表达盒能够连接至被称为ddRNAi载体或ddRNAi构建体的载体中。所述载体可以提供确定所述ddRNAi表达盒体内或体外转录的序列。所述载体可以额外地作为ddRNAi表达盒的递送媒介。例如,基于病毒的载体将产生用于ddRNAi表达盒表达以及与病毒递送相容的ddRNAi构建体。
当核酸已经被引入至细胞中时,所述细胞已经“转化”、“转导”或“转染”外源或异源核酸或载体。所述转化DNA可以或可以没有整合(共价连接)至所述细胞的基因组中。关于真核细胞,稳定转化的细胞是这样的细胞:转化DNA已经整合至宿主细胞染色体中,或者保持在染色体外(游离的)使得转化DNA在细胞复制过程中由子细胞遗传。在非复制、分化的细胞中,所述转化DNA可以持续作为游离基因。
“基因表达”可以指转录或翻译之一或二者。
“表达的抑制”指在靶基因的蛋白质和/或mRNA产物水平上不存在或可见的减少。所述抑制不需要是绝对的,但可以是足以用于作为施用本发明的RNAi或ddRNAi制剂或siRNA制剂或ddRNAi构建体的可检测的或可观察的变化的部分抑制。可以通过测量靶核酸的mRNA和/或蛋白质产物的水平相对于缺少ddRNAi制剂或构建体的细胞的减少量来测量抑制效果,可以少至1%、5%或10%,或者可以是绝对的,即100%抑制。可以通过分析外在性质(即,所述细胞或生物体的定量和/或定性的表型)而确定抑制效果,并且也可以包括在施用本发明的ddRNAi制剂或构建体之后进行病毒负荷评估而确定抑制效果。
如在本文中所使用的,“定量的表型特征”指与宿主细胞中核酸的分子表达相关特征,并因此可以包括转录的或复制的RNA分子的数量、转录后修饰的RNA分子的数量、翻译的肽或蛋白质的数量或者这些肽或蛋白质的活性。
核酸的显型表达(所述显型是定性特征)的减少意思是,当存在本发明的RNAi制剂时,所述显型特征转换至与不存在RNAi制剂的情况时相比不同的状态。因此,核酸的显型表达的减少可以被测量为(部分)该核酸的稳定状态水平的减少,(部分)该核酸的翻译的减少或者转录的RNA或翻译的多肽对真核细胞和生物体的作用的减少,并且将最终导致改变的表型特征。明显地,目标核酸的显型表达的减少可能与可观察的显型变化共存或相应。所述评估可以通过生化技术如Northern杂交、定量实时PCR实验、基因表达实验、抗体结合、ELISA、RIA、蛋白质印迹或本领域已知的其它实验和技术完成。
“靶核酸”可以是RNA或DNA,它的转录产物是靶定的、编码或非编码的序列、外源或内源的。在优选的实施方式中,DNA病毒乙型肝炎病毒的聚合酶(P)基因被靶定用于抑制。因此,在该实施方式中,所述靶核酸至少是聚合酶基因的RNA转录本。
用于靶的效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本互补或基本互补。“基本互补”的意思是序列可杂交或可退火。基本互补优选地是与所述靶基因的某一部分大约85%互补。更优选地,至少85~90%互补;以及最优选地,至少95、96、97、98、99或100%互补。因此,基本互补包括100%互补,但100%互补在贯穿本说明书中同样可以被指定为“互补的”或“是互补的”。
与靶基因的某一区域互补或基本互补的序列具有在连续靶序列的序列互补度。通常,将对本发明的双链RNA区域进行诱变以产生单一或几个核苷酸取代、缺失或添加。
“治疗组合物”或“药物组合物”或“用于治疗HBV感染的组合物”指包括ddRNAi制剂、ddRNAi表达盒、ddRNAi构建体或siRNA制剂的组合物。
表述“治疗”或“处理”指治疗学上的处理,其中将减慢(减轻)所述个体的不期望的生理变化或紊乱。出于本发明的目的,有益的或期望的临床结果包括但不限于:无论可观察的或不可观察的,HBV感染症状的减轻、HBV的感染性减少、疾病程度的缩小、疾病状态稳定(即,不恶化)、疾病进程的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和,以及好转(无论部分地或全部地)。“治疗”也可以表示与如果不接受治疗所期望的存活期相比延长的存活期。治疗可以不必要地导致HBV感染的完全清除,但是可以减少或最小化并发症和感染的负作用以及感染的进程。
短语“治疗有效量”表示本发明的化合物的量为:(i)治疗具体疾病、状况或失调,(ii)减弱、改善或消除具体疾病、状况或失调的一种或多种症状,或者(iii)延迟本文所述的具体疾病、状况或失调的一种或多种症状的发作。
具体描述
本发明提供一种新的RNAi制剂,所述RNAi制剂用于靶定感染的个体中HBV的应用。HBV的治疗的目标是:
i消除感染性以防止HBV从一个个体传播和扩散至另一个个体;以及
ii将感染的个体中的肝病的全部进程最小化。
ddRNAi制剂
从DNA基础的ddRNAi表达盒表达的RNAi制剂被称为DNA-指导的RNAi制剂或者ddRNAi制剂。它们可以直接靶定基因活性并且具有最小程度的脱靶事件。“脱靶事件”指核酸而不是所述靶的表达不被所述RNAi或ddRNAi制剂抑制。在HBV感染的情况中,这提供了处理未满足的用于HBV的临床治疗要求的唯一机会。因此,在本发明的一个方面,提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中一条或多条靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂包括至少:
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;和
一条第一效应器互补序列;
其中,第一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
典型地,所述第一效应器序列与第一效应器互补序列形成双链区域。
本发明的ddRNAi制剂的序列与所述HBV基因的一个区域具有充分的互补性以介导靶特异RNAi。“基本互补”的意思是所述序列可杂交或可退火,以及任一的:
·所述第一效应器序列的序列与所述靶序列的至少17个或更多个连续核苷酸有至少大约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90%的互补;更优选地,与所述靶序列的17个或更多个连续核苷酸有至少大约90、91、92、92、94或者95%互补,以及甚至更优选地,有至少大约95、96、97、98或者99%互补或绝对互补(即,100%);或者,
·所述效应器序列有至少10个或更多个连续核苷酸能够与所述靶100%互补,以及优选地少于6个核苷酸不能与所述靶序列碱基配对。因此,所述第一效应器序列可以有1、2、3、4或5个核苷酸序列将不与所述靶序列形成G-C/A-U碱基配对。可以相信,这个水平的差异将不会负面影响所述ddRNAi制剂的能力以能够抑制所述靶序列的表达。
当所述第一效应器序列确实有1、2、3、4或5个核苷酸将不与所述靶序列形成G-C/A-U碱基配对时,优选地,所述差异是在所述第一效应器序列的最开始或最后5个核苷酸,而在所述效应器序列的中心部分仅有1或2个核苷酸变化。
所述ddRNAi制剂也可以包括由长度是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸组成的第一效应器序列,其中所述效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。因此,一种根据本发明的该实施方式的ddRNAi制剂的最大长度由效应器序列的长度和数量决定,即,每一条效应器序列并不包括在一条更长的序列中。
如上所述,基本互补意味着所述序列是可杂交或可退火的。所述术语“杂交”和“退火”(以及语法上的等价物)在本说明书中关于核苷酸序列可交换使用并表示能够基于它们的互补性形成沃森-克里克碱基配对的核苷酸序列。优选地,所述基本互补序列能够在中度或高度严格条件下杂交:
高度严格条件:0.1×SSPE(或者0.1×SSC),0.1%SDS,65℃;
中度严格条件:0.2×SSPE(或者0.1×SSC),0.1%SDS,50℃。
可选地,“基本互补”也可以被本领域技术人员理解为包括非沃森-克里克碱基配对,特别是在关于RNA序列的内容中,例如一种被称为“摇摆配对”,它可以在RNA的鸟苷和尿嘧啶残基之间形成。“互补”在本文中以它通常的方式被使用,以表示沃森-克里克碱基配对,而“非互补”用于表示非沃森-克里克碱基配对,即使这样的非互补序列可以形成摇摆配对或其它相互作用。在本发明的上下文中,提及“非配对”序列特别表示序列之间没有形成沃森-克里克碱基配对的序列。
所述第一效应器序列的长度至少是17个核苷酸,优选地17至50个核苷酸,以及最优选地17至30个核苷酸。长度可以是17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个核苷酸。当所述第一效应器序列长于17个核苷酸时,优选地,所述第一效应器序列的至少17个连续核苷酸形成具有互补链的双链区。
本发明的ddRNAi制剂抑制HBV核酸序列的表达。优选地,所述HBV靶基因是作为聚合酶(P)基因被表达的核酸序列。因此,在本发明的一种实施方式中,本发明的ddRNAi制剂抑制乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因中一条或多条靶序列的表达。所述HBV基因组具有重叠的开放阅读框。就这点而言,靶定所述聚合酶基因的特定序列同样也是靶定重叠基因中的相同序列。因此,本发明的制剂能够靶定具有单一的效应器序列的多个基因。但是在每一种优选的实施方式中,至少靶定所述聚合酶基因。
在具体实施方式中,所述第一效应器序列选自下面所列出的SEQ IDNO:1~19或SEQ ID NO:20~27的ddRNAi HBV聚合酶效应器序列的任意一条序列中的任何10个或更多个、以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。出于简明考虑,所述SEQ ID NO将被共同地指定为SEQ ID NO:1~27。
表1:RNAi效应器序列
SEQ ID | RNAi效应器序列a | HBV靶位点b | nt | 基因目标c |
1 | GAUUGACGAUAAGGGAGA | 109-126 | 18 | pol |
2 | UUGAAGUCCCAAUCUGGAU | 2935-2953 | 19 | pol |
3 | GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC | 1139-1161 | 23 | pol |
4 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGAGUUAUC | 1335-1363 | 29 | pol |
5 | UCCUGAUGUGAUGUUCUCCAUGU | 155-177 | 23 | pol&HBsAg |
6 | AAGGCCUCCGUGCGGUGGGG | 3019-3038 | 20 | pol |
7 | GGUAUUGUUUACACAGAAAGGC | 1116-1137 | 22 | pol |
8 | GAUGUGUUCUUGUGGCAAG | 908-926 | 19 | pol |
9 | GGGAAAGCCCUACGAACCACU | 698-718 | 21 | pol&HBsAg |
10 | GUGGAGACAGCGGGGUAGGC | 3128-3147 | 20 | pol |
11 | GAGGACAACAGAGUUAUC | 1335-1352 | 18 | pol |
12 | GCCCACUCCCAUAGGAAUUUUCC | 631-653 | 23 | pol&HBsAg |
13 | GGAUCUUGCAGAGUUUGG | 18-35 | 18 | pol |
14 | CGUUGCCGGGCAACGGGGUA | 1146-1165 | 20 | pol |
15 | GCAAUUUCCGUCCGAAGGUUUGG | 575-597 | 23 | pol&HBsAg |
16 | GUUGGAGGACAGGAGGUUGG | 340-359 | 20 | pol&HBsAg |
17 | GUUGGAGGACAGGAGGUUGGUG | 338-359 | 22 | pol&HBsAg |
18 | GAAGUGCACACGGUCCGGCAGA | 1568-1589 | 22 | pol&X |
19 | CAAGAUGCUGUACAGACUUGGC | 762-783 | 22 | pol&HBsAg |
20 | GGGAGAGGACAACAGAGUUAUC | 1335-1356 | 22 | pol |
21 | CGGGAGAGGACAACAGAGUUAU | 1336-1357 | 22 | pol |
22 | GCGGGAGAGGACAACAGAGUUA | 1337-1358 | 22 | pol |
23 | UGCGGGAGAGGACAACAGAGUU | 1338-1359 | 22 | pol |
24 | UUGCGGGAGAGGACAACAGAGU | 1339-1360 | 22 | pol |
25 | UUUGCGGGAGAGGACAACAGAG | 1340-1361 | 22 | pol |
26 | AUUUGCGGGAGAGGACAACAGA | 1341-1362 | 22 | pol |
27 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAG | 1342-1363 | 22 | pol |
a基于根据Genbank ID U95551的HBV基因组的靶的效应器序列的序列。
b HBV基因组内的靶位点,基于U95551的序列;效应器序列是这些位点的反向互补序列。
c靶定的ORF:pol对应聚合酶;HBsAg对应HBV表面抗原;以及X对应X蛋白。
如在背景技术部分所解释的,dsRNA的两条链都有成为效应器序列的潜质。但是,有证据表明一条序列的特殊性质可以促使一条链进入RISC并且破坏另一条链。有证明表明,所述RISC复合体的蛋白Argonaut2(AGO2)对具有5’A的序列有偏好,而对5’U的偏好程度较少。此外,由于一种“感受”整个RNA双链体中的热力学稳定性且偏好从所述双链体的较不稳定末端合并序列的机制,在5’区域具有较高的AU含量的RNA序列似乎更易于被置于RISC复合体内。这些序列偏好在优选的实施方式中得以反映,但不是必须的。
例如,在本发明的该方面的一种实施方式中,提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中一种或多种靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括:
一条为GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第一效应器序列;以及
一条第一效应器互补序列。
所述第一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
优选地,所述第一效应器序列是GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ IDNO:1)中的至少17个或更多个连续核苷酸。
当所述第一效应器与SEQ ID NO:1相比具有1、2、3、4或5个不同的核苷酸时,所述差异优选地存在于最初和/或最后5个核苷酸;并且至少中心的10个核苷酸与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
在可选的实施方式中,所述ddRNAi制剂包括一条第一效应器序列,所述第一效应器序列是以下序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
在具体优选的实施方式中,所述ddRNAi制剂包括一条第一效应器序列,所述第一效应器序列是能够抑制靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,在该实施方式中,所述第一效应器选自:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13和SEQ ID NO:23。
所述第一效应器序列可以包括选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸的序列,或者可选地,每一效应器序列可以是具有1、2、3、4或5个核苷酸变异的SEQ ID NO:1~27变异体。在另一种实施方式中,每一效应器序列可以由22个核苷酸组成,其中的17、18、19、20、21或全部22个核苷酸是来自于选自SEQ ID NO:1~27的一条序列的连续核苷酸。
多靶定ddRNAi制剂
在本发明的一种优选实施方式中,所述ddRNAi制剂包括两种或更多种能够靶定HBV基因组中的多于一种靶序列的效应器序列。所述多种靶序列可以是在所述HBV基因的同一区域中。例如,一个在不同种类之间的序列中具有天然变异的17~30个核苷酸的区域,或者已经赋予抗药性的单核苷酸多态性。可选地,所述靶序列可以位于一个靶基因的不同区域中。
为提供更高的特异性,所述ddRNAi制剂包括以下内容(无特殊顺序):
·一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;
·一条长度是至少17个核苷酸的第二效应器序列;
·一条第一效应器互补序列;和
·一条第二效应器互补序列。
所述多靶定ddRNAi制剂的第一和第二效应器序列与它们各自的效应器互补序列形成双链区域。优选地,所述第一和第二效应器序列的长度是17~30个核苷酸。更优选地,所述第一和第二效应器序列均选自上述表1中列出的任何一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,或者是与上述表1中列出的那些序列有1、2、3、4或5个核苷酸差异的序列。
在一种实施方式中,所述第一效应器序列选自SEQ ID NO:1~27的任何一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,以及所述第二效应器序列选自SEQ ID NO:1~27任何一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。所述第一和第二效应器序列可以是相同序列,或者可选地可以是不相同序列。
所述第一和第二效应器序列的每一个可以包括一条序列,所述序列选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸,或者可选地,每一效应器序列也可以是具有1、2、3、4或5个核苷酸变异的SEQ IDNO:1~27变异体。在另一种实施方式中,每一效应器序列可以由22个核苷酸组成,其中的17、18、19、20、21或全部22个核苷酸是来自选自SEQ ID NO:1~27的一条序列的连续核苷酸。当有两种或更多种效应器序列时,它们可以代表上述3种类型的组合。
在具体优选的实施方式中,所述第一和第二效应器序列包括能够抑制靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,在该实施方式中,每一效应器序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
具有多种效应器序列的ddRNAi制剂的应用具有限制逃避突变株的出现和靶定逃避突变株的优势,所述逃避突变株是目前许多抗病毒治疗的一个问题。本发明的一个方面用含有RNAi序列的ddRNAi制剂中和出现的逃避突变株,所述RNAi序列基于所述靶基因的基因序列以及另外地出现以抵抗RNAi治疗的点突变的序列。
相似地,具有多种效应器序列的ddRNAi制剂具有能够靶定在不同病毒基因型或准种中发现的一定范围的序列的优势,以及与单一效应器序列相对的由多种效应器序列实现的累加或协同效应的优势。
但是,如上所提及的,当所述靶序列在两种或更多种基因中相同时,单一效应器序列能够实现多种靶定。HBV包含多种重叠的阅读框,使得靶定重叠区域中的一个序列将抑制包含所述序列的两种基因的表达。
长发夹形式
当所述ddRNAi制剂包含多于一种效应器序列时,所述ddRNAi制剂以单链RNA表达,基于所述效应器序列和与所述效应器序列互补的序列的顺序,它将折叠以形成不同结构。在一种实施方式中,提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;
一条长度是至少17个核苷酸的第二效应器序列;
一条第二效应器互补序列;和
一条第一效应器互补序列,
其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。这将导致一种具有如图1A所示结构的ddRNAi制剂。同样可以参见WO2004/106517,所述内容通过引用的方式结合至本文。
可选地,至少一种效应器,以及优选地两种效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
优选地,所述第一和第二效应器序列均选自SEQ ID NO:1~27中任何一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。例如,在一种实施方式中,提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条为GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第一效应器序列;
一条为UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2)或GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第二效应器序列;
一条第二效应器互补序列;和
一条第一效应器互补序列。
每一效应器序列与所述靶序列的一个区域的预测转录本基本互补。
可选地,至少一种效应器,以及优选地两种效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
在具体优选的实施方式中,所述第一和第二效应器序列包括能够抑制一个靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,在该实施方式中,每一效应器序列选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
在另一种实施方式中(其中所述ddRNAi制剂具有三种效应器序列),提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条为GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第一效应器序列;
一条为UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第二效应器序列;
一条为GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第三效应器序列;
一条第三效应器互补序列;
一条第二效应器互补序列;和
一条第一效应器互补序列。
每一效应器序列与所述靶序列的一个区域的预测转录本基本互补。
可选地,至少一种效应器,以及可选地,三种中的两种或者全部三种效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
在具体优选的实施方式中,所述第一、第二和第三效应器序列包括能够抑制一个靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,在该实施方式中,每一效应器序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
本领域技术人员将意识到,如果一种单一的、长的发夹结构是由所述效应器序列与它的效应器互补序列退火而形成dsRNA,那么所述效应器和效应器互补序列的顺序可以变化。例如,在一种含有两种效应器序列的ddRNAi制剂中,所述序列可以下面例举的5’至3’顺序设置:
·第一效应器-第二效应器-第二效应器互补序列-第一效应器互补序列;
·第一效应器-第二效应器互补序列-第二效应器-第一效应器互补序列;
·第一效应器互补序列-第二效应器互补序列-第二效应器-第一效应器;
·第一效应器互补序列-第二效应器-第二效应器互补序列-第一效应器。
在一种包含三种效应器序列的ddRNAi制剂中,所述序列可以下面例举的5’至3’顺序设置:
·第一效应器-第二效应器-第三效应器-第三效应器互补序列-第二效应器互补序列-第一效应器互补序列;
·第一效应器-第二效应器互补序列-第三效应器-第三效应器互补序列-第二效应器-第一效应器互补序列;
·第一效应器-第二效应器-第三效应器互补序列-第三效应器-第二效应器互补序列-第一效应器互补序列;
·第一效应器互补序列-第二效应器互补序列-第三效应器互补序列-第三效应器-第二效应器-第一效应器互补序列;
·第一效应器互补序列-第二效应器互补序列-第三效应器-第三效应器互补序列-第二效应器-第一效应器。
在其它实施方式中,所述第一效应器序列可以选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸;所述第二效应器序列可以选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸;所述第三效应器序列可以选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸;以及任何更多效应器序列可以选自SEQ IDNO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。可选地,每一效应器序列可以是具有1、2、3、4或5个核苷酸变异的SEQ ID NO:1~27变异体。优选地,所述差异存在于最初和/或最后5个核苷酸,并且至少中心11~12个核苷酸与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。这样的实施方式对于靶定HBV逃逸突变株以及不同的病毒基因型或准种特别有用。
所述第一、第二和第三效应器序列的每一个可以包括一条序列,所述序列选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸,或者可选地,每一效应器序列也可以是具有1、2、3、4或5个核苷酸变异的SEQID NO:1~27变异体。在另一种实施方式中,每一效应器序列可以由22个核苷酸组成,其中的17、18、19、20、21或全部22个核苷酸是来自选自SEQ IDNO:1~27的一条序列的连续核苷酸。当有多种效应器序列时,它们可以代表上述3种类型的组合。
多发夹形式
在另一种实施方式中,提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;
一条第一效应器互补序列;
一条长度是至少17个核苷酸的第二效应器序列;和
一条第一效应器互补序列,
其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
可选地,至少一种效应器序列、优选地两种效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
取决于所使用的表达ddRNAi制剂的表达盒的类型,这将导致具有在图1B或C中显示的结构的ddRNAi制剂(详见本说明书中后面内容)。同样可参见WO2005/087926和WO2006/084209,所述内容通过引用的方式结合至本文。
优选地,所述第一和第二效应器序列均选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。例如,在一种实施方式中,提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条为GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第一效应器序列;
一条第一效应器互补序列;
一条为UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2)或GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第二效应器序列;和
一条第二效应器互补序列。
每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
可选地,至少一种效应器序列、优选地两种效应器序列均与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
在具体优选的实施方式中,所述第一和第二效应器序列包括能够抑制一个靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,在该实施方式中,每一效应器序列选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
在一种所述ddRNAi制剂具有三种效应器序列的实施方式中,提供了一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条为GAUUGACGAUAAGGGAGA(SEQ ID NO:1)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第一效应器序列;
一条第一效应器互补序列;
一条为UUGAAGUCCCAAUCUGGAU(SEQ ID NO:2)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第二效应器序列;
一条第二效应器互补序列;
一条为GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC(SEQ ID NO:3)中的任何10个或更多个连续核苷酸的第三效应器序列;和
一条第三效应器互补序列。
每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
可选地,至少一种效应器,以及可选地,三种中的两种或者全部三种效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
在具体优选的实施方式中,所述第一、第二和第三效应器序列包括能够抑制一个靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,在该实施方式中,每一效应器序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
在其它实施方式中,所述第一效应器序列可以是选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸;所述第二效应器序列可以是选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸;所述第三效应器序列可以是选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸;以及任何更多效应器序列可以是选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸。优选地,每一效应器序列至少是17个连续核苷酸。
每一效应器序列可以是具有1、2、3、4或5个核苷酸变异的SEQ IDNO:1~27变异体。优选地,所述差异存在于最初和/或最后5个核苷酸,并且至少中心10~12个核苷酸与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。这样的实施方式对于靶定HBV逃逸突变株以及不同的病毒基因型或准种特别有用。
所述第一、第二和第三效应器序列的每一个可以包括一条序列,所述序列选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸,或者可选地,每一效应器序列也可以是具有1、2、3、4或5个核苷酸变异的SEQID NO:1~27变异体。在另一种实施方式中,每一效应器序列可以由22个核苷酸组成,其中的17、18、19、20、21或全部22个核苷酸是来自选自SEQ IDNO:1~27的一条序列的连续核苷酸。当有多种效应器序列时,它们可以代表上述3种类型的组合。此外,在长发夹结构或多发夹结构中,根据以下式子之一,所述ddRNAi制剂可以包括额外的效应器序列和对应的互补序列:
长发夹:
·[效应器序列]1-10[效应器互补序列]1-10
多发夹:
·[效应器序列-效应器互补序列]1-10
优选地,在长发夹式子中,效应器序列的数量与效应器互补序列的数量相同。典型地,有2、3、4或5种效应器序列以及相应地分别2、3、4或5种效应器互补序列。
当所述ddRNAi制剂包含多于一种效应器序列时,所述效应器序列可以相同或不同。例如,如果ddRNAi制剂具有3种效应器序列,其中2种效应器序列可以具有相同序列,而1种具有不同序列。可选地,全部3种效应器序列可以不同。优选地,所述效应器序列是选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,或者是具有1、2、3、4或5个核苷酸变异的SEQ ID NO:1~27的序列的变异体。优选地,所述差异存在于最初和/或最后5个核苷酸,并且至少中心10~12个核苷酸与所述靶基因的一个区域的预测转录本100%互补。
当靶定一个靶序列的单一区域时,所述靶序列具有天然存在的变异体(如不同基因型或准种)、逃逸突变株或单核苷酸多态性(SNP),优选地,至少一种效应器序列选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,而其它效应器序列是所述选择的序列的变异体。例如,一条第一效应器序列可以包括SEQ ID NO:1的20个核苷酸;而第二效应器序列因此可以是SEQ ID NO:1的一个变异体。
发夹结构
在上述的实施方式中,所述效应器序列与它对应的效应器互补序列杂交以形成发夹结构。在所述发夹的末端,两个或更多个未结合的核苷酸形成“铰链”或“环”。在一种实施方式中,所述未结合的核苷酸是所述效应器序列和效应器互补序列的一部分,使得所述至少17个核苷酸的效应器序列的仅一部分将与它对应的效应器互补序列形成双链体。例如,当所述效应器序列和它的互补序列的长度均是22个核苷酸时,其中的19个核苷酸可以碱基配对以形成双链区域,留下一共6个核苷酸(每链3个)以在所述效应器序列和它的效应器互补序列之间形成单链环并连接所述效应器序列和它的效应器互补序列。
在另一种实施方式中,所述ddRNAi可以包括一条额外序列,所述额外序列与其本身、所述靶序列、所述效应器序列或与所述效应器序列互补的序列都不互补。就这点而言,在本发明的另一种实施方式中,所述ddRNAi制剂进一步包括一条能够形成环的2~100个未配对的核苷酸、优选地2~10个未配对的核苷酸的序列。在一种优选的实施方式中,所述环包括核苷酸序列AA、UU、UUA、UUAG、UUACAA、CAAGAGA或N1AAN2,其中N1和N2是C、G、U和A中的任何一种,并且可以是相同的或不同的。
取决于所述ddRNAi制剂的结构,可以有一种或更多种环。当ddRNAi制剂具有基于式子[效应器序列]1-10[效应器互补序列]1-10的长发夹结构时,如图1D所例示的,在所述最后效应器序列和最后效应器序列的效应器互补序列之间包含产生单环结构的额外的非自身互补序列。在该实施方式中,因此,提供一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;
一条长度是至少17个核苷酸的第二效应器序列;
一条2~100个非自身互补核苷酸的序列;
一条第二效应器互补序列;和
一条第一效应器互补序列,
其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
当所述ddRNAi制剂具有基于式子[效应器序列-效应器互补序列]1-10的多发夹结构时,如图1E和F所例示的(取决于所使用的表达它的表达盒种类,见说明书后面的内容),在每一效应器序列和它的互补序列之间包含额外的非自身互补序列以产生环结构。在该实施方式中,因此,提供一种用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂至少包括(5’至3’方向):
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;
一条2~100个非自身互补核苷酸的序列;
一条第一效应器互补序列;
一条长度是至少17个核苷酸的第二效应器序列;
一条2~100个非自身互补核苷酸的序列;和
一条第二效应器互补序列;
其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
在该实施方式中有多于两种效应器和两种效应器互补序列以及因此的多于两种发夹结构,形成每一环结构的额外非自身互补序列的长度不需要相同。例如,一种环结构可以有5个核苷酸,而另一种环结构可以有9个核苷酸。
双链ddRNAi制剂
本领域技术人员将可以意识到,没有必要将整个ddRNAi制剂表达为一条序列。例如,在本发明的一种实施方式中,可以产生所述第一效应器序列(例如,由一条DNA序列转录),然后可以产生所述第一效应器互补序列(例如,由分开的DNA序列转录)。任选地,环序列可以连接至任一转录本或者所述环的一部分连接至一条转录本的3’末端和另一条转录本的5’末端。在细胞中,两条转录本然后经由在所述效应器序列和它们的互补序列之间退火而杂交形成ddRNAi制剂。
体外表达的ddRNAi制剂或化学合成的siRNA制剂
尽管设想慢性HBV感染的有效治疗将需要从ddRNAi构建体(将在下文概述)在体内表达的ddRNAi制剂,也可能有需要施用在体外表达的ddRNAi制剂或施用化学合成的siRNA的情况,由此不仅仅作为瞬时治疗起作用。例如,急性HBV感染可以从使用siRNA的短期治疗中收益,所述siRNA在细胞中不整合和复制。
因此,本发明的ddRNAi制剂可以体外表达,然后递送至靶细胞。可选地,siRNA可以化学合成,然后递送至靶细胞。根据此,在本发明的另一方面,提供了一种小干扰RNAi制剂(siRNA制剂),用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中一种或多种靶序列的表达,所述siRNA包括:
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;和
一条第一效应器互补序列;
其中所述效应器序列与靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
与上面所述的ddRNAi制剂相似,所述siRNA制剂也可以包括用于多靶定的多于一种的效应器序列。所述效应器序列优选地靶定所述HBV聚合酶基因,以及最优选地,选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。
在siRNA的设计中可以包含适当的灵活性。典型地,siRNA由具有5’-磷酸和3’-羟基残基的dsRNA分子组成,链长度可以在21~29个核苷酸间变化,并可选地可以被设计为包含2个核苷酸的3’突出。在一些实施方式中,每一链可以被合成为N19-27TT(其中TT可以是脱氧核糖核苷酸)。可以基于如上所述的SEQ ID NO:1~27的区域容易地设计siRNA并可以作为单一序列或以任何组合形式医疗使用。可选地,siRNA制剂可以由单一RNA分子组成,所述单一RNA分子包含与从ddRNAi表达盒表达序列相似或相同的效应器和效应器互补序列。这些序列可以基于SEQ ID NO:1~27,并且可以作为单一序列或以任何组合形式医疗使用。可以用适当保护的核苷亚磷酰胺和常规的合成物化学合成siRNA,所述siRNA因此可以商业上广泛应用并能够根据本领域的常规方法设计和合成。在优选的实施方式中,所述siRNA具有SEQ ID NO:1~27中的一条或多条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸。
多种转染试剂已经被用于将siRNA递送至不同的细胞系。通常使用Lipofectamine2000和Oligofectamine递送siRNA。同样已经通过水动力转染法递送裸siRNA。其它递送方法将是本领域技术人员已知的。
ddRNAi制剂表达盒
如上面所解释的,从被插入至任何合适载体或ddRNAi构建体的DNA表达盒表达ddRNAi制剂。ddRNAi表达盒包括(没有特别顺序):
·一条或多条启动子序列;
·一条或多条编码一种或多种效应器序列的DNA序列;
·一条或多条编码一种或多种效应器互补序列的DNA序列;
·一条或多条终止子序列;
以及可选地,
·一条或多条编码环序列的DNA序列;
·一条或多条增强子序列。
在一种实施方式中,提供一种用于表达ddRNAi制剂的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)表达盒,其中所述ddRNAi制剂抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列的表达,所述ddRNAi表达盒包括(5’至3’方向):
一条启动子序列;
一条编码第一效应器序列的DNA序列;
可选地,一条编码能够形成环的序列的序列;
一条编码第一效应器互补序列的DNA序列;以及
一条终止子序列。
所述编码第一效应器序列的DNA序列优选地是编码SEQ ID NO:1~27中的任意一条序列中的任何10个或更多个、优选地17个或更多个连续核苷酸的DNA。在一种优选的实施方式中,所述第一效应器序列包括能够抑制一个靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地17个或更多个连续核苷酸。优选地,在该实施方式中,所述第一效应器序列选自:SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
可选地,如在上文关于ddRNAi制剂本身的内容中所概述的,编码所述效应器序列的序列可以编码与SEQ ID NO:1~27有1、2、3、4或5个核苷酸变化的效应器序列,而不影响所编码的效应器序列与所述靶序列碱基配对和抑制所述靶序列表达的能力。
本领域技术人员将意识到,编码任意给出的RNA序列的DNA序列是与所述RNA序列相同,但将胸腺嘧啶(T)碱基替换为尿嘧啶(U)碱基的序列。
编码具有在长发夹结构中多于一种效应器序列的ddRNAi制剂的ddRNAi表达盒包括(5’至3’方向):
一条启动子序列;
一条编码第一效应器序列的DNA序列;
一条编码第二效应器序列的DNA序列;
可选地,一条编码能够形成环的序列的序列;
一条编码第二效应器互补序列的DNA序列;
一条编码第一效应器互补序列的DNA序列;以及
一条终止子序列。
优选地,所述DNA序列编码第一和第二效应器序列,所述第一和第二效应器序列选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,所述第一和第二效应器序列选自:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:23。可选地,所述DNA序列编码效应器序列,所述效应器序列与SEQ IDNO:1~27有1、2、3、4或5个核苷酸变化,但不影响所编码的效应器序列与所述靶序列碱基配对并抑制所述靶序列的表达的能力。
当所述ddRNAi制剂具有多于一种效应器序列和基于式子[效应器序列-效应器互补序列]1-10的多发夹结构时,每一[效应器序列-效应器互补序列]对的表达可以由唯一的启动子或可选地由分开的启动子控制。当预期采用分开的启动子时,所述ddRNAi表达盒包括(5’至3’方向):
一条启动子序列;
一条编码第一效应器序列的DNA序列;
一条编码第一效应器互补序列的DNA序列;
可选地,一条终止子序列;
一条启动子序列;
一条编码第二效应器序列的DNA序列;
一条编码第二效应器互补序列的DNA序列;和
一条终止子序列。
当预期采用唯一启动子时,所述ddRNAi表达盒包括(5’至3’方向):
一条启动子序列;
一条编码第一效应器序列的DNA序列;
一条编码针对第一效应器序列的效应器互补序列的DNA序列;
一条编码第二效应器序列的DNA序列;
一条编码针对第二效应器序列的效应器互补序列的DNA序列;和
一条终止子序列。
与上述实施方式相似,所述DNA序列优选地编码第一和第二效应器序列,所述第一和第二效应器序列选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,或者编码与SEQ IDNO:1~27的序列有1、2、3、4或5个核苷酸变化的效应器序列。优选地,所述第一和第二效应器序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
可以可选地参考所表达的ddRNAi制剂的总长度来描述所述ddRNAi表达盒,所表达的ddRNAi制剂是所述启动子和终止子之间全长序列的产物。例如,当单一效应器ddRNAi中的效应器序列的长度由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸组成时,所述ddRNAi表达盒中所述启动子和终止子之间的长度将是34至60个核苷酸。这个长度可以进一步包括2~100个核苷酸的“环”或“铰链”序列,使得长度是36~160个核苷酸之间。对于具有多效应器序列的ddRNAi制剂而言,当每一效应器序列由17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸组成时,所述全长按比例地增加。
设计本发明的ddRNAi表达盒的一种有用方式是假定Dicer在每22个核苷酸处剪切(也被称为22nt相位),并以所述shRNA为基础进行加工。因此,编码所述效应器序列的DNA序列可以被设计为编码SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,以及合适的间隔子和用于合适的启动子的其它序列要求。例如,SEQ ID NO:1~27中列出的一些序列多于22个核苷酸,在这些情况中,仅一部分序列需要可操作地与启动子连接。
靶定mRNA不同位点的制剂适于shRNA构建,因为它们可以避免mRNA的二级结构的影响,并因此独立地实施它们的功能。
当使用U6启动子时,优选地所述DNA序列可操作地与以鸟嘌呤(G)碱基起始的启动子连接;当使用H1启动子时,优选地所述DNA序列可操作地与以腺嘌呤(A)碱基起始的启动子连接。因此,可以修饰所述效应器编码序列。对于SEQ ID NO:1~27的一些序列而言,效应器序列短于22nt。在这些情况下,优选地包括与HBV靶位点邻近的HBV序列。这可能提供效应器序列与HBV mRNA之间最大的同源性并可能允许包括A或G残基以使得从上述的U6或H1启动子的有效转录起始。此外,对于具体的US转录,期望将所述效应器序列置于所述环的3’位置以避免用于有效U6转录所必须的5’G。
在一些情况中,可能期望避免在效应器序列、效应器互补序列或环序列中出现DNA序列TTTT,因为它们能够在使用Pol III启动子(如U6或H1)的表达构建体中作为转录终止子。shRNA设计还应当考虑U6终止将在shRNA的3’末端添加UU。当设计长发夹RNA时,有时候修饰精确选择的效应器序列(使用SEQ ID NO:1~27的序列或与其邻近的序列)是有益的以将Dicer加工的效应器序列将包括5’U或A的可能性最大化,因此促进融合至AGO2。
是否控制每一[效应器序列-效应器互补序列]对的表达的选择取决于多种因素。可以使用唯一启动子以将启动子之间的干扰最小化。仅具有唯一启动子的ddRNAi构建体的尺寸也将更小,在一些对于所述构建体的稳定性的情况中(在生产过程中(如,在大肠杆菌中复制)和递送过程中)这是重要的。此外,唯一启动子的使用避免了启动子之间任何同源重组的可能性。
在需要一定程度调整每一效应器序列或效应器互补序列的表达的情况下,设计具有多个启动子的ddRNAi构建体是有利的,借此,每一[效应器序列-效应器互补序列]对的表达由分开的启动子控制。在所述效应器序列是不同序列的情况下,所述序列的性质可能意味着一条序列被表达至更高的表达水平。当期望保证每一效应器序列的更相等的表达水平时,更高表达的效应器序列可以与较弱的启动子配对,反之亦然。此外,当将被转录的任何一条序列的长度更短时,可以实现更高效的表达。当使用多个启动子时,优选地不是所有的启动子都相同以将它们之间任何同源重组的风险最小化。在2个启动子的情况下,优选地,每一个不相同。在3个启动子的情况下,至少2个以及可选地全部3个启动子都彼此不相同。
编码所述效应器序列的DNA序列优选地可操作地连接至所述启动子序列。当一条序列被置于与另一条核苷酸序列功能上相关时,所述序列“可操作地连接”至另一条核苷酸序列。例如,如果一条编码序列可操作地连接至启动子序列,这通常意味着所述启动子启动所述编码序列的转录。可操作地连接意味着所述被连接的DNA序列通常是连续的,并且当需要连接两个蛋白编码区域时,是连续的且位于阅读框中。但是,由于增强子可能在当与所述启动子被几千个碱基分开时起作用且内含子序列可能是变化的长度,一些核苷酸序列可能是可操作地连接但是不连续。
“启动子”或“启动子序列”或“启动子元件”通常是一种DNA调节区域,所述DNA调节区域能够在细胞中结合RNA聚合酶并引起多核苷酸或多肽编码序列如mRNA或由任何类型的RNA聚合酶转录的任何种类的RNA的转录。所述启动子和终止子可以取自不同基因,但是通常彼此匹配;即,所述启动子和终止子序列或元件取自它们天然存在的同一基因。可以使用分子技术修饰或不修饰启动子,例如,通过调节元件(如增强子)的突变以获得更高或更低的转录水平。
当涉及启动子时,术语“组成型”表示所述启动子能够在存在或不存在特定刺激因素(如,热击、化学物质、光等)时指导可操作地连接的核酸序列的转录。通常,组成型启动子能够指导编码序列基本上在任何细胞和任何组织中表达。在用以转录所述ddRNAi制剂的表达盒中使用的启动子优选地是组成型启动子,如用于泛素、CMV、β-肌动蛋白、组蛋白H4、EF-1α或pgk基因的启动子,所述基因的表达通过RNA聚合酶II与启动子结合,或被RNA聚合酶I结合的启动子元件而控制。在其它实施方式中,使用Pol II启动子,如CMV、SV40、hAAT、U1、β-肌动蛋白或杂交的Pol II启动子。在其它实施方式中,使用被RNA聚合酶III结合的启动子元件,如U6启动子(例如,U6-1、U6-8、U6-9)、H1启动子、7SL启动子、人Y启动子(hY1、hY3、hY4(见Maraia等,Nucleic Acids Res22(15):3045-52(1994))和hY5(见Maraia等,Nucleic AcidsRes24(18):3552-59(1994)))、人MRP-7-2启动子、腺病毒VA1启动子、人tRNA启动子、5S核糖体RNA启动子以及这些启动子中任何启动子的功能性杂交体和组合。同样可以使用这些启动子的变异体,其中所述启动子被修饰以减少或增加它的活性。例如,当一种强启动子引起可操作地连接至所述启动子的序列的过量表达时,可以修饰所述启动子以减少它的活性。
当使用U6启动子时,优选地所述DNA序列可操作地与以鸟嘌呤(G)碱基起始的启动子连接;当使用H1启动子时,优选地所述DNA序列可操作地与以腺嘌呤(A)碱基起始的启动子连接。因此,所述核酸的序列可能相对于另一种启动子而偏袒使用一种启动子。
可选地,在一些实施方式中,选择能够诱导表达自所述ddRNAi构建体的多ddRNAi制剂表达的启动子是最佳的。使用这样的启动子的一些用于可诱导表达的系统是本领域已知的,包括但不限于四环素响应系统和lac操纵子-抑制子系统(见WO03/022052A1公开文本和美国专利公开文本2002/0162126A1)、蜕皮激素调节系统,或者由糖皮质激素、孕酮、雌激素、RU-486、类固醇、甲状腺激素、环AMP、细胞因子、钙化醇调节子家族调节的启动子,或金属硫蛋白启动子(由无机金属调节)。
在本发明的一些实施方式中有用的启动子可以是组织特异的或细胞特异的。当用于启动子时,术语“组织特异的”指能够指导感兴趣的核苷酸序列在特定类型的组织中选择性表达而相同的感兴趣的核苷酸序列在不同类型的组织(如,大脑)中相对缺乏表达的启动子。当用于启动子时,术语“细胞特异的”指能够指导感兴趣的核苷酸序列在特定类型的细胞中选择性表达而相同的感兴趣的核苷酸序列在相同组织的不同类型的细胞中相对缺乏表达的启动子。当用于启动子时,术语“细胞特异的”也表示能够启动感兴趣的核苷酸序列在单一组织中的一个区域中选择性表达的启动子。可选地,启动子可以是组成型的或可调节的。此外,可以对启动子修饰以具有不同的特异性。
在HBV感染的情况下,可以使用肝脏特异启动子。肝脏特异启动子的例子是人α抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、阿朴脂蛋白H(ApoH)和卵磷脂胆固醇乙酰转移酶启动子(LCAT)。可选地,可以使用运甲状腺素蛋白或TTR启动子。所述TTR启动子源自鼠前清蛋白基因,并也被称为前清蛋白。所述全长TTR启动子通常控制血清甲状腺素结合蛋白的表达,所述蛋白由肝细胞以及在成人中由脉络丛上皮细胞产生。在一种实施方式中,优选的TTR启动子是控制脉络丛表达的区域缺失但是保留驱动肝特异性表达的区域的TTR启动子。见例如WO2007/120533和US20060189561,所述内容通过引用的方式结合至本文。
如上所述,本发明的ddRNAi构建体任选地包括增强子元件。一种优选的增强子元件是ApoE。所述ApoE增强子元件由源自阿朴脂蛋白E(ApoE)的大约155bp组成。ApoE介导脂蛋白微粒的结合、内化和分解代谢,并且是低密度脂蛋白(ApoB/E)受体和肝组织的ApoE受体的配体。与ApoE基因相关的基因增强子是能够增加核酸在肝脏中特异转录的真核控制元件。所述ApoE增强子可以位于肝特异启动子的上游或下游2000核苷酸处,并且可以以多于一个拷贝的状态存在。ApoE/hAAT是一种优选的增强子/启动子组合。
可选地,可以使用合成增强子(SynEnh),如在US20060189561(通过引用的方式结合至本文)中所描述的。
当所述ddRNAi表达盒或构建体包含多于一条终止子序列或元件时,所述终止子序列或元件可以是相同的,或者不同的,或者可以是在任何盒内仅出现一次的终止元件和出现两次或更多次的终止元件的组合。无论使用何种的终止序列或元件,需要选择这些终止序列或元件以保证它们适合与所使用的肝特异启动子一起工作。在使用Pol I、Pol II或Pol III启动子的情况下,可以使用合适的终止子序列。在本发明中有用的终止元件包括U1终止序列(U1盒)、合成的多聚A终止子以及被称为最小的多聚A终止子。可以将转录中止位点,如MAZ1和MAZ2(见Ashfield等,EMBO J1994Vol13No235656pp以及Yonaha和Proudfoot EMBO J.2000Jul.17;19(14):3770-7)插入至多聚A终止子的上游以帮助联结转录终止和多腺苷酸化。对于Pol III启动子,序列TTTT、TTTTT或TTTTTT通常被用作终止子。在这些情况下,转录本通常以序列UU终止。
ddRNAi构建体-基于病毒的ddRNAi构建体的递送
开发任何HBV治疗剂的挑战是事实上病患中的所有肝细胞都被感染。就这点而言,需要一种能够实现用本发明的ddRNAi制剂有效地和一致地转导全部肝细胞的方法以提供对于慢性HBV感染的有效基因治疗。此外,对于有效地体内治疗HBV感染,本发明的ddRNAi表达盒需要能够被转染至原代细胞、干细胞和不分裂细胞。
为克服这个限制,本发明的ddRNAi表达盒被引入至递送载体(优选地,所述递送载体源自病毒,以保证与病毒递送的相容性)以产生ddRNAi构建体。如之前所述的,所述载体骨架可以用于两种目的:作为表达载体以及递送载体。可以使用本领域公知的基因工程技术完成构建体的产生,包括但不限于,标准PCR技术、寡核苷酸合成、DNA合成、限制性核酸内切酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序。所述构建体优选地包括,例如,将ddRNAi构建体包装至病毒颗粒所必须的序列和/或使得将所述ddRNAi构建体整合至靶细胞基因组的序列。所述病毒构建体也可以包括使得病毒复制和繁殖的基因,尽管在优选的实施方式中,这样的基因将被反式提供。此外,所述ddRNAi构建体可以包含来自以天然形式或修饰形式融合的任何已知生物体的基因组的基因或基因序列。例如,优选的病毒构建体包括对于构建体在细菌中复制有用的序列。
所述病毒载体骨架可以选自慢病毒、腺病毒(Adv)和腺相关病毒(AAV)载体。非整合的病毒载体可以用于本发明的ddRNAi制剂在分裂细胞中瞬时表达,或用于在非分裂细胞中较长期稳定表达。整合的病毒载体,如慢病毒载体,在分裂细胞和非分裂细胞中均介导稳定的、长期表达。
可选地,如在US20040214329中描述的小环载体可以用于递送ddRNAi表达盒。小环载体提供持久稳定高水平的核酸转录,并且其特征为缺乏表达沉默的细菌序列。
AAV载体是非致病性的,并且与其它病毒载体相比具有较少的免疫原性。AAV载体感染分裂细胞和非分裂细胞以及在这些组织中指导基因长期表达的能力使得它成为基因治疗中的有用载体。此外,AAV有具有不同组织向性的多种假型。优选的AAV载体是双链AAV假型8(dsAAV8)。
通常,AAV的基因组仅包含两个基因。“rep”基因编码至少四种在DNA复制中使用的单独的蛋白。“cap”基因产物被差异剪切以产生三种蛋白,包括所述病毒的衣壳。当将所述基因组包装至初生病毒中时,仅末端反向重复序列(ITR)是有作用的序列。可以将rep和cap从所述基因组中删除并由选择的异源序列取代。但是,为了产生复制和将基于AAV的异源构建体包装至初生病毒体所需要的蛋白,必须反式提供rep和cap蛋白。通常由用辅助病毒(如腺病毒或疱疹病毒)共感染所提供的辅助功能同样也可以以一种或多种DNA表达质粒的形式反式提供。由于所述基因组通常仅编码两种基因,作为递送载体,AAV被限定为包装能力为单链4.5千个碱基(kb)是不奇怪的。但是,尽管这个大小限定可能限制了可以被递送用于替代基因治疗的基因,这并不负面影响更短序列(如ddRNAi载体)的包装和表达。
因此,在本发明的另一方面,提供了一种包括病毒载体的ddRNAi构建体,所述病毒载体插入有根据本发明的ddRNAi表达盒。优选地,所述表达盒编码多RNAi制剂,如长发夹结构或多发夹结构。在一种实施方式中,所述病毒载体是AAV载体。
在产生基于病毒的ddRNAi构建体之后,所述构建体被包装至病毒颗粒中。可以使用本领域任何已知的方法来生产有传染性的病毒颗粒,其基因组包括一个拷贝的病毒ddRNAi构建体。一种方法使用包装细胞,所述包装细胞反式稳定表达将病毒ddRNAi构建体融合至病毒颗粒中所需要的病毒蛋白质,以及对于具体病毒递送体系所必需或优选的其它序列(如,用于复制、结构蛋白和病毒装配的序列)以及用于组织进入的病毒来源的或人造的配体。在将病毒ddRNAi构建体转染至包装细胞之后,所述包装细胞然后复制病毒序列,表达病毒蛋白并将ddRNAi表达构建体包装至有传染性的病毒颗粒。所述包装细胞系可以是能够表达病毒蛋白的任何细胞系,包括但不限于293、HeLa、A549、PerC6、D17、MDCK、BHK、红樱桃(bing cherry)、phoenix、Cf2Th或本领域技术人员已知的或开发的其它任何细胞系。例如,在美国专利号6,218,181中描述了一种包装细胞系。
可选地,不能稳定表达必需病毒蛋白的细胞系可以与一种或多种构建体一起共转染以实现有效生产功能颗粒。一种构建体是基于病毒的ddRNAi构建体;另一种构建体包括编码使得细胞生产功能性病毒以及其它辅助功能所必需的蛋白的核酸。
所述包装细胞系或复制和包装构建体可能不表达外膜基因产物。在这些实施方式中,编码所述外膜基因的基因可以在分离的构建体上提供,所述分离的构建体与基于病毒的ddRNAi构建体共转染。由于外膜蛋白部分地对病毒颗粒的宿主范围起作用,所述病毒可以是假型的。如上所述,“假型”病毒是具有来自病毒而不是基因组所源自的病毒的外膜蛋白的病毒颗粒。本领域技术人员可以选择用于所使用的病毒递送系统和被靶定的细胞的合适假型。除了特定的宿主范围,所选择的假型可以将所述病毒浓缩至很高的滴度。可选地,病毒可以用将感染限定在特定物种中的亲嗜性外膜蛋白假型(例如,仅允许鼠类细胞感染的亲嗜性外膜,而双嗜性外膜允许人和鼠类细胞感染)。此外,基因修饰的配体可以用于细胞特异靶定,如用于肝细胞的脱唾液酸糖蛋白,或者用于受体介导的结合的转铁蛋白。
在包装细胞系中生产之后,纯化并定量(滴定)包含所述ddRNAi表达盒的病毒微粒。纯化策略包括密度梯度离心,或者优选地,柱层析方法。
治疗方法
施用本发明的ddRNAi制剂、ddRNAi构建体或siRNA制剂抑制在感染有HBV的细胞中HBV基因的表达。因此,在本发明的另一方面,提供了一种在个体中治疗HBV感染的方法,包括向有治疗需要的病患提供治疗有效量的ddRNAi制剂,其中所述ddRNAi制剂抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中一种或多种靶序列(优选地,HBV的聚合酶基因)的表达。对病患施用的ddRNAi制剂可以是以下一种或多种:
·一种ddRNAi制剂,包括第一效应器序列和第一效应器互补序列;其中所述效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第二效应器序列,第二效应器互补序列和第一效应器互补序列;其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第二效应器序列,第三效应器序列,第三效应器互补序列,第二效应器互补序列和第一效应器互补序列;其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第一效应器互补序列,第二效应器序列和第二效应器互补序列;其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第一效应器互补序列,第二效应器序列,第二效应器互补序列,第三效应器序列和第三效应器互补序列;其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,第二效应器序列,2~100个非自身互补核苷酸的序列,第二效应器互补序列和第一效应器互补序列;其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补;
·一种ddRNAi制剂,从5’到3’方向包括:第一效应器序列,2~100个非自身互补核苷酸的序列,第一效应器互补序列,第二效应器序列,2~100个非自身互补核苷酸的序列和第二效应器互补序列;其中每一效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。
如本领域技术人员所理解的以及如附图所例示的,所述制剂中,任何具体的效应器序列都可以与其互补序列在位置上互换。在上文所述的每一实施方式的具体形式中,每一个效应器序列的长度至少是17个核苷酸,所述核苷酸选自SEQ ID NO:1-27的任何一条序列的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸。所述效应器序列可以全部是相同的,或者全部不同,或者是其组合,例如序列是SEQ ID NO:1的至少10个连续核苷酸的2个效应器序列和序列是SEQ ID NO:4的至少10个连续核苷酸的1个效应器序列。
优选地,所述效应器序列选自SEQ ID NO:1-27的任何一条序列中的任何连续11、12、13、14、15或16个核苷酸;最优选地,选自SEQ ID NO:1-27的任何一条序列中的17个或更多个连续核苷酸。通常,所述效应器互补序列的长度与其对应的效应器序列的长度相同或大致相同(即,±15%核苷酸长度)。
如在本说明书较早章节中所描述的,可以通过ddRNAi构建体中的ddRNAi表达盒施用这些ddRNAi制剂中的每一种。可以通过递送两种或更多种每一种都能够表达单一ddRNAi制剂的ddRNAi表达盒或构建体,或者递送一种或多种每一种都能够表达多于一种ddRNAi制剂的ddRNAi表达盒或构建体来实现多靶定。
在可选的实施方式中,每一效应器序列可以与所述靶基因的一个区域的预测转录本有100%互补性,或者可以仅有1、2、3、4或5个核苷酸变化。
治疗HBV感染的方法可以可选地包括鉴定感染HBV的个体的初步步骤,包括鉴定HBV分离体的血清型。
对于更长期或稳定地提供本发明的ddRNAi制剂,通过本发明的ddRNAi构建体提供所述ddRNAi制剂,即,从插入至递送至所述细胞的合适的载体的ddRNAi表达盒体内表达ddRNAi制剂。所述ddRNAi表达盒包括:
·一条或多条启动子序列;
·一条或多条DNA序列,所述DNA序列选自编码SEQ ID NO:1-27的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸的序列;
·一条或多条DNA序列,所述DNA序列编码一条或多条效应器互补序列;
·一条或多条终止子序列;
以及可选地,
·一条或多条编码环序列的DNA序列;
·一条或多条增强子序列。
如在本说明书之前所描述的,所述ddRNAi表达盒的这些成分可以具有不同的5’至3’设置,都适于在本发明的方法中使用。
在本发明的方法中,所述HBV靶基因至少是聚合酶(P)基因,以及可能地当所述靶序列包含在重叠开放阅读框中时,所述靶基因是表面抗原或X基因,且所述ddRNAi制剂包括ddRNAi效应器序列,所述ddRNAi效应器序列是表1中列出的SEQ ID NO:1~27中的一条序列的任何10个或更多个连续核苷酸。可选地,如之前详细描述的,编码所述效应器序列或与所述第一效应器序列互补的序列的序列可以与SEQ ID NO:1~27有1、2、3、4或5个核苷酸变化,而不影响所编码的序列与靶序列碱基配对的能力以及抑制HBV靶序列表达的能力。
通常,每一效应器序列与其对应的效应器互补序列形成双链区域。
在另一种实施方式中,治疗个体中HBV感染的方法包括施用治疗有效量的ddRNAi构建体,所述ddRNAi构建体编码具有多于一种如上所列出的那些效应器序列的ddRNAi制剂。
待治疗的HBV感染可以是慢性HBV感染。“慢性”表示所述HBV感染是长效的或持久的。术语慢性描述了疾病的过程,或它的发作和进展速率。当治疗慢性HBV感染时,优选地施用所述ddRNAi构建体并且所述构建体稳定地保持在或整合至所述靶细胞,以使得所述ddRNAi制剂的更长期表达。如上所详述的,这可以通过使用具有病毒载体骨架的ddRNAi构建体而实现。根据此,提供了一种治疗个体中慢性HBV感染的方法,包括对需要治疗的病患施用治疗有效量的本发明的ddRNAi构建体。
治疗慢性HBV感染的目的是通过干扰病毒复制减少所述病毒的感染性。这最终降低了HBV传染和传播的风险。因此提供了一种减少感染有HBV的个体中的HBV感染性的方法,包括对个体施用本发明的ddRNAi构建体以靶定HBV基因,优选地聚合酶基因。在慢性乙型肝炎治疗中使用的临床端点将与代偿的乙型肝炎病患(其中持久的病毒抑制、血清学反应、组织学改善、肝功能检测的标准化和非临床进程是主要的端点)和代偿失调的乙型肝炎病患之间的不同。在代偿失调的疾病病患中,肝脏广泛地被创伤和纤维化,肝脏损伤的预防/逆转和疾病过程的预防和避免肝脏移植是治疗的主要目标。代偿的乙型肝炎的端点是病毒负荷的减少以及血清学和生物化学改进、组织学改进、肝脏衰竭和末期肝脏疾病的测量、并发症、移植和致死率。
在另一种实施方式中,提供了一种将个体中的由HBV感染导致的肝脏疾病的进程最小化的方法,包括对个体施用本发明的ddRNAi构建体以靶定HBV基因,优选地聚合酶基因。
在本发明的另一种实施方式中,提供了一种将个体中与HBV感染有关的症状最小化的方法,包括对个体施用本发明的ddRNAi构建体以靶定HBV基因,优选地聚合酶基因。
个体的HBV感染的状态或严重性可以通过测量他们的病毒负荷而评估。“病毒负荷”的意思是涉及的体液中病毒的量。例如,可以以RNA拷贝每毫升血浆给出。具有高的病毒负荷的个体被认为具有更严重的HBV感染。可选地,所述病毒负荷是个体对具体治疗的反应性的指示。如果所述治疗有效并保持低水平的病毒,这表示成功的治疗。因此,提供了一种降低患有HBV感染的个体中病毒负荷的方法,包括对所述个体施用本发明的ddRNAi构建体以靶定HBV基因,优选地聚合酶基因。
随后的监测已接受使用本发明的ddRNAi构建体进行治疗的个体中的病毒负荷因此是本发明的ddRNAi构建体和ddRNAi制剂的有效性的表型指示剂。
可选地,急性HBV感染的治疗可以不需要长期治疗,并且事实上,相对于整合的或稳定保持的ddRNAi构建体中的ddRNAi制剂的长期表达,它可能更依赖于ddRNAi制剂或siRNA制剂的瞬时存在。“急性”的意思是HBV感染具有快速的发作和/或短的持续时间。
根据本发明的这一实施方式,提供了一种治疗个体中急性HBV感染的方法,包括对有治疗需要的病患施用治疗有效量的体外合成的或化学合成的ddRNAi制剂,用于抑制乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一种或多种靶序列的表达。所述ddRNAi制剂包括至少:
长度为至少17个核苷酸、选自SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸的第一效应器序列;和
第一效应器互补序列;
其中所述效应器序列与所述靶基因的一个区域的预测转录本基本互补。在该实施方式中,本发明的ddRNAi制剂在体外生产或化学合成,并被提供至所述细胞。
在本说明书中描述的任何本发明的siRNA制剂或ddRNAi制剂适于体外表达并递送至细胞。
优选地,所述HBV靶基因至少是聚合酶(P)基因,以及可能地当所述靶序列包含在重叠开放阅读框中时,所述靶基因是表面抗原、核心抗原或X基因。因此,在本发明的一种实施方式中,所述ddRNAi制剂抑制乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶基因中的一种或多种靶序列的表达。所述第一效应器序列优选地选自表1中列出的SEQ ID NO:1~27的效应器序列中的一条序列的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。可选地,所述效应器序列与SEQ ID NO:1~27可以有1、2、3、4或5个核苷酸变化,而不影响所述效应器序列与靶序列碱基配对的能力以及抑制HBV聚合酶基因表达的能力。
在另一种实施方式中,可以施用siRNA制剂。优选地,与所述ddRNAi制剂相似,所述siRNA制剂靶定HBV聚合酶基因,且序列可以选自SEQ IDNO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,或可以与SEQ ID NO:1~27有1、2、3、4或5个核苷酸变化,而不影响所述效应器序列与靶序列碱基配对的能力以及抑制HBV聚合酶基因表达的能力。
对含有急性HBV感染的个体施用本发明的ddRNAi制剂或siRNA制剂同样可以降低病毒负荷,减少与急性感染相关的症状的严重性以及减少HBV的感染性。
在本发明的另一种实施方式中,提供了本发明的ddRNAi构建体、ddRNAi制剂或siRNA制剂在制备用于治疗HBV感染(优选地慢性HBV感染)、减少HBV病毒负荷、减少与HBV感染相关的症状的严重性和减少HBV的感染性的药物中的应用。
在本发明另一方面,提供了用于治疗HBV感染(优选地慢性HBV感染)、减少HBV病毒负荷、减少与HBV感染相关的症状的严重性和减少HBV的感染性的ddRNAi构建体、ddRNAi制剂或siRNA制剂。
在本发明的另一方面,提供了一种包含ddRNAi构建体、ddRNAi制剂或siRNA制剂作为活性成分用于治疗HBV感染(优选地慢性HBV感染)、减少HBV病毒负荷、减少与HBV感染相关的症状的严重性和减少HBV的感染性的组合物。
在本发明的方法中使用的ddRNAi构建体、ddRNAi制剂或siRNA制剂的一种或多种效应器序列包括能够抑制所述HBV靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,所述一种或多种效应器序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
药物组合物
通过与合适的药物学可接受的载体或稀释剂组合,本发明的ddRNAi制剂、siRNA制剂或包含ddRNAi表达盒的载体可以被配制成药物组合物。因此,提供了一种包含本发明的ddRNAi制剂、ddRNAi表达盒、ddRNAi构建体或siRNA制剂和药物学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
在药物剂量形式中,可以单独或与其它药物活性化合物联合或一起施用所述制剂或包含ddRNAi表达盒的载体。本领域技术人员将容易地意识到制剂或包含所述ddRNAi表达盒的载体的剂量水平将作为所述递送载体的性质、所述靶细胞的转导相对容易度、所述RNAi制剂在靶细胞中的表达水平等的函数而变化。
本发明的ddRNAi制剂、siRNA制剂或包括ddRNAi表达盒的载体将被配制成制品,用于将它们溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂中而注射或施用,所述溶剂包括油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸或丙二醇的酯;以及如果期望,与常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起施用。
本发明期望的药物学可接受的载体或稀释剂包括以使用的剂量和浓度对接受者无毒的任何稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂,并包括如磷酸、柠檬酸和其它有机酸的缓冲液;包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂;防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵,苯酚、丁醇或苯甲醇,对羟基苯甲酸烷基酯,如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯,邻苯二酚,间苯二酚,环己醇,3-戊醇和m-甲酚);低分子量(如小于大约10个残基)多肽;蛋白,如血浆白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它的碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂如EDTA;糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成盐抗衡离子,例如钠;金属复合物(例如,锌-蛋白质复合物);和/或非离子型表面活性剂如吐温TM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
所述药物组合物可以被制备用于多种途径和类型的施用。通常,通过均匀地和密切地将所述活性成分与液体载体或精细分离的固体载体或两者联系在一起而制备配方,并且如果需要,制备成形产品。可以在室温、在合适的pH值下,以及在期望的纯度下通过与生理学可接受的载体混合而操作所述配方,所述载体是在使用的剂量和浓度下对接受者无毒的载体。
在本发明的组合物中使用的ddRNAi构建体、ddRNAi制剂或siRNA制剂的一种或多种效应器序列包括能够抑制所述HBV靶基因区域至少70%表达的序列中的任何10个或更多个、优选地任何17个或更多个连续核苷酸。优选地,所述一种或多种效应器序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:23。
实施例
以下实施例实际上是例举说明,不作为任何形式的限定。
实施例1:整个siRNA靶(EsT)库的生产
亚克隆来自HBV Adr-1(登录号M38454)的全长依赖于HBV RNA的DNA聚合酶基因并用于生产整个siRNA靶(EsT)库。测序5000个克隆,其中642个被鉴定为具有范围在19-23bp的非重复序列。代表用于本发明的ddRNAi制剂的潜在靶的序列沿着所述靶基因分布(图2)。
实施例2:使用具有≥50%敲减的SEC的大规模筛选结果
为鉴定之后在制备本发明的ddRNAi制剂中使用的最有效的siRNA序列,通过PCR扩增的siRNA表达盒(SEC)被转染至HepG22.2.15细胞。评估对HBV聚合酶mRNA表达水平的作用以鉴定起作用的siRNA序列。
化学合成与第一次筛选的SEC相对应40个siRNA并转染至HepG22.2.15细胞中以确认初始聚合酶mRNA敲减水平。HepG22.2.15是包含整合的成串的HBV基因组二聚体的稳定细胞系(Genebank登录号:U95551),并能够稳定表达HBV抗原和HBV Dane颗粒。所述对应结果在图3中显示。
如能够从图3中看到的,当聚合酶表达的SEC抑制>50%时,大多数对应的合成的siRNA序列给出HBV mRNA的大约70%敲减,且仅2/23给出敲减水平低于50%。与具有<50%沉默功效的SEC相对照,仅18%(3/17)的相应的合成siRNA产生>70%敲减(p<0.05-培生卡方检验,|t Stat|=4.29>1.68)。此外,产生>90%敲减的合成siRNA(需要解释这个)对应于给出65%敲减的SEC克隆。从这里可以推断出在通过来自SEC的siRNA的HBV mRNA的敲减和由合成的siRNA产生的HBV mRNA的敲减之间存在合理的相互关系,达到通过SEC的≥50%敲减的截断值。所述截断值用于SEC的筛选的剩余部分。
实施例3:通过siRNA表达盒(SEC)的靶筛选
图4显示了用于抑制HBV mRNA积累的体外大规模筛选的结果(501个非重复siRNA制剂)。在这些筛选的序列中,100个siRNA序列有效敲减HBVmRNA≥50%,其中14个导致>70%的敲减(表2)。在HBV聚合酶基因上的前100个siRNA靶的分布在图5A中给出,任何序列能够最终在聚合酶上绘制。例如图5B绘制了第一批3个序列。
表2:
在转染的HepG22.2.15细胞中相对于空载体对照测量相对的mRNA表达(通过一步定量RT-PCR方法使用SensiMix SYBR一步试剂盒(Bioline,美国),根据生产商的指导),所述空载体对照的水平被任意地设定为1.0。用于HBV聚合酶基因的特定引物是:正向引物5’-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3’,反向引物5’-GCGTCAGCAAACACTTGG-3’,所述PCR产物的长度158bp。U6snRNA(正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)用作内部对照,所述PCR产物的长度是94bp。使用2-ΔΔCt分析方法标准化聚合酶基因的相对表达水平。使用一式四份独立转导实施所述实验。
实施例4:使用合成的siRNA确认活性
第一轮筛选使用具有相对启动子的载体(pU6H1-GFP)。在shRNA表达构建体中,所述shRNA处于单一启动子控制下。因此,为了在开发基于表2中所示的前14个siRNA序列的shRNA表达构建体之前确认前14个siRNA序列的功效,用每一siRNA转染HepG22.2.15细胞,并评估HBV复制的抑制以测量HBV聚合酶mRNA水平。
化学合成所述14个siRNA并具有dTdT3’突出。5’-FAM标记的siRNA-GL3(具有不相关siRNA序列的pGL3荧光素酶报道载体)用作负对照。将所述siRNA用DEPC处理的水溶解为100μM,等分并保存于-20℃。此外,长度为29bp的SEQ ID NO:4被重新设计为8个siRNA(SEQ ID NO:20~27),每一个长度是22bp,由SEQ ID NO:4的重叠序列组成(下面表3):
表3:
SEQ ID NO | RNAi效应器序列 |
4 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGAGUUAUCTT |
20 | GGGAGAGGACAACAGAGUUAUCTT |
21 | CGGGAGAGGACAACAGAGUUAUTT |
22 | GCGGGAGAGGACAACAGAGUUATT |
23 | UGCGGGAGAGGACAACAGAGUUTT |
24 | UUGCGGGAGAGGACAACAGAGUTT |
25 | UUUGCGGGAGAGGACAACAGAGTT |
26 | AUUUGCGGGAGAGGACAACAGATT |
27 | UAUUUGCGGGAGAGGACAACAGTT |
通过变化5’FAM-标记的siRNA-GL3和Lipofectamine2000(Invitrogen)实施转染优化。所述细胞在37℃、5%CO2下保持在补充有10%PBS(Excellbio,中国)和200μg/mL G418(Sangon,中国)的DMEM(GIBCO,美国)中。
使用优化的方案用siRNA转染HepG22.2.15细胞并在转染后72小时收获。使用Trizol(Invitrogen)分离总RNA,并如在实施例3中详述的,使用SensiMix SYBR一步试剂盒(Bioline,美国),根据生产商的指导,在一步定量RT-PCR方法中定量总RNA。
结果
所述结果被表示为平均值±STDV(表4和图9)
siNC=负对照;正常=未转染的细胞
在所检测的22个siRNA中,全部展示出至少大约50%抑制,最多的展示出60~70%抑制。尽管在SEQ ID NO:4的22bp变异体SEQ ID NO:20~27之间的高度序列相似度,抑制它们序列的表达的能力在50至70%之间变化。基于这些结果,SEQ ID NO:3、9、12、13和23被选出用于进一步开发。虽然所有的SEQ ID NO都靶定所述聚合酶基因,同样基于它们沿着所述聚合酶基因mRNA分布为基础选择这些序列(见表1中列“HBV靶位点”)。
实施例5:shRNA设计和构建
步骤1-效应器序列设计
根据SEQ ID NO:3、9、12、13和23设计shRNA表达构建体。可以使用不同启动子容易地合成构建体,所述启动子包括不同版本的具有不同内在活性的人U6启动子(Domitrovich,AM and Kunkel,GR(2003)Multiple,dispersedhuman U6small nuclear RNA genes with varied transcriptional efficiencies NucleicAcids Research31:2344-2352)或多种polII启动子。在设计这些构建体时,考虑以下事项:
·Dicer以shRNA为基础开始加工。
·Dicer的加工过程是不严密的,但是主要期望每22个核苷酸剪切。
·U6终止被期待在所述shRNA的3’末端添加UU。
·所述被加工的效应器序列期望地包含5’U或A以促进有效的Ago2载入。
·所述效应器序列被置于环的3’位置以避免对于最大限度的U6转录是优选的5’G。
·可以通过在所述ddRNAi制剂所靶定的序列的上游或下游融合2或3个核苷酸的序列而将5’A或U残基融合至shRNA效应器序列中。这被定义为“滑动”序列1、2或3个核苷酸,即,用于shRNA的效应器序列可以基于相对于所述siRNA效应器序列的5’末端的5’端或3’端的1、2或3个核苷酸的序列。
当应用于基于SEQ ID NO:3、9、12、13和23这5个siRNA时:
i)对于基于SEQ ID NO:3:gccgggcaacgggguaaagguucTT的shRNA
“最好的”shRNA效应器序列(最小化5’GC序列,“向下”滑动3nt)
GGGCAACGGGGUAAAGGUUCuu(uu来自pol III终止)
ii)对于基于SEQ ID NO:9:gggaaagcccuacgaaccacuTT的shRNA
“最好的”shRNA效应器序列(最小化5’G,向下滑动3nt至5’A,在3’添加GA(来自HBV基因组以最大化同源性)
AAAGCCCUACGAACCACUGAuu
iii)对于基于SEQ ID NO:12:gcccacucccauaggaauuuuccTT的shRNA
“最好的”shRNA效应器序列在反义链上提升2nt以避免UUUU(将引起过早的终止),添加来自HBV序列的AG,这将偶然地掺入5’A。
AGGCCCACUCCCAUAGGAAUU
iv)对于基于SEQ ID NO:13:ggaucuugcagaguuuggTT的shRNA
“最好的”shRNA效应器序列(将长度增加至20nt,向上滑动2nt,添加来自HBV序列的TG,这将导致5’T(即,U))
TGGGAUCUUGCAGAGUUUGGuu
v)对于基于SEQ ID NO:23:ugcgggagaggacaacagaguuTT的shRNA
“最好的”shRNA效应器序列在3’末端减少2nt
UGCGGGAGAGGACAACAGAGUU
步骤2-表达盒
制备基于在步骤(a)中设计的效应器序列的U6shRNA盒(Genscript)并克隆至pUC57中。
所述表达盒的插入物,包括用于后续操作的一些侧翼限制性位点,具有以下序列:
U6.HBV shRNA3
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAAGAGACCGGGCAACGGGGTAAAGGTTCTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO:28);
U6.HBVshRNA9
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCAAGAGAGGAAAGCCCTACGAACCACTGATTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO:29);
U6.HBVshRNA12
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCACAAGAGATGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO:30);
U6.HBVshRNA13
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAAACTCTGCAAGATCCCAGACAAGAGATCTGGGATCTTGCAGAGTTTGGTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO:31);
U6.HBVshRNA23
GGGACCCGGTACCTCGAGAGATCTGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCTGTTGTCCTCTCCCGCAAACAAGAGATTTGCGGGAGAGGACAACAGAGTTTTTTGTTAACGAATTC(SEQ ID NO:32)。
这些表达盒的每一个所对应的表达的shRNA在图6中示出(如SEQ IDNO:36至40)。符号“∧”和“∨”表示shRNA的潜在加工位点,这些位点起因于转录起始/终止或具有22nt相位和2nt3’突出的Dicer加工过程,假定这样加工过程的预测效应器序列在下面示出。
实施例6:使用多序列构建体表达细胞的稳定shRNA的产生
如上面所详述的,一种设计本发明的ddRNAi表达盒的有用途径是假定Dicer在每22个核苷酸处剪切(也被指定为22nt相位)。因此,编码效应器序列的DNA序列可以被设计为编码SEQ ID NO:1~27中的一条序列中的任何10个或更多个以及优选地任何17个或更多个连续核苷酸,以及合适的间隔子和用于所述启动子和/或终止子的其它序列要求。
将使用以下结构产生ddRNAi构建体(使用非限制的例示序列):
i)单发夹表达盒
如上所提及的,图6图示了基于SEQ ID NO:3(图6A)、SEQ ID NO:9(图6B)和SEQ ID NO:12(图6C)、SEQ ID NO:13(图6D)和SEQ ID NO:23(图6E)的所述表达盒、表达的发夹RNAi制剂和由Dicer(假定22个核苷酸相位)所加工的理论效应器序列。在图6A和6B的盒中,分别编码SEQ ID NO:3和9的20个连续核苷酸;在图6C至6E的盒中,分别编码SEQ ID NO:12、13和23的21个连续核苷酸。发夹RNAi制剂上的箭头表示期望Dicer剪切的位置以产生下面所示的效应器序列。
图6A至6E的表达盒的序列已经在上面提供(SEQ ID NO:28至32)。
ii)多发夹表达盒
图7例示了基于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的所述表达盒、表达的发夹RNAi制剂(SEQ ID NO:41至43)以及由Dicer(假定22个核苷酸相位)加工的理论效应器序列,此时SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6被设置在所述盒中以在加工之前引起单独发夹RNAi制剂的表达(图7A)或包含3个发夹RNAi制剂的单一RNA的表达(图7B)。SEQ ID NO:1、4和6在涉及单一发夹表达盒方面与上面所述的相同。发夹RNAi制剂上的符号“∧”和“∨”表示期望Dicer剪切的位置以产生下面所示的效应器序列。
图7A的表达盒具有DNA序列:TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTCTCCCTTATCGTCAATCTTCAAGAGAAAGATTGACGATAAGGGAGATTTTTTTTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGATAACTCTGTTGTCCTCTTTCAAGAGAAGAGGACAACAGAGTTATCTTTTTTTTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCCCACCGCACGGAGGCCTTTTCAAGAGAAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTTTTTTT(SEQ ID NO:33)。
在图7A的盒中,每一效应器互补序列可操作地与启动子序列连接,而对应的效应器序列可操作地与终止元件或序列连接。
相反,在图7B的表达盒中,所述第一效应器互补序列(效应器1互补序列)可操作地与启动子连接,而最后效应器(效应器6)可操作地与终止元件或序列连接,箭头表示Dicer加工的预期位点。设计该盒以表达单一RNA分子(SEQ ID NO:44),且具有DNA序列:TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGCTGTTGACAGTGAGCGTCTCCCTTATCGTCAATCTTCAAGAGAAAGATTGACGATAAGGGAGATGCCTACTGCCTCGGATTCTGCTGTTGACAGTGAGCGGTTGTCCTCTCCCGCAAATACAAGAGATATTTGCGGGAGAGGACAACTGCCTACTGCCTCGGATTCTGCTGTTGACAGTGAGCGCCCCACCGCACGGAGGCCTTCAAGAGAAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTGCTGTTGACAGTGAGCGTTTTTTT(SEQ ID NO:34)。
iii)长发夹表达盒
图8例示了基于(按顺序)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:4的表达盒、表达的发夹RNAi制剂(SEQ ID NO:45)和由Dicer(假定22个核苷酸相位)加工的理论效应器序列。在图8的盒中,根据上面的实施例,编码SEQ ID NO:1的17个连续核苷酸和SEQ ID NO:6的20个连续核苷酸,但是与图7和8的盒相反,仅编码SEQ ID NO:4的18个连续核苷酸。在发夹RNAi制剂上的箭头表示期望Dicer剪切的位置以产生下面所示的效应器序列。
图8的表达盒具有DNA序列:TACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCCCTTATCGTCAATCTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTCTGATGTCCTCTCCCGCAAATACAAGAGATATTTGCGGGAGAGGACAACAGAAGGCCTCCGTGCGGTGGGGTGAAAGATTGACGATAAGGGAGATTTTTTT(SEQ ID NO:35)。
实施例7:体外测定ddRNAi制剂的功效
为检测ddRNA制剂的功效,可以用本发明的RNA制剂转染合适的细胞和细胞系并测定HBV复制的抑制。
为测定本发明的ddRNAi构建体的功效,构建基于pGL3荧光素酶报道载体的质粒DNA。首先,“pGL3多”包含在萤火虫荧光素酶表达质粒pGL3的3’未翻译区(UTR)的单一拷贝的序列,编码用于分别基于SEQ ID NO:3、9、12、13和23的siRNA或shRNA3、9、12、13和23的靶位点。第二,“pGL3-23”包含三次重复的基于SEQ ID NO:23的shRNA23。在这些质粒上的HBV靶位点对应于由具体的siRNA或shRNA识别的HBV的正义序列,并包含所述靶位点的上游和下游的额外的10nt的HBV序列。
以下信息涉及使用pGL3-23构建体进行的实验。
出于方便原因,我们选择采用初始检测,所述检测使用在HEK293细胞中的瞬时实验的双荧光素酶实验。将细胞培植在96孔板中(0.1mL培养基/孔)以在转染前达到大约50%的融合。使用生产商(Invitrogen)的方案用LipofectamineTM2000将质粒DNA和化学合成的siRNA(或shRNA载体)共转染至HEK293细胞中。测试构建体与表达海肾(Renilla)荧光素酶(pRL-TK,Promega)(作为转染效率的内在对照)的构建体一起使用。
如果化学合成的siRNA或表达自载体的shRNA在沉默靶序列中有效,由于所述靶序列可操作地与荧光素酶基因连接,所以转染细胞中的荧光素酶水平将降低。
因此,多种剂量的化学合成的siRNA或shRNA表达载体与恒定量的pGL3-23和对照质粒共转染(见下表)。
表5:检测抗pGL3-23的siRNA23
用指定量的pGL3-23和对照(pRL-TK)质粒以及变化量的基于SEQ IDNO:23的siRNA(HBV-siRNA23)转染细胞。siNC,一种在HBV中没有已知的靶序列的不相关的siRNA用作负对照和用于调整添加至细胞的siRNA的总量,以避免由于不平等转染导致的潜在的人工结果。siRNA GL3用作正对照,使得siRNA被靶定至所述荧光素酶基因。
表6:检测抗pGL3-23的shRNA23
用指定量的pGL3-23和对照质粒(pRL-TK)以及变化量的用于表达基于SEQ ID NO:23的shRNA的检测质粒(HBV shRNA23)转染细胞。pUC57用作负对照并用于调整添加至细胞的质粒DNA的总量,以避免由于不平均转染导致的人工结果。表达基于GL3siRNA的荧光素酶shRNA的质粒用作正对照。
将用于检测的样品转染至4个单独孔中,并使用双荧光素酶检验系统(Promega)和SynergyTM2Luminescence读微板器(Biotek),分别根据生产商的方案,在转染后48小时测量萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。测量每一孔的萤火虫/海肾活性比例,通过标准化至各自对照计算siRNA或shRNA的抑制功效。
结果
图10A和B中的图显示了使用表5和6中列出的条件转染有不同量的靶定pGL3-23的化学合成的siRNA23(A)或shRNA23表达构建体(B)的细胞中的荧光素酶活性(+/-SD;n=4)。即使在最低的浓度下,基于SEQ ID NO:23的siRNA和shRNA相对于负对照(siNC或shNC-任意地设置为1)是下调的。所述正对照荧光素酶siRNA和shRNA同样下调来自pGL3-23的荧光素酶表达水平。
实施例8:体内检测ddRNAi制剂的功效
可以使用HBV的小鼠模型,如HBV感染的NOD/SCID小鼠(Yang等,2002;Ketzinel-Gilad等,2006),以及表达HBV的转基因小鼠系,任一一种或两种都可以用于这些实验。
把ddRNAi制剂注射至小鼠的尾部静脉将用于递送所述制剂至肝脏。可以在不同时间点使用qRT-PCR检验监测HBV复制的抑制以测量肝脏组织中HBV pol mRNA的水平,或者通过定量用本发明的ddRNAi制剂处理的动物和合适的对照动物中循环的HBsAg和HBeAg的水平的比较来监测HBV复制的抑制,所述合适的对照动物如注射有如上所述的乱序的(scrambled)序列或无相关的DNA。
用于稳定表达ddRNAi制剂的合适表达构建体包括慢病毒载体。
实施例9:在正常小鼠模型中体内检测临床前候选物
在正常小鼠模型中体内检测临床前候选物的一种可用递送系统是AAV。对于AAV,使用本领域公知的策略将ddRNAi构建体在体外包装并将其静脉注射至HBV感染的NOD/SCID小鼠和/或HBV转基因小鼠。将如上所述监测HBV复制的抑制。
应当理解,在本说明书中公开和定义的本发明延伸至在本文或附图中提及或显现的两种或多种个别性质的所有可交替的组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多种可选择的方面。
Claims (15)
1.一种用于抑制一种或多种乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一条或多条靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂从5’至3’方向包括:
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;
一条长度是至少17个核苷酸的第二效应器序列;
一条第二效应器互补序列;和
一条第一效应器互补序列,
其中,每一效应器序列与一条靶序列的预测转录本基本互补。
2.一种根据权利要求1所述的ddRNAi制剂,包括第三效应器序列和第三效应器互补序列。
3.一种用于抑制一种或多种乙型肝炎病毒(HBV)基因中的一条或多条靶序列的表达的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)制剂,所述ddRNAi制剂从5’至3’方向包括:
一条长度是至少17个核苷酸的第一效应器序列;
一条第一效应器互补序列;
一条长度是至少17个核苷酸的第二效应器序列;和
一条第二效应器互补序列,
其中,每一效应器序列与一条靶序列的预测转录本基本互补。
4.一种根据权利要求3所述的ddRNAi制剂,包括第三效应器序列和第三效应器互补序列。
5.一种根据权利要求1~4任意一项所述的ddRNAi制剂,其特征在于,每一效应器序列选自SEQ ID NO:1~27中任意一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸。
6.一种根据权利要求5所述的ddRNAi制剂,其特征在于,每一效应器序列选自SEQ ID NO:3、9、12、13和23。
7.一种ddRNAi表达盒,用于表达根据权利要求1~6任意一项所述的ddRNAi制剂,所述表达盒包括:
一条或多条启动子序列;
一条或多条编码一种或多种效应器序列的DNA序列;
一条或多条编码一种或多种效应器互补序列的DNA序列;
一条或多条终止子序列;
以及可选地,
一条或多条编码环序列的DNA序列;
一条或多条增强子序列。
8.一种根据权利要求7所述的ddRNAi表达盒,其特征在于,编码一种或多种效应器序列的一条或多条DNA序列选自SEQ ID NO:1~27中任意一条序列中的任何10个或更多个连续核苷酸。
9.一种ddRNAi表达构建体,包括根据权利要求7或8的ddRNAi表达盒。
10.一种治疗个体中急性或慢性HBV感染的方法,包括施用治疗有效量的根据权利要求1~6任意一项的ddRNAi制剂或根据权利要求9的ddRNAi构建体。
11.一种减少个体中HBV病毒负荷的方法,包括施用治疗有效量的根据权利要求1~6任意一项的ddRNAi制剂或根据权利要求9的ddRNAi构建体。
12.一种减少个体中与HBV感染相关的症状的严重性的方法,包括施用治疗有效量的根据权利要求1~6任意一项的ddRNAi制剂或根据权利要求9的ddRNAi构建体。
13.一种减少HBV感染性的方法,包括施用治疗有效量的根据权利要求1~6任意一项的ddRNAi制剂或根据权利要求9的ddRNAi构建体。
14.一种根据权利要求10~13任意一项所述的方法,其特征在于,所述ddRNAi制剂或所述ddRNAi构建体至少抑制HBV聚合酶基因的表达。
15.一种药物组合物,包括根据权利要求1~6任意一项的ddRNAi制剂或根据权利要求9的ddRNAi构建体,以及药物学可接受的载体或稀释剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201180062884.8A CN103370415B (zh) | 2010-10-28 | 2011-10-27 | Hbv治疗 |
Applications Claiming Priority (25)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010521990.5 | 2010-10-28 | ||
CN201010522005.2 | 2010-10-28 | ||
CN2010105219483 | 2010-10-28 | ||
CN201010521975.0 | 2010-10-28 | ||
CN201010521962.3A CN101979554B (zh) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | 一种干扰HBV基因的siRNA分子及其应用 |
CN2010105219750 | 2010-10-28 | ||
CN201010522003.3 | 2010-10-28 | ||
CN2010105220052 | 2010-10-28 | ||
CN2010105219905 | 2010-10-28 | ||
CN201010521975.0A CN101979555B (zh) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | 一种小干扰rna分子及其应用 |
CN201010522005.2A CN101979558B (zh) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | 一种靶向乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其应用 |
CN2010105219623 | 2010-10-28 | ||
CN2010105220033 | 2010-10-28 | ||
CN201010521948.3 | 2010-10-28 | ||
CN201010521962.3 | 2010-10-28 | ||
CN201010521990.5A CN101979556B (zh) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | 一种siRNA靶向分子及其应用 |
CN201010521948.3A CN101979553B (zh) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | 一种干扰HBV基因的siRNA分子及其抗病毒应用 |
CN2010105219727 | 2010-10-28 | ||
CN201010522003.3A CN101979557B (zh) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | 一种siRNA分子及其在抗病毒药物中的应用 |
CN201010521972.7 | 2010-10-28 | ||
CN201010521972.7A CN102021170B (zh) | 2010-10-28 | 2010-10-28 | 一种干扰乙型肝炎病毒基因的siRNA分子及其应用 |
CNPCT/CN2011/071107 | 2011-02-18 | ||
PCT/CN2011/071107 WO2012109798A1 (en) | 2011-02-18 | 2011-02-18 | Hbv treatment |
PCT/CN2011/081386 WO2012055362A1 (en) | 2010-10-28 | 2011-10-27 | Hbv treatment |
CN201180062884.8A CN103370415B (zh) | 2010-10-28 | 2011-10-27 | Hbv治疗 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103370415A true CN103370415A (zh) | 2013-10-23 |
CN103370415B CN103370415B (zh) | 2017-05-31 |
Family
ID=45993174
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201180062884.8A Expired - Fee Related CN103370415B (zh) | 2010-10-28 | 2011-10-27 | Hbv治疗 |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9080174B2 (zh) |
EP (2) | EP3124610B1 (zh) |
KR (2) | KR101903778B1 (zh) |
CN (1) | CN103370415B (zh) |
AU (1) | AU2011320437B2 (zh) |
BR (1) | BR112013010525A2 (zh) |
CA (1) | CA2853613C (zh) |
CY (1) | CY1121894T1 (zh) |
DK (1) | DK3124610T3 (zh) |
ES (1) | ES2730393T3 (zh) |
HR (1) | HRP20190995T1 (zh) |
HU (1) | HUE044426T2 (zh) |
LT (1) | LT3124610T (zh) |
PL (1) | PL3124610T3 (zh) |
PT (1) | PT3124610T (zh) |
RS (1) | RS58982B1 (zh) |
RU (1) | RU2620966C2 (zh) |
SI (1) | SI3124610T1 (zh) |
TR (1) | TR201908127T4 (zh) |
WO (1) | WO2012055362A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105002214A (zh) * | 2015-04-08 | 2015-10-28 | 许中伟 | 用于载体表达的复合多联gRNA和RNAi的表达框架 |
WO2018209848A1 (zh) * | 2017-05-19 | 2018-11-22 | 百奥迈科生物技术有限公司 | 抑制HBV的siRNA分子及其应用 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SI3505528T1 (sl) | 2011-04-21 | 2021-04-30 | Glaxo Group Limited | Modulacija izražanja virusa hepatitisa B (HBV) |
SG11201507496UA (en) | 2013-04-17 | 2015-11-27 | Pfizer | N-piperidin-3-ylbenzamide derivatives for treating cardiovascular diseases |
CN107683336A (zh) * | 2015-05-06 | 2018-02-09 | 贝尼泰克生物制药有限公司 | 用于治疗乙型肝炎病毒(hbv)感染的试剂及其用途 |
CA2991639A1 (en) | 2015-08-07 | 2017-02-16 | Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. | Rnai therapy for hepatitis b virus infection |
RS61528B1 (sr) | 2016-03-14 | 2021-04-29 | Hoffmann La Roche | Oligonukleotidi za smanjenje ekspresije pd-l1 |
RU2748806C2 (ru) * | 2016-05-05 | 2021-05-31 | Бенитек Байофарма Лимитед | Средства для лечения инфекции вируса гепатита в (hbv) и их применение |
MA45496A (fr) | 2016-06-17 | 2019-04-24 | Hoffmann La Roche | Molécules d'acide nucléique pour la réduction de l'arnm de padd5 ou pad7 pour le traitement d'une infection par l'hépatite b |
JOP20170161A1 (ar) | 2016-08-04 | 2019-01-30 | Arrowhead Pharmaceuticals Inc | عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب |
UA126931C2 (uk) | 2017-10-16 | 2023-02-22 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | МОЛЕКУЛИ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ ДЛЯ ЗМЕНШЕННЯ РІВНЯ мРНК PAPD5 І PAPD7 ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЙНОГО ГЕПАТИТУ B |
CA3097544A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of fubp1 inhibitors for treating hepatitis b virus infection |
MX2020013366A (es) | 2018-07-03 | 2021-03-09 | Hoffmann La Roche | Oligonucleotidos para modular la expresion de tau. |
BR112021000538A2 (pt) | 2018-07-13 | 2021-04-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Oligonucleotídeos para modular a expressão de rtel1 |
WO2021122993A1 (en) | 2019-12-19 | 2021-06-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of saraf inhibitors for treating hepatitis b virus infection |
CN114901821A (zh) | 2019-12-19 | 2022-08-12 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | Sept9抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途 |
WO2021122921A1 (en) | 2019-12-19 | 2021-06-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection |
JP2023506550A (ja) | 2019-12-19 | 2023-02-16 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ エージー. | B型肝炎ウイルス感染症を処置するためのsbds阻害剤の使用 |
EP4200419A2 (en) | 2020-08-21 | 2023-06-28 | F. Hoffmann-La Roche AG | Use of a1cf inhibitors for treating hepatitis b virus infection |
TW202246500A (zh) | 2021-02-02 | 2022-12-01 | 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 | 用於抑制 rtel1 表現之增強型寡核苷酸 |
WO2023111210A1 (en) | 2021-12-17 | 2023-06-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101684478A (zh) * | 2009-06-26 | 2010-03-31 | 武汉大学 | 一种串联表达小干扰rna重组慢病毒载体的构建方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030206887A1 (en) * | 1992-05-14 | 2003-11-06 | David Morrissey | RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA) |
US6218181B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-04-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Retroviral packaging cell line |
AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
NZ547283A (en) | 1998-03-20 | 2008-06-30 | Commw Scient Ind Res Org | Control of gene expression |
JP2003526367A (ja) | 2000-03-16 | 2003-09-09 | ジェネティカ インコーポレイテッド | Rna干渉の方法とrna干渉組成物 |
US7919309B2 (en) | 2001-09-13 | 2011-04-05 | California Institute Of Technology | Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell |
EP1572943B1 (en) | 2002-08-29 | 2015-04-22 | The Board of Trustees of The Leland S. Stanford Junior University | Circular nucleic acid vectors, and methods for making and using the same |
US20050059044A1 (en) | 2003-06-03 | 2005-03-17 | Graham Michael Wayne | Double-stranded nucleic acid |
WO2005087926A2 (en) | 2004-03-05 | 2005-09-22 | Benitec, Inc. | Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents |
EP1844145A2 (en) | 2005-02-03 | 2007-10-17 | Benitec, Inc. | Rnai expression constructs |
US8008468B2 (en) | 2005-02-16 | 2011-08-30 | Benitec, Inc. | RNAi expression constructs with liver-specific enhancer/promoter |
AR057252A1 (es) * | 2005-12-27 | 2007-11-21 | Alcon Mfg Ltd | Inhibicion de rho quinasa mediada por arni para el tratamiento de trastornos oculares |
WO2007120533A2 (en) | 2006-03-30 | 2007-10-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Minigene expression cassette |
CN101979556B (zh) * | 2010-10-28 | 2015-01-21 | 百奥迈科生物技术有限公司 | 一种siRNA靶向分子及其应用 |
-
2011
- 2011-10-27 KR KR1020137013563A patent/KR101903778B1/ko active IP Right Grant
- 2011-10-27 DK DK16188642.9T patent/DK3124610T3/da active
- 2011-10-27 HU HUE16188642 patent/HUE044426T2/hu unknown
- 2011-10-27 WO PCT/CN2011/081386 patent/WO2012055362A1/en active Application Filing
- 2011-10-27 TR TR2019/08127T patent/TR201908127T4/tr unknown
- 2011-10-27 RS RS20190704A patent/RS58982B1/sr unknown
- 2011-10-27 RU RU2013124422A patent/RU2620966C2/ru active
- 2011-10-27 KR KR1020187027763A patent/KR20180110186A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-10-27 PT PT16188642T patent/PT3124610T/pt unknown
- 2011-10-27 CA CA2853613A patent/CA2853613C/en active Active
- 2011-10-27 PL PL16188642T patent/PL3124610T3/pl unknown
- 2011-10-27 EP EP16188642.9A patent/EP3124610B1/en active Active
- 2011-10-27 AU AU2011320437A patent/AU2011320437B2/en not_active Ceased
- 2011-10-27 EP EP11835635.1A patent/EP2633051B1/en not_active Not-in-force
- 2011-10-27 US US13/882,124 patent/US9080174B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-10-27 CN CN201180062884.8A patent/CN103370415B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-10-27 SI SI201131733T patent/SI3124610T1/sl unknown
- 2011-10-27 LT LTEP16188642.9T patent/LT3124610T/lt unknown
- 2011-10-27 ES ES16188642T patent/ES2730393T3/es active Active
- 2011-10-27 BR BR112013010525A patent/BR112013010525A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2015
- 2015-06-05 US US14/731,824 patent/US9410154B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2019
- 2019-05-31 HR HRP20190995TT patent/HRP20190995T1/hr unknown
- 2019-06-03 CY CY20191100583T patent/CY1121894T1/el unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101684478A (zh) * | 2009-06-26 | 2010-03-31 | 武汉大学 | 一种串联表达小干扰rna重组慢病毒载体的构建方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MARC等: "Specific Inhibition of HBV Replication In Vitro and In Vivo With Expressed Long Hairpin RNA", 《MOLECULAR THERAPY》 * |
WU KAI-LANG等: "Inhibition of Hepatitis B virus gene expression by single and dual small interfering RNA treatment", 《VIRUS RESEARCH》 * |
ZHI LI等: "Inhibition of HBV replication and gene expression in vitro and in vivo with a single AAV vector delivering two shRNA molecules", 《BMB REPORTS》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105002214A (zh) * | 2015-04-08 | 2015-10-28 | 许中伟 | 用于载体表达的复合多联gRNA和RNAi的表达框架 |
CN105002214B (zh) * | 2015-04-08 | 2018-07-17 | 许中伟 | 用于载体表达的复合多联gRNA和RNAi的表达框架 |
WO2018209848A1 (zh) * | 2017-05-19 | 2018-11-22 | 百奥迈科生物技术有限公司 | 抑制HBV的siRNA分子及其应用 |
CN108929870A (zh) * | 2017-05-19 | 2018-12-04 | 百奥迈科生物技术有限公司 | 抑制HBV的siRNA分子及其应用 |
CN108929870B (zh) * | 2017-05-19 | 2020-01-24 | 百奥迈科生物技术有限公司 | 抑制HBV的siRNA分子及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2012055362A1 (en) | 2012-05-03 |
BR112013010525A2 (pt) | 2016-08-02 |
RU2013124422A (ru) | 2014-12-10 |
PT3124610T (pt) | 2019-06-14 |
KR20140071949A (ko) | 2014-06-12 |
SI3124610T1 (sl) | 2019-08-30 |
EP2633051A1 (en) | 2013-09-04 |
ES2730393T3 (es) | 2019-11-11 |
KR101903778B1 (ko) | 2018-10-04 |
PL3124610T3 (pl) | 2019-09-30 |
CY1121894T1 (el) | 2020-10-14 |
RS58982B1 (sr) | 2019-08-30 |
HRP20190995T1 (hr) | 2019-08-09 |
US20130296401A1 (en) | 2013-11-07 |
EP3124610A1 (en) | 2017-02-01 |
LT3124610T (lt) | 2019-08-12 |
HUE044426T2 (hu) | 2019-10-28 |
EP3124610B1 (en) | 2019-03-06 |
DK3124610T3 (da) | 2019-06-11 |
CN103370415B (zh) | 2017-05-31 |
CA2853613A1 (en) | 2012-05-03 |
AU2011320437A1 (en) | 2013-06-13 |
US20150344885A1 (en) | 2015-12-03 |
AU2011320437B2 (en) | 2017-03-16 |
US9080174B2 (en) | 2015-07-14 |
KR20180110186A (ko) | 2018-10-08 |
EP2633051B1 (en) | 2016-09-14 |
CA2853613C (en) | 2020-03-24 |
EP2633051A4 (en) | 2014-04-23 |
RU2620966C2 (ru) | 2017-05-30 |
TR201908127T4 (tr) | 2019-06-21 |
US9410154B2 (en) | 2016-08-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103370415B (zh) | Hbv治疗 | |
US10093927B2 (en) | Reduction of off-target RNA interference toxicity | |
US9523093B2 (en) | Huntington's disease therapeutic compounds | |
AU2005222084B2 (en) | Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of RNAI agents | |
US20220010314A1 (en) | Rnai induced reduction of ataxin-3 for the treatment of spinocerebellar ataxia type 3 | |
US9790502B2 (en) | HBV treatment | |
KR102358280B1 (ko) | B형 간염 바이러스(hbv) 감염 처리용 시약 및 그 용도 | |
WO2012109798A1 (en) | Hbv treatment |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1185916 Country of ref document: HK |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1185916 Country of ref document: HK |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170531 Termination date: 20191027 |