CN103370133A

CN103370133A - 使用过滤和样品转移装置离析、积聚、表征和/或确定微生物的方法

Info

Publication number: CN103370133A
Application number: CN2011800677596A
Authority: CN
Inventors: 约翰·沃尔什; 琼斯·海曼; 克里斯托弗·S·龙西克
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: BR112013015141A2; CA2820355C; WO2012083150A2; EP2651561A2; EP2651561B1; AU2011343588B2; AU2011343588A1; CA2820355A1; ES2683032T3; US10335785B2; CN106238110B; AU2016200341A1; CN106238110A; CN103370133B; BR112013015141B1; WO2012083150A3; US20120156716A1; AU2016200341B2

Abstract

本发明涉及用于分离、积聚、表征和/或确定已知存在或可能存在测试样品中的微生物的方法、装置和成套仪器。本发明的方法包括可选择地裂解可能在测试样品中存在的非微生物细胞和/或微粒，随后是用于微生物的离析和/或积聚的后续的过滤步骤。在一个实施方案中，过滤和样品转移装置用于通过过滤离析和/或积聚微生物。一旦微生物已经被过滤以离析和/或积聚微生物，那么已离析的和/或已积聚的微生物可以被分析以获取用于所述微生物的表征和/或确定的测量结果。

Description

使用过滤和样品转移装置离析、积聚、表征和/或确定微生物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年12月17日提交的标题为“Methods for theIsolation,Accumulation,Characterization and/or Identification ofMicroorganisms using a Filtration and Sample Transfer Device”的美国临时专利申请第61/424,418号的权益，该美国临时专利申请并入本文。

发明领域

本发明涉及用于离析、积聚、表征和/或确定测试样品中的微生物的方法和装置。在一个方面，本发明涉及采用过滤和样品转移装置来用于离析、积聚、转移和随后表征和/或确定测试样品中的微生物的方法。在另一个方面，本发明涉及用于从样品离析、积聚和/或纯化微生物的方法和成套仪器。

发明背景

对生物流体中的病原性的微生物的检测应当在可能的最短的时间内进行，特别是在败血症的情况下，败血症的死亡率保持为高的，尽管有为医生可用的宽的范围的抗生素。生物活性剂例如微生物在患者的体液尤其是血液中的存在通常使用血液培养物瓶来确定。血液流感染与高发病率和死亡率相关联，而当前的诊断方法，即培养随后生物化学确定以及抗菌素敏感试验，可以耗费几日来进行。典型地，经验疗法基于临床症状而开始，并且测试结果仅影响当初始的疗法失败时的临床决定。在前几个小时内，优选地在阳性血液培养物结果之后的一个小时内，表征血液流感染的能力将很大地促进所提供的诊断信息的临床相关性。已经提出分子放大方法以填补这种需要，但是这种途径的严重的挑战仍然存在。阳性血液培养物肉汤自身代表微生物的自然地放大的种群，具有在多种快速确定（ID）测试中的潜在的用途。

传统的自动化表型ID测试例如

Phoenix^TM和系统或手动的表型测试例如API要求微生物应当在合适的生长阶段中并且没有干扰的介质和血液产品以提供高效的结果。这些系统使用在平板介质上从阳性肉汤生长18-24小时的菌落。然而，在获得更快的结果的努力中，某个实验室已经报道使用具有从阳性血液培养物瓶离析的微生物的这些系统。这些直接从瓶的测试不适合于所有的微生物（例如革兰氏阳性球菌），没有被测试制造商验证，并且通常耗费3-8小时以提供结果。迫切地需要更快的且更宽泛地专一性的测试以在前几个小时内，优选地在阳性培养物结果之后的一个小时内向医师提供临床上相关的结果。

质谱方法具有允许微生物的非常迅速的确定的潜力，但是可以遇到来自在液体微生物培养基中以及在临床样品例如血液中，或其组合中存在的很多化合物的干扰。最普遍地采用的用于直接地从阳性血液培养物肉汤回收微生物的方法是两步骤差速离心和在血清分离管中的离心。

其他用于微生物的分离、表征和/或确定的方法已经被描述，包括：

美国专利第6,177,266号公开了用于通过细胞蛋白质提取物或整个细胞的基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）分析产生的具有属、种和菌株专一性的生物标记物的细菌的化学分类学分类的方法。

在美国专利第7,070,739号中提出用于通过直接地从体液或均质化的组织二维超离心抽取、分离和纯化包含病毒的微生物的方法。在第一离心步骤中，除去具有高于待被确定的微生物的沉降速率的沉降速率的所有颗粒。在第二超离心步骤中，使用空间锯齿状的离心管，在填充的液体中使用等密度的成带以形成宽范围的密度梯度。根据该专利，分离技术可以用于通过使用对核酸专一性的染料的光散射或荧光来检测成带的颗粒，和用于通过对病毒蛋白质亚单位和完整的病毒颗粒的质谱法以及通过对核酸质量和由限制酶产生的碎片的质量的荧光流动细胞计数测定来回收非常小体积的成带颗粒用于表征。

EP0533912A描述了用于透析流体和尿液的样品预处理设备和方法。该专利申请描述了大孔径大小的预过滤器除去典型的尿沉积物例如血细胞、上皮细胞、蜕皮、黏液和晶体的用途。任何存在的细菌经过预过滤器并且被捕获在第二下游过滤器上。已捕获的细菌然后通过手动地拆开堆叠的设备来取得。

美国专利申请公布第2007/0175278号描述了使用液体培养基来培养关心的样品，包括例如血液、尿液、粪便、静脉内导管等等、工业生产线、水系统、食品产品、化妆品产品、药品产品和法医样品。随后，微生物可以通过本领域中已知的方法例如通过离心从液体介质收获。然后，可选择地在干燥之后，已浓缩的微生物可以被转移至载体材料，以获得振动光谱。该专利申请讨论各种用于确定和分类微生物的方法，包括振动光谱，例如拉曼光谱法。

然而，当试图从某些临床测试样品（例如复杂的样品，例如含有血液的培养基）分离和表征微生物时，这些方法具有若干缺点。在含有血液的培养基的情况下，所得到的微生物制剂经常含有污染的红血细胞、血小板、脂质颗粒、血浆酶和细胞碎屑，它们可以导致差的结果。这些方法还是非常劳动密集型的并且不安全的，这是由于可以导致潜在地危险的病原体向使用者的气溶胶暴露的步骤。

共转让的美国专利申请公布第2010/0120085号描述了用于分离、表征和/或确定测试样品中的微生物的方法。方法描述了样品制备程序，样品制备程序包括选择性裂解步骤和后续的分离步骤，用于从测试样品离析和纯化未知的微生物，以使用质谱法确定微生物。该申请还描述了使用过滤从测试样品离析和纯化未知的微生物。

据此，对与快速确定技术例如质谱法相容的用于从临床测试样品离析和/或积聚微生物的改进的样品制备方法、装置和/或成套仪器仍然存在需要。此外，对与用于确定微生物的快速的和自动化的技术相容的用于从多个临床测试样品同时离析和/或积聚多种微生物的改进的样品制备方法、装置和/或成套仪器仍然存在需要。本文描述的方法和装置生产微生物的清洁的已浓缩的样品，其对于例如通过质谱法的分析，尤其对于MALDI-TOFMS分析来说是最佳的。

发明概述

本发明提供用于样品中的微生物的离析、分离和/或积聚以用于后续的表征和/或确定的方法、装置和成套仪器（kit）。方法允许比现有技术更迅速表征和/或确定微生物，导致更快的诊断（例如在患有或怀疑患有败血症、脑膜炎或尿路感染的受试者中）和对被污染的材料（例如食品和药物）或水的确定。在本发明的方法中涉及的从获得样品至微生物的表征和/或确定的步骤，能够在非常短的时间帧内例如在小于约120分钟内进行，以产生临床上相关的可操作的信息。

在一个方面，本发明涉及从测试样品离析并且随后表征和/或确定微生物的方法，包括：

（a）获得已知含有或可能含有微生物的测试样品；

（b）可选择地裂解所述测试样品中的非微生物细胞和/或微粒，生产已裂解的样品；

（c）通过使用一体化过滤和样品转移装置过滤从所述测试样品或所述已裂解的样品的其他组分离析和积聚所述微生物；

（d）把所述已离析的微生物样品转移至适合于分析和/或询问所述已离析的并且已积聚的微生物样品的容器或载玻片；

（e）分析所述微生物的所述已离析的或已积聚的样品以获取所述微生物的表征和/或确定的测量结果；以及

（f）基于所获取的测量结果表征和/或确定所述已离析的并且已积聚的样品中的所述微生物。

在另一个方面，本发明涉及从血液培养物离析并且随后表征和/或确定微生物的方法，包括：

（a）从已知含有或可能含有微生物的血液培养物获得样品；

（b）可选择地裂解所述样品中的非微生物细胞和/或微粒以生产已裂解的样品；

（c）通过使用一体化过滤和样品转移装置过滤从所述已裂解的样品的其他组分离析和积聚所述微生物；

（d）把所述已离析的微生物样品转移至质谱法平板；

（e）通过质谱法分析所述微生物的所述已离析的并且已积聚的样品以获取所述微生物的质谱；以及

（f）通过所获取的质谱与基准质谱的比较来表征和/或确定所述已离析的并且已积聚的样品中的所述微生物。

在又一个方面，本发明涉及从尿液样本离析并且随后表征和/或确定微生物的方法，包括：

（a）获得已知含有或可能含有微生物的尿液的样品；

（b）可选择地裂解所述尿液样品中的非微生物细胞和/或微粒以生产已裂解的样品；

（c）通过使用一体化过滤和样品转移装置过滤从所述可选择地已裂解的样品的其他组分离析和积聚所述微生物；

在一个实施方案中，所述微生物的已离析的或已积聚的样品可以使用光谱询问，例如基于微生物的固有特征（例如内源荧光）或组成分子的振动结构（例如拉曼光谱法）来分析。在另一个实施方案中，已离析的或已积聚的微生物可以通过质谱法（例如MALDI-TOF-MS）来分析。

根据本发明的另一个实施方案，一体化过滤和样品转移装置可以包括中空的长形的主体（例如圆柱形的、六边形的、或相似形状的长形的中空的管），该中空的长形的主体具有设置有过滤材料（例如过滤膜）或被过滤材料（例如过滤膜）覆盖的第一端部或尖端，其中所述过滤材料被定位为毗邻于所述第一端部或尖端并且在所述第一端部或尖端外部；以及可操作为提供用于过滤的流体流动的第二端部。例如，第二端部可以适合于连接至真空系统、注射器、柱塞或相似的装置以产生真空。在另一个实施方案中，中空的圆柱形的主体包括由玻璃、塑料、金属、或其他相似的材料制造的长的并且窄的主体。在还另一个实施方案中，作为真空源的替代形式，过滤和样品转移装置可以使用内部装填的吸附剂来提供足够的毛细管作用和/或芯吸力以用于过滤和洗涤。例如，吸附剂可以通过提供用于流体流动的毛细管作用或芯吸力来提供被动过滤。

在另一个实施方案中，本发明还涉及一体化过滤和样品转移组件，包括：用于多个测试样品的离析和/或积聚并且用于将多个已离析的和/或已积聚的微生物同时转移至容器、载玻片或平板以用于分析所述已离析的或已积聚的微生物的多个一体化过滤和样品转移装置。

在又一个实施方案中，本发明还涉及两部件样品过滤和转移系统，其包括可操作为用于通过过滤来离析和/或积聚多个测试样品的微生物的过滤组件和可操作为用于将所述多个已离析的和/或已积聚的微生物同时转移至载玻片或平板以用于分析的转移组件。

在还另一个方面，本发明涉及用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的成套仪器，其包括，在被包装的组合中：

（a）可选择地，选择性裂解缓冲剂，其用于已知存在或可能存在于测试样品中的非微生物的选择性裂解；

（b）一体化过滤和样品转移装置，其中所述装置可操作为用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物，以及用于随后将微生物转移至容器、载玻片或平板，用于分析；以及

（c）至少一种洗涤流体或缓冲剂，其用于洗涤已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物样品。在一个实施方案中，一体化过滤和样品转移装置包括中空的长形形状的主体，该中空的长形形状的主体具有设置有过滤材料或被过滤材料覆盖的第一端部或尖端，其中所述过滤材料被定位为毗邻于所述第一端部或尖端并且在所述第一端部或尖端外部；以及可操作为提供用于过滤的流体流动的第二端部。

本发明在本文的附图和在下文提出的描述中更详细地解释。

附图简述

图1A示出了根据本发明的一体化过滤和样品转移装置的前视图。图2B示出了图1A中示出的一体化过滤和样品转移装置的横截面图。

图2A示出了根据本发明的一体化过滤和样品转移装置的第二设计构思的前视图。图2B示出了装置的横截面图，并且图2C示出了装置的第一端部的详细视图。

图3A示出了在图2中图示的一体化过滤和样品转移装置的分解图，并且图3B示出了装置的第一端部的详细视图。

图4示出了用于从多个测试样品离析和/或积聚微生物的过滤和样品转移组件的透视图。

图5示出了在图4中图示的过滤和样品转移组件的分解图。

图6示出了过滤组件的分解图，其包括两部件样品过滤和转移系统的第一部件。

图7示出了在图6中图示的过滤组件的透视图。

图8示出了在图6中图示的过滤组件的部分分解图。

图9A-D示出了根据本发明的转移组件的透视图。图9A示出了正被置于底部衬垫平板上的载玻片或平板的透视图。图9B示出了底部衬垫和载玻片或平板的透视图。图9C示出了与转移针块对准的底部衬垫的分解图。图9D示出了在转移针块的顶部并且与转移针块对准的底部衬垫平板位置的透视图。

图10示出了在图6中图示的过滤组件的顶部板的底部表面的仰视图。

图11示出了在图6中图示的过滤组件的顶部板、中部衬垫或带和顶部块的分解图。

图12示出了在图6中图示的过滤组件的顶部板、中部衬垫或带和顶部块的分解和横截面图。

图13示出了用图1的一体化过滤和样品转移装置帮助的包括裂解步骤、分离步骤和转移步骤的方法的示意图。

发明的详细描述

本发明可以以不同的形式实施并且不应当被理解为限于本文提出的实施方案。确切地说，这些实施方案被提供，使得本公开内容将是详尽的并且完整的，并且将向本领域的技术人员完全地传达本发明的范围。例如，关于一个实施方案所图示的特征可以被结合入其他实施方案中，并且关于一个特定的实施方案所图示的特征可以从该实施方案删除。此外，依据本公开内容，对于本文提出的实施方案的多种变化形式和增加对于本领域的技术人员将是明显的，其不偏离本发明。

除非另有定义，否则本文使用的所有的技术的和科学的术语具有与本发明属于的领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。在本文的发明的描述中使用的术语仅是为了描述具体的实施方案的目的并且不意图是对本发明的限制。

定义。

如本文所使用的，“一（a）”、“一（an）”或“该（the）”可以意指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可以意指单一的细胞或多个细胞。

还如本文所使用的，“和/或”是指并且包含相关联的列出的项目中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当被以选择形式（“或”）解释时组合的缺乏。

此外，如本文所使用的术语“约”当指代可测量的值，例如本发明的化合物或剂的量、剂量、时间、温度和类似物时，意指包含指定的量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。

如本文所使用的，术语“微生物”意图包含通常是单细胞的生物，其可以在实验室中繁殖和操纵，包括但不限于，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、寄生虫、和柔膜细菌。本发明的革兰氏阴性细菌的非限制性的实例包括以下的属的细菌：假单胞菌属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、肠杆菌属、克雷白氏杆菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、弯曲菌属、嗜血杆菌属、摩根氏菌属、弧菌属、耶尔森菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、短波单胞菌属、罗尔斯通菌属、无色杆菌属、梭杆菌属、普氏菌属、布兰汉氏球菌属、奈瑟氏菌属、伯克氏菌属、枸橼酸杆菌属、哈夫尼菌属、爱德华菌属、气单胞菌属、莫拉克斯氏菌属、布鲁氏菌、巴斯德菌属、普罗维登斯菌属和军团菌属。本发明的革兰氏阳性细菌的非限制性的实例包括以下的属的细菌：肠球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、芽胞杆菌属、类芽孢杆菌属、乳杆菌属、李斯特菌属、消化链球菌属、丙酸菌属、梭菌属、拟杆菌属、加德纳菌属、考克氏菌属、乳球菌属、明串珠菌属、微球菌属、分枝杆菌属和棒状杆菌属。本发明的酵母和霉菌的非限制性的实例包括以下的属的那些：假丝酵母属、隐球菌属、诺卡氏菌属、青霉菌属、链格孢属、红酵母属、曲霉属、镰刀菌属、酵母菌属和毛孢子菌属。本发明的寄生虫的非限制性的实例包括以下的属的那些：锥体虫属、巴倍虫属、利什曼原虫属、疟原虫属、吴策线虫属、布鲁格丝虫属、盘尾丝虫属、和纳氏虫属。本发明的柔膜细菌的非限制性的实例包括以下的属的那些：支原体和脲原体。

在一个实施方案中，如在本文中更详细地描述的，来自样品或生长介质的微生物可以被“分离”或“离析”并且随后被询问以表征和/或确定在样品中存在的微生物。如本文所使用的，术语“分离”意图包含任何已经被从其最初的状态或从生长介质或培养基除去、浓缩或以其他方式分开的微生物的样品。例如，根据本发明，可以将微生物从如果不以这种方式可能干扰表征和/或确定的非微生物或非微生物组分分离开（例如作为微生物的已分离的样品或物质（mass））。该术语可以包括被收集在固体表面（例如过滤膜）上的微生物的层。据此，已分离的微生物样品（或微生物的物质或薄膜）可以包括比最初的样品更浓缩或以其他方式从最初的样品分开的微生物和/或其组分的任何集合或层，并且可以范围从微生物的紧密地装填的高密度聚丛至微生物的扩散层。可以以分离的形式或样品被包括的微生物组分包括但不限于，以任何组合的纤毛、鞭毛、菌毛和囊泡。与微生物分离的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如血细胞和/或其他组织细胞）、尿管型或晶体和/或其任何组分。如本文所使用的，术语“离析”意图包含已经从其最初的状态被至少部分地纯化或从生长介质或培养基和其中含有的任何非微生物或非微生物组分至少部分地纯化出来的微生物的任何样品。例如，根据本发明，微生物可以被从如果不以这种方式可能干扰表征和/或确定的非微生物或非微生物组分离析出来（例如作为已离析的样品）。与微生物分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如血细胞和/或其他组织细胞）和/或其任何组分。

在一个实施方案中，如在本文中更详细地描述的，来自样品或生长介质的微生物可以被“积聚”或“捕获”在过滤材料（例如过滤膜）内或上，并且随后被询问以表征和/或确定在样品中存在的微生物。如本文所使用的，术语“积聚”或“捕获”意图包含已经被压缩或沉积入微生物的物质或膜中的微生物的任何样品。例如，可以通过过滤将来自样品的微生物压缩或沉积入过滤材料（例如过滤膜）上的物质或膜中。该术语包括在过滤（例如真空过滤）之后微生物（和/或其组分）在过滤材料（例如过滤膜）的表面上的集合。可以被包括在微生物的已压缩的或已沉积的物质中的微生物组分包括但不限于以任何组合的纤毛、鞭毛、菌毛和囊泡。根据本发明，微生物可以被压缩或沉积入物质（例如作为被实质上纯化的微生物物质）中，远离如果不以这种方式可能干扰微生物的表征和/或确定（例如通过质谱法）的非微生物或非微生物组分。与微生物离析或分离开的非微生物组分可以包括非微生物细胞（例如血细胞和/或其他组织细胞）和/或其任何组分。

如本文所使用的，术语“分析所述已离析的或已积聚的样品”意图包含所有的熟知的用于分析、询问、获得或以其他方式获取可以用于微生物（例如未知的微生物）的表征和/或确定的测量结果或数据的方法或手段。例如，微生物的已离析的或已积聚的物质可以通过光谱方法，例如基于微生物的固有特征（例如内源荧光）或组成分子的振动结构（例如拉曼光谱法）来分析或询问。在另一个实施方案中，微生物的已离析的或已积聚的物质可以通过质谱法方法（例如MALDI-TOF-MS）来分析或询问，以用于可以用于未知的微生物的表征和/或确定的测量结果或数据的获取，如在本文中更详细地讨论的。

本发明提供用于离析或分离微生物并且随后表征和/或确定样品中的微生物的方法。此外，对于从复杂的样品例如含有血液的培养基或尿液样品离析或分离微生物和随后表征和/或确定微生物，该方法可以是特别有用的。快速的方法还允许比现有技术更迅速地表征和/或确定微生物，导致更快的诊断（例如在患有或怀疑患有败血症、脑膜炎或尿路感染的受试者中）和对被污染的材料（例如食品和药物）或水的表征/确定。在本发明的方法中涉及的从获得样品至微生物的表征/确定的步骤，能够在非常短的时间帧中进行，以获得临床上相关的可操作的信息。在某些实施方案中，本发明的方法可以在小于约120分钟内，例如在小于约110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5分钟内进行。本发明的方法的极大的快速性代表相对于以前的方法的改进。方法可以用于表征和/或确定如本文描述的任何微生物。在一个实施方案中，微生物是细菌。在另一个实施方案中，微生物是酵母。在还另一个实施方案中，微生物是霉菌。在另外的实施方案中，微生物是寄生虫。在另一个实施方案中，微生物是柔膜细菌。此外，本发明的方法可以是完全自动化的，由此减少处理感染性材料和/或污染样品的风险。

样品

可以通过本发明的方法来测试的样品（即测试样品）包括怀疑或可能怀疑在其中微生物存在和/或生长的临床样品和非临床样品二者，以及被常规地或偶然地测试微生物的存在的材料的样品。被利用的样品的量可以由于方法的通用性和/或灵敏性而大大地变化。样品制备可以通过本领域的技术人员已知的许多技术来进行，虽然本发明的优点中的一个是，复杂的样品类型，例如血液、体液和/或其他不透明的物质，可以直接地利用系统来测试，而具有很少或没有大量的预处理。在一个实施方案中，从培养物取得样品。在另一个实施方案中，从微生物学培养物（例如血液培养物）取得样品。在另一个实施方案中，样品被怀疑含有或已知含有在其中的微生物。

可以被测试的临床样品包括任何类型的在临床的或研究实验室中典型地测试的样品，包括但不限于血液、血清、血浆、血液成分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓穿刺液、骨匀浆、痰、抽出物、药签和药签漂洗物、其他体液，和类似物。在另一个实施方案中，临床样品可以被培养，并且培养物样品可以被使用。

本发明在研究以及兽医的和医学的应用中得到应用。可以从其获得临床样品的合适的受试者通常是哺乳动物受试者，但是可以是任何动物。如本文所使用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿动物（例如大鼠或小鼠）等等。人受试者包括新生儿、婴儿、少年、成年人和老年病人受试者。可以从其获得样品的受试者包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼。

可以被测试的非临床样品还包括以下物质，所述物质包括但不限于食品、饮料、药物、化妆品、水（例如饮用水、非饮用水和废水）、海水压载、空气、土壤、污水、植物材料（例如种子、叶、茎、根、花、果）、血液产品（例如血小板、血清、血浆、白血球部分等等）、供体器官或组织样品、生物战样品，和类似物。方法还特别良好地适合于实时测试以在工业设置中监控污染水平、过程控制、品质控制和类似物。在另一个实施方案中，非临床样品可以被培养，并且培养物样品可以被使用。

在本发明的一个实施方案中，从患有或怀疑患有微生物感染的受试者（例如患者）获得样品。在一个实施方案中，受试者患有或怀疑患有败血症，例如菌血症或真菌血症。样品可以是直接地来自受试者的血液样品。样品可以是从患者的血液的样品生长的血液培养物，例如

血液培养物。血液培养物样品可以来自阳性血液培养物，例如指示微生物的存在的血液培养物。在某些实施方案中，在阳性血液培养物转变为阳性之后短时间内从阳性血液培养物取得样品，例如在约6小时内，例如在约5、4、3、或2小时内，或在约60分钟内，例如约55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5分钟。在一个实施方案中，从其中微生物在对数生长期中的培养物取得样品。在另一个实施方案中，从其中微生物在静止期中的培养物取得样品。

在某些实施方案中，为了帮助例如从吸附剂颗粒回收粘附性微生物的，可以使用熟知的用于含有吸附剂的样品的预处理步骤。例如，表面活性剂（例如Tween80）可以被加入并且样品可以被涡流。在其他实施方案中，样品还可以被声处理以破碎生物膜并且释放完整的微生物。实例包括结合于木炭颗粒的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

样品的体积应当大至足以生产微生物的已离析的和/或已积聚的样品或微生物的物质，其可以被分析或询问以获取用于在进行本发明的方法的分离/离析步骤之后所述微生物的表征和/或确定的测量结果。合适的体积将取决于样品的来源以及样品中的微生物的预期的水平。例如，阳性血液培养物将含有比待被测试污染的饮用水样品高的每体积微生物水平，所以与饮用水样品相比，可以需要较小体积的血液培养基。通常，样品大小可以是小于约50ml，例如小于约40、30、20、15、10、5、4、3、或2ml。在某些实施方案中，样品大小可以是约1ml，例如约0.75、0.5或0.25ml。在其中以微小规模进行分离的某些实施方案中，样品大小可以是小于约200μl，例如小于约150、100、50、25、20、15、10、或5μl。在某些实施方案中（例如当样品被预期包含少量的微生物时），样品大小可以是约100ml或更多，例如约250、500、750、或1000ml或更多。

可选择的裂解步骤

在某些实施方案中，在获得样品之后，本发明的方法中的下一个步骤是选择性地裂解或溶解可能在样品中存在的非期望的细胞和/或微粒，例如血细胞和/或组织细胞。细胞和/或微粒可以被裂解或溶解以允许分离和/或离析微生物与样品的其他成分。从其他成分分离和/或离析微生物防止在分析或询问步骤期间的干扰。如果不预期非微生物细胞在样品中存在或不预期非微生物细胞干扰询问步骤，那么可以不需要进行裂解步骤。在一个实施方案中，待被裂解的细胞是在样品中存在的非微生物细胞。典型地，可能在样品中存在的微生物细胞没有被裂解。然而，在某些实施方案中，具体类别的微生物的选择性裂解可以是期望的并且因此可以根据本文描述的并且如本领域中熟知的方法来进行。例如，一类非期望的微生物可以被选择性地裂解，例如酵母被裂解而细菌不被裂解，或反之亦然。在另一个实施方案中，期望的微生物被裂解以分离微生物的特定的亚细胞组分，例如细胞膜或细胞器。在一个实施方案中，所有的非微生物细胞被裂解。在其他实施方案中，非微生物细胞的一部分被裂解，例如足够的细胞被裂解，以防止干扰询问步骤。细胞的裂解可以使用本领域中已知的有效的任何方法来进行以选择性地裂解细胞，且裂解或不裂解微生物，包括但不限于裂解溶液的加入、声处理、渗透压休克、化学处理和/或其组合。

裂解溶液是能够裂解细胞例如非微生物细胞（例如通过增溶或溶解真核细胞膜）和/或微生物细胞的溶液。在一个实施方案中，裂解溶液可以包含一种或多种清洁剂（detergent），可选择地一种或多种酶，或一种或多种清洁剂和一种或多种酶的组合，并且还可以包含另外的剂。在一个实施方案中，清洁剂可以是非变性的裂解清洁剂，例如

X-100

X-100-R、X-114、NP-40、C-100、

X-100、

CA630、Arlasolve^TM200、

96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷和九乙二醇单十二烷基醚（C12E9，聚多卡醇）。可选择地，可以包括变性的裂解清洁剂，例如十二烷基硫酸钠、N-十二烷基肌氨酸、脱氧胆酸钠、胆汁盐、溴化十六烷基三甲铵、SB3-10、SB3-12、脒基磺基甜菜碱-14和C7BzO。可选择地，还可以包括增溶剂，例如

98、

58、35、

80、

20、L64、

P84、非清洁剂磺基甜菜碱类（NDSB201）、两亲高分子（PMAL-C8）和甲基-β-环糊精。典型地，非变性清洁剂和增溶剂以高于它们的临界胶团浓度（CMC）的浓度被使用，而变性的清洁剂可以低于它们的CMC的浓度被加入。例如，非变性的裂解清洁剂可以约0.010%至约10%的浓度被使用，例如约0.015%至约1.0%，例如约0.05%至约0.5%，例如约0.10%至约0.30%（在使用样品稀释之后的最终浓度）。在另一个实施方案中，包含通过醚键键合于疏水性烷烃或烯烃“尾部”基团的亲水性聚氧化乙烯“头部”基团的清洁剂可以是优选的。这些清洁剂通常使用形式C_xE_y的符号来指定，其中“x”等于烷烃或烯烃链中的碳的数量，并且“y”是聚氧化乙烯链中的氧化乙烯单体（CH₂CH₂O）的数量。其中x落入10-20的范围内并且y落入8-12的范围内的这种类型的清洁剂是优选的。甚至更优选的是其中x落入12-18的范围内并且y落入9-11的范围内的这种类型的清洁剂。例如，烷烃-聚氧化乙烯或烯烃-聚氧化乙烯清洁剂可以选自由

97、

96V、

C-100、

X-100、九乙二醇单十二烷基醚（聚多卡醇）或其组合组成的组。

可以在裂解溶液中使用的酶包括但不限于消化核酸和其他膜积垢材料的酶（例如蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、神经氨酸酶、多糖酶、

和

）。其他可以使用的添加剂包括但不限于还原剂，例如2-巯基乙醇（2-Me）或二硫苏糖醇（DTT）；和稳定剂，例如镁、丙酮酸盐和湿润剂。裂解溶液可以在适合于裂解期望的细胞并且将取决于多重因素的任何pH下被缓冲，多重因素包括但不限于样品的类型、待被裂解的细胞和所使用的清洁剂。在某些实施方案中，pH可以在约2至约13的范围内，例如约6至约13，例如约8至约13，例如约10至约13。合适的pH缓冲剂包括能够将pH保持在期望的范围内，例如约0.05M至约1.0M CAPS的任何缓冲剂。对于某些样品类型（例如尿液）来说，不想要的细胞和/或微粒的溶解的最优的pH可以是约2至约8。

在一个实施方案中，将样品和裂解溶液混合并且然后温育对于细胞膜的裂解和增溶来说足够的时间，例如约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、或60秒、或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20分钟或更长，例如约1秒至约20分钟、约1秒至约5分钟、或约1秒至约2分钟。在另一个实施方案中，将样品和裂解溶液温育约30秒至约5分钟或约1分钟至约3分钟。温育时间将取决于裂解溶液的强度，例如清洁剂和/或酶的浓度。通常，较温和的裂解缓冲剂将需要较多的时间和样品的较大的稀释以完全地增溶非微生物细胞。裂解溶液的强度可以基于已知在样品中或怀疑在样品中的微生物来选择。对于更易受裂解影响的微生物，可以使用温和的裂解溶液。裂解可以在约0℃至约60℃、约15℃至约40℃、约20℃至约40℃、或约30℃至约40℃的温度下发生。

在某些实施方案中，裂解条件（例如溶液或温育时间）以及分离和/或询问步骤可以足以杀死样品中的微生物中的某些或全部。本发明的方法是高度通用的并且不需要所有的微生物都是存活的以用于发生离析和确定。在某些实施方案中，微生物中的某些或全部可以是死的，其中死亡进行在方法的步骤之前、期间和/或之后发生。

在本发明的实践中涵盖的裂解缓冲剂的另外的细节和描述在于2009年10月30日提交的标题为“Methods for Isolation and Identification ofMicroorganisms”的待审的美国专利申请系列第12/589,929号（现在作为US2010/0129857Al公布）中公开，其内容通过引用并入本文。所涵盖的裂解缓冲剂的另外的细节和描述可以见于2009年10月30日提交的标题为“Methods for Separation,Characterization and/or Identification ofMicroorganisms using Mass Spectrometry”的待审的美国专利申请系列第12/589,936号（现在作为US2010/0120085Al公布），其内容通过引用并入本文。

典型地，在本发明的实践中，裂解步骤在容器（例如微型离心管）内进行。容器可以是具有足以容纳测试样品和可选择的裂解溶液的容积的任何容器。在一个实施方案中，容器可以是微型离心管。在另一个实施方案中，在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in theSeparation,Characterization and/or Identification of Microorganisms”的相关的美国专利申请系列第12/589,969号（现在作为US2010/0120133Al公布）中公开的分离装置可以在本发明的实践中使用。容器的容积可以是约0.1ml至约25ml，例如约1ml至约10ml，例如约2ml至约8ml。如果裂解步骤和后续的离析或分离步骤以微小规模进行，那么容器的容积可以是约2μl至约100μl，例如，约5μl至约50μl。容器可以具有附接的闭合装置或可以是有螺纹的以接受闭合装置（例如帽），使得容器可以在使用期间被密闭地密封。闭合物的存在减小操纵是或可能是感染性的和/或危害性的微生物的风险以及污染样品的风险。此外，本发明的方法的另一个可能的优点是在密封容器（例如被密闭地密封的容器）中使用微生物实施步骤中的一个或多个（例如裂解或过滤步骤）的能力。本发明的方法可以避免与高度毒性的微生物的操纵相关联的健康和安全性风险，例如当从样品回收微生物用于直接测试时发生的。

过滤和样品转移装置

如之前在本文的其他地方讨论的，本发明还涉及可操作为用于通过真空过滤从测试样品分离、捕获和积聚微生物以及随后将已捕获的并且已积聚的微生物（例如作为物质或膜）转移至测试载玻片或平板以进行微生物的分析或询问（例如通过质谱法）的过滤和样品转移装置。在一个实施方案中，过滤和样品转移装置包括具有中空的长形的主体（例如圆柱形的、六边形的、或相似形状的长形的中空的管）的一体化过滤和样品转移装置，中空的长形的主体具有设置有过滤材料（例如过滤膜）或被过滤材料（例如过滤膜）覆盖的第一端部或尖端以及适合于连接至真空系统或装置的第二端部。在优选的实施方案中，过滤材料（例如过滤膜）被定位为毗邻于一体化过滤和样品转移装置的第一端部或尖端并且从一体化过滤和样品转移装置的第一端部或尖端延伸。例如，过滤材料可以在长形的主体的第一端部或尖端外部（即从其延伸或突出）。本发明的申请人已经发现，从一体化过滤和样品转移装置的第一端部延伸或突出的过滤材料的使用允许任何已离析的和/或已积聚的微生物的转移，例如通过把样品涂抹或点涂在平板或载玻片上。

在一个实施方案中，中空的长形的主体由玻璃制造。在另一个实施方案中，中空的长形的主体由刚性的或半刚性的塑料材料制造，例如聚丙烯（PP）、聚碳酸酯（PC）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）或其他塑料材料。通常，一体化过滤和样品转移装置包括具有约0.5mm至约10mm、约1mm至约5mm、或约1.5mm至约3mm的过滤尖端直径的长形的大体上圆柱形的主体。在另一个实施方案中，圆柱体的圆筒可以外扩至甚至更大的直径以能够容纳甚至更大的体积的滤液。过滤和转移装置可以具有约2cm至约20cm、约3cm至约15cm、或约4cm至约10cm的长度。在一个实施方案中，一体化过滤和样品转移装置包括具有约1.5mm至约3mm的直径和约4cm至约10cm的长度的长形的圆柱形的主体。在另一个实施方案中，一体化过滤和样品转移装置包括具有约0.5cm³至约10cm³、约1cm³至约5cm³、或约1.5cm³至约3.5cm³的内部容积的长形的圆柱形的主体。在又一个实施方案中，一体化过滤和样品转移装置包括具有约1.5mm至约3mm的直径和约4cm至约10cm的长度（或约0.9cm³至约4.7cm³的容积）的长形的圆柱形的主体。

在一个实施方案中，一体化过滤和样品转移装置的中空的长形的圆柱形的管可以填充或装填有吸附剂。将吸收剂材料装填在膜后方在两个方式上是有帮助的。第一，其提供支撑部，支撑部允许膜略微地突出超出尖端，申请人已经发现这允许将微生物从过滤材料（例如过滤膜）更高效率地转移至载玻片或目标平板。第二，吸附剂在过滤和转移装置中的使用还允许已经经过过滤材料的溶解产物（即培养基和/或细胞材料）的吸附。此外，申请人已经发现装填材料提供在样品溶解产物和过滤膜之间的清楚的分离区域，由此防止溶解产物滤液在洗涤期间和之后与膜接触再次再混合，从而防止清洁的微生物的再污染。通常，可以使用任何已知的吸附剂材料。例如，在一个实施方案中，吸附剂可以是聚酯、玻璃或纤维素纤维或微粒材料。在另一个实施方案中，吸附剂可以是吸附树脂、硅胶、水凝胶、聚丙烯酸或聚丙烯酰胺衍生物、植物胶、分子筛、沸石或其他本领域的技术人员熟知的吸附剂。

根据本发明，一体化过滤和样品转移装置的第一端部或尖端设置有过滤材料（filter material）（或过滤材料（filtration material））或被过滤材料（filter material）（或过滤材料（filtration material））覆盖。例如，如在本文中其他地方讨论的，过滤材料（例如过滤膜）被定位为毗邻于一体化过滤和样品转移装置的第一端部或尖端并且从一体化过滤和样品转移装置的第一端部或尖端延伸。通常，具有保留微生物的至少某些部分并且允许溶解产物经过的孔径大小的任何过滤材料可以在本发明的实践中被使用。在本发明的实践中使用的过滤材料可以包括本领域中熟知的过滤膜或深度过滤器。在一个实施方案中，过滤膜将具有约0.1μm至约30.0μm或约0.1μm至约10.0μm或约0.1μm至约1.0μm的孔径大小。示例性的膜可以包括聚醚砜（PES）膜（例如，

200、450、

MachV（Pall-Gelman，华盛顿港，纽约州）、Millipore Express

（Millipore））。其他可能的过滤材料可以包括HT

（聚砜）、GN

（混合纤维素酯）、

（Nylon）、FP Verticel（PVDF），其全部来自Pall-Gelman（华盛顿港，纽约州），以及来自Whatman（肯特郡，英国）的Nuclepore（聚碳酸酯）。示例性的深度过滤器材料可以包括类型GF/F、GF/C和GMF150（玻璃纤维，Whatman）、

（玻璃纤维，Pall-Gelman）、AP15（玻璃纤维，Millipore）、以及多种纤维素、聚酯、聚丙烯或其他纤维或微粒过滤器，只要过滤介质可以保留足够的数量的目标微生物以能够实现分析。在另一个实施方案中，可以使用带电荷的或改性的微粒或纤维过滤材料，例如带ζ电荷的膜。

如上文描述的，与中空的长形的管的第一端部或尖端相对的中空的长形的管的第二端部可以被附接于真空源或真空系统，真空源或真空系统可操作为提供真空以用于过滤（即用于真空过滤）。通常，可以使用任何本领域中已知的用于把过滤和样品转移装置连接于真空系统的手段。例如，过滤和转移装置可以使用简单的真空管来连接于真空系统，如本领域中熟知的。

在还另一个实施方案中，过滤和样品转移装置还可以包括用于手动施加用于真空过滤的真空的挤球。挤球的使用还可以允许反冲洗技术的使用，以把足够的量的微生物转移至载玻片或平板以用于通过质谱法的分析，如本文其它地方描述的。在另一个实施方案中，注射器和柱塞可以用于产生真空。在还另一个实施方案中，一体化过滤和样品转移装置可以使用内部装填的吸附剂来提供足以用于过滤和洗涤的毛细管作用和/或芯吸力（即由此允许被动过滤）。

现在参照图1，示出了一体化过滤和样品转移装置的示例性的实施方案。图1图示了包括具有第一端部或尖端6和第二端部8的中空的长形的圆柱形的管或主体4的一体化过滤和样品转移装置2。第一端部或尖端6设置有过滤器或过滤材料9或被过滤器或过滤材料9覆盖，其操作以当真空或吸入被施加于一体化过滤和样品转移装置2时捕获或积聚微生物。在优选的实施方案中，过滤材料9毗邻于长形的圆柱形的管或主体4的第一端部或尖端6并且在长形的圆柱形的管或主体4的第一端部或尖端6外部（即从其延伸或从其突出）。第二端部8典型地被连接于真空源或系统（未示出）。在其他实施方案中，第二端部8可以设置有球或柱塞以提供用于过滤的吸入力或流体流动。还如所示的，在一个可能的实施方案中，中空的圆柱形形状的主体可以填充或装填有吸附剂10，如上文讨论的。根据本实施方案，吸附剂自身可以提供毛细管作用或芯吸力，毛细管作用或芯吸力提供用于过滤的流体流动。

另一个设计构思在图2-3中示例。图2-3图示了包括具有第一端部15和第二端部16的中空的长形的圆柱形的管或主体14的一体化过滤和样品转移装置12。第一端部15设置有过滤材料17或被过滤材料17覆盖，其操作以当真空或吸入被施加于一体化过滤和样品转移装置12时捕获或积聚微生物。在优选的实施方案中，过滤材料17毗邻于长形的圆柱形的管或主体14的第一端部或尖端15并且在长形的圆柱形的管或主体14的第一端部或尖端15外部（即从其延伸或从其突出）。一体化过滤和样品转移装置12的第一端部15还可以包括锥形的部分18和喇叭形的或扁平的尖端19。在其他实施方案中，第二端部16可以设置有球或柱塞以提供用于过滤的吸入力。还如所示的，在一个可能的实施方案中，中空的圆柱形形状的主体可以填充或装填有吸附剂10，如上文讨论的。根据本实施方案，吸附剂自身可以提供毛细管作用或芯吸力，毛细管作用或芯吸力提供用于过滤的流体流动。

在另一个实施方案中，本发明提供过滤和样品转移组件，过滤和样品转移组件包括用于多个测试样品的离析和/或积聚并且用于将多个已离析的和/或已积聚的微生物同时转移至容器、载玻片或平板以用于分析所述微生物的所述已离析的或已积聚的样品以获取用于所述微生物的表征和/或确定的测量结果的多个一体化过滤和样品转移装置。这样的装置在图4-5中示例。

如图4-5中示出的，过滤和样品转移组件20包括基部板22、顶部板24和被定位在顶部板24和所述基部板22之间并且把顶部板24与所述基部板22间隔开的一对竖直支撑棒26。顶部板24还包括一对轴承28，其允许顶部板在竖直平面中沿着支撑棒26“向上”和“向下”运动。

如所示的，过滤和样品转移组件20还可以包括一对基部轨道30和相应的一对支架导向杆32，其支撑具有用于容纳多个单独的管（例如微型离心管）38的多个孔36的支架组件34。如所示的，基部轨道30可以包括凹口40，凹口40支撑支架导向杆32并且允许支架导向杆32以及因此支架组件34在水平平面中相对于基部板22和基部轨道28滑动。还如所示的，支架组件34可以设置有允许使用者或技术人员把支架组件34在水平平面中，如由凹口40引导地，沿着基部轨道30往复地滑动的把手42。

此外，如图4-5中示出的，过滤和样品转移组件20还可以包括竖直轴线托架44和竖直台46，竖直台46使竖直轴线托架44能够沿着竖直台46“向上”和“向下”（即在竖直平面中）运动。这种竖直运动允许顶部板沿着支撑棒26“向上”和“向下”（即竖直地）运动。

顶部板24支撑真空组件50，真空组件50支撑多个一体化过滤和样品转移装置52并且向多个一体化过滤和样品转移装置52提供真空。如图4-5中示出的，真空组件50还可以包括水平定向的对准杆54，水平定向的对准杆54包括用于容纳多个可除去的一体化过滤和样品转移装置52的多个相等地间隔开的位置或洞56。如所示的，在一个实施方案中，对准杆54容纳或支撑多个（例如十二（12）个）一体化过滤和样品转移装置52。如所示的，一个或多个间隔柱（例如四（4）个）58可以用于把对准杆54与顶部板24间隔开或支撑对准杆54与顶部板24。

真空组件50还包括阀歧管60，阀歧管60包括多个阀62和配件64，多个阀62和配件64中的每个分别地支撑一体化过滤和样品转移装置52并且把一体化过滤和样品转移装置52连接于真空组件50。被支撑在阀歧管60上的每个单独的阀62和配件64分别地通过单独的真空管68连接于真空歧管66。真空歧管66经过主真空管70连接于真空系统（未示出）。

在操作中，从真空源（未示出）经过真空通道将真空提供至单独的一体化过滤和样品转移装置52中的每个。真空通道包括，从真空源串联的主真空管70和真空歧管66。从真空歧管66，真空通道连接于单独的真空通道并且向单独的真空通道供应真空，其中每个单独的真空通道包括，从真空源串联的单独的真空管68、阀62、阀歧管60、配件64、和最终地每个单独的一体化过滤和样品转移装置52。

在又一个设计构思中，本发明提供两部件样品过滤和转移系统。两部件样品过滤和转移系统包括用于通过过滤来离析和/或积聚多个测试样品（即含有或怀疑含有微生物的测试样品）的第一部件或过滤组件，和用于将微生物的多个已离析的和/或已积聚的样品同时转移至载玻片或平板以分析所述微生物的所述已离析的或已积聚的样品以获取用于所述微生物的表征和/或确定的测量结果的第二部件或转移组件。这样的装置在图6-9中示例。

根据本实施方案，两部件样品过滤和转移系统100包括第一部件或过滤组件102（见例如图6）和第二部件或转移组件104（见例如图9D）。如图6-12中示例的，两部件样品过滤和转移系统100可以包括48孔过滤组件102（图6）和相应的转移组件104（图9D），以把高至48个已过滤的样品（即已离析的和/或已积聚的微生物物质）转移至48孔载玻片或平板（例如48孔MALDI-TOF平板），用于高至48个单独的测试样品（即48个单独的已离析的和/或已积聚的微生物物质）的分析和后续的表征和/或确定。如本领域的技术人员将意识到的，其他孔配置是可能的并且被认为是本发明的一部分。

如图6-8中示出的，过滤组件102包括真空基部板106、底部衬垫块108和顶部块110。基部板106设置有真空配件120，用于附接把真空从真空源（未示出）提供至两部件样品过滤和转移系统100的真空引导部（例如真空管路）。过滤组件102还包括多个可除去的螺栓112和设置为穿过真空基部板106、底部衬垫块108和顶部块110的螺栓通孔114。螺栓112和螺栓通孔114允许过滤组件102在过滤之前和期间锁定或保持在一起。过滤组件102还设置有一对对准针116和对准通孔118，其允许在把组件102通过螺栓112锁定或保持在一起之前组装过滤组件102。如图6中示出的，对准通孔118，相似于螺栓通孔114，也被设置为穿过真空基部板106、底部衬垫块108和顶部块110。

过滤组件102还包括真空衬垫122，真空衬垫122提供在真空基部板106和底部衬垫块108之间的气密密封。

如图6中示出的，底部衬垫块108容纳包括在底部衬垫块108的顶部表面中的凹部的过滤空腔124并且容纳在其中的多个过滤通孔140。过滤空腔124在其中容纳下衬垫128和上衬垫130，下衬垫128和上衬垫130“夹住”过滤材料132（例如过滤膜）。相似于真空空腔124，下衬垫128和上衬垫130包括在其中的多个过滤通孔140，多个过滤通孔140相应于被容纳在过滤空腔124中的过滤通孔。如在图6中示例的，过滤空腔124、下衬垫128和上衬垫130可以包括48个相应的真空通孔140（再次地，其他样品孔配置是可能的并且被涵盖为本发明的一部分）。下衬垫128和上衬垫130响应于经过真空配件120和真空源（未示出）拉动的真空而提供气密密封，允许经过过滤材料的过滤。

顶部块110还可以包括中部衬垫或带136和顶部板138，如例如图6中所示的。相似于过滤空腔124、下衬垫128和上衬垫130，顶部块110、中部衬垫或带136和顶部板138包括多个洞或样品孔142，测试样品可以被加入多个洞或样品孔142中并且被过滤以用于其中含有的任何微生物的离析和/或积聚。多个洞或样品孔142中的每个相应于容纳在过滤空腔124、下衬垫128和上衬垫130中的真空通孔140中的每个或与真空通孔140中的每个对准。通过使用中部衬垫或带136，顶部块110和顶部板138可以两个单独的部件被制造并且然后使用中部衬垫或带136来组装，从而允许凹陷的流体流动通道（如图10-12中示出的）被制造在每个部件中。

如图10中示出的，顶部板138的底部表面180可以包括第一流体流动通道182。在图10和12中图示的第一流体流动通道182包括位于顶部板138的侧边缘中的入口184以及提供在入口184和设置在顶部板138中的多个单独的洞或样品孔142之间的流体连通的多个分布通道186。如在图12中更清楚地示出的，第一流体流动通道182导致或提供从入口184至由顶部块110、中部衬垫或带136和顶部板138形成的单独的洞或样品孔142的顶部边缘的流体流动。第一流体流动通道182可以用于把液体样品提供至单独的洞或样品孔，例如，样品孔142可以经由第一流体流动通道182（如例如由箭头188示出的）而被填充上裂解溶液或洗涤缓冲剂。

如图11中示出的，顶部块110的顶部表面190可以包括第二流体流动通道192。在图11-12中图示的第二流体流动通道包括多个离开通道194，多个离开通道194从多个单独的洞或样品孔142的底部通向容纳在顶部块110的顶部表面190中的多个分布通道196或将多个单独的洞或样品孔142的底部连接至容纳在顶部块110的顶部表面190中的多个分布通道196，多个分布通道196进而通向容纳在顶部块110的侧边缘中的离开口198。第二流体流动通道192可以用于从单独的样品孔142除去流体（如例如由箭头200示出的）。例如，如果孔中的一个或多个由于微生物在过滤材料上的积聚而成为被阻塞或堵塞，那么真空源可以被关闭，并且第二手段（例如第二真空）提供力或吸入以把过量的流体从样品孔142经过第二流体流动通道192抽出。

在操作中，多个测试样品（例如已裂解的血液培养物样品，根据本发明的一个可能的实施方案）可以经过过滤组件102过滤并且其中含有的微生物可以被离析和/或积聚在过滤材料132上。根据本实施方案，单独的测试样品（未示出）可以被加入单独的样品孔142中并且可以从真空源（未示出）经过真空配件120将真空施加于过滤组件102，以经过过滤材料132过滤溶解产物，由此把任何微生物离析和/或积聚至过滤材料132上。该过程可以使用设置在单独的洞或样品孔142中的每个中的不同的测试样品来重复，单独的洞或样品孔142设置在顶部块110中。

如图9A-9D中示出的，转移组件104包括转移针块150，转移针块150包括基部152、一对对准针154和多个转移针156。根据本实施方案，转移针156可操作为通过将过滤材料（例如过滤膜）稳固地压在载玻片或平板160上来把已离析的和/或已积聚的微生物物质转移至载玻片或平板160（例如MALDI-TOF平板），由此转移已离析的和/或已积聚的微生物。

将已离析的和/或已积聚的微生物转移至载玻片或平板160在图9A-9D中图示。在操作中，在过滤之后，从过滤组件102除去底部衬垫块108。从底部衬垫块108的真空空腔124除去上衬垫130，并且把载玻片或平板160（例如MALDI-TOF平板）放置入真空空腔中在过滤材料132的顶部上方（见图9A和9B）。为了提供把载玻片或平板160精确放置入真空空腔124中，把引导部162和唇部164设置在底部衬垫块108的顶部表面上。把载玻片或平板160与引导部162和唇部164对准确保容纳在载玻片或平板160的表面上的样品点166适当地与由通过设置在顶部块110中的单独的洞或样品孔142过滤单独的测试样品而产生的相应的微生物点（未示出）对准（即每个洞或样品孔142与相应的样品点166对准）。

然后，把底部衬垫块108、过滤材料132和载玻片或平板160转移至转移针块150并且使用对准针154和设置在底部衬垫块108中的对准通孔118在转移针块150的顶部上对准（见图9C）。对准针154和对准通孔118允许转移针156适当地与容纳在底部衬垫块108中的通孔140对准，并且因此允许串联的转移针、过滤材料132上的已离析的和/或已积聚的微生物和容纳在载玻片或平板160的表面上的相应的样品点166的适当的对准。

最后，可以通过本领域中已知的手段把转移针156压入过滤材料132和载玻片或平板160中，以把已离析的和/或已积聚的微生物（由通过相应的单独的洞或样品孔142中的一个或多个过滤单独的测试样品而产生的）转移至容纳在载玻片或平板160的表面上的相应的样品点166（见图9D）。随后，根据本发明，载玻片或平板160可以被分析或询问以获取用于所述微生物的表征和/或确定的测量结果。

分离、离析和/或积聚步骤

本发明的方法中的下一个步骤（例如在样品已经被裂解之后的步骤，如果进行裂解或溶解步骤的话）是分离、离析和/或积聚步骤。可以进行分离、离析和/或积聚步骤以从样品的其他组分（例如非微生物或其组分）分离和离析或纯化微生物并且把微生物积聚或捕获入物质中，物质可以被转移至质谱法载玻片或平板并且随后被询问以用于确定和/或表征目的。分离、离析和/或积聚不必须是完全的，即不要求发生100%分离。所有的被要求的是，从样品的其他组分分离、离析和/或积聚微生物足以允许微生物的分析或询问，而没有来自其他组分的很大的干扰。例如，分离/离析可以导致是至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、或99%纯或更高的已积聚的或已捕获的微生物物质。

在一个实施方案中，分离、离析和/或积聚步骤被作为过滤步骤进行，其中过滤和样品转移装置（如本文其他地方描述的）被放置入容器中的样品（例如已裂解的样品）中并且将真空施加于过滤和转移装置，这使微生物被分离、离析和/或积聚（例如微生物可以被积聚或捕获在过滤和转移装置的过滤材料（例如过滤膜）上），离开可能在样品中存在的其他组分。根据本实施方案，样品的其他组分（例如可能在样品介质中存在的非微生物或其组分）经过过滤器或过滤材料。据此，该过滤步骤把微生物离析、分离和/或积聚为离开样品中的材料，例如介质、细胞碎片和/或其他可能干扰微生物的分析或询问（例如通过质谱法）的组分。

据此，在一个实施方案中，本公开内容描述了新颖的通过过滤和样品转移装置帮助的用于快速地处理来自样品（例如阳性液体培养物）的微生物以用于微生物的表征和/或确定的方法。在一个实施方案中，方法涉及把微生物捕获和积聚在过滤材料上或中以及随后把已积聚的微生物转移至用于质谱分析的载玻片或目标平板。现在参照图13，示出了示例性的用于分离/离析、捕获和积聚、以及随后转移微生物用于质谱分析的方法。如图13中示出的，方法涉及以下步骤：（1）获得已知含有或可能含有微生物的测试样品（例如阳性血液培养物）（标记为步骤1）；（2）选择性地裂解测试样品中的非微生物细胞，由此生产已裂解的样品（步骤2）；（3）把过滤和样品转移装置（如本文其它地方描述的）浸没入已裂解的样品中（步骤3）；（4）把真空施加于过滤和样品转移装置，由此把已裂解的样品向上经过过滤器过滤，由此把微生物捕获在一体化过滤和转移装置的过滤材料上（步骤4）；（5）把过滤和转移装置转移至洗涤流体或缓冲剂，用于洗涤过滤器（步骤5）；（6）通过施加或推动过滤和转移装置中的真空，由此把洗涤流体或缓冲剂向上推动经过过滤器，来洗涤过滤器，并且因此洗涤任何被捕获在过滤材料上的微生物（步骤6）；（7）把过滤和转移装置转移至MALDI-TOF目标平板（在下文更详细地描述）（步骤7）；（8）把微生物沉积在MALDI-TOF目标平板的表面上（例如使用轻拍技术）（步骤8）；（9）把基质溶液加入平板上的微生物样品中（在下文更详细地描述）（步骤9）；以及（10）使用MALDI-TOF获取微生物样品的质谱（如下文描述的）（未示出）。

可选择的转移步骤

在过程的一个实施方案中，在把微生物积聚或捕获在过滤和转移装置的过滤材料（例如过滤膜）上之后，下一个步骤是把已积聚的微生物（即作为物质或膜）转移和沉积至载玻片或目标平板，用于分析和/或询问（例如通过质谱法）。根据本发明，过滤和样品转移装置，除了提供用于从测试样品捕获和积聚微生物的装置之外，还作为用于把微生物转移和施用至用于质谱法分析的载玻片或目标平板上的转移装置起作用。

在一个实施方案中，过滤和转移装置上的已积聚的微生物可以被应用或直接地沉积至容器、载玻片或目标平板内/上。根据本实施方案，过滤和转移装置可以被一次或多次轻拍（例如以向上和向下竖直方式）至容器、载玻片或目标平板内/上，以允许足够的量的微生物被转移至容器、载玻片或平板，用于分析。在某些情况下，将足够的微生物转移用于分析可能需要重复地轻拍。

在另一个实施方案中，过滤和转移装置上的已积聚的微生物可以使用反冲洗技术来应用或直接地沉积至载玻片或目标平板上。反冲洗技术涉及通过一体化过滤和转移装置施加温和的背压（例如使用挤球或折叠的管路）使得少量的液体从尖端流出。背压可以在把装置竖直地在容器、载玻片或目标平板内或上轻拍的同时被施加，直到足够的液体被释放以留下约1-2μl的反冲洗悬浮液，由此转移足够的量的微生物用于通过质谱法的分析。

在又一个实施方案中，过滤和转移装置上的已积聚的微生物可以使用涂抹技术来应用或直接地沉积至载玻片或目标平板上。涂抹技术涉及把装置的过滤材料一次或多次涂抹或擦拭经过载玻片或目标平板的表面，以允许足够的量的微生物被转移至载玻片或平板以用于质谱法分析。在某些情况下，把足够的微生物转移用于质谱法分析可能需要在载玻片或目标平板的表面上重复涂抹或擦拭装置。

分析、测量和/或询问步骤

一旦微生物已经被过滤（例如使用本文公开的过滤和样品转移装置）以用于未知的微生物的离析和/或积聚，那么已离析的和/或已积聚的微生物物质可以被分析以获取用于所述微生物的表征和/或确定的测量结果。在一个实施方案中，所述微生物的已离析的或已积聚的样品可以使用光谱询问，例如基于微生物的固有特征（例如内源荧光）或组成分子的振动结构（例如拉曼光谱法）来分析。在另一个实施方案中，已离析的或已积聚的微生物可以通过质谱法（例如，MALDI-TOF-MS）来分析。优选的用于获取用于所述微生物的表征和/或确定的测量结果的方法的另外的细节和描述可以在以下的共同待审的美国专利申请中找到：（1）系列第12/589,952号（现在作为US2010/0129858Al公布），于2009年10月30日提交，标题为“Methods for Separation,Characterization and/or Identification ofMicroorganisms using Spectroscopy”，其内容通过引用并入本文；（2）系列第12/589,976号（现在作为US2010/0156609Al公布），于2009年10月30日提交，标题为“Methods for Separation,Characterization and/orIdentification of Microorganisms using Raman Spectroscopy”，其内容通过引用并入本文；以及（3）系列第12/589,936号（现在作为US2010/0120085Al公布），于2009年10月30日提交，标题为“Methods for Separation,Characterization and/or Identification of Microorganisms using MassSpectrometry”，其内容通过引用并入本文。

在某些实施方案中，已离析的和/或已积聚的样品或微生物物质可以利用光谱方法来询问。在一个实施方案中，光学光谱方法可以用于分析微生物的一个或多个固有的性质，例如在不存在另外的剂例如染色剂、染料、结合剂等等时在微生物内存在的性质。在其他实施方案中，光学光谱方法可以用于分析微生物的一个或多个外在的性质，例如仅能够在另外的剂的辅助下检测到的性质。询问可以使用以下来进行：例如荧光光谱法、漫反射光谱法、红外光谱法、太赫兹光谱法、透射和吸收光谱法、拉曼光谱法，包括表面增强拉曼光谱法（SERS）、空间偏移拉曼光谱法（SORS）、透射拉曼光谱法、透射拉曼光谱法、和/或谐振拉曼光谱法。为了增强拉曼（SERS）和荧光信号，微生物可以在离心之前用金和/或银纳米粒子包覆，和/或内光学表面可以用具有特定的大小和形状的金属胶体预包覆（参考文献：对于荧光，Lakowicz，Anal.Biochem.337：171（2005）；对于SERS，Efrima等人，J.Phys.Chem.B.（Letter）702：5947（1998））。在一个实施方案中，已离析的和/或已积聚的样品或微生物物质被分析以获得对于未知的微生物的表征和/或确定有用的测量结果，同时样品或物质保留在过滤和/或样品转移装置内/上。在另一个实施方案中，如在本文中其他地方讨论的，样品或微生物物质可以在转移至容器、平板或载玻片之后被分析。

在其他实施方案中，在样品已经被过滤（例如使用过滤和样品转移装置，如本文其他地方公开的）之后，样品的一部分被转移至容器、平板或载玻片内/上，用于引入质谱仪中。高度吸收性的物质被沉积在样品（例如基质）的顶部；该材料具有关于用于电离样品的激光频率的非常高的光吸收系数（例如对于氮激光器，发射波长是337nm，所以吸收性材料在337nm的波长下将具有大的吸收系数）。在样品和吸收性物质已经干燥之后，平板被插入质谱仪中。在把样品泵送向下（即从样品除去大气气体使得其在10-5至10-7托的环境中）所需要的时间之后，样品被引入质谱仪的电离室中。使样品与系统对准。当实现最优的对准时，氮激光器被脉冲化。激光能量被基质吸收使其由于所沉积的高能量而从平板的表面烧蚀。作为副作用，微生物细胞的一部分也在过程中被蒸发和电离。这些离子通过在平板和向质谱仪的飞行管的入口之间的静电场的发生而被加速至已知的动能（即系统的这部分是质量/电荷鉴别器）。所有的单电荷的离子，与质量无关，将在向飞行管的入口处具有相同的动能，但是它们将具有与它们的质量成反比的速度。从那里，离子沿着飞行管向下朝向探测器运动，并且较轻的离子将在较重的离子之前到达（飞行管是质量/电荷鉴别器）。探测器在每当离子撞击探测器时产生一个电荷。探测器的输出被数字化并且输出在一个轴线上展示质量/电荷比率并且在另一个轴线上展示撞击的数量。在其他实施方案中，物质中的已转移的微生物可以使用质谱法技术来询问，例如MALDI-TOF质谱法、解吸电喷射离子化（DESI）质谱法、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法、电喷射离子化（ESI）质谱法和选择离子流动管（SIFT）光谱测定法。

在本发明的某些实施方案中，已离析的样品或物质中的微生物的表征和/或确定不需要涉及对精确的物种的确定。表征包括生物颗粒的宽泛的归类或分类以及单一物种的实际的确定。来自已离析的样品或物质的微生物的分类可以包括对于微生物的表型的、形态学的和/或新陈代谢的特征的确定。例如，生物颗粒的表征可以基于可观察的差异来实现，例如组成、形状、大小、成簇和/或新陈代谢。在某些实施方案中，关心的生物颗粒的分类可以不需要给定的生物颗粒的特征的以前的知识，而是仅需要与经验上的测量结果的一致的相关性，从而使这种方法是比基于专门的结合事件或新陈代谢反应的方法更通用的并且更容易地可适应的。如本文所使用的“确定”意指确定之前未知的微生物属于什么科、属、种和/或菌株。例如，确定之前的未知的微生物至科、属、种和/或菌株水平。

在某些情况下，表征包括提供对于待被采取的行动来说足够有用的信息的分类模型。所涵盖的分类模型的另外的细节和描述可以在于2009年10月30日提交的标题为“Methods for Separation,Characterization and/orIdentification of Microorganisms using Mass Spectrometry”的共同待审的美国专利申请系列第12/589,936号（现在作为US2010/0120085Al公布）中找到，其内容通过引用并入本文。如本文描述的，优选的分类模型包括分组为以下的中的一个或多个：（1）革兰氏组;（2）临床革兰氏组；（3）治疗组;以及（4）功能组。

成套仪器。

本发明还涉及用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的成套仪器。在其最简单的形式中，本发明的成套仪器将包括：（1）可选择地，用于已知存在或可能存在于测试样品中的非微生物的选择性裂解的裂解溶液或缓冲剂；（2）一体化过滤和样品转移装置（如本文其它地方描述的），其用于可能在测试样品中的微生物的离析、积聚和/或纯化并且用于微生物的后续的收获和转移；以及（3）至少一种洗涤流体或缓冲剂，其用于洗涤已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物样品。在成套仪器中使用的一体化过滤和样品转移装置在本文其他地方详细地描述。

可选择地，成套仪器可以包括选择性裂解溶液或缓冲剂以选择性地裂解或溶解可能在测试样品中存在的非期望的细胞和/或微粒，例如血细胞和/或组织细胞。细胞和/或微粒可以被裂解或溶解以允许从样品的其他成分分离和/或离析微生物。从其他成分分离和/或离析微生物防止在任何后续的直接测试应用期间的干扰，例如用于微生物的表征和/或确定（例如通过质谱法）或血液培养物肉汤上的宽范围微生物PCR的表现的分析或询问。然而，如果不预期非微生物细胞在样品中存在或不预期非微生物细胞干扰任何后续的测试，那么可以不需要进行裂解步骤。

典型地，选择性裂解溶液可以用于裂解或溶解可能在测试样品中存在的非微生物细胞。然而，在某些实施方案中，具体类别的微生物的选择性裂解可以是期望的并且因此可以根据本文描述的并且如本领域中熟知的方法来进行。例如，一类非期望的微生物可以被选择性地裂解，例如酵母被裂解而细菌不被裂解，或反之亦然。在另一个实施方案中，期望的微生物被裂解以分离微生物的特定的亚细胞组分，例如细胞膜或细胞器。在一个实施方案中，所有的非微生物细胞被裂解。在其他实施方案中，非微生物细胞的一部分被裂解，例如足够的细胞被裂解，以防止干扰询问步骤。细胞的裂解可以使用本领域中已知的有效的任何方法来进行以选择性地裂解细胞，且裂解或不裂解微生物，包括但不限于裂解溶液的加入、声处理、渗透压休克、化学处理和/或其组合。

裂解溶液是能够裂解细胞例如非微生物细胞（例如通过增溶或溶解真核细胞膜）和/或微生物细胞的溶液。在一个实施方案中，裂解溶液可以包含一种或多种清洁剂，可选择地一种或多种酶，或一种或多种清洁剂和一种或多种酶的组合，并且还可以包含另外的剂。在一个实施方案中，清洁剂可以是非变性的裂解清洁剂，例如

X-100、

X-100-R、

X-114、NP-40、C-100、

X-100、

CA630、Arlasolve^TM200、

98、

58、

35、

80、

20、

L64、

97、

96V、

C-100、

和）。其他可以使用的添加剂包括但不限于还原剂，例如2-巯基乙醇（2-Me）或二硫苏糖醇（DTT）；和稳定剂，例如镁、丙酮酸盐和湿润剂。裂解溶液可以在适合于裂解期望的细胞并且将取决于多重因素的任何pH下被缓冲，多重因素包括但不限于样品的类型、待被裂解的细胞和所使用的清洁剂。在某些实施方案中，pH可以在约2至约13的范围内，例如约6至约13，例如约8至约13，例如约10至约13。合适的pH缓冲剂包括能够将pH保持在期望的范围内，例如约0.05M至约1.0M CAPS的任何缓冲剂。对于某些样品类型（例如尿液）来说，不想要的细胞和/或微粒的溶解的最优的pH可以是约2至约8。

成套仪器还将包括用于洗涤过滤材料上的已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物或微生物物质的至少一种洗涤流体或缓冲剂。洗涤缓冲剂可以用于通过“洗涤”出可能在测试样品中存在的其他组分（例如介质、介质组分、细胞碎片、非微生物或其组分）来进一步分离、离析或纯化已积聚的或已捕获的微生物。如本领域的技术人员将容易地意识到的，洗涤缓冲剂的使用允许或帮助洗涤出（或经过过滤材料）介质、介质组分、细胞碎片、非微生物或其组分，它们如果不以这种方式可以干扰后续的测试（例如质谱分析）。洗涤缓冲剂还可以用于快速地中和裂解溶液的碱性的pH。通常，任何已知的洗涤流体或缓冲剂可以被包括在成套仪器中。例如，洗涤缓冲剂可以是蒸馏水。在另一个实施方案中，洗涤缓冲剂可以是能够保持适合于微生物的pH的pH缓冲剂，例如磷酸盐、MOPS或TRIS缓冲剂。例如，洗涤缓冲剂可以是0.01M至约0.2M磷酸盐溶液，pH6.0至7.5。

此外，成套仪器还可以包括过滤装置、真空源和/或真空接口。过滤装置可以适合于附接至真空源或真空系统，真空源或真空系统可操作为提供用于过滤的真空（即用于真空过滤）。通常，可以使用本领域中用于把过滤和样品转移装置连接于真空系统的任何已知手段。例如，过滤和转移装置可以使用简单的真空管来连接于真空系统，如本领域中熟知的。例如，成套仪器可以包括具有可重复使用的过滤器保持器的侧臂真空烧瓶（见图2-3，数字2）或具有滤液储器和多个可重复使用的过滤器保持器（见图3，数字6）的歧管（见图3，数字4）。在还其他实施方案中，成套仪器还可以包括另外的用于过滤的部件，例如成套仪器可以包括一个或多个管、夹持器、阀或真空阱。在另一个实施方案中，成套仪器可以包括一个或多个具有内置的过滤膜的一次性过滤装置。在这些一次性装置中，过滤可以通过真空源或通过离心驱动。

成套仪器还可以包括容器（例如管），在其内可以进行裂解步骤。容器可以是具有足以容纳测试样品和可选择的裂解溶液的容积的任何容器。在一个实施方案中，容器可以是管。在另一个实施方案中，在于2009年10月30日提交的标题为“Separation Device for Use in the Separation,Characterization and/or Identification of Microorganisms”的相关的美国专利申请系列第12/589,969号（现在作为US2010/0120133Al公布）中公开的分离装置可以包括在成套仪器中。容器的容积可以是约0.1ml至约25ml，例如约1ml至约10ml，例如约2ml至约8ml。如果裂解步骤和后续的离析或分离步骤以微小规模进行，那么容器的容积可以是约2μl至约100μl，例如，约5μl至约50μl。容器可以具有附接的闭合装置或可以是有螺纹的以接受闭合装置（例如帽），使得容器可以在使用期间被密闭地密封。闭合物的存在减小操纵是或可能是感染性的和/或危害性的微生物的风险以及污染样品的风险。例如，成套仪器可以容纳1至500个容器（例如管），在其内可以进行裂解步骤。在其他实施方案中，成套仪器可以容纳1至100、10至80或10至50个在其内可以进行裂解步骤的容器。在其他实施方案中，成套仪器可以容纳20、50、75或100个在其内可以进行裂解步骤的容器。

成套仪器还可以包括用于微生物的分析或询问（例如通过质谱法）的一个或多个测试载玻片或目标平板。根据本实施方案，一体化过滤和转移装置上的已积聚的微生物可以被应用或直接地沉积至测试载玻片或目标平板内/上以用于后续的测试。根据本实施方案，一体化过滤和转移装置上的已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物可以被转移或沉积（例如通过使用轻拍、反冲洗和/或涂抹技术）至载玻片或目标平板上以允许后续的测试和/或分析，如本文其他地方更详细地描述的。例如，成套仪器可以容纳1至500个测试载玻片或目标平板。在其他实施方案中，成套仪器可以容纳1至100、或10至80、或20至50个测试载玻片或目标平板。在其他实施方案中，成套仪器可以容纳20、50、75或100个测试载玻片或目标平板，用于后续的测试和/或分析。

通常，成套仪器可以被配置为处理任何数量的测试样品（即用于从任何特别的数量的测试样品离析、积聚和/或纯化微生物）。例如，成套仪器可以被配置为处理（离析、积聚和/或纯化微生物）约1至约1000个测试样品，约10至约500个测试样品或约10至约100个测试样品。在另一个实施方案中，成套仪器可以被配置为处理约10至约80个测试样品，约20至约60个测试样品或约50个测试样品。

在以下的实施例中进一步详细描述本发明，以下的实施例以例证的方式提供并且不意图以任何方式限制本发明。利用本领域中熟知的标准的技术或下文具体地描述的技术。

实施例

实施例1.使用一体化过滤和转移装置的裂解过滤-质谱法

使用在每个测试菌种的1.0ml悬浮液中的约40或400CFU的接种物把微生物“接种”入容纳10mL的人血液的

SA或SN瓶中。然后把已接种的测试样品通过倒置瓶子几次混合并且在

3DCombo柜中温育并且监控对瓶子内的微生物生长的检测。

把血液培养物培养基样品在由

3D微生物检测系统标记为阳性的几分钟内从瓶子除去。如果不立即处理瓶子，那么把其储存在2-8℃，并且然后在测试之前通过把瓶子放置在37℃水浴中5-15分钟把培养基升温至环境温度。如下处理阳性血液培养物培养基样品以把微生物从可以干扰后续分析的血液和介质组分分离：

（1）使用1mL注射器和18G针，把0.5mL的阳性培养基传递入清洁的1.5ml微离心管中；

（2）把0.25ml的裂解缓冲剂（0.45%w/v Brij-97+0.3M CAPS，pH11.7（0.2μm过滤，储存在2-8℃））加入培养基中，并且通过温和的吸入/分配混合5-6次，注意尽可能地避免气泡形成，并且把混合物在室温温育2:00至2:15分钟，由此产生已裂解的样品或溶解产物；

（3）在裂解温育之后，把一体化过滤和转移装置的尖端浸没入溶解产物中约3-5mm并且在室温真空吸气2:00至2:15分钟，当拉入液体时，调整一体化过滤和转移装置的深度以保持约3-5mm的深度；

（4）在把样品真空过滤2:00至2:15分钟之后，把过滤和转移装置运动至容纳第一洗涤溶液（Brij/盐水（0.45%w/v NaCl+0.05%Brij97））的容器，浸没，并且在室温真空吸气4:00至4:15分钟；

（5）在第一洗涤步骤之后，把过滤和转移装置运动至容纳第二洗涤溶液（去离子水）的第二容器，浸没在第一洗涤溶液中，并且在室温真空吸气4:00至4:15分钟；

（6）然后把已洗涤的微生物施用于MALDI-TOF目标平板上的一个或多个点，使用轻拍技术或重复竖直轻拍，或可选择地反冲洗，直到沉积了可见残留物或1-2μl的悬浮液；

（7）把各点干燥并且然后加入1μl的基质；

（8）在施用和干燥所有的对于给定的目标平板的样品之后，使用MALDI-TOF MS分析各点。

实施例2：使用包括膜滤器的一体化过滤和转移装置的裂解-过滤质谱法

把四十四（44）个微生物离析物生长，处理并且使用MALDI-TOF MS分析，如在实施例1中描述的，使用采用450（Pall-Gelman，华盛顿港，纽约州）作为过滤材料的一体化过滤和样品转移装置并且使用反冲洗技术把已积聚的微生物沉积至MALDI-TOF平板上。

在所有的微生物物种已经完全地干燥之后，对于每个物种，在AximaAssurance MALDI-TOF质谱仪（Shimadzu Biotech North America，马里兰州）上获取在2,000-34,000的质量/电荷范围内的MALDI-TOF质谱。

在获取每个质谱之后，把质量峰的表输入“Saramis”微生物确定软件（bioMerieux Inc.,USA）中，用于分析。该软件建立在在从琼脂生长的微生物收集的MALDI-TOF质谱数据库上。

下文的表1示出了使用由Supor450膜制造的一体化过滤和转移装置的ID结果。

表1-Supor450装置-反冲洗技术-SA瓶

ID置信度评级

4=99.9%

3=85-99.8%

2=种ID<85%，或属或科>85%

0=无ID

如表1中所示的，22/44（50%）以良好的置信度得到正确的ID，并且61%以至少某个水平得到确定。

虽然使用本实验的成功率不是完美的，但是表明这种构思是非常有希望的。选择了该组微生物是因为它们对于通过之前的离心方法直接地来自血液培养物的ID有挑战性的，并且因此提供严格的测试。

这些第一测试可能无法在所有的情况下提供强的ID的原因有很多。一种可能性是细胞质量不足，另一种可能性是所沉积的细胞纯度不足，或可能具有二者的组合。

如果细胞质量是问题，那么其他膜或甚至尚未研究的深度过滤器可以捕获更多数量的细胞。另一种可能性是增加捕获时间/体积从而积聚更大的质量。

实施例3：使用包括深度过滤器的一体化过滤和转移装置的裂解-过滤质谱法

把四十六（46）个微生物离析物生长、处理并且使用MALDI-TOF MS分析，如在实施例1中描述的，使用采用深度过滤器（Whatman GF/F过滤器（标称0.7微米）和Metrigard（Pall-Gelman）过滤器（标称0.5微米，具有丙烯酸结合剂））作为过滤材料代替膜的一体化过滤和样品转移装置。

仅用由Pall-Gelman Metrigard过滤器（标称0.5微米，具有丙烯酸结合剂）制造的一体化过滤和样品转移装置测试问题较多的培养样品中的几个，但是给出和GF/F过滤器一样好或比GF/F过滤器好的结果。

在获取每个质谱之后，把质量峰的表输入“Saramis”微生物确定软件（bioMerieux Inc.,USA）中，用于分析。该软件建立在从琼脂生长的微生物收集的MALDI-TOF质谱数据库上。

下文的表2示出了使用由Whatman GF/F过滤器或Pall-GelmanMetrigard过滤器制造的一体化过滤和转移装置的结果。

表2-经过深度过滤器型装置处理的在SA瓶中的已接种培养物

ID置信度评级

4=99.9%

3=85-99.8%

2=种ID<85%，或属或科>85%

0=无ID

ND=不确定

如表2中所示的，在SA瓶中生长并且经过由深度过滤器而非膜制造的过滤器装置处理的已接种培养物的结果。总体地，结果是非常良好的，并且类似于我们使用其他处理方法已经获得的最好结果。使用WhatmanGF/F过滤器（标称0.7微米）制造的装置给出对具有46个离析物中的43个（93.5%）的种级别（包括使用肺炎链球菌和白色念珠菌的典型的低分辨结果）的置信ID（>85%置信度），以及以较低的置信水平中给出对具有46个离析物中的45个（97.8%）的至少属或种的ID。

据此，深度过滤器的使用显示出相对于使用膜滤器的先前实验的改进。可能的是，在深度过滤器中可以捕获的更高的细胞数量贡献改进的结果，但是改进的洗涤也可以是一个因素。已捕获生物的革兰氏染色和/或细胞计数可以帮助辨别两种可能性。

另一种与先前测试的差异是MALDI-TOF获取程序在两个实验之间重新调整（如偶尔因为仪器/探测器老化而需要）。重新调整可能也将改善膜装置结果，但是将不单独地引起使用深度过滤器观察到的差异的幅度。

实施例4：使用包括具有容纳树脂的介质瓶的深度过滤器的一体化过滤和转移装置的裂解-过滤质谱法

把五十一（51）个微生物离析物生长、处理并且使用MALDI-TOF MS分析，使用采用

深度过滤器的一体化过滤和样品转移装置，如在实施例3中描述的，除了以下不同之外：a）已接种培养物在容纳具有树脂的有氧介质的瓶而非

SA瓶中生长，b）裂解缓冲剂具有以下组成（0.6%w/v Brij-97+0.4M CAPS，pH11.7），并且c）第一洗涤溶液具有以下组成（20mm磷酸钠、0.05%w/v Brij97、0.45%w/v NaCl，pH7.2）。

在所有的微生物物种已经完全地干燥之后，对于每一物种，在AximaAssurance MALDI-TOF质谱仪（Shimadzu Biotech North America，马里兰州）上获取在2,000-34,000的质量/电荷范围内的MALDI-TOF质谱。

在获取每个质谱之后，把质量峰的表输入“Saramis”微生物确定软件（bioMerieux Inc.,USA）中，用于分析。该软件建立从在琼脂生长的微生物收集的MALDI-TOF质谱数据库上。

下文的表3示出了来自在需氧的含有树脂的介质中生长的培养物的使用由Pall-Gelman Metrigard过滤器制造的一体化过滤和转移装置的ID结果。

表3-经过深度过滤器型装置处理的在有氧树脂介质瓶中的已接种培养物

ID置信度评级

4=99.9%

3=85-99.8%

2=种ID<85%，或属或科>85%

0=无ID

如表3中所示的，在含有树脂的瓶中生长并且经过由深度过滤器制造的过滤器装置处理的已接种培养物的结果是非常良好的。这些已处理的培养物给出具有51个离析物中的47个（92.2%）的对种级别（包括使用肺炎链球菌和白色念珠菌的典型的低分辨结果）的置信ID（>85%置信度）。

Claims

1.一种一体化过滤和样品转移装置，包括：

中空的长形形状的主体，其具有设置有过滤材料或被过滤材料覆盖的第一端部或尖端，其中所述过滤材料被定位为毗邻于所述第一端部或尖端并且在所述第一端部或尖端外部；以及

第二端部，其可操作为提供用于过滤的流体流动。

2.根据权利要求1所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述第二端部适合于连接至真空系统、注射器或柱塞以产生真空。

3.根据权利要求1或2所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述中空的长形的主体由刚性的或半刚性的塑料材料制造，所述刚性的或半刚性的塑料材料例如聚丙烯（PP）、聚碳酸酯（PC）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）或其他塑料材料。

4.根据权利要求1至3所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述中空的长形的主体包括具有约0.5mm至约10mm的直径和约2cm至约20cm的长度的长形的圆柱形的主体。

5.根据权利要求1至4所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述中空的长形的主体具有约0.5cm³至约10cm³的内部容积。

6.根据权利要求1至5所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述中空的长形的主体被吸附剂填充或装填，并且其中所述吸附剂通过提供用于流体流动的毛细管作用或芯吸力而提供被动过滤。

7.根据权利要求6所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述吸附剂选自由棉、聚酯、吸附树脂、硅胶、水凝胶、分子筛、沸石或其他吸附剂材料组成的组。

8.根据权利要求1至7所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述过滤材料具有约0.1μm至约10.0μm的孔径大小。

9.根据权利要求1至8所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述过滤材料选自由以下组成的组：聚醚砜（PES）膜（200、

450、

MachV（Pall-Gelman，华盛顿港，纽约州）、Millipore Express

（Millipore））、聚砜（HT

）、混合纤维素酯（GN

）、PVDF（

FP Verticel）、聚碳酸酯（Nuclepore）、选自由类型GF/F、GF/C和GMF150组成的组的深度过滤器材料（玻璃纤维，Whatman）、（玻璃纤维，Pall-Gelman）、AP15（玻璃纤维，Millipore）、以及多种纤维素、聚酯、聚丙烯或其他纤维和微粒过滤器，或其组合。

10.一种过滤和样品转移组件，包括：用于多个测试样品的离析和/或积聚并且用于将多个已离析的和/或已积聚的微生物同时转移至容器、载玻片或平板以用于分析所述已离析的或已积聚的微生物的权利要求1至9所述的多个一体化过滤和样品转移装置。

11.根据权利要求10所述的过滤和样品转移组件，其中所述组件还包括：

基部板和顶部板，所述顶部板与所述基部板间隔开，可选择地其中，设置有至少一个支撑棒，优选地被定位在所述顶部板和所述基部板之间并且把所述顶部板与所述基部板间隔开的一对竖直支撑棒；

支架组件，其具有用于容纳多个单独的管的多个孔，可选择地其中，所述支架组件通过一对基部轨道和相应的一对支架导向杆来支撑；

竖直轴线托架，其可选择地与竖直台相关联，所述竖直台是可操作的以允许所述竖直轴线托架可选择地沿着所述竖直台“向上”和“向下”运动，以提升和降低所述顶部板和所述多个一体化过滤和样品转移装置；以及

真空组件，其包括水平定向的对准杆以及具有与其相关联的多个阀和配件的阀歧管，所述水平定向的对准杆包含用于容纳多个可除去的根据权利要求1至9所述的一体化过滤和样品转移装置的多个洞或凹部，所述多个阀和配件中的每个分别地支撑所述一体化过滤和样品转移装置并且被连接于所述一体化过滤和样品转移装置。

12.一种两部件样品过滤和转移系统，包括：

过滤组件，其可操作为用于通过过滤来离析和/或积聚多个测试样品的微生物；以及

转移组件，其可操作为用于将所述多个已离析的和/或已积聚的微生物同时转移至载玻片或平板，用于分析。

13.根据权利要求12所述的两部件样品过滤和转移系统，其中所述过滤组件包括真空基部板、底部衬垫块和顶部块，并且所述顶部块还包括中部衬垫或带和顶部板，并且

其中所述顶部块和/或所述顶部板还包括流体流动通道。

14.根据权利要求12或13所述的两部件样品过滤和转移系统，其中所述转移组件还包括具有基部、一对对准针和多个转移针的转移针块。

15.一种用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物的成套仪器，包括，在被包装的组合中：

（b）权利要求1至9所述的一体化过滤和样品转移装置，其中所述装置可操作为用于从测试样品离析、积聚和/或纯化微生物，以及用于随后将微生物转移至容器、载玻片或平板，用于分析；以及

（c）至少一种洗涤流体或缓冲剂，其用于洗涤已离析的、已积聚的和/或已纯化的微生物样品；

可选择地，其中所述成套仪器被配置为处理约1至约500个测试样品。

16.根据权利要求15所述的成套仪器，其中所述成套仪器包括选择性裂解缓冲剂，并且其中所述选择性裂解缓冲剂包含一种或多种清洁剂。

17.根据权利要求15或16所述的成套仪器，其中所述过滤材料选自由以下组成的组：聚醚砜（PES）膜（例如，Express PLUS、

200、450、MachV（Pall-Gelman，华盛顿港，纽约州）、MilliporeExpress（Millipore））、HT

（聚砜）、GN

（混合纤维素酯）、

FP Verticel（PVDF）、Nuclepore（聚碳酸酯）、玻璃纤维类型GF/F、GF/C和GMF150、

AP15、GD/X组合过滤器（Whatman）、旋转过滤器（例如，VectaSpin，Whatman）、无注射器过滤器（例如，Mini-UniPrep，Whatman）、纤维素、聚酯、聚丙烯和其他纤维或微粒过滤器，或其组合。

18.根据权利要求15至17所述的成套仪器，其中所述洗涤流体或缓冲剂包含能够保持适合于微生物的pH的pH缓冲剂。

19.根据权利要求15所述的成套仪器，其中所述洗涤流体或缓冲剂选自由磷酸盐缓冲剂、MOPS和TRIS缓冲剂组成的组，和/或其中所述成套仪器还包括能够在其内进行裂解步骤的一个或多个容器。

20.根据权利要求15至19所述的成套仪器，其中所述成套仪器还包括用于通过质谱法进行分析的一个或多个测试载玻片或目标平板。

21.一种从测试样品离析和确定微生物的方法，包括：

（a）获得已知含有或可能含有微生物的测试样品；

（c）通过使用权利要求1至9所述的一体化过滤和样品转移装置过滤从所述测试样品或所述已裂解的样品的其他组分离析和积聚所述微生物；

（e）分析所述微生物的所述已离析的或已积聚的样品以获取用于所述微生物的表征和/或确定的测量结果；以及

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述分析步骤（e）选自由以下组成的组：荧光光谱法、漫反射光谱法、吸收和透射光谱法、红外光谱法、太赫兹光谱法、拉曼光谱法、表面增强拉曼光谱法、空间偏移拉曼光谱法、谐振拉曼光谱法、和其任何组合，优选地其中所述分析步骤（e）是通过质谱法进行的，并且其中所述质谱法选自由MALDI-TOF质谱法、解吸电喷射离子化（DESI）质谱法、气相色谱质谱法、液相色谱质谱法、电喷射离子化（ESI）质谱法和选择离子流动管（SIFT）光谱法组成的组。

23.根据权利要求21至22所述的方法，其中所述样品是临床或非临床样品，并且其中当所述样品是临床样品时，那么优选地其中所述临床样品选自由血液、血清、血浆、血液成分、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓穿刺液、骨匀浆、痰、抽出物、药签和药签漂洗物、体液、血液培养物样品和尿液样品组成的组。