ES2683032T3 - Métodos de aislamiento, acumulación, caracterización y/o identificación de microorganismos utilizando un dispositivo de filtración y transferencia de muestra, y dicho dispositivo - Google Patents

Abstract

Un dispositivo de filtración y transferencia de muestra integrado que comprende: un cuerpo alargado y hueco que tiene un primer extremo o punta que está provisto de, o tapado con, un material de filtración, en donde dicho material de filtración está situado adyacente a y sobresale de dicho primer extremo o punta; en donde dicho cuerpo alargado y hueco está lleno o taponado con un adsorbente para proporcionar soporte al material de filtración; y un segundo extremo operable para proporcionar flujo de fluido para la filtración.

Description

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DESCRIPCION

Metodos de aislamiento, acumulacion, caracterizacion y/o identificacion de microorganismos utilizando un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra, y dicho dispositivo

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos y dispositivos para aislar, acumular, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra de ensayo. En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo que hace uso de un dispositivo de filtracion y transferencia de muestras para el aislamiento, la acumulacion, la transferencia y la posterior caracterizacion y/o identificacion de microorganismos en una muestra de ensayo. En otro aspecto, la presente invencion se refiere a dispositivos para aislar, acumular y/o purificar microorganismos a partir de una muestra.

Antecedentes de la invencion

La deteccion de microorganismos patogenos en fluidos biologicos debe realizarse en el menor tiempo posible, en particular en el caso de la septicemia, cuya mortalidad sigue siendo elevada a pesar de la amplia gama de antibioticos disponibles para los medicos. La presencia de agentes biologicamente activos, tales como un microorganismo en el fluido corporal de un paciente, especialmente en la sangre, generalmente se determina utilizando frascos de hemocultivo. Las infecciones en el torrente sangumeo se asocian con una alta morbilidad y mortalidad y, sin embargo, los metodos de diagnostico actuales, cultivos seguidos por identificacion bioqmmica y pruebas de susceptibilidad a antibioticos, pueden tardar varios dfas en completarse. En general, la terapia emprnca se inicia en funcion de los smtomas clmicos, y los resultados de las pruebas solamente influyen sobre las decisiones de los facultativos cuando falla la terapia inicial. La capacidad para caracterizar infecciones en el torrente sangumeo en las primeras horas, preferiblemente no mas tarde de una hora despues de un resultado de hemocultivo positivo, aumentana significativamente la importancia clmica de la informacion de diagnostico proporcionada. Se han propuesto metodos de amplificacion molecular para satisfacer esta necesidad, pero subsisten serias dificultades con respecto a esta tecnica. El caldo de hemocultivo positivo representa en sf mismo una poblacion naturalmente amplificada de microorganismos con potencial para uso en una variedad de pruebas de identificacion (ID) rapidas.

Las pruebas de ID fenotfpicas automatizadas tradicionales, tales como los sistemas Vitek®, Phoenix™ y Microscan®, o las pruebas fenotfpicas manuales, tales como API, requieren que los microrganismos se encuentren en una fase de crecimiento adecuada y libres de la interferencia de productos del medio y de la sangre a fin de proporcionar resultados concluyentes. Estos sistemas emplean colonias que han crecido en caldo positivo durante 18-24 horas en medios para cultivo en placas. Sin embargo, en un esfuerzo por obtener resultados mas rapidos, algunos laboratorios han dado a conocer el uso de estos sistemas con microorganismos aislados a partir de frascos de hemocultivos positivos. Estas pruebas directas desde el frasco no son adecuadas para todos los microorganismos (por ej., cocos Gram-positivos), no estan validadas por los fabricantes de la prueba, y en general tardan 3-8 horas en dar resultados. Se necesitan con urgencia pruebas mas rapidas y mas espedficas a fin de proporcionar al medico los resultados clmicamente relevantes dentro de las primeras horas, preferiblemente dentro de la primera hora despues de un resultado de cultivo positivo.

Los metodos de espectrometna de masas tienen el potencial de permitir la identificacion de microrganismos muy rapidamente, pero pueden encontrar interferencia de muchos compuestos presentes en medios de cultivos microbiologicos lfquidos y en muestras clmicas, tales como sangre, o combinaciones de los mismos. Los metodos mas comunmente empleados para recuperar microorganismos directamente a partir del caldo de hemocultivo positivo son la centrifugacion diferencial de dos etapas y la centrifugacion en un tubo separador de suero.

Se han descrito otros metodos para la separacion, caracterizacion y/o identificacion de microorganismos, que incluyen:

La patente de EE.UU. N° 6.177.266 revela un metodo para la clasificacion quimiotaxonomica de bacterias con biomarcadores espedficos de genero, especie y cepa generados mediante analisis por espectrometna de masas por tiempo de vuelo y fuente de ionizacion/desorcion laser asistida por matriz (MALDI-TOF-MS por su version en ingles “matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry”) con extractos de protema celular o celulas completas.

En la patente de EE.UU. N° 7.070.739 se presenta un metodo para extraer, separar y purificar microbios que incluyen virus mediante ultra-centrifugacion bidimensional directamente a partir de fluidos corporales o tejido homogeneizado. En una primera etapa de centrifugacion, se separan todas las partmulas cuya velocidad de sedimentacion es mayor que las de los microbios a ser identificados. En la segunda etapa de ultracentrifugacion, se utiliza la banda isopmnica en lfquidos que se introducen para formar un gradiente de densidad de amplio rango, utilizando tubos centnfugos dentados especiales. Segun la patente, la tecnica de separacion puede emplearse para detectar partmulas en bandas mediante dispersion de luz o fluorescencia usando tintes espedficos de acidos nucleicos, y para recuperar las partmulas en bandas en volumenes muy pequenos para la caracterizacion por espectrometna de masas de subunidades de protemas virales y partmulas virales intactas, y por determinacion

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citometrica de flujo fluorescente tanto de la masa del acido nucleico como de las masas de fragmentos producidos por enzimas de restriccion.

EP0533912A describe un aparato de pretratamiento de muestras y un metodo para dializar fluido y orina. La solicitud de patente describe el uso de un pre-filtro de poros de gran tamano para separar sedimentos urinarios tipicos, tales como celulas sangumeas, celulas epiteliales, cilindros, mocos y cristales. Cualquier bacteria presente pasa a traves del pre-filtro y es capturada en un segundo filtro descendente. Posteriormente se tiene acceso a las bacterias capturadas desmontando manualmente del dispositivo.

La solicitud de patente de EE. UU. N° de Pub. 2007/0175278 describe el uso de un medio de cultivo lfquido para cultivar una muestra de interes, que incluye, por ejemplo, sangre, orina, heces, cateteres intravenosos, lmeas de produccion industrial, sistemas de aguas, un producto alimentario, un producto cosmetico, un producto farmaceutico, y una muestra forense. Posteriormente, los microorganismos pueden recolectarse del medio lfquido mediante metodos conocidos en la tecnica, por ej., por centrifugacion. Los microorganismos concentrados pueden transferirse despues al material portador, opcionalmente despues del secado, para obtener un espectro vibracional. La solicitud de patente describe varios metodos para identificar y clasificar microorganismos, que incluyen espectroscopia vibracional, tal como la espectroscopia Raman.

Sin embargo, estos metodos presentan varias desventajas cuando se intenta separar y caracterizar microorganismos a partir de algunas muestras de ensayos clmicos (por ej., muestras complejas tales como medios de cultivo que contienen sangre). En el caso de medios de cultivo que contienen sangre, las preparaciones microbianas resultantes a menudo contienen globulos rojos, plaquetas, partmulas de lfpidos, enzimas en plasma y desechos celulares contaminantes, que pueden producir resultados deficientes. Estos metodos son tambien muy laboriosos e inseguros debido a etapas que pueden dar como resultado la exposicion al aerosol de patogenos potencialmente peligrosos para el usuario.

La solicitud de patente de EE. UU. N° de Pub. 2010/0120085, del mismo cesionario que la presente, describe metodos para separar, caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra de ensayo. El metodo describe un procedimiento de preparacion de la muestra que comprende una etapa de lisis selectiva y una etapa subsiguiente de separacion para el aislamiento y la purificacion de un microorganismo desconocido a partir de una muestra de ensayo para la identificacion del microorganismo mediante espectrometna de masas. La solicitud tambien describe el uso de filtracion para el aislamiento y la purificacion de un microorganismo desconocido a partir de una muestra de ensayo.

La patente de EE.UU. N° 5833927A revela un dispositivo para capturar un componente presente en un fluido, en donde el dispositivo es una punta de pipeta que tiene un extremo posterior adaptado para ajustarse sobre una micro- pipeta, y un extremo anterior con una membrana, adaptado para unirse al componente, que se extiende a traves de la punta de pipeta.

La patente de EE.UU. N° 4999164 A revela un dispositivo de pipeteo que comprende un cono de retencion para sostener una punta de pipeta deslizante y una camara de piston, que se comunica con un pasaje del cono de retencion y contiene un piston redproco, que actua sobre la punta de pipeta que se ha ajustado en el cono de retencion. Se proporciona un filtro en el dispositivo que consiste en un filtro de retencion de aerosol que esta ensamblado en forma desmontable en una region que comprende el extremo inferior del dispositivo de pipeteo, incluyendo el cono de retencion, asf como la porcion de extremo mas alto de la punta de pipeta debajo del cono de retencion. El filtro puede disenarse de diversas formas y puede tener una accion de filtro progresivo. El filtro puede disponerse en el extremo mas bajo del cono de retencion o en la punta de pipeta o en un miembro interpuesto.

En consecuencia, subsiste la necesidad de metodos , dispositivos y/o kits de preparacion de muestras mejorados para el aislamiento y/o la acumulacion de microorganismos a partir de muestras de ensayos clmicos, que sean compatibles con tecnologfas de identificacion rapida tales como la espectrometna de masas. Ademas, subsiste la necesidad de metodos, dispositivos y/o equipos de preparacion de muestras mejorados para el aislamiento y/o la acumulacion simultaneos de una pluralidad de microorganismos de una pluralidad de muestras de ensayos clmicos, que sean compatibles con las tecnicas rapidas y automatizadas para la identificacion de microorganismos. Los metodos y dispositivos aqrn descritos producen una muestra limpia y concentrada de microorganismos que es optima para su analisis, por ejemplo, mediante espectrometna de masas, especialmente para el analisis MALDI- TOF-MS.

Compendio de la invencion

La presente invencion proporciona metodos y dispositivos de aislamiento, separacion y/o acumulacion para la subsiguiente caracterizacion y/o identificacion de microorganismos en una muestra. Los metodos permiten la caracterizacion y/o identificacion de microorganismos mas rapidamente que las tecnicas anteriores, con el resultado de diagnosticos mas rapidos (por ej., en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene septicemia, meningitis o una infeccion del tracto urinario) e identificacion mas rapida de materiales contaminados (por ej., alimentos o productos farmaceuticos) o agua. Las etapas implicadas en los metodos de la invencion, desde la obtencion de una muestra hasta la caracterizacion y/o identificacion de microorganismos, pueden llevarse a cabo en un marco de tiempo muy

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corto para producir informacion procesable clmicamente relevante, por ej., en menos de aproximadamente 120 minutos.

En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para aislar y posteriormente identificar un microorganismo en una muestra de ensayo, que comprende:

(a) proporcionar una muestra de ensayo que contiene a ciencia cierta o que puede contener microorganismos;

(b) opcionalmente lisar celulas y/o material en partfculas no microbiano en dicha muestra de ensayo produciendo una muestra lisada;

(c) aislar dichos microorganismos de otros componentes de dicha muestra de ensayo o de dicha muestra lisada, y acumularlos, mediante filtracion, utilizando un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que comprende:

un cuerpo hueco y de forma alargada que tiene un primer extremo o punta que esta provisto de, o tapado con, un material de filtracion, en el que dicho material de filtracion esta situado adyacente y sobresale de dicho primer extremo o punta, y en el que dicho cuerpo alargado hueco esta lleno o taponado con un adsorbente para proporcionar soporte al material de filtracion, y

un segundo extremo operable para proporcionar flujo de fluido para filtracion;

(d) transferir dicha muestra de microorganismos aislados a un recipiente o portaobjetos adecuado para analizar y/o escudrinar dicha muestra de microorganismos aislados y acumulados;

(e) analizar dicha muestra aislada o acumulada de dichos microorganismos para obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de dicho microorganismo; y

(f) caracterizar y/o identificar dichos microorganismos en dicha muestra aislada y acumulada en funcion de las mediciones obtenidas.

En este documento tambien se describe un metodo para aislar y posteriormente caracterizar y/o identificar un microorganismo en un hemocultivo, que comprende:

(a) obtener una muestra a partir de un hemocultivo que contiene a ciencia cierta o que puede contener microorganismos;

(b) opcionalmente lisar celulas y/o material en partfculas no microbiano en dicha muestra para producir una muestra lisada;

(c) aislar dichos microorganismos de otros componentes de la muestra lisada, y acumularlos, mediante filtracion, utilizando un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado;

(d) transferir dicha muestra de microorganismos aislados a una placa de espectrometna de masas;

(e) analizar dicha muestra aislada y acumulada de microorganismos por espectrometna de masas para obtener un espectro de masas de dichos microorganismos; y

(f) caracterizar y/o identificar dichos microorganismos en dicha muestra aislada y acumulada mediante comparacion del espectro de masas adquirido con espectros de masas de referencia.

Tambien se describe en este documento un metodo para aislar, y posteriormente caracterizar y/o identificar un microorganismo en una muestra de orina, que comprende:

(a) obtener una muestra de orina que contiene a ciencia cierta o que puede contener microorganismos;

(b) opcionalmente lisar celulas y/o material en partfculas no microbiano en dicha muestra de orina para producir una muestra lisada;

(c) aislar dichos microorganismos de otros componentes de la muestra opcionalmente lisada, y acumularlos, mediante filtracion, utilizando un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado;

(d) transferir dicha muestra de microorganismos aislados a un recipiente o portaobjetos adecuado para analizar y/o escudrinar dicha muestra de microorganismos aislada y acumulada;

(e) analizar dicha muestra de microorganismos aislados o acumulados para obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de dicho microorganismo; y

(f) caracterizar y/o identificar dichos microorganismos en la muestra aislada y acumulada en funcion de las mediciones adquiridas.

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La muestra aislada o acumulada de dichos microrganismos puede analizarse utilizando escudrinamiento espectroscopico, por ej., en base a caractensticas intrmsecas de los microorganismos (por ej., fluorescencia intrmseca) o la estructura vibracional de las moleculas constituyentes (por ej., espectroscopia Raman). En una realizacion de la invencion, los microorganismos aislados o acumulados pueden analizarse por espectrometna de masas (por ej., MALDI-TOF MS).

De acuerdo con otra realizacion de la invencion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado puede comprender un cuerpo alargado y hueco (por ej., un tubo alargado y hueco cilmdrico, hexagonal o de configuracion similar) que tiene un primer extremo o punta que comprende o esta provisto de un material de filtracion (por ej., una membrana de filtracion), en donde dicho material de filtracion esta colocado adyacente a y sobresale de dicho primer extremo o punta, en donde dicho cuerpo alargado hueco esta lleno de, o taponado con un adsorbente para proporcionar soporte al material de filtracion, y un segundo extremo que funciona proporcionando flujo de fluido para la filtracion. Por ejemplo, el segundo extremo puede estar destinado a la conexion con un sistema de vado, una jeringa, un embolo o dispositivo similar para generar un vado. El cuerpo cilmdrico hueco comprende un cuerpo largo y angosto y puede ser de vidrio, plastico, metal u otro material similar. En aun otra realizacion, como una alternativa a la fuente de vado, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra puede utilizar un adsorbente taponado internamente para proporcionar suficiente accion capilar y/o fuerza de succion para filtracion y lavado. Por ejemplo, el adsorbente puede proporcionar filtracion pasiva para proveer una accion capilar o fuerza de absorcion para el flujo de fluido.

En otra realizacion, la presente invencion tambien se refiere a una unidad de filtracion y transferencia de muestra integrada que comprende una pluralidad de dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados como se describe en el parrafo anterior con respecto al aislamiento y/o la acumulacion de una pluralidad de muestras de ensayo y para la transferencia simultanea de la pluralidad de microorganismos aislados y/o acumulados a un recipiente, portaobjetos o placa para analizar dichos microrganismos aislados o acumulados.

Aqu tambien se describe un sistema de filtracion y transferencia de muestra de dos partes que comprende una unidad de filtracion que funciona para el aislamiento y/o la acumulacion de microorganismos para una pluralidad de muestras de ensayo mediante filtracion, y una unidad de transferencia que funciona para la transferencia simultanea de dicha pluralidad de microorganismos aislados y/o acumulados a un portaobjetos o placa para su analisis.

Tambien se describe un kit para el aislamiento, la acumulacion y/o la purificacion de microorganismos a partir de una muestra de ensayo que comprende, en una combinacion concentrada:

(a) opcionalmente un tampon de lisis selectivo para la lisis selectiva de los no microorganismos que se sabe estan o pueden estar presentes en una muestra de ensayo;

(b) un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado en donde dicho dispositivo funciona para el aislamiento, la acumulacion y/o la purificacion de microorganismos de una muestra de ensayo, y para la subsiguiente transferencia de microorganismos a un recipiente, portaobjetos o placa para su analisis; y

(c) al menos un fluido o tampon de lavado para lavar la muestra de microorganismos aislados, acumulados y/o purificados. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado puede comprender un cuerpo alargado y hueco que tiene un primer extremo o punta que esta provisto de o tapado con un material de filtracion, en donde dicho material de filtracion es adyacente y externo a dicho primer extremo o punta, y un segundo extremo para proporcionar flujo de fluidos para filtracion.

La presente invencion se explica con mas detalle en las figuras que se adjuntan y la descripcion a continuacion. Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1A muestra una vista frontal de un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado, segun la presente invencion. La Figura 2B muestra una vista transversal del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que se muestra en la Figura 1A.

La Figura 2A muestra una vista frontal de un segundo concepto de diseno de un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado, segun la presente invencion. La Figura 2B muestra una vista transversal del dispositivo y la Figura 2C muestra una vista detallada de un primer extremo del dispositivo.

La Figura 3A muestra una vista en despiece ordenado del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que se ilustra en la Figura 2 y la Figura 3B muestra una vista detallada de un primer extremo del dispositivo.

La Figura 4 muestra una vista en perspectiva de una unidad de filtracion y transferencia de muestra para el aislamiento y/o la acumulacion de microorganismos en una pluralidad de muestras de ensayo.

La Figura 5 muestra una vista en despiece ordenado de la unidad de filtracion y transferencia de muestra que se ilustra en la Figura 4.

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La Figura 6 muestra una vista en despiece ordenado de una unidad de filtracion, que comprende la primera parte de un sistema de filtracion y transferencia de muestra de dos partes. Esto no se reivindica como parte de la presente invencion.

La Figura 7 muestra una vista en perspectiva de la unidad de filtracion ilustrada en la Figura 6. Esto no se reivindica como parte de la presente invencion.

La Figura 8 muestra una vista ampliada parcial de la unidad de filtracion ilustrada en la Figura 6. Esto no se reivindica como parte de la presente invencion.

Las Figuras 9A-D muestran vistas en perspectiva de una unidad de transferencia. Esto no se reivindica como parte de la presente invencion. La Figura 9A muestra una vista en perspectiva de un portaobjetos o placa que se pone sobre la placa de junta inferior. La Figura 9B muestra una vista en perspectiva de la junta inferior y el portaobjetos o placa. La Figura 9C muestra una vista ampliada de la junta inferior alineada con el bloque de pasadores de transferencia. La Figura 9D muestra una vista en perspectiva de la posicion de la placa de junta inferior en la parte superior del bloque de pasadores de transferencia y en alineamiento con el mismo.

La Figura 10 muestra una vista inferior de la superficie inferior de la placa superior de la unidad de filtracion ilustrada en la Figura 6. Esto no se reivindica como parte de la presente invencion.

La Figura 11 muestra una vista en despiece ordenado de la placa superior, junta o cinta intermedia y un bloque superior de la unidad de filtracion ilustrado en la Figura 6. Esto no se reivindica como parte de la presente invencion.

La Figura 12 muestra una vista en despiece ordenado y transversal de la placa superior, junta o cinta intermedia y un bloque superior de la unidad de filtracion ilustrada en la Figura 6. Esto no se reivindica como parte de la presente invencion.

La Figura 13 muestra una representacion esquematica de un metodo que comprende una etapa de lisis, una etapa de separacion y etapa de transferencia, facilitadas con el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de la Figura 1.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion puede comprender realizaciones diferentes y no debena interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas aqrn en la descripcion, sino que solamente esta limitada por las presentes reivindicaciones. Sin embargo, estas realizaciones en la descripcion se presentan aqrn para que esta divulgacion sea rigurosa y completa, y para trasladar completamente el alcance de la invencion a los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las caractensticas ilustradas con respecto a una realizacion pueden incorporarse en otras realizaciones, y las caractensticas ilustradas con respecto a una realizacion particular pueden eliminarse de esa realizacion siempre que se encuentren contempladas en el alcance de las presentes reivindicaciones. Ademas, numerosas variantes y adiciones a las realizaciones sugeridas aqrn resultaran evidentes para los expertos en la tecnica a la luz de la presente descripcion, las que no se desviaran de la presente invencion segun se la define en las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cienrtficos utilizados aqrn tienen el mismo significado que el entendido normalmente por un experto en la tecnica a la que pertenece la invencion. La terminologfa utilizada en la descripcion de la invencion pretende solamente describir las realizaciones particulares y no limitar la invencion.

Definiciones

Como se emplea aqrn, "un," "una," o "el", “la” pueden significar uno o mas de uno. Por ejemplo, "una" celula puede significar una sola celula o una multiplicidad de celulas.

Tambien como se emplea aqrn, "y/o" se refiere a e incluye cualquiera y la totalidad de las combinaciones posibles de uno o mas de los items asociados, asf como la ausencia de combinaciones cuando se interpreta como alternativa ("o").

Ademas, el termino “aproximadamente”, como se emplea aqrn al referirse a un valor mensurable como una cantidad de un compuesto o agente de esta invencion, dosis, tiempo, temperatura, y lo similar, incluira variaciones de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1 %, ± 0,5%, o aun ± 0,1 % de la cantidad especificada.

Como se emplea aqrn, el termino "microorganismo" pretende incluir organismos que son generalmente unicelulares, que pueden ser multiplicados y manipulados en el laboratorio, incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias Gram- positivas o Gram-negativas, levaduras, mohos, parasitos, y micoplasmas. Los ejemplos no restrictivos de bacterias Gram-negativas de esta invencion incluyen bacterias de los siguientes generos: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevundimonas, Ralstonia, Achromobacter, Fusobacterium, Prevotella, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Brucella,

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Pasteurella, Providencia, y Legionella. Los ejemplos no restrictivos de bacterias Gram-positivas de esta invencion incluyen bacterias de los siguientes generos: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Listeria, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria y Corynebacteria. Los ejemplos no restrictivos de levaduras y mohos de esta invencion incluyen los de los siguientes generos: Candida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaria, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces y Trichosporon. Los ejemplos no restrictivos de parasitos de esta invencion incluyen a aquellos de los siguientes generos: Trypanosoma, Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca, y Naegleria. Los ejemplos no restrictivos de Mollicutes de esta invencion incluyen a aquellos de los siguientes generos: Mycoplasma y Ureaplasma.

En una realizacion, como se describe con mas detalle aqrn, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento pueden ser “separados” o “aislados” y posteriormente escudrinados para caracterizar y/o identificar al microorganismo presente en la muestra. Como se emplea aqrn, con el termino "separar" se pretende abarcar cualquier muestra de microorganismos que ha sido retirada, concentrada o de otro modo apartada de su estado original, o de un medio de crecimiento o cultivo. Por ejemplo, segun esta invencion, los microorganismos pueden ser separados (por ej., como una muestra o masa separada de microorganismo) de los no microorganismos o los componentes no microbianos que pueden de otro modo interferir con la caracterizacion y/o identificacion. El termino puede incluir una capa de microorganismos recolectados sobre una superficie solida (por ej., una membrana de un filtro). Como tal, una muestra de microorganismos separada (o masa o pelmula delgada de microorganismos) puede incluir cualquier coleccion o capa de microorganismos y/o componentes de los mismos que esten mas concentrados, o de otro modo mas separados, que la muestra original, y puede variar desde un agregado denso y muy compacto de microorganismos hasta una capa difusa de microorganismos. Los componentes microbianos que pueden estar comprendidos en una forma o muestra separada incluyen, pero no se limitan a, pili, flagelos, fimbrias, y capsulas en cualquier combinacion. Los componentes no microbianos que son separados de los microorganismos pueden incluir celulas no microbianas (por ej., celulas sangumeas y/o celulas tisulares), cilindros o cristales urinarios y/o cualquier componente de los mismos. Como se emplea aqrn, con el termino "aislado" se pretende abarcar cualquier muestra de microorganismos que han sido al menos parcialmente purificados a partir de su estado original, o fuera de su medio de crecimiento o cultivo, y cualquier no microorganismo o componente no microbiano contenido en la misma. Por ejemplo, segun esta invencion, los microorganismos pueden ser aislados (por ej., como una muestra aislada) a partir de no microorganismos o componentes no microbianos que de otro modo pueden interferir con la caracterizacion y/o identificacion. Los componentes no microbianos que son separados de los microorganismos pueden incluir celulas no microbianas (por ej., celulas sangumeas y/o celulas tisulares) y/o cualquier componente de las mismas.

En una realizacion, como se describe en mas detalle aqrn, los microorganismos de una muestra o medio de crecimiento pueden ser “acumulados” o “capturados” en o sobre un material filtrante (por ej., una membrana filtrante), y posteriormente escudrinados para caracterizar y/o identificar al microorganismo presente en la muestra. Como se emplea aqrn, el termino "acumulado" o "capturado" comprende cualquier muestra de microorganismos que se ha comprimido o depositado en una masa o pelmula de microorganismos. Por ejemplo, los microorganismos de una muestra pueden ser comprimidos o depositados en una masa o pelmula sobre un material filtrante (por ej., una membrana filtrante) por filtracion. El termino incluye una coleccion de microorganismos (y/o componentes de los mismos) sobre la superficie de un material filtrante (por ej., una membrana filtrante) despues de la filtracion (por ej., filtracion al vacm). Los componentes de microorganismos que pueden estar comprendidos en masa comprimida o depositada de microorganismos incluyen, pero no se limitan a, pili, flagelos, fimbrias, y capsulas en cualquier combinacion. Segun esta invencion, los microorganismos pueden ser comprimidos o depositados en una masa (por ej., como una masa de microorganismos sustancialmente purificada), fuera de los no microorganismos o componentes no microbianos que pueden de otro modo interferir con la caracterizacion y/o identificacion del microorganismo (por ej., por espectrometna de masas). Los componentes no microbianos que se afslan o separan de los microorganismos pueden incluir celulas no microbianas (por ej., celulas sangumeas y/o celulas tisulares) y/o cualquier componente de las mismas.

Como se emplea aqrn, la expresion "analizar dicha muestra aislada o acumulada” pretende comprender todos los metodos o medios conocidos para analizar, escudrinar, obtener o adquirir de otro modo mediciones o datos que puedan utilizarse para la caracterizacion y/o identificacion de microorganismos (por ej., microorganismos desconocidos). Por ejemplo, una masa de microorganismos aislada o acumulada puede analizarse o examinarse por metodos espectroscopicos, por ej., en base a caractensticas intrmsecas de los microorganismos (por ej., fluorescencia intrmseca) o a la estructura vibracional de las moleculas constituyentes (por ej., espectroscopia Raman). En otra realizacion, una masa aislada o acumulada de microorganismos puede ser analizada o examinada por metodos de espectrometna de masas (por ej., MALDI-TOF-MS) para obtener mediciones o datos que pueden utilizarse para la caracterizacion y/o identificacion de microorganismos desconocidos, como se describen con mas detalle aquf

La presente invencion proporciona metodos para aislar o separar microorganismos, y subsiguientemente caracterizar y/o identificar microorganismos en una muestra. Mas aun, el metodo puede ser particularmente util para el aislamiento o la separacion y la subsiguiente caracterizacion y/o identificacion de microorganismos en muestras complejas, como muestras de orina o medios de cultivo que contienen sangre. Los metodos rapidos tambien permiten la caracterizacion y/o identificacion de microorganismos mas rapidamente que las tecnicas anteriores, y

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dan como resultado diagnosticos mas veloces (por ej., en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene septicemia, meningitis o una infeccion del tracto urinario) y la caracterizacion/identificacion de materiales contaminados (por ej., alimentos y productos farmaceuticos) o agua. Las etapas comprendidas por los metodos de la invencion, desde la obtencion de una muestra hasta la caracterizacion/identificacion de los microorganismos, pueden llevarse a cabo en un lapso de tiempo muy corto para obtener informacion procesable clmicamente relevante. En ciertas realizaciones, los metodos de la invencion pueden llevarse a cabo en menos de aproximadamente 120 minutos, por ej., en menos de aproximadamente 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5 minutos. La tremenda rapidez de los metodos de la invencion representa una mejora con respecto a los metodos previos. Los metodos pueden utilizarse para caracterizar y/o identificar cualquier microorganismo como el descrito aqrn. En una realizacion, el microorganismo es una bacteria. En otra realizacion, el microorganismo es una levadura. En aun otra realizacion, el microorganismo es un moho. En una realizacion adicional, el microorganismo es un parasito. En otra realizacion, el microorganismo es un micoplasma. Ademas, los metodos de la invencion pueden ser totalmente automatizados, con lo que se reduce el riesgo de manipular materiales infecciosos y/o contaminar las muestras.

Muestras

Las muestras que pueden someterse a ensayo (es decir, una muestra de ensayo) por los metodos de la invencion incluyen muestras tanto clmicas como no clmicas, en donde se sospecha o puede sospecharse la presencia y/o crecimiento de microrganismos, asf como tambien muestras de materiales que son rutinaria u ocasionalmente sometidos a ensayo con respecto a la presencia de microorganismos. La cantidad de muestra utilizada puede variar ampliamente debido a la versatilidad y/o sensibilidad del metodo. La preparacion de la muestra puede llevarse a cabo mediante cualquier numero de tecnicas conocidas por los expertos aunque una de las ventajas de la presente invencion es que los tipos de muestras complejas, como, por ej., sangre, fluidos corporales y/u otras sustancias opacas, pueden someterse a ensayo directamente utilizando el sistema con poco o ningun pretratamiento exhaustivo. En una realizacion, la muestra se toma a partir de un cultivo. En otra realizacion, la muestra se toma a partir de un cultivo microbiologico (por ej., un hemocultivo). En otra realizacion, se sospecha o se sabe que la muestra contiene microorganismos.

Las muestras clmicas que pueden analizarse incluyen cualquier tipo de muestra generalmente analizada en laboratorios clmicos o de investigacion, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, plasma, fracciones sangumeas, fluido articular, orina, semen, saliva, heces, fluido cerebroespinal, contenidos gastricos, secreciones vaginales, secreciones vaginales, homogeneizados tisulares, aspirados de medula osea, homogeneizados oseos, esputos, aspirados, hisopados y enjuagues de hisopados, otros fluidos corporales, y lo similar. En otra realizacion, se puede cultivar la muestra clmica, y se puede emplear la muestra del cultivo.

La presente invencion resulta util en la investigacion asf como en aplicaciones veterinarias y medicas. Los sujetos adecuados de los que pueden obtenerse muestras clmicas son generalmente sujetos mairnferos, pero puede ser cualquier animal. El termino "mamffero" como se emplea aqrn incluye, pero no se limita a, humanos, primates no humanos, ganado vacuno, ovejas, cabras, cerdos, caballos, gatos, perros, conejos, roedores (por ej., ratas o ratones), etc. Los sujetos humanos incluyen neonatos, ninos, jovenes, adultos y sujetos geriatricos. Los sujetos de los que pueden obtenerse muestras incluyen, sin limitarse a ello, mamfferos, pajaros, reptiles, anfibios y peces.

Las muestras no clmicas que pueden analizarse tambien incluyen sustancias, que comprenden, pero no se limitan a, productos alimenticios, bebidas, productos farmaceuticos, cosmeticos, agua (por ej., agua potable, agua no potable, y agua residual), lastres de agua marina, aire, suelo, aguas cloacales, material vegetal (por ej., semillas, hojas, tallos, rafces, flores, frutos), productos sangumeos (por ej., plaquetas, suero, plasma, fracciones de globulos blancos, etc.), muestras de organos o tejidos de donantes, muestras de armas bacteriologicas, y similares. El metodo es tambien particularmente muy adecuado para ensayos en tiempo real para supervisar los niveles de contaminacion, control de procesos, control de calidad, y lo similar en instalaciones industriales. En otra realizacion, se puede cultivar la muestra no clmica, y se puede emplear una muestra de cultivo.

En una realizacion de la invencion, se obtienen muestras de un sujeto (por ej., un paciente) que tiene o se sospecha que tiene una infeccion microbiana. En una realizacion, el sujeto tiene o se sospecha que tiene septicemia, por ej., bacteriemia o fungemia. La muestra puede ser una muestra de sangre obtenida directamente del sujeto. La muestra puede ser obtenida a partir de un hemocultivo desarrollado a partir de una muestra de sangre del paciente, por ej., un hemocultivo BacT/ALERT®. La muestra de hemocultivo puede obtenerse a partir de un hemocultivo positivo, por ej., un hemocultivo que indica la presencia de un microorganismo. En ciertas realizaciones, la muestra se toma a partir de un hemocultivo positivo poco tiempo despues de que aparezca como positivo, por ej., dentro de aproximadamente 6 horas, por ej., dentro de aproximadamente 5, 4, 3, o 2 horas, o dentro de aproximadamente 60 minutos, por ej., aproximadamente 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 minutos. En una realizacion, la muestra se toma a partir de un cultivo en donde los microorganismos estan en crecimiento en fase logantmica. En otra realizacion, la muestra se toma a partir de un cultivo en donde los microorganismos estan en una fase estacionaria.

En alguna realizacion, para asistir a la recuperacion de microorganismos adherentes, por ej., a partir de partmulas adsorbentes, pueden emplearse las etapas de pretratamiento bien conocidas para muestras que contienen adsorbentes. Por ejemplo, puede agregarse un tensioactivo (por ej., Tween 80) y la muestra puede agitarse en

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vortice. En otras realizaciones, la muestra puede tambien someterse a sonicacion para romper las biopelfculas y liberar los microorganismos intactos. Los ejemplos incluyen S. aureus unido a partfculas de carbon vegetal.

El volumen de la muestra debena ser suficientemente grande para producir una muestra aislada y/o acumulada de microorganismos o una masa de microorganismos que se puede analizar y examinar para obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de dicho microorganismo despues de llevar a cabo la etapa de separacion/aislamiento de los metodos de la invencion. Los volumenes adecuados dependeran de la fuente de la muestra y el nivel anticipado de microorganismos en la muestra. Por ejemplo, un hemocultivo positivo contendra un nivel mas alto de microorganismos por volumen que una muestra de agua potable a ser examinada con respecto a contaminacion, de modo que puede ser necesario un volumen menor de medio de hemocultivo cuando se compara con la muestra de agua potable. En general, el tamano de muestra puede ser menor a aproximadamente 50 ml, por ej., menor a aproximadamente 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, o 2 ml. En ciertas realizaciones, el tamano de muestra puede ser de aproximadamente 1 ml, por ej., aproximadamente 0,75, 0,5, o 0,25 ml. En ciertas realizaciones en donde la separacion se realiza a microescala, el tamano de muestra puede ser menor a aproximadamente 200 pl, por ej., menor a aproximadamente 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10, o 5 pl. En algunas realizaciones (por ej., cuando se espera que la muestra comprenda un numero pequeno de microorganismos), el tamano de muestra puede ser de aproximadamente 100 ml o mas, por ej., aproximadamente 250,500, 750, o 1000 ml o mas.

Etapa de lisis opcional

En algunas realizaciones, despues de obtener una muestra, la proxima etapa en el metodo de la presente invencion es lisar o disolver selectivamente las celulas y/o material en partfculas no deseados que pueden estar presentes en la muestra, por ej., celulas sangumeas y/o celulas tisulares. Las celulas y/o material en partfculas pueden ser lisados o disueltos para permitir la separacion y/o aislamiento de microorganismos de otros componentes de la muestra. La separacion y/o aislamiento de microorganismos de otros componentes impide la interferencia durante la etapa de analisis o escudrinamiento. Si no se espera que haya celulas no microbianas presentes en la muestra o no se espera que interfieran con la etapa de examen, la etapa de lisis puede no ser necesaria. En una realizacion, las celulas a ser lisadas son celulas no microbianas que estan presentes en la muestra. Tfpicamente, las celulas no microbianas que pueden estar presentes en la muestra son lisadas. Sin embargo, en algunas realizaciones, puede ser deseable la lisis selectiva de clases espedficas de microorganismos y, por lo tanto, puede realizarse segun los metodos descritos aqu y que son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se puede lisar selectivamente una clase de microorganismos no deseados, por ej., las levaduras son lisadas mientras que las bacterias no lo son o viceversa. En otra realizacion, los microorganismos deseados son lisados a fin de separar un componente subcelular particular de los microorganismos, por ej., membranas de celulas u organulos. En una realizacion, la totalidad de las celulas no microbianas son lisadas. En otras realizaciones, una porcion de las celulas no microbianas son lisadas, por ej., celulas suficientes para impedir la interferencia con la etapa de escudrinamiento La lisis de celulas puede realizarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica efectivo para lisar selectivamente celulas con o sin lisis de microorganismos, incluyendo, sin limitacion, la adicion de una solucion de lisis, sonicacion, choque osmotico, tratamiento qrnmico, y/o una combinacion de los mismos.

Una solucion de lisis es aquella capaz de lisar celulas, por ej., celulas no microbianas (por ej., solubilizando o disolviendo membranas de celulas eucarioticas) y/o celulas microbianas. En una realizacion, la solucion de lisis puede comprender uno o mas detergentes, opcionalmente una o mas enzimas, o una combinacion de uno o mas detergentes y una o mas enzimas, y puede ademas incluir agentes adicionales. En una realizacion, el detergente puede ser un detergente lttico no desnaturalizante, como Triton® X-100, Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™200, Brij® 96/97, CHAPS, octil-p-D-glucopiranosido, saponina, y nonaetilenglicol-monododecil-eter (C12E9, polidocenol). Opcionalmente, pueden incluirse detergentes ltticos desnaturalizantes, como dodecilsulfato sodico, N-laurilsacosina, desoxicolato sodico, sales biliares, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetama-14, y C7BzO. Opcionalmente, pueden incluirse solubilizantes, como Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetamas no detergentes (NDSB 201), anfipoles (PMAL-C8), y metil-p-ciclodextrina. Tfpicamente, se utilizan detergentes no desnaturalizantes y solubilizantes a concentraciones por encima de su concentracion micelar cntica (CMC), mientras que los detergentes desnaturalizantes pueden agregarse a concentraciones por debajo de su CMC. Por ejemplo, pueden emplearse detergentes ltticos no desnaturalizantes a una concentracion de aproximadamente 0,010% a aproximadamente 10%, por ej., de aproximadamente 0,015% a aproximadamente 1,0%, por ej., de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,5%, por ej., de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,30% (concentracion final despues de dilucion con la muestra). En otra realizacion, pueden preferirse los detergentes que comprenden un grupo “cabeza” de polioxietileno hidrofilo unido a un grupo “cola” de alcano o alqueno hidrofobo mediante un enlace de eter. Estos detergentes son comunmente especificados por la notacion CxEy, en donde "x" es igual al numero de carbonos en la cadena de alcano o alqueno, mientras que "y" es el numero de monomeros de oxietileno (CH2CH20) en la cadena de polioxietileno. Se prefieren los detergentes de este tipo en donde x se encuentra dentro del intervalo de 10-20 e y se encuentra dentro del intervalo de 8-12. Se prefieren aun mas los detergentes de este tipo en donde x se encuentra dentro del intervalo de 12-18 e y se encuentra dentro del intervalo de 9-11. Por ejemplo, el detergente de alcano-polioxietileno o de alquenopolioxietileno puede seleccionarse del grupo que consiste en Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, nonaetileno-glicol-monododecil eter (polidocanol), o una combinacion de los mismos.

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Las enzimas que pueden utilizarse en las soluciones de lisis incluyen, sin limitacion, las enzimas que digieren acidos nucleicos y otros materiales que obstruyen las membranas (por ej., proteinasa, DNasa, neuraminidasa, polisacaridasa, Glucanex®, y Pectinex®). Otros aditivos que pueden emplearse incluyen, sin limitacion, agentes reductores como 2-mercaptoetanol (2-Me) o ditiotreitol (DTT) y agentes estabilizantes como magnesio, piruvato, y humectantes. La solucion de lisis puede ser tamponada a cualquier pH que sea adecuado para lisar las celulas deseadas, y dependera de multiples factores, incluyendo, sin limitacion, el tipo de muestra, las celulas a ser lisadas, y el detergente empleado. En algunas realizaciones, el pH puede mantenerse en un intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 13, por ej., de aproximadamente 6 a aproximadamente 13, por ej., de aproximadamente 8 a aproximadamente 13, por ej., de aproximadamente 10 a aproximadamente 13. Los tampones de pH adecuados incluyen cualquier tampon capaz de mantener un pH en el intervalo deseado, por ej., CAPS de aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 1,0 M. Para algunos tipos de muestras (por ej., orina), el pH optimo para la disolucion de celulas y/o material en partfculas no deseados puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 8.

En una realizacion, la muestra y la solucion de lisis se mezclan y despues se incuban durante un tiempo suficiente para que se produzcan la lisis y la solubilizacion de las membranas celulares, por ej., aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, o 60 segundos, o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, o 20 minutos o mas, por ej., de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 minutos, de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 2 minutos. En otra realizacion, la muestra y la solucion de lisis se incuban de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos, o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 3 minutos. El tiempo de incubacion dependera de la fuerza de la solucion de lisis por ej., la concentracion del detergente y/o las enzimas. En general, los tampones de lisis mas suaves requeriran mas tiempo y una mayor dilucion de la muestra para solubilizar completamente las celulas no microbianas. La fuerza de la solucion de lisis puede seleccionarse en funcion de los microorganismos que se sabe o se sospecha que se encuentran en la mezcla. Para los microorganismos que son mas susceptibles a la lisis, puede utilizarse una solucion de lisis suave. La lisis puede tener lugar a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 15°C a aproximadamente 40°C, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C, o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C.

En algunas realizaciones, las condiciones de la lisis (por ej., la disolucion o el tiempo de incubacion), asf como tambien las etapas de separacion y/o escudrinamiento, pueden ser suficientes para matar algunos o todos los microorganismos en la muestra. Los metodos de la presente invencion son muy versatiles y no requieren que todos los microorganismos esten vivos para que se produzcan el aislamiento y la identificacion. En ciertas realizaciones, algunos o todos los microorganismos pueden estar muertos, ocurriendo la muerte antes, durante y/o despues de las etapas de los metodos que se estan llevando a cabo.

Otros detalles y la descripcion de los tampones de lisis contemplados en la practica de esta invencion se describen en la solicitud de patente de EE.UU. N° de serie 12/589.929 (actualmente publicada como US 2010/0129857 A1), presentada el 30 de octubre de 2009, con el tftulo "Methods for Isolation and Identification of Microorganisms". Otros detalles y la descripcion de los tampones de lisis contemplados pueden encontrarse en la solicitud de patente de EE.UU. en tramite N° de serie 12/589.936 (actualmente publicada como US 2010/0120085 Al), presentada el 30 de octubre de 2009, con el tftulo "Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry".

Tfpicamente, en la practica de esta invencion, la etapa de lisis se lleva a cabo dentro de un recipiente (por ej., un tubo de microcentnfuga). El recipiente puede ser cualquier recipiente con volumen suficiente para contener una muestra de ensayo y opcionalmente una solucion de lisis. El recipiente puede ser un tubo de microcentnfuga. En la practica de esta invencion se puede emplear el dispositivo de separacion dado a conocer en la solicitud de patente de EE.UU. N° de serie 12/589.969 (actualmente publicada como Us 2010/0120133 A1), presentada el 30 de octubre de 2009, con el tftulo "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms". El volumen del recipiente puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 25 ml, por ej., aproximadamente 1 ml a aproximadamente 10 ml, por ej., aproximadamente 2 ml a aproximadamente 8 ml. Si la etapa de lisis y la subsiguiente etapa de aislamiento o separacion se realizan a microescala, el volumen del recipiente puede ser de aproximadamente 2 pl a aproximadamente 100 pl, por ej., aproximadamente 5 pl a aproximadamente 50 pl. El recipiente puede tener un dispositivo de cierre fijado o puede estar roscado para aceptar un dispositivo de cierre (por ej., una tapa) para que el recipiente pueda estar hermeticamente sellado durante su uso. La presencia de un cierre reduce los riesgos de manipulacion de microorganismos que sean o puedan ser infecciosos y/o peligrosos, asf como el riesgo de contaminar la muestra. Ademas, otra posible ventaja de los metodos de la presente invencion es la capacidad de llevar a cabo una o mas de las etapas (por ej., las etapas de lisis o filtracion) con los microorganismos en un recipiente sellado (por ej., un recipiente hermeticamente sellado). Los presentes metodos pueden evitar los riesgos para la salud y la seguridad asociados con la manipulacion de microorganismos muy virulentos, como ocurre con la recuperacion de microorganismos a partir de muestras para ensayo directo.

Dispositivos de filtracion y transferencia de muestra

Como se describe anteriormente, la presente invencion tambien se refiere a un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra que funciona para la separacion, captura y acumulacion de microorganismos de una

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muestra de ensayo mediante filtracion al vado, y la subsiguiente transferencia de los microorganismos capturados y acumulados (por ej., como una masa o una pelmula) a un portaobjetos o placa de ensayo para el analisis o escudrinamiento de los microorganismos (por ej., por espectrometna de masas). En una realizacion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra comprende un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que tiene un cuerpo alargado y hueco (por ej., un tubo alargado y hueco cilmdrico, hexagonal o de forma similar,) que tiene un primer extremo o punta que esta provisto de o tapado con un material de filtracion (por ej., una membrana de filtracion), en donde dicho material de filtracion esta en posicion adyacente a y sobresale de dicho primer extremo o punta, en donde dicho cuerpo hueco alargado esta lleno de, o taponado con, un adsorbente para proporcionar soporte al material de filtracion, y un segundo extremo adaptado para conexion con un sistema o dispositivo de vado. Por ejemplo, el material de filtracion puede ser externo con respecto al primer extremo o punta del cuerpo alargado (es decir, se extiende sobre o sobresale del mismo). Los presentes solicitantes han encontrado que el uso de un material de filtracion que se extiende sobre o sobresale del primer extremo del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado permite la transferencia de cualquiera de los microorganismos aislados y/o acumulados, por ej., mediante frotacion o manchado de una placa o portaobjetos con la muestra.

En una realizacion, el cuerpo hueco y alargado es de vidrio. En otra realizacion, el cuerpo hueco y alargado es de un material plastico ngido o semi-ngido, como polipropileno (PP), policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), u otro material plastico. En general, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado comprende un cuerpo alargado y generalmente cilmdrico cuyo diametro de la punta de filtracion es de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 5 mm, o de aproximadamente 1,5 mm a aproximadamente 3 mm. En otra realizacion, el cuerpo del cilindro puede ensancharse hasta un diametro aun mayor para poder contener un volumen mayor de material filtrado. El dispositivo de filtracion y transferencia puede tener una longitud de 2 cm a aproximadamente 20 cm, de aproximadamente 3 cm a aproximadamente 15 cm, o de aproximadamente 4 cm a aproximadamente 10 cm. En una realizacion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado comprende un cuerpo cilmdrico alargado que tiene un diametro de aproximadamente 1,5 mm a aproximadamente 3 mm, y una longitud de aproximadamente 4 cm a aproximadamente 10 cm. En otra realizacion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado comprende un cuerpo cilmdrico alargado que tiene un volumen interno de aproximadamente 0,5 cm3 a aproximadamente 10 cm3, de aproximadamente 1 cm3 a aproximadamente 5 cm3, o de aproximadamente 1,5 cm3 a aproximadamente 3,5 cm3. En otra realizacion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado comprende un cuerpo cilmdrico alargado que tiene un diametro de aproximadamente 1,5 mm a aproximadamente 3 mm y una longitud de aproximadamente 4 cm a aproximadamente 10 cm (o un volumen de aproximadamente 0,9 cm3 a aproximadamente 4,7 cm3).

En una realizacion, el tubo cilmdrico, alargado y hueco del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado puede llenarse o compactarse con un adsorbente. La concentracion de un material adsorbente detras de la membrana es util de dos maneras. Primero, proporciona soporte, lo que permite que la membrana sobresalga levemente mas alla de la punta, habiendo encontrado los solicitantes que esto permite una transferencia de microorganismos mas eficaz desde el material de filtro (por ej., una membrana de filtro) hasta un portaobjetos o placa objetivo. Segundo, el uso de un adsorbente en el dispositivo de filtracion y transferencia tambien permite la adsorcion del lisado (es decir, materiales de medio y/o celulas de cultivo) que ha pasado a traves del material de filtracion. Mas aun, los solicitantes han descubierto que el material taponante proporciona una clara zona de separacion entre el lisado de la muestra y la membrana filtrante, lo que impide el retromezclado del filtrado del lisado en contacto con la membrana durante y despues del lavado, impidiendo asf la recontaminacion de los microbios limpios. En general, puede emplearse cualquier material. Por ejemplo, en una realizacion, el adsorbente puede ser un material de poliester, vidrio o celulosa en forma de fibras o de partmulas. En otra realizacion, el adsorbente podna ser una resina adsorbente, un gel de sflice, un hidrogel, derivados de acido poliacnlico o de poliacrilamida, gomas vegetales, un tamiz molecular, zeolita u otros adsorbentes bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Segun la presente invencion, el primer extremo o punta del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado esta provisto de, o tapado con, un material filtrante (o material de filtracion). Por ejemplo, como se describe anteriormente aqrn, el material de filtracion (por ej., una membrana filtrante) es adyacente a, y se extiende desde, el primer extremo o punta del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado. En general, en la practica de la invencion puede emplearse cualquier material filtrante con tamanos de poros que retienen al menos algunas porciones de los microorganismos y permiten que el lisado pase a traves de los mismos. Los materiales de filtro empleados en la practica de esta invencion pueden comprender membranas filtrantes o filtros de profundidad muy conocidos en la tecnica. En una realizacion, la membrana filtrante tendra un tamano de poros de aproximadamente 0,1 pm a aproximadamente 30,0 pm, o de aproximadamente 0,1 pm a aproximadamente 10,0 pm, o de aproximadamente 0,1 pm a aproximadamente 1,0 pm. Los ejemplos de membranas pueden incluir, membranas de polietersulfona (PES) (por ej., Supor® 200, Supor® 450, Supor® MachV (Pall-Gelman, Port Washington, NY), Millipore Express PLUS® (Millipore)). Otros materiales filtrantes posibles pueden incluir, HT Tuffryn® (polisulfona), GN Metricel® (ester de celulosa mixto), Nylaflo® (Nailon), FP Verticel (PVDF), todos de PallGelman (Port Washington, NY), y Nuclepore (policarbonato) de Whatman (Kent, UK). Los ejemplos de materiales filtrantes de profundidad pueden incluir, tipo Gf/F, GF/C y GMF150 (fibra de vidrio, Whatman), Metrigard® (fibra de vidrio, PallGelman), AP15 (fibra de vidrio, Millipore), asf como tambien una variedad de filtros de celulosa, poliester, polipropileno u otros filtros de fibra o material en partmulas, siempre que el medio filtrante pueda retener una

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cantidad suficiente de los microorganismos objetivo para permitir el analisis. En otra realizacion, puede emplearse un material filtrante formado por fibras o partmulas modificado, por ejemplo, una membrana con potencial zeta.

Como se describio anteriormente, el segundo extremo del tubo hueco alargado, opuesto al primer extremo o punta del tubo hueco alargado, puede fijarse a una fuente de vado o sistema de vado, que funciona para proporcionar un vado para la filtracion (es decir, para la filtracion al vado). En general, puede emplearse cualquier medio conocido en la tecnica para conectar el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra al sistema de vado. Por ejemplo, el dispositivo de filtracion y transferencia puede conectarse a un sistema de vado con el uso de un tubo al vado simple, como es bien conocido en la tecnica.

En otra realizacion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra puede comprender ademas un bulbo de compresion para aplicacion manual de un vado para filtracion al vado. El uso del bulbo de compresion puede tambien permitir el uso de una tecnica de flujo inverso para transferir una cantidad suficiente de microbios a un portaobjetos o placa para el analisis por espectrometna de masas, como se describe aqm. En otra realizacion, puede emplearse una jeringa y un embolo para generar un vado. En aun otra realizacion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado puede utilizar el tapon interno de adsorbente para proporcionar suficiente accion capilar y/o fuerza de absorcion para la filtracion y el lavado (es decir, para permitir asf la filtracion pasiva).

Con referencia ahora a la Figura 1, se muestra un ejemplo de realizacion del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado. La Figura 1 ilustra un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado 2 que comprende un cuerpo o tubo cilmdrico hueco y alargado 4 que tiene un primer extremo o punta 6 y un segundo extremo 8. El primer extremo o punta 6 esta provisto de, o tapado con, un filtro o material de filtracion 9, que funciona para capturar o acumular microorganismos cuando se aplica vado o succion al dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado 2. En la presente invencion el material de filtracion 9 es adyacente y externo al (es decir, se extiende sobre o sobresale del) primer extremo o punta 6 del cuerpo o tubo cilmdrico y alargado 4. El segundo extremo 8 esta generalmente conectado a una fuente o un sistema de vado (no se muestra). En otras realizaciones, el segundo extremo 8 puede proporcionarse con un bulbo o un embolo para proveer una fuerza de succion o flujo de fluidos para la filtracion. Como se muestra, en una realizacion posible, el cuerpo de forma cilmdrica y hueco puede llenarse o compactarse con un adsorbente 10, como se describio anteriormente. Segun esta realizacion, el mismo adsorbente puede proporcionar una accion capilar o fuerza absorbente que provee el flujo de fluidos para la filtracion.

Otro concepto de diseno se ejemplifica en las Figuras 2-3. Las Figuras 2-3, ilustran un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado 12 que comprende un tubo o cuerpo cilmdrico, alargado y hueco 14 que tiene un primer extremo 15 y un segundo extremo 16. El primer extremo 15 esta provisto de, o tapado con, un material filtrante 17, que funciona para capturar o acumular microorganismos cuando se aplica vado o succion al dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado 12. En la invencion, el material de filtracion 17 es adyacente, y externo al primer extremo o punta 15 del tubo o cuerpo cilmdrico alargado 14 (es decir, se extiende sobre o sobresale del mismo). El primer extremo 15 del dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado 12 puede ademas comprender una porcion ahusada 18 y una punta ensanchada o aplanada 19. En otras realizaciones, el segundo extremo 16 puede proporcionarse con un bulbo o un embolo para proporcionar una fuerza de succion para la filtracion. Como tambien se muestra, en una realizacion posible, el cuerpo cilmdrico y hueco puede llenarse o compactarse con un adsorbente 10, como se describe anteriormente. Segun esta realizacion, el mismo adsorbente puede proporcionar una accion capilar o fuerza absorbente que provee el flujo de fluidos para la filtracion.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona una unidad de filtracion y transferencia de muestra que comprende una pluralidad de dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados para el aislamiento y/o la acumulacion de una pluralidad de muestras de ensayo y para la transferencia simultanea de microorganismos aislados y/o acumulados a un recipiente, portaobjetos o placa para analizar dicha muestra aislada o acumulada de dichos microorganismos a fin de obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de dichos microorganismos. Este dispositivo se ejemplifica en las Figuras 4-5.

Como se muestra en las Figuras 4-5, la unidad de filtracion y transferencia de muestra 20 comprende una placa base 22, una placa superior 24 y un par de varillas de apoyo verticales 26 ubicadas entre la placa superior 24 y dicha placa base 22 y separando las mismas. La placa superior 24 ademas comprende un par de rodillos 28 que permiten que la placa superior se mueva “hacia arriba” y “hacia abajo” en un plano vertical a lo largo de las varillas de soporte 26.

Como se muestra, la unidad de filtracion y transferencia de muestra 20 puede ademas comprender un par de rieles base 30 y las correspondientes varillas grna 32 de la gradilla, que sostienen una gradilla 34 que tiene una pluralidad de pocillos 36 para contener una pluralidad de tubos individuales 38 (por ej., tubos de microcentnfuga). Como se muestra, los rieles base 30 pueden comprender ranuras 40 que sostienen las varillas grna 32 de la gradilla y permiten que las varillas grna de la gradilla 34 se deslicen en un plano horizontal con respecto a la placa base 22 y a los rieles de base 28. Como tambien se muestra, la gradilla 34 puede comprender una manivela 42 que permite al usuario o tecnico deslizar la gradilla 34 hacia atras y hacia adelante en un plano horizontal, segun es guiado por las ranuras 40, a lo largo de los rieles base 30.

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Ademas, como se muestra en las Figuras 4-5, la unidad de filtracion y transferencia de muestra 20 puede ademas comprender un brazo de eje vertical 44 y una plataforma vertical 46, que permite que el soporte de eje vertical 44 se mueva “hacia arriba” y “hacia abajo” (es decir, en un plano vertical) junto con la plataforma vertical 46. Este movimiento vertical permite que la placa superior se mueva “hacia arriba” y “hacia abajo” (es decir, verticalmente) junto con las varillas de soporte 26.

La placa superior 24 sostiene una unidad de vado 50 que sostiene a una pluralidad de dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados 52. Como se muestra en las Figuras 4-5, la unidad de vado 50 puede tambien comprender una barra de alineamiento orientada horizontalmente 54 que comprende una pluralidad de lugares o pocillos 56 separados por espacios iguales para contener una pluralidad de dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados extrafbles 52. Como se muestra, en una realizacion, la barra de alineamiento 54 contiene o sostiene una pluralidad de (por ej., doce (12)) dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados 52. Como se muestra, pueden emplearse uno o mas puntos de separacion (por ej., cuatro ( 4)) 58 para separar o sostener la barra de alineamiento 54 desde la placa superior 24.

La unidad de vado 50 ademas incluye un colector de valvulas 60 que comprende una pluralidad de valvulas 62 y conectores 64 en donde cada uno individualmente sostiene y conecta un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado 52 a la unidad de vado 50. Cada valvula individual 62 y conector 64 sostenido sobre el colector de valvulas 60 se conecta individualmente a un colector de vado 66 mediante tubos de vado individuales 68. El colector de vado 66 se conecta a un sistema al vado (no se muestra) a traves del principal tubo de vado 70.

En funcionamiento, se proporciona un vado a cada uno de los dispositivos individuales de filtracion y transferencia de muestra integrados 52 a partir de una fuente de vado (no se muestra) por un canal de vado. El canal de vado comprende, en serie a partir de la fuente de vado, el tubo de vado principal 70 y el colector de vado 66. A partir del colector de vado 66, el canal de vado conecta a y suministra un vado a los canales de vado individuales, en donde cada canal de vado individual comprende, en serie desde la fuente de vado, los tubos de vado individuales 68, valvulas 62, el colector de valvulas 60, los conectores 64, y finalmente cada dispositivo individual de filtracion y transferencia de muestra integrado 52.

La presente tambien describe, aunque sin formar parte de la invencion reivindicada, un sistema de filtracion y transferencia de muestra de dos partes. El sistema de filtracion y transferencia de muestra de dos partes comprende una primera parte, o una unidad de filtracion, para el aislamiento y/o la acumulacion de una pluralidad de muestras de ensayo (es decir, muestras de ensayo que contienen o que se sospecha que contienen microorganismos) mediante filtracion, y una segunda parte, o unidad de transferencia, para la transferencia simultanea de la pluralidad de muestras de microorganismos aislados y/o acumulados a un portaobjetos o una placa para obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de dichos microorganismos. Este dispositivo se ejemplifica en las Figuras 69.

El sistema de filtracion y transferencia de muestra de dos partes 100 puede comprender una primera parte, o una unidad de filtracion 102 (ver, por ej., la Figura 6), y una segunda parte, o unidad de transferencia 104 (ver, por ej., la Figura 9D). Como se muestra en las Figuras 6-12, el sistema de filtracion y transferencia de muestra de dos partes 100 puede comprender una unidad de filtracion 102 de 48 pocillos (Figura 6) y que corresponden a la unidad de transferencia 104 (Figura 9D) para transferir hasta 48 muestras filtradas (es decir, masas de microorganismos aislados y/o acumulados) a un portaobjetos o placa de 48 pocillos (por ej., una placa de 48 pocillos MALDI-TOF) para el analisis y la subsiguiente caracterizacion y/o identificacion de hasta 48 muestras de ensayo individuales (es decir, 48 masas individuales de microorganismos aislados y/o acumulados). Como apreciara un experto en la tecnica, otras configuraciones de pocillos son posibles.

Como se muestra en las Figuras 6-8, la unidad de filtracion 102 comprende una placa base de vado 106, un bloque de junta inferior 108 y un bloque superior 110. La placa base 106 comprende un conector de vado 120 para fijar un conductor de vado (por ej., un tubo de vado) para proporcionar un vado al sistema de filtracion y transferencia de muestra de dos partes 100 a partir de una fuente de vado (no se muestra). La unidad de filtracion 102 ademas comprende una pluralidad de pernos extrafbles 112 y orificios pasantes de los pernos 114 que se proveen a traves de una placa base de vado 106, un bloque de junta inferior 108 y un bloque superior 110. Los pernos 112 y los orificios pasantes de los pernos 114 permiten que se asegure o se ensamble la unidad de filtracion 102 antes o durante la filtracion. La unidad de filtracion 102 tambien comprende un par de pasadores de alineamiento 116 y orificios pasantes de alineamiento 118 que permiten el ensamblado de la unidad de filtracion 102 antes de asegurar o ensamblar la unidad 102 via los pernos 112. Como se muestra en la Figura 6, los orificios pasantes de alineamiento 118, al igual que los orificios pasantes de los pernos 114, tambien se proporcionan a traves de la placa base de vado 106, un bloque de junta inferior 108 y un bloque superior 110.

La unidad de filtracion 102 ademas comprende una junta de vado 122 que proporciona un sello hermetico entre la placa base de vado 106 y el bloque de junta inferior 108.

Como se muestra en la Figura 6, el bloque de junta inferior 108 contiene una cavidad de filtracion 124 que comprende un espacio en la superficie superior del bloque de junta inferior 108 y contiene allf una pluralidad de orificios pasantes de filtracion 140. La cavidad de filtracion 124 aloja una junta mas baja 128 y una junta mas alta

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El bloque superior 110 puede ademas comprender una junta o cinta intermedia 136 y una placa superior 138, como se muestra por ejemplo en la Figura 6. Como la cavidad de filtracion 124, la junta inferior 128 y la junta superior 130, el bloque superior 110, la junta o cinta intermedia 136 y una placa superior 138 comprenden una pluralidad de orificios o pocillos de muestras 142, en los que una muestra de ensayo puede ser agregada y filtrada para aislacion y/o acumulacion de cualquiera de los microorganismos contenidos en la misma. Cada uno entre la pluralidad de orificios o pocillos de muestra 142 corresponden a, o se alinean con, cada uno de los orificios pasantes en vado 140 contenidos en la cavidad de filtracion 124, junta inferior 128 y junta superior 130. Usando una junta o cinta intermedia 136, el bloque superior 110 y la placa superior 138 pueden formarse en dos partes separadas y despues ensamblarse con la cinta o junta intermedia 136, lo que permite que se formen canales concavos de flujo de fluidos (como se muestra en las Figuras 10-12) en cada parte.

Como se muestra en la Figura 10, la superficie inferior 180 de la placa superior 138 puede comprender un primer canal de flujo de fluidos 182. El primer canal de flujo de fluidos 182 ilustrado en las Figuras 10 y 12 comprende una entrada 184 ubicada en un borde lateral de la placa superior 138 y una pluralidad de canales de distribucion 186 que proporcionan comunicacion fluida entre la entrada 184 y una pluralidad de orificios o pocillos de muestra individuales 142 en la placa superior 138. Como se muestra mas claramente en la Figura 12, el primer canal de flujo de fluidos

182 lleva un flujo de fluidos, desde la entrada 184 hasta el borde superior de los orificios o pocillos de muestra

individuales 142 formados por el bloque superior 110, la junta o cinta intermedia 136 y una placa superior 138. Puede emplearse el primer canal de flujo de fluidos 182 para proporcionar una muestra lfquida a los orificios o pocillos de muestra individuales, por ejemplo, los pocillos de muestra individuales 142 puede llenarse con una solucion lttica o un tampon de lavado via el primer canal de flujo de fluidos 182 (como se muestra, por ejemplo, mediante la flecha 188).

Como se muestra en la Figura 11, la superficie superior 190 del bloque superior 110 puede comprender un segundo canal de flujo de fluidos 192. El segundo canal de flujo de fluidos ilustrado en las Figuras 11-12 comprende una

pluralidad de canales de salida 194 que llevan desde o conectan la parte inferior de la pluralidad de orificios o

pocillos de muestra individuales 142 hasta una pluralidad de canales de distribucion 196 contenidos en la superficie superior 190 del bloque superior 110, que a su vez llevan a una puerta de salida 198 contenida en un borde lateral del bloque superior 110. El segundo canal de flujo de fluidos 192 puede emplearse para retirar fluido desde los pocillos de muestra individuales 142 (como se muestra, por ejemplo, mediante la flecha 200). Por ejemplo, si uno o mas de los pocillos son bloqueados u obstruidos debido a la acumulacion de microorganismos en el material filtrante, la fuente de vado puede desconectarse, y se puede suministrar un segundo medio (por ej., un segundo vado) para proveer fuerza o succion para extraer el exceso de fluido de los pocillos de muestra individuales 142 via el segundo canal de flujo de fluidos 192.

En funcionamiento, puede filtrarse una pluralidad de muestras de ensayo (por ej., muestras de hemocultivo lisadas, segun una realizacion posible de la presente invencion) a traves de la unidad de filtracion 102, y el microorganismo contenido en las mismas puede ser aislado y/o acumulado en el material filtrante 132. Segun esta disposicion, puede agregarse una muestra de ensayo individual (no se muestra) a un pocillo de muestra individual 142 y puede aplicarse un vado a la unidad de filtracion 102 a partir de una fuente de vado (no se muestra) via el conector de vado 120 para la filtracion del material lisado a traves del material filtrante 132, con lo que se afslan y/o acumulan cualquiera de los microorganismos en el material filtrante 132. Este procedimiento puede repetirse con muestras de ensayo diferentes en cada uno de los orificios o pocillos de muestra individuales 142 provistos en el bloque superior 110.

Como se muestra en las Figuras 9A-9D, la unidad de transferencia 104 comprende un bloque de pasadores de transferencia 150 que comprende una base 152, un par de pasadores de alineamiento 154 y una pluralidad de pasadores de transferencia 156. Segun esta disposicion, los pasadores de transferencia 156 funcionan para transferir una masa de microorganismos aislados y/o acumulados a un portaobjetos o placa 160 (por ej., una placa de MALDI-TOF) al presionar el material filtrante (por ej., una membrana filtrante) firmemente contra el portaobjetos o placa 160, y de esta manera transferir los microorganismos aislados y/o acumulados.

La transferencia de los microorganismos aislados y/o acumulados a un portaobjetos o placa 160 se ilustra en las Figuras 9A-9D. En funcionamiento, despues de la filtracion, el bloque de junta inferior 108 es retirado de la unidad de filtracion 102. La junta superior 130 es retirada de la cavidad de vado 124 del bloque de junta inferior 108 y se coloca un portaobjetos o placa 160 (por ej., una placa de MALDI-TOF) en la cavidad de vado sobre la parte superior del material filtrante 132 (ver las Figuras 9A y 9B). Para proporcionar el lugar exacto del portaobjetos o la placa 160 en la cavidad de vado 124, se proveen una grna 162 y un reborde 164 sobre la superficie superior del bloque de

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junta inferior 108. El alineamiento del portaobjetos o placa 160 con la gma 162 y el reborde 164 asegura que los manchados de muestra 166 contenidos sobre la superficie del portaobjetos o placa 160 esten correctamente alineados con los manchados de microorganismos correspondientes (no se muestran) que resultan de la filtracion de muestras de ensayo individuales a traves de los orificios o pocillos de muestra individuales 142 provistos en el bloque superior 110 (es decir, cada uno de los orificios o pocillos de muestra individuales 142 se alinea con un manchado de muestra correspondiente 166).

A continuacion, el bloque de junta inferior 108, el material filtrante 132 y el portaobjetos o placa 160, se transfieren a y se alinean con la parte superior del bloque de pasadores de transferencia 150 utilizando los pasadores de alineamiento 154 y los orificios pasantes de alineamiento 118 provistos en el bloque de junta inferior 108 (ver la Figura 9C). Los pasadores de alineamiento 154 y los orificios pasantes de alineamiento 118 permiten que los pasadores de transferencia 156 se alineen correctamente con los orificios pasantes 140 contenidos en el bloque de junta inferior 108, y asf permitan el alineamiento adecuado, en serie, de los pasadores de transferencia, los microorganismos aislados y/o acumulados en el material filtrante 132 y los correspondientes manchados de muestra 166 contenidos sobre la superficie del portaobjetos o placa 160.

Finalmente, los pasadores de transferencia 156 pueden ser presionados dentro del material filtrante 132 y el portaobjetos o placa 160, con los medios conocidos en la tecnica, para transferir los microorganismos aislados y/o acumulados (resultan de la filtracion de muestras de ensayo individuales a traves de uno o mas de los correspondientes orificios o pocillos de muestra individuales 142) a los correspondientes puntos de muestra 166 contenidos sobre la superficie del portaobjetos o placa 160 (ver Figura 9D). Subsiguientemente, el portaobjetos o la placa 160 pueden analizarse o examinarse para obtener mediciones con respecto a la caracterizacion y/o identificacion de dichos microorganismos.

Etapa de separacion, aislamiento y/o acumulacion

La siguiente etapa en el metodo de la presente invencion (por ej., la etapa despues de lisar la muestra, si se realiza una etapa de lisado o disolucion) es una etapa de separacion, asilamiento y/o acumulacion. La etapa de separacion, aislamiento y/o acumulacion puede llevarse a cabo para separar y aislar o purificar los microorganismos a partir de otros componentes de la muestra (por ej., no microrganismos o componentes de los mismos) y para acumular o capturar los microorganismos en una masa que puede ser transferida a un portaobjetos o placa de espectrometna de masas y subsiguientemente examinada para identificacion y/o caracterizacion. La separacion, el aislamiento y/o la acumulacion no tienen que ser completos, es decir, no se requiere que tenga lugar el 100% de la separacion. Solamente es necesario que la separacion, el aislamiento y/o la acumulacion de los microorganismos a partir de otros componentes de la muestra sean suficientes para permitir el analisis o el examen de los microorganismos sin interferencia sustancial de los otros componentes. Por ejemplo, la separacion/el aislamiento puede resultar en una masa de microrganismos acumulados o capturados que es al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, o 99% pura o mas.

En una realizacion, la etapa de separacion, aislamiento y/o acumulacion se realiza como una etapa de filtracion en donde un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra (como se describe aqrn) se coloca en la muestra (por ej., una muestra lisada) en un recipiente y se aplica un vacfo al dispositivo de filtracion y transferencia, que permite que los microorganismos sean separados, aislados y/o acumulados (por ej., los microorganismos pueden ser acumulados o capturados en el material de filtracion ( por ej., una membrana filtrante) del dispositivo de filtracion y transferencia) a partir de otros componentes que pueden estar presentes en la muestra. Segun esta realizacion, otros componentes de la muestra (por ej., no microorganismos o componentes de los mismos que pueden estar presentes en el medio de muestra) pasan a traves del filtro o material de filtracion. Por consiguiente, esta etapa de filtracion afsla, separa y/o acumula los microorganismos a partir de materiales en la muestra, como medio, residuos celulares, y/u otros componentes que podnan interferir con el analisis o examen de los microorganismos (por ej., por espectrometna de masas).

En consecuencia, en una realizacion, se describe un metodo novedoso para procesar rapidamente microorganismos a partir de una muestra (por ej., un cultivo lfquido positivo), mediante un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra, para la caracterizacion y/o identificacion del microorganismo. En una realizacion, el metodo comprende capturar y acumular microorganismos sobre o en un material filtrante y subsiguientemente transferir los microbios acumulados a un portaobjetos o placa objetivo para su analisis por espectrometna de masas. Con referencia ahora a la Figura 13, se muestra un metodo ejemplificado para separacion/aislamiento, captura y acumulacion, y la subsiguiente transferencia de los microorganismos para el analisis espectrometrico de masas. Como se muestra en la Figura 13, el metodo comprende las siguientes etapas: (1) obtener una muestra de ensayo que se sabe contiene, o puede contener, un microorganismo ( por ej., un hemocultivo positivo) (etiquetada como etapa 1); (2) selectivamente lisar las celulas no microorganismo en la muestra de ensayo, y asf producir una muestra lisada (etapa 2); (3) sumergir un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra (como se describe aqrn) en una muestra lisada (etapa 3); ( 4) aplicar un vacfo al dispositivo de filtracion y transferencia de muestra, para asf filtrar la muestra lisada a traves del filtro, y de esta manera capturar al microorganismo en el material filtrante del dispositivo de filtracion y transferencia integrado (etapa 4); (5) transferir el dispositivo de filtracion y transferencia a un fluido o tampon de lavado, para lavar el filtro (etapa 5); (6) lavar el filtro aplicando o llevando un vacfo en el dispositivo de filtracion y transferencia, en donde se toma el fluido o tampon de lavado a traves del filtro, y, en donde se lava asf

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cualquiera de los microorganismos capturados en el material filtrante (etapa 6); (7) transferir el dispositivo de filtracion y transferencia a una placa objetivo de MALDI-TOF (descrita en mas detalle a continuacion) (etapa 7); (8) depositar los microorganismos en la superficie de la placa objetivo de MALDI-TOF (por ej., usando una tecnica de aplicacion de pequenas cantidades (dabbing)) (etapa 8); (9) agregar solucion matriz a la muestra de microorganismos sobre la placa (que se describe con mas detalle a continuacion) (etapa 9); y (10) adquirir un espectro de masas de la muestra de microorganismos utilizando MALDI-TOF (como se describe mas adelante) (no se muestra).

Etapa de transferencia opcional

Despues de acumular o capturar microorganismos sobre el material de filtracion (por ej., una membrana filtrante) del dispositivo de filtracion y transferencia, la siguiente etapa, en una realizacion del proceso, comprende la transferencia y el deposito de los microorganismos acumulados (es decir, como una masa o pelfcula) en un portaobjetos o placa objetivo para analisis y/o examen (por ej., por espectrometna de masas). Segun la presente invencion, el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra, ademas de proporcionar un dispositivo para capturar y acumular microorganismos a partir de una muestra de ensayo, tambien sirve como un dispositivo de transferencia, para transferir y aplicar microorganismos sobre un portaobjetos o una placa objetivo para su analisis por espectrometna de masas.

En una realizacion, los microorganismos acumulados sobre el dispositivo de filtracion y transferencia pueden aplicarse o directamente depositarse sobre un portaobjetos o una placa objetivo. Segun esta realizacion, se pueden aplicar pequenas cantidades con el dispositivo de filtracion y transferencia (por ej., en forma vertical hacia arriba y hacia abajo) sobre un portaobjetos o una placa objetivo, una o mas veces, para permitir que se transfiera una cantidad suficiente de microbios al portaobjetos o a la placa para su analisis. En algunos casos, la transferencia de microbios suficientes para su analisis puede requerir la aplicacion de pequenas cantidades en forma repetida.

En otra realizacion, los microorganismos acumulados sobre el dispositivo de filtracion y transferencia pueden aplicarse o directamente depositarse sobre un portaobjetos o una placa objetivo empleando una tecnica de flujo inverso. La tecnica de flujo inverso comprende aplicar una suave presion inversa a traves del dispositivo de filtracion y transferencia integrado (por ej., con un bulbo de compresion o un conducto plegado) de manera que la punta exuda una pequena cantidad de lfquido. La presion inversa puede aplicarse mientras se aplican pequenas cantidades con el dispositivo verticalmente en o sobre el recipiente, portaobjetos o placa objetivo hasta que se libera suficiente lfquido para dejar aproximadamente 1-2 pl de suspension de flujo inverso y transferir asf una cantidad suficiente de microbios para su analisis por espectrometna de masas.

En otra realizacion, los microorganismos acumulados sobre el dispositivo de filtracion y transferencia pueden aplicarse o directamente depositarse sobre un portaobjetos o una placa objetivo empleando una tecnica de extension. La tecnica de extension comprende extender o deslizar el material filtrante del dispositivo a traves de la superficie de un portaobjetos o una placa objetivo, una o mas veces, para permitir que se transfiera una cantidad suficiente de microbios al portaobjetos o placa para su analisis por espectrometna de masas. En algunos casos, la transferencia de microbios suficientes para el analisis por espectrometna de masas puede requerir que el dispositivo sea repetidamente extendido o deslizado sobre la superficie del portaobjetos o placa objetivo.

Etapa de analisis, medicion y/o examen

Una vez que se han filtrado los microorganismos (por ej., usando el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra descrito aqrn) para aislamiento y/o acumulacion del microorganismo desconocido, la masa de microorganismo aislado y/o acumulado puede analizarse para obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de dicho microorganismo. En una realizacion, la muestra aislada o acumulada de dichos microorganismos puede analizarse empleando examen espectroscopico, por ej., en base a las caractensticas intnnsecas de los microorganismos (por ej., fluorescencia intnnseca) o la estructura vibracional de las moleculas constituyentes (por ej., espectroscopia Raman). En otra realizacion, los microorganismos aislados o acumulados pueden ser analizados por espectrometna de masas (por ej., MALDI-TOF-MS). Otros detalles y la descripcion de los metodos preferidos para obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de dichos microorganismos pueden encontrarse en las solicitudes de patente de EE.UU. en tramitacion con la presente: (1) N° 12/589.952 (actualmente publicada como US 2010/0129858 Al), presentada el 30 de octubre de 2009, con el tftulo "Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy"; (2) N° 12/589.976 (actualmente publicada como US 2010/0156609 Al), presentada el 30 de octubre de 2009, con el tftulo "Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Raman Spectroscopy"; y (3) N° 12/589.936 (actualmente publicada como US 2010/0120085 Al), presentada el 30 de octubre de 2009, con el tftulo "Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry".

La muestra o masa de microorganismos aislados y/o acumulados puede examinarse espectroscopicamente. Pueden emplearse metodos espectroscopicos opticos para analizar una o mas propiedades intnnsecas de los microorganismos, por ej., una propiedad presente dentro del microorganismo en ausencia de agentes adicionales, como manchas, tintas, agentes aglutinantes, etc. En otros escenarios, pueden emplearse los metodos espectroscopicos opticos para analizar una o mas propiedades extnnsecas de los microorganismos, por ej., una

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propiedad que solamente puede detectarse con la ayuda de agentes adicionales. El examen puede llevarse a cabo empleando, por ejemplo, espectroscopia fluorescente, espectroscopia de reflectancia difusa, espectroscopia infrarroja, espectroscopia de teraherz, espectroscopia de transmision y absorbancia, espectroscopia Raman, incluyendo la Espectroscopia Raman de Superficie Mejoradas (SERS, por su version en ingles “Surface Enhanced Raman Spectroscopy”), espectroscopia Raman compensada espacialmente (SORS, por su version en ingles “Spatially Offset Raman spectroscopy”), espectroscopia Raman de transmision, y/o espectroscopia Raman de resonancia. Para mejorar las senales Raman (SERS) y de fluorescencia, los microorganismos podna ser revestidos con nanoparffculas de oro y/o plata antes de la centrifugacion, y/o la superficie optica interna podna ser pre- revestida con coloides de metal de tamano y forma particulares (Re: Lakowicz, Anal. Biochem. 337: 171 (2005) con respecto fluorescencia; Efrima et al., J. Phys. Chem. B. (Letter) 102:5947 (1998) con respecto a SERS). En una realizacion, la muestra o la masa de microorganismos aislados y/o acumulados se analiza para obtener mediciones utiles para la caracterizacion y/o identificacion del microorganismo desconocido, mientras que la muestra o masa permanece en/sobre el dispositivo de filtracion y/o transferencia de muestra. En otra realizacion, como se describe aqrn, la muestra o la masa de microorganismos puede analizarse despues de la transferencia a un recipiente, placa o portaobjetos.

En otras realizaciones, despues de filtrar la muestra (por ej., empleando un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra, como se describe aqrn), se transfiere una porcion de la muestra sobre una placa o portaobjetos para su introduccion en un espectrometro de masas. Se deposita una sustancia altamente absorbente sobre la parte superior de la muestra (por ej., matriz); este material tiene un coeficiente de absorcion optica muy alto con respecto a la frecuencia laser que se emplea para ionizar la muestra (por ej., para un laser de nitrogeno, la longitud de onda de emision es 337 nm, de manera que el material absorbente tendna un coeficiente de gran absorcion en una longitud de onda de 337 nm). Una vez que la muestra y la sustancia absorbente se han secado, la placa se inserta en el espectrometro de masas. Despues del tiempo necesario para reducir la muestra (es decir, para retirar los gases atmosfericos de la muestra de manera de tener un entorno de 10-5 a 10-7 torr), la muestra se introduce en la camara de ionizacion del espectrometro de masas. La muestra es alineada con el sistema. Cuando se alcanza el alineamiento optimo, se producen pulsos de laser de nitrogeno. La absorcion de la energfa laser por la matriz hace que esta se separe de la superficie de la placa debido a la alta energfa depositada. Como un efecto secundario, las porciones de las celulas de microorganismos tambien se vaporizan e ionizan en el proceso. Estos iones son acelerados hasta una energfa cinetica conocida mediante la generacion de un campo electrostatico entre la placa y la entrada al tubo de vuelo del espectrometro (es decir, esta porcion del sistema es el discriminador de masa/carga). Todos los iones cargados individualmente, independientemente de la masa, tendran la misma energfa cinetica en la entrada al tubo de vuelo, pero tendran velocidades inversamente proporcionales a sus masas. A partir de aqrn, los iones bajan por el tubo de vuelo hacia el detector, y los iones mas livianos llegaran antes que los iones mas pesados (el tubo de vuelo es un discriminador de masa/carga). El detector genera una carga electrica cada vez que un ion impacta en el detector. La salida del detector es digitalizada y la salida muestra la relacion masa/carga sobre un eje y el numero de impactos sobre el otro eje. En otras realizaciones, los microorganismos transferidos en la masa pueden ser examinados empleando tecnicas de espectrometna de masas, como espectrometna de masas MALDI- TOF, espectrometna de masas con ionizacion por desorcion y electropulverizacion (DESI, por su version en ingles “desorption electrospray ionization”), espectrometna de masas acoplada a cromatograffa en fase gaseosa, espectrometna de masas acoplada a cromatograffa en fase ffquida, espectrometna de masas con ionizacion por electropulverizacion (ESI, por su version en ingles “electrospray ionization”), y espectrometna con tubo de flujo de iones seleccionados (SIFT, por su version en ingles “selected ion flow tube”).

En algunas realizaciones de la invencion, la caracterizacion y/o identificacion de los microorganismos en la muestra o masa aislada no necesita comprender la identificacion de una especie exacta. La caracterizacion comprende la amplia categorizacion o clasificacion de parffculas biologicas asf como la identificacion real de una especie unica. La clasificacion de un microorganismo a partir de una muestra o masa aislada puede comprender la determinacion de las caractensticas fenoffpicas, morfologicas y/o metabolicas del microorganismo. Por ejemplo, la caracterizacion de las parffculas biologicas puede llevarse a cabo en base a diferencias observables, como composicion, forma, tamano, agregacion y/o metabolismo. En algunas realizaciones, la clasificacion de las parffculas biologicas de interes puede no requerir conocimiento previo de las caractensticas de una parffcula biologica determinada, sino solamente correlaciones compatibles con las mediciones empmcas, lo que hana que este metodo fuera mas general y facilmente adaptable que los metodos en base a eventos de union espedfica o reacciones metabolicas. Como se emplea aqrn, "identificar" significa determinar a que familia, genero, especie y/o cepa pertenece un microorganismo previamente desconocido. Por ejemplo, identificar un microorganismo previamente desconocido a nivel de familia, genero, especie, y/o cepa.

En algunos casos, la caracterizacion comprende modelos de clasificacion que proporcionan informacion util con respecto a la accion que se debe tomar. Los detalles adicionales y la descripcion de los modelos de clasificacion contemplados pueden encontrarse en la solicitud de patente de EE.UU. tambien en tramite No. 12/589.936 (actualmente publicada como US 2010/0120085 Al), presentada el 30 de octubre de 2009, con el fftulo "Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry”. Como se describe alff, los modelos de clasificacion preferidos comprenden agrupamientos en uno o mas de los siguientes: (1) Grupos Gram; (2) Grupos Gram Clmicos; (3) Grupos Terapeuticos; y (4) Grupos Funcionales.

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Equipo.

En la presente solicitud tambien se describe, aunque no se reivindica, un equipo para aislamiento, acumulacion y/o purificacion de microorganismos a partir de una muestra de ensayo. En su forma mas simple, el equipo incluira: (1) opcionalmente una solucion o tampon de lisis de no microorganismo que se sabe esta presente o puede estar presente en una muestra de ensayo; (2) un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado (como se describe aqrn) para aislamiento, acumulacion y/o purificacion de microorganismos que pueden estar en una muestra de ensayo, y para la subsiguiente recoleccion y transferencia de los microorganismos; y (3) al menos un fluido o tampon de lavado para lavar la muestra de microorganismo aislado, acumulado y/o purificado. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado empleado en el equipo se describe en detalle aqrn.

Opcionalmente, el equipo puede incluir una solucion o tampon de lisis selectiva para selectivamente lisar o disolver las celulas y/o material en partfculas no deseados que pueden estar presentes en la muestra de ensayo, por ej., celulas sangumeas y/o celulas tisulares. Se puede lisar o disolver las celulas y/o los material en partfculas para permitir la separacion y/o el aislamiento de microorganismos a partir de otros componentes de la muestra. La separacion y/o el aislamiento de microorganismos a partir de otros componentes impide la interferencia durante cualquier aplicacion de ensayo directa subsiguiente, por ejemplo, el analisis o examen con respecto a la caracterizacion y/o identificacion del microorganismo (por ej., por espectrometna de masas) o la realizacion de PCR microbiana de amplio rango sobre caldo de cultivo sangumeo. Sin embargo, si no se espera encontrar celulas no microorganismo presentes en la muestra o no se espera que las mismas interfieran con cualquier ensayo subsiguiente, la etapa de lisis puede no ser necesaria.

En general, la solucion de lisis selectiva puede utilizarse para lisar o disolver celulas no microorganismo que pueden estar presentes en la muestra de ensayo. Sin embargo, en otras realizaciones, la lisis selectiva de clases espedficas de microorganismos puede ser conveniente y por lo tanto llevarse a cabo de acuerdo con los metodos descritos aqrn y segun se conoce en la tecnica. Por ejemplo, una clase de microorganismos no deseados puede ser selectivamente lisada, por ej., la levadura se somete a lisis mientras no lo son las bacterias o viceversa. En otra realizacion, los microorganismos deseados son lisados a fin de separar un componente subcelular particular de microorganismos, por ej., membranas celulares u organulos. En un escenario, la totalidad de las celulas no microbianas son lisadas. En otros escenarios, una porcion de las celulas no microbianas son lisadas, por ej., celulas suficientes para impedir la interferencia con la etapa de examen. La lisis de las celulas puede llevarse a cabo mediante cualquier metodo conocido en la tecnica como efectivo para selectivamente lisar celulas con o sin lisis de microorganismos, incluyendo, sin limitacion, la adicion de una solucion de lisis, sonicacion, choque osmotico, tratamiento qrnmico, y/o una combinacion de lo anterior.

La solucion de lisis es aquella capaz de lisar celulas, por ej., celulas no microrganismo (por ej., al solubilizar o disolver las membranas de celulas eucarioticas) y/o celulas microorganismo. En una realizacion, la solucion de lisis puede comprender uno o mas detergentes, opcionalmente una o mas enzimas, o una combinacion de uno o mas detergentes y una o mas enzimas, y puede ademas incluir agentes adicionales. En una realizacion, el detergente puede ser un detergente lttico no desnaturalizante, como Triton® X-100, Triton® X-100-R, Triton® X-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® X-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™200, Brij® 96/97, CHAPS, octil-U-D- glucopiranosido, saponina y nonaetilenglicol-monododecil-eter (C12E9, polidocanol). Opcionalmente, se pueden incluir detergentes ltticos desnaturalizantes, como dodecilsulfato sodico, N-laurilsarcosina, desoxicolato sodico, sales biliares, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, SB3-10, SB3-12, amidosulfobetama-14 y C7BzO. Opcionalmente, tambien se pueden incluir agentes solubilizantes, como Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Tween® 80, Tween® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, sulfobetamas no detergentes (NdSb 201), anfipoles (PMAL-C8) y metil-U- ciclodextrina. Tfpicamente, los detergentes no desnaturalizantes y solubilizantes se emplean en concentraciones por encima de su concentracion micelar cntica (CMC), mientras que los detergentes desnaturalizantes pueden agregarse a concentraciones por debajo de su CMC. Por ejemplo, los detergentes lfticos desnaturalizantes pueden emplease a una concentracion de aproximadamente 0,010% a aproximadamente 10%, por ej., de aproximadamente 0,015% a aproximadamente 1,0%, por ej., de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,5%, por ej., de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,30% (concentracion final despues de dilucion con la muestra). En otro escenario, pueden preferirse los detergentes que comprenden un grupo de “cabeza” de polioxietileno hidrofflico unido a un grupo de “cola” de alcano o alqueno hidrofobico mediante un enlace de eter. Estos detergentes son comunmente especificados utilizando la indicacion de la forma CxEy, en donde "x" es igual al numero de carbonos en la cadena alcano o alqueno, mientras que "y" es el numero de monomeros de oxietileno (CH2CH2O) en la cadena polioxietileno. Se prefieren los detergentes de este tipo en donde x se encuentra dentro del intervalo de 10-20 e y esta dentro del intervalo de 8-12. Todavfa mas preferidos son los detergentes de este tipo en donde x esta dentro del intervalo de 12-18 e y esta dentro del intervalo 9-11. Por ejemplo, el detergente de alcano-polioxietileno o alquenopolioxietileno puede seleccionarse entre el grupo que consiste en Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, nonaetilenglicol-monododecil-eter (polidocanol), o una combinacion de los mismos.

Las enzimas que pueden emplearse en soluciones de lisis incluyen, sin limitacion, enzimas que digieren acidos nucleicos y otros materiales que obstruyen las membranas (por ej., proteinasa, DNasa, neuraminidasa, polisacaridasa, Glucanex®, y Pectinex®). Otros aditivos que pueden emplearse incluyen, sin limitacion, agentes reductores como 2-mercaptoetanol (2-Me) o ditiotreitol (dTt) y agentes estabilizantes como magnesio, piruvato y humectantes. La solucion de lisis puede estar tamponada a cualquier pH que sea adecuado para lisar las celulas

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deseadas, y dependera de multiples factores, incluyendo, sin limitacion, el tipo de muestra, las celulas a ser lisadas, y el detergente empleado. En algunas realizaciones, el pH puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 13, por ej., aproximadamente 6 a aproximadamente 13, por ej., aproximadamente 8 a aproximadamente 13, por ej., aproximadamente 10 a aproximadamente 13. Los tampones de pH adecuado incluyen cualquier tampon capaz de mantener un pH en el intervalo deseado, por ej., aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 1,0 M en CAPS. Para algunos tipos de muestra (por ej., orina), el pH optimo para la disolucion de celulas y/o material en partfculas no deseados puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 8.

El kit incluira tambien al menos un fluido o tampon de lavado para lavar el microorganismo o masa de microorganismos aislados, acumulados y/o purificados sobre el material filtrante. El tampon de lavado puede emplearse para ademas separar, aislar o purificar los microorganismos acumulados o capturados, “eliminando" otros componentes (por ej., medios, componente del medio, residuos celulares, no microorganismos o componentes de los mismos) que pueden estar presentes en la muestra de ensayo. Como apreciara facilmente un experto en la tecnica, el uso de un tampon de lavado permite o facilita la eliminacion (o el paso a traves del material filtrante) de medio, componentes del medio, residuos celulares, no microorganismos o componentes de los mismos, que pueden de otro modo interferir con los ensayos posteriores (por ej., analisis por espectrometna de masas). El tampon de lavado puede tambien emplearse para neutralizar rapidamente el pH alcalino de la solucion de lisis. En general, puede incluirse cualquier fluido o tampon de lavado en el kit. Por ejemplo, el tampon de lavado podna ser agua destilada. En otra realizacion, el tampon de lavado podna ser un tampon de pH capaz de mantener un pH adecuado para microorganismos, como un tampon fosfato, MOPS o TRIS. Por ejemplo, el tampon de lavado podna ser una solucion de fosfato de 0,01 M a aproximadamente 0,2 M, pH de 6,0 a 7,5

Ademas, el kit puede tambien comprender un dispositivo de filtracion, una fuente de vado y/o una interface de vado. El dispositivo de filtracion puede adaptarse para fijacion a una fuente de vado o un sistema de vado, que funciona para proporcionar un vado para filtracion (es decir, para filtracion de vado). En general, puede emplearse cualquier medio conocido en la tecnica para conectar el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra al sistema de vado. Por ejemplo, el dispositivo de filtracion y transferencia puede conectarse a un sistema de vado con el uso de un tubo de vado simple, segun se conoce en la tecnica. Por ejemplo, el kit puede comprender un frasco al vado de brazo lateral (ver Figuras 2-3, numero 2) con porta-filtro reutilizable o un conector (ver Figura 3, numero 4) con un reservorio de filtrado y una pluralidad de porta-filtros reutilizables (ver Figura 3, numero 6). En aun otras realizaciones, el kit puede ademas comprender componentes adicionales para filtracion, por ejemplo, el kit puede comprender uno o mas tubos, pinzas, valvulas, o el kit puede comprender uno o mas tubos, pinzas, valvulas o trampas de vado. En otra realizacion, el kit puede comprender uno o mas dispositivos de filtracion descartables que tienen una membrana de filtracion incorporada. En estos dispositivos descartables, puede activarse la filtracion ya sea por una fuente de vado o por centrifugacion.

El kit puede tambien incluir un recipiente (por ej., un tubo), dentro del cual puede llevarse a cabo la etapa de lisis. El recipiente puede ser cualquier recipiente con volumen suficiente para contener una muestra de ensayo y opcionalmente una solucion de lisis. En una realizacion, el recipiente puede ser un tubo. En otra realizacion, el kit puede incluir el dispositivo de separacion descripto en la solicitud de patente relacionada de los EE.UU. No. 12/589,969 (actualmente publicada como US 2010/0120133 Al), presentada el 30 de octubre de 2009, con el tftulo “Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms". El volumen del recipiente puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 25 ml, por ej., de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 10 ml, por ej., de aproximadamente 2 ml a aproximadamente 8 ml. Si la etapa de lisis y la posterior etapa de aislamiento o separacion se realizan a una microescala, el volumen del recipiente puede ser de aproximadamente 2 pl a aproximadamente 100 pl, por ej., de aproximadamente 5 pl a aproximadamente 50 pl. El recipiente puede tener un dispositivo de cierre fijo o puede tener una rosca para aceptar un dispositivo de cierre (por ej., una tapa) de modo que el recipiente puede estar hermeticamente sellado durante su uso. La presencia de un cierre reduce los riesgos de manipular microorganismos que son o pueden ser infecciosos y/o peligrosos, asf como el riesgo de contaminar la muestra. Por ejemplo, el kit puede contener de 1 a 500 recipientes (por ej., tubos) dentro de los cuales puede llevarse a cabo la etapa de lisis. En otras realizaciones, el kit puede contener de 1 a 100, de 10 a 80, o de 10 a 50 recipientes dentro de los cuales se puede llevar a cabo la etapa de lisis. En otras realizaciones, el kit puede contener 20, 50, 75 o 100 recipientes dentro de los cuales puede realizarse la etapa de lisis.

El kit puede tambien incluir uno o mas portaobjetos para ensayo o placas objetivo para el analisis o examen de los microorganismos (por ej., por espectrometna de masas). Segun esta realizacion, los microorganismos acumulados en el dispositivo de filtracion y transferencia integrado pueden aplicarse o directamente depositarse en o sobre un portaobjetos de ensayo o placa objetivo para las ensayos subsiguientes. Segun esta realizacion, los microorganismos aislados, acumulados y/o purificados en el dispositivo de filtracion y transferencia integrado pueden transferirse o depositarse sobre un portaobjetos o una placa (por ej., usando una tecnica de aplicacion de pequenas cantidades, flujo inverso y/o extension) sobre el portaobjetos o la placa objetivo para permitir la posterior experimentacion y/o analisis, como se describe con mas detalle aqrn. Por ejemplo, el kit puede contener de 1 a 500 portaobjetos de ensayo o placas objetivo. En otras realizaciones, el kit puede contener de 1 a 100, o de 10 a 80, o de 20 a 50 portaobjetos de ensayo o placas objetivo. En otras realizaciones, el kit puede contener 20, 50, 75 o 100 portaobjetos de ensayo o placas objetivo para posterior experimentacion y/o analisis.

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En general, el kit puede configurarse para procesar cualquier numero de muestras de ensayo (es dedr, para aislamiento, acumulacion y/o purificacion de microorganismos a partir de cualquier numero espedfico de muestras de ensayo). Por ejemplo, el kit puede configurarse para procesar (aislar, acumular y/o purificar microorganismos) desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 muestras de ensayo, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 500 muestras de ensayo, o desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 muestras de ensayo. En otro ejemplo, el kit podna configurarse para procesar desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 80 muestras de ensayo, desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 60 muestras de ensayo, o aproximadamente 50 muestras de ensayo.

La presente invencion se detalla ademas en los siguientes ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustracion y que no pretenden limitar la invencion en modo alguno. Se emplean las tecnicas convencionales y ampliamente conocidas que se describen espedficamente a continuacion.

Ejemplos

Ejemplo 1. Lisis-filtracion y espectrometna de masas mediante el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia integrado

Se “sembraron” microorganismos con un inoculo de aproximadamente 40 o 400 CFU en una suspension de 1,0 ml de cada cepa de ensayo en frascos BacT/ALERT® SA o SN que conteman 10 ml de sangre humana. Las muestras de ensayo sembradas se mezclaron despues volteando los frascos varias veces, se incubaron en una cabina BacT/ALERT® 3D Combo y se vigilaron para detectar el crecimiento microbiano dentro del frasco.

Las muestras de caldo de hemocultivo se retiraron de los frascos algunos minutos despues de ser marcadas como positivas por el Sistema de Deteccion Microbiana BacT/ALERT® 3D. Si el frasco no se procesaba inmediatamente, se almacenaba a 2-8 °C, y mas tarde se llevaba a temperatura ambiente colocando el frasco en un bano de agua a 37 °C durante 5-15 minutos antes del ensayo. Las muestras de caldo de hemocultivo positivas se procesaron para separar los microorganismos de los componentes de sangre y del medio que pudieran interferir con el analisis subsiguiente, de la siguiente manera:

(1) usando una jeringa de 1 ml y aguja 18G, se transfirieron 0,5 mL de caldo positivo a un tubo de microfuga limpio de 1,5 ml;

(2) al caldo se anadieron 0,25 ml de tampon de lisis (0,45% peso/volumen de Brij-97 + CAPS 0,3M, pH de 11,7 (filtrado a traves de filtro de 0,2 |im, y almacenado a 2-8 °C)) y se mezclo mediante suave aspiracion/suministro 5-6 veces, con cuidado para evitar la formacion de burbujas tanto como fuera posible, y la mezcla se incubo durante 2:00 a 2:15 minutos a temperatura ambiente, con lo que se genero una muestra lisada o un lisado;

(3) despues de la incubacion y la lisis, la punta de un dispositivo de filtracion y transferencia integrado se sumergio aproximadamente 3-5 mm en el lisado y se aspiro al vado durante 2:00 a 2:15 minutos a temperatura ambiente, a medida que el lfquido se llevaba al fondo del dispositivo de filtracion y transferencia integrado, y se ajusto para mantener una profundidad de aproximadamente 3-5 mm;

(4) despues de que la muestra se filtro al vado durante 2:00 - 2:15 minutos, el dispositivo de filtracion y transferencia se traslado a un recipiente que contema una primera solucion de lavado (Brij/Salina (0,45% peso/volumen de NaCl+ 0,05% de Brij 97)), se sumergio, y se aspiro al vado durante 4:00 - 4:15 minutos a temperatura ambiente;

(5) despues de la primera etapa de lavado, el dispositivo de filtracion y transferencia se traslado a un segundo recipiente que contema una segunda solucion de lavado (agua desionizada), se sumergio en la primera solucion de lavado, y se aspiro al vado durante 4:00 - 4:15 minutos a temperatura ambiente;

(6) los microbios lavados se aplicaron despues a uno o mas puntos de manchado en las placas diana MALDI-TOF usando una tecnica de aplicacion vertical de pequenas porciones en forma repetida, o alternativamente por inversion de flujo, hasta que se deposito un residuo visible de 1-2 pl de suspension;

(7) los puntos se secaron y despues se agrego 1pl de matriz;

(8) despues de aplicar y secar todas las muestras para una placa diana determinada, los puntos de manchado se analizaron por mAlDI-TOF MS.

Ejemplo 2: Lisis-filtracion y espectrometna de masas mediante el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia integrado que comprende filtros de membrana

Cuarenta y cuatro (44) aislados de microorganismos se desarrollaron, procesaron y analizaron mediante MALDI- TOF MS, como se describe en el Ejemplo 1, empleando un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que usa Supor® 450 (Pall-Gelman, Port Washington, NY) como material filtrante, y una tecnica de inversion de flujo para depositar el microorganismo acumulado en la placa de MALDI-TOF.

Una vez que todas las muestras de microorganismo se habfan secado completamente, se obtuvieron espectros de masas por MALDI-TOF para cada una en un intervalo de masa/carga de 2.000-34.000 en un espectrometro de masas MALDI-TOF Axima Assurance (Shimadzu Biotech North America, Maryland).

Despues de la obtencion de cada espectro de masas, se introdujo una tabla de picos de masa en el software de 5 identificacion de microorganismos “Sammis” (bioMerieux Inc., USA) para su analisis. Este software consiste en una base de datos de los espectros de masas de MALDI-TOF recolectados a partir de microrganismos desarrollados en agar.

La Tabla 1 a continuacion muestra los resultados de la identificacion (ID) mediante el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia integrado con una membrana Supor 450.

10 Tabla 1 - Dispositivo Supor 450 - Tecnica de inversion de flujo - Frascos SA

Material aislado

Confianza de ID Material aislado Confianza de ID

E. coli, 104471

3 S. epidermidis, D055 2

E. coli, 100257

4 S. epidermidis, D069 0

E. coli, D104

4 S. epidermidis, D082 4

E. coli, D168

4 S. epidermidis, D092 3

P. aeroginosa, 105716

4 E. faecalis, D149 4

P. aeroginosa, 107930

4 E. faecalis, D135 3

E. aerogenes, 104098

3 E.faecium, 13243 0

E. aerogenes, 107930

3 E.faecium, 14334 0

K. pneumoniae, 108902

4 E. faecium, D068 0

K. pneumoniae, 105245

4 S.pneumoniae, 7265 2

S. aereus, 10754

0 S.pneumoniae, 14226 0

S. aereus, 8816

4 S.pneumoniae, D013 0

S. aereus, 7537

4 S. pyogenes, 11629 0

S. aereus, 7623

0 S. pyogenes, 11620 0

S. aereus, D164

2 S. pyogenes, 11631 0

S. aereus, D076

2 S. pyogenes, 12897 0

S. aereus, D116

3 C. albicans, 303070 4

S. aereus, D176

2 C. albicans, 18804 3

S. epidermidis, 13298

0 C. albicans, 302611 4

S. epidermidis, D011

0 C. albicans, 304765 0

S. epidermidis, D036

3 C. albicans, 304771 0

S. epidermidis, D042

0 C. albicans, 304776 3

Puntuaciones de confianza de ID 4 = 99,9%

3 = 85-99,8%

15 2 = ID de Especie < 85%, o Genero o Familia > 85%

0 = Sin ID

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Como se muestra en la Tabla 1, 22/44 (50%) recibieron una ID correcta con buena confianza, mientras que el 61% se identifico en al menos algun nivel.

Aunque la tasa de exito de este experimento aun no era perfecta, demuestra que el concepto es muy prometedor. Se eligio este conjunto de microorganismos porque desafiaban la identificacion directa a partir del hemocultivo mediante metodos centnfugos previos y, por lo tanto, proporcionaban una prueba rigurosa.

Hay muchas razones por las que estos primeros ensayos pueden no haber proporcionado ID correctas en todos los casos. Una posibilidad es que no hubiera suficiente masa celular, otra posibilidad es que las celulas depositadas tuvieran pureza insuficiente, o pudiera haberse dado una combinacion de ambas circunstancias.

Si el problema es la masa celular, entonces otras membranas, o aun filtros profundos todavfa no investigados, podnan capturar un mayor numero de celulas. Otra posibilidad es aumentar la razon tiempo/volumen de captura para acumular una masa mayor.

Ejemplo 3: Espectrometna de masas por lisis-filtracion mediante el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia integrado que comprende filtros de profundidad.

Cuarenta y seis (46) aislados de microorganismos se desarrollaron, procesaron y analizaron por MALDI-TOF MS como se describe en el Ejemplo 1, usando un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que emplea filtros de profundidad (filtro Whatman GF/F (0,7 micrometros nominales) y filtros Metrigard (Pall-Gelman) (0,5 micrometros nominales con aglutinante acnlico)) como material filtrante en lugar de membranas.

Los dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados realizados con los filtros Pall-Gelman Metrigard (0,5 micrometros nominales con aglutinante acnlico) se sometieron a ensayo solamente sobre unas pocas de las muestras mas problematicas, pero dieron resultados tan buenos como los filtros GF/F o mejores.

Una vez que todas las muestras de microorganismos se habfan secado completamente, se obtuvieron espectros de masas MALDI-TOF para cada una en un intervalo de masa/carga de 2.000-34.000 en un espectrometro de masas MALDI-TOF Axima Assurance (Shimadzu Biotech North America, Maryland).

Despues de obtener cada espectro de masas, se introdujo una tabla de picos de masas en el software de identificacion de microorganismos "Sammis" (bioMerieux Inc. USA) para su analisis. Este software consiste en una base de datos de los espectros de masa de MALDI-TOF recolectados a partir de microrganismos desarrollados en agar.

La Tabla 2 a continuacion muestra los resultados de ID mediante el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia integrado que comprende un filtro Whatman GF/F o los filtros Pall-Gelman Metrigard.

Tabla 2 - Cultivos sembrados en frascos SA procesados con dispositivo de tipo filtro de profundidad

Material aislado

Dispositivo GF/F Material aislado Dispositivo GF/F Dispositivo Metrigard

E. coli, 104471

4 S. epidermidis, D055 3 ND

E. coli, 100257

4 S. epidermidis, D069 3 ND

E. coli, D104

4 S. epidermidis, D082 4 ND

E. coli, D168

4 S. epidermidis, D092 4 ND

P. aeroginosa, 105716

4 E. faecalis, D149 4 ND

P. aeroginosa, 107930

4 E. faecalis, D135 4 ND

E. aerogenes, 104098

4 E.faecium, 13243 4 ND

E. aerogenes, 107930

4 E.faecium, 14334 4 ND

K. pneumoniae, 108902

4 E. faecium, D068 3 ND

K. pneumoniae, 105245

4 S.pneumoniae, 7265 3 ND

S. aereus, 10754

3 S.pneumoniae, 41226 3 3

S. aereus, 8816

4 S.pneumoniae, D0013 3 ND

S. aereus, 7537

4 S.pneumoniae, D002 3 ND

5

10

15

20

25

30

35

S. aereus, 7623

4 S. pyogenes, 11629 2 3

S. aereus, D164

4 S. pyogenes, 11620 0 2

S. aereus, D076

4 S. pyogenes, 11631 3 ND

S. aereus, D116

4 S. pyogenes, 12897 3 ND

S. aereus, D176

4 C. albicans, 303070 4 ND

S. epidermidis, 13298

3 C. albicans, 18804 4 ND

S. epidermidis, D011

4 C. albicans, 302611 2 4

S. epidermidis, D036

3 C. albicans, 304765 4 ND

S. epidermidis, D042

4 C. albicans, 304771 3 ND

C. albicans, 304776 4 ND

Puntuaciones de confianza de ID 4 = 99,9%

3 = 85-99.8%

2 = ID de Especie < 85%, o Genera o Familia > 85%

0 = Sin ID

ND = No determinado

La Tabla 2 muestra los resultados de los cultivos sembrados que se desarrollaron en frascos SA y se procesaron con Dispositivo de Filtro realizado a partir de filtros de profundidad en lugar de membranas. En general, los resultados son muy buenos y similares a los mejores que se han obtenido mediante otros metodos de procesamiento. El dispositivo hecho con filtro Whatman GF/F (0,7 micrometros nominales) dieron ID de confianza (>85% de confianza) con respecto al nivel de especies (incluyendo los tipicos resultados de baja discriminacion con S.pneumoniae y C.albicans) con 43 de 46 aislados (93,5%), e ID para al menos genero o especie en un nivel de confianza mas bajo, con 45 de 46 aislados (97,8%).

Por consiguiente, el uso de filtros de profundidad muestra una mejora con respecto a los anteriores experimentos con filtros de membrana. Es posible que la mayor cantidad de celulas que pueden atraparse en un filtro de profundidad contribuyan a obtener mejores resultados, pero otro factor podna ser tambien la mejora en el lavado. Los recuentos de cepas Gram y/o celulas de los organismos capturados pueden ayudar a distinguir entre las dos posibilidades.

Otra diferencia con respecto a ensayos anteriores es que se reajusto el programa de adquisicion de MALDI-TOF (segun es necesario periodicamente debido al envejecimiento del instrumento/detector) entre los dos experimentos. El reajuste probablemente hubiera mejorado tambien los resultados del dispositivo de membrana, pero no representana en forma exclusiva la magnitud de la diferencia observada con los filtros de profundidad.

Ejemplo 4: Lisis-filtracion y espectrometna de masas mediante el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia integrado que comprende filtros de profundidad con frascos de medio que contienen resina.

Se desarrollaron, procesaron y analizaron cincuenta y un (51) aislados de microorganismos mediante MALDI-TOF MS como se describe en el Ejemplo 3, con el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que emplea filtros de profundidad Metrigard® excepto que a) los cultivos sembrados se desarrollaron en frascos que conteman medios aerobicos con resinas en lugar de los frascos BacT/ALERT® SA, b) el tampon de lisis tuvo la siguiente composicion (0,6% en peso/volumen de Brij-97 + 0,4M en CAPS, pH de 11,7), y c) la primera solucion de lavado tema la siguiente composicion (fosfato de sodio 20 mM, 0,05% en peso/volumen de Brij 97, 0,45% en peso/volumen de NaCl, pH de 7,2).

Una vez que todas las muestras de microorganismos se habfan secado completamente, se obtuvieron espectros de masas por MALDI-TOF para cada una en un intervalo de masa/carga de 2.000-34.000 en un espectrometro de masas MALDI-TOF Axima Assurance (Shimadzu Biotech North America, Maryland).

Despues de obtener cada espectro de masas, se introdujo una tabla de picos de masa en el software de identificacion de microorganismos "Sammis" (bioMerieux Inc. USA) para su analisis. Este software consiste en una base de datos de espectros de masas de MALDI-TOF recolectados entre microorganismos desarrollados en agar.

La Tabla 3 a continuacion muestra los resultados de ID mediante el uso de un dispositivo de filtracion y transferencia 5 integrado con filtros Pall-Gelman Metrigard a partir de cultivos desarrollados en medios aerobicos que contienen resina.

Tabla 3 - Cultivos sembrados en frascos con medios aerobicos de resina procesados con dispositivo tipo filtro de profundidad

Material aislado

Confianza de ID Material aislado Confianza de ID

E. coli, 104471

4 S. epidermidis, 13298 4

E. coli, 100257

4 S. epidermidis, D011 4

E. coli, D104

4 S. epidermidis, D036 4

E. coli, D168

4 S. epidermidis, D055 4

E. coli-101262

4 S. epidermidis, D069 4

E. aerogenes, 104098

4 S. epidermidis, D082 4

E. aerogenes, 107930

4 S. epidermidis, D092 4

K. pneumoniae, 108902

4 E. faecalis, D149 4

K. pneumoniae, 105245

4 E. faecalis, D135 4

K. pneumoniae -104143

3 E. faecalis -15268 4

K. pneumoniae -108904

3 E. faecalis - 15282 4

P. aeruginosa, 105716

4 E.faecium, 13243 4

P. aeruginosa, 108042

4 E.faecium, 14334 4

P. aeruginosa -104014

4 E. faecium, D050 4

P. aeruginosa-108937

4 E.faecium, D068 4

S. aereus, 10754

4 S.pneumoniae, 7265 3

S. aereus, 8816

4 S.pneumoniae, 14226 3

S. aereus, 7537

4 S.pneumoniae, D013 3

S. aereus, 7623

4 S.pneumoniae, D002 3

S. aereus, D164

4 S. pyogenes, 11629 3

S. aereus, D076

4 S. pyogenes, 11620 3

S. aereus, D116

4 S. pyogenes, 11631 3

S. aereus, D176

4 S. pyogenes, 12897 1

S. albicans, 303070

4 H. influenzae, 500891 3

S. albicans, 304771

2 H. influenzae, 500893 0

S. albicans, 304776

0

Puntuaciones de confianza de ID 4 = 99,9 %

3 = 85-99,8%

2= ID de especie < 85%, o genera o familia > 85%

5 0 = Sin ID

Como se muestra en la Tabla 3, son muy buenos los resultados de los cultivos sembrados que se desarroNaron en frascos que conteman resina y que se procesaron con Dispositivo de Filtro con filtros de profundidad. Estos cultivos procesados dieron ID de confianza (>85% de confianza) con respecto al nivel de especie (incluyendo resultados tipicos de baja discriminacion con S.pneumoniae y C.albicans) con 47 de 51 aislados (92,2%).

10

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Un dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado que comprende:

   un cuerpo alargado y hueco que tiene un primer extremo o punta que esta provisto de, o tapado con, un material de filtracion, en donde dicho material de filtracion esta situado adyacente a y sobresale de dicho primer extremo o punta;

   en donde dicho cuerpo alargado y hueco esta lleno o taponado con un adsorbente para proporcionar soporte al material de filtracion; y

   un segundo extremo operable para proporcionar flujo de fluido para la filtracion.
2. 2. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de la reivindicacion 1, en donde dicho segundo extremo esta adaptado para conexion a un sistema de vado, una jeringa o un embolo para generar un vado.
3. 3. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho

   cuerpo alargado y hueco esta hecho de un material de plastico ngido o semi-ngido seleccionado del grupo de

   polipropileno (PP), policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), u otro material plastico.
4. 4. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho

   cuerpo alargado y hueco comprende un cuerpo alargado y cilmdrico que tiene un diametro de 0,5 mm a 10 mm y

   una longitud de 2 cm a 20 cm.
5. 5. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho cuerpo alargado y hueco tiene un volumen interno de 0,5 cm3 a 10 cm3.
6. 6. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho adsorbente proporciona filtracion pasiva mediante una accion capilar o fuerza de absorcion para el flujo de fluido.
7. 7. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de la reivindicacion 6, en donde dicho adsorbente se selecciona del grupo que consiste en algodon, poliester, una resina adsorbente, un gel de sflice, una hidrogel, un criba molecular, zeolita, u otros materiales adsorbentes.
8. 8. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho material de filtracion tiene un tamano de poros de 0,1 pm a 10,0 pm.
9. 9. El dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho material de filtracion se selecciona del grupo que consiste en membranas de polietersulfona (PES), polisulfona, ester de celulosa mixto, PVDF, policarbonato, materiales filtrantes profundos seleccionados entre el grupo que consiste en fibra de vidrio tipos GF/F, GF/C y GMF150, fibra de vidrio, fibra de vidrio AP15, asf como una variedad de filtros de celulosa, poliester, polipropileno u otros filtros de fibras y material en partfculas, o una combinacion de los mismos
10. 10. Una unidad de filtracion y transferencia de muestra que comprende: una pluralidad de dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados de las reivindicaciones 1 a 9, para el aislamiento y/o la acumulacion de una pluralidad de muestras de ensayo y para la transferencia simultanea de la pluralidad de microorganismos aislados y/o acumulados a un recipiente, portaobjetos o placa para analizar dichos microorganismos aislados o acumulados.
11. 11. La unidad de filtracion y transferencia de muestra de la reivindicacion 10, en donde dicha unidad ademas comprende:

    una placa base y una placa superior separada de dicha placa base, en donde opcionalmente se proporciona al menos una varilla de soporte o un par de varillas de soporte verticales ubicadas entre dicha placa superior y dicha placa base y que separan a las mismas;

    una gradilla que tiene una pluralidad de pocillos para contener una pluralidad de tubos individuales, en donde opcionalmente dicha gradilla esta sostenida a traves de un par de rieles de base y un par correspondiente de varillas grna de la gradilla;

    un brazo de eje vertical, opcionalmente asociado con una plataforma vertical, operable para permitir que dicho brazo de eje vertical se mueva hacia “arriba” y hacia “abajo”, opcionalmente a lo largo de la plataforma vertical, para subir y bajar dicha placa superior y dicha pluralidad de dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados; y

    una unidad de vado que comprende una barra de alineamiento que contiene una pluralidad de orificios o cavidades para contener una pluralidad de dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados y extrafbles segun las reivindicaciones 1 a 9, y un colector de valvulas asociado con una pluralidad de valvulas y conectores en donde cada uno individualmente sostiene y conecta a dichos dispositivos de filtracion y transferencia de muestra integrados.

    5

    10

    15

    20

    25
12. 12. Un metodo para aislar e identificar un microorganismo a partir de una muestra de ensayo, que comprende:

    (a) proporcionar una muestra de ensayo que se sabe contiene o puede contener microorganismos;

    (b) opcionalmente lisar celulas y/o material en partmulas no microbianos en dicha muestra de ensayo para producir una muestra lisada;

    (c) aislar y acumular dichos microorganismos a partir de otros componentes de dicha muestra de ensayo o dicha muestra lisada por filtracion, usando el dispositivo de filtracion y transferencia de muestra integrado de las reivindicaciones 1-9;

    (d) transferir dicha muestra de microorganismos aislados a un recipiente o portaobjetos adecuado para analizar y/o examinar dicha muestra de microorganismos aislada y acumulada;

    (e) analizar dicha muestra aislada o acumulada de dichos microorganismos para obtener mediciones para la caracterizacion y/o identificacion de los microorganismos; y

    (f) caracterizar y/o identificar dichos microorganismos en dicha muestra aislada y acumulada en base a las mediciones adquiridas.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en donde dicha etapa de analisis (e) es por espectrometna de masas y en donde dicha espectrometna se selecciona del grupo que consiste en espectrometna de masas MALDI-TOF, espectrometna de masas con ionizacion por electropulverizacion y desorcion (DESI), espectrometna de masas acoplada a cromatograffa en fase gaseosa, espectrometna de masas acoplada a cromatograffa en fase ffquida, espectrometna de masas con ionizacion por electropulverizacion (ESI), y espectrometna con tubo de flujo de iones seleccionados (SIFT).
14. 14. El metodo de las reivindicaciones 12 a 13, en donde dicha muestra es una muestra clmica o no clmica y en donde, cuando dicha muestra es una muestra clmica, entonces la muestra clmica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, fracciones sangumeas, fluido articular, orina, semen, saliva, heces, fluido cerebroespinal, contenidos gastricos, secreciones vaginales, homogeneizados tisulares, aspirados de medula osea, homogeneizados oseos, esputos, aspirados, hisopados y enjuagues de hisopados, fluidos corporales, una muestra de hemocultivo, y una muestra de orina.