CN103364496A

CN103364496A - 同时测定柴胡浸膏中四种柴胡皂苷含量的方法

Info

Publication number: CN103364496A
Application number: CN2012101007047A
Authority: CN
Inventors: 佟玲; 朱永宏; 王一飞; 张瀛
Original assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2012-04-09
Filing date: 2012-04-09
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-04-09
Also published as: CN103364496B

Abstract

柴胡浸膏皂苷类成分的高效液相色谱检测方法，供试品采用固相萃取柱预处理，色谱条件为采用C18色谱柱，流动相为乙腈-水梯度洗脱，检测器为二极管阵列检测器。

Description

同时测定柴胡浸膏中四种柴胡皂苷含量的方法

技术领域

本发明涉及药物成分的含量测定方法，特别涉及一种同时测定柴胡浸膏中四种柴胡皂苷含量的方法。

背景技术

柴胡属于宿根草本，一般高40-70厘米。通常从基部分出数茎，茎基部木质化，上部多次分枝。叶为宽或窄的披针形，背面具有5-7条明显突起的纵脉，基生叶和下部的茎生叶有长柄，叶片较大；茎上部的叶小，披针形或线形。伞形花序常有伞幅10-15，伞幅长2-3厘米，形成开展疏散的圆锥花序；总苞片4-6，披针形，长0.5-1厘米，宽1-3毫米，向后反折，顶端渐尖；小总苞片通常5，少数7，长圆状披针形或披针形，长2-5毫米，宽1-2毫米，亦向后反折；花瓣淡黄色。双悬果长圆状椭圆形，油管在每棱槽中通常1条，少数2-3条。花期6-7月，果期7-8月。

柴胡的别名有：茈胡、地薰《神农本草经》、山菜、茹草《吴普本草》，柴草《品汇精要》。性味：苦，微寒，归经：归肝经、胆经。功能：疏散退热，升阳舒肝。主治：感冒发热、寒热往来、疟疾，肝郁气滞，胸肋胀痛，脱肛，子宫脱落，月经不调。

柴胡滴丸是利用现代高科技手段制成的纯中药制剂，是由柴胡提取的有效成分加入适当辅料经特殊制剂过程制成的一种呈高度分散状态的固体分散物。该制剂有效成分溶出快。直接经粘膜吸收入血。生物利用度高，所以具有高效、速效和安全的优点。柴胡滴丸为现有技术，如中国专利200410019826，200610003447中描述了柴胡滴丸的制备，主要是将柴胡经过提取加工得到浸膏，然后进一步得到滴丸制剂。

柴胡浸膏为柴胡经水提提取的有效成分浓缩成的膏状制剂，是柴胡滴丸的重要原料，柴胡皂苷类成分是浸膏中的最主要的生物活性成分群，具有明显的抗炎、抗病毒作用，柴胡浸膏作为中药提取物含有多种柴胡皂苷类成分，如：柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂等。柴胡浸膏中的有关成分的含量测定目前有多种方法，但这些方法只能一次测定一种成分，如果测定多种成分就需要每一种成分都要测一遍，操作非常复杂，繁琐，也浪费资源。

因此建立一种测定柴胡皂苷类各种成分含量的方法十分必要。柴胡皂苷在制剂工艺中得到了充分提取，然而其主成分柴胡皂苷d因其分子中环氧结构的不稳定性导致在制剂工艺过程中大量转化，就柴胡滴丸的现行提取工艺而言，尚无可靠手段完全防止或有效控制柴胡皂苷d的转化速度和程度，从而在客观上造成了柴胡滴丸制剂中柴胡皂苷含量的不确定性。所以在柴胡滴丸制剂中仅测定柴胡皂苷d的含量对其质量控制意义不大[4，5]。因此本含量测定研究柴胡滴丸浸膏剂中四种主要柴胡皂苷成分作为质量控制的指标。本研究建立了同时测定柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂四种柴胡皂苷含量的方法，该方法操作简便，结果可靠准确，能够对柴胡滴丸浸膏质量进行较为全面的控制。

发明内容

本发明经过研究，找到一种同时测定柴胡浸膏中四种柴胡皂苷含量的方法，解决了上述问题。

在高效液相色谱-质谱/质谱定性分析制剂的化学成分的基础上采用高效液相色谱定量分析制剂的指标成分。

本发明所述检测方法，其中供试品预处理过程优选：取柴胡浸膏用水溶解并稀释，上固相萃取柱(SPE)，用20％乙腈水溶液淋洗后，再用50％乙腈水溶液洗脱并收集洗脱液，过0.22μm有机膜。

本发明所述检测方法，其中供试品预处理过程最优选：取柴胡浸膏0.5g，置25mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，SPE柱经10mL乙腈，10mL水预先活化，上样2mL。用10mL 20％乙腈水溶液淋洗后，再用50％乙腈水溶液洗脱并收集洗脱液，定容至10mL，过0.22μm有机膜。

本发明所述检测方法，色谱流动相A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱方法为：

0～18min，38％A相

18-35min，38％A→60％A相

本发明所述检测方法其中色谱流动相流速为0.5-1.5mL/min，优选1.0mL/min。

本发明所述检测方法其中色谱柱温为25-35℃，优选30℃。发明人考察了柱温(不控温、25℃、30℃、35℃)对分离效果的影响使用，结果表明柱温30℃的情况下，制剂中待测组分峰形对称，分离度高且分析结果稳定。

本发明所述检测方法，其中二极管阵列检测器变波长扫描，色谱检测器波长为200-260nm，优选色谱检测器波长依次选择为依次选择210nm、252nm和210nm。

实验证明，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d的最佳吸收波长为210nm，柴胡皂苷b2的最佳吸收波长为：252nm，故采用二极管阵列检测器(DAD)变波长扫描，在一次分析中可以实现多个成分在最佳波长的检测。

使用本发明所述的检测方法，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b2的含量测定结果分别为3.23-4.03mg·g-1、1.33-0.1.61mg·g-1、0.06-0.42mg·g-1、0.99-1.34mg·g-1。

本发明利用HPL℃测定了柴胡浸膏中4种指标成分的含量，本发明具有很好的线性、重复性、重现性和回收率，有助于更加全面控制柴胡滴丸的质量，其方法操作简单，结果可靠准确。

附图说明

图1柴胡皂苷混合标准品溶液(A)和柴胡浸膏供试品溶液(B)色谱图，其中1：柴胡皂苷c 2：柴胡皂苷a 3：柴胡皂苷b₂ 4：柴胡皂苷d。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

试验例

1仪器与试药

1.1仪器

安捷伦1200型高效液相色谱仪(四元泵，自动进样器，二级管阵列检测器，美国安捷伦公司)；安捷伦Chemstation化学工作站(美国安捷伦公司)；Milli-Q超纯水系统(美国密理博公司)；XS150十万分之一电子天平(美国梅特勒托利多公司)；HyperSep C₁₈固相萃取小柱(赛默飞世尔公司)。

1.2试药

甲醇，乙腈(色谱纯，美国默克公司)；柴胡浸膏(由天津天士力集团提供)；柴胡皂苷a(批号：110777-200406)，柴胡皂苷d(批号：110778-200505)均购自中国药品生物制品检定所；柴胡皂苷c(购自天津药物研究院)；柴胡皂苷b₂(购自天津一方科技有限公司)。

2方法

2.1色谱条件

流动相为乙腈(A)-水，梯度洗脱0-18min 38％A，18-35min38％-60％A；检测波长0-15min 210nm，15-25min 252nm，25-35min 210nm；流速1.0mL/min；柱温30℃，进样量10μL；色谱柱WATERS XBridge ShieldRP C₁₈(4.6mm×250mm，5.0μm)。

2.2溶液的制备

2.2.1供试品溶液的制备

称取柴胡浸膏0.5g，置25mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，SPE柱经10mL乙腈，10mL水预先活化，上样2mL。用10mL 20％乙腈水溶液淋洗后，再用50％乙腈水溶液洗脱并收集洗脱液，定容至10mL，过0.22μm有机膜，作为供试品溶液备用。

2.2.2对照品溶液的制备

取四种对照品，用甲醇分别配制成柴胡皂苷a 0.95mg/mL，柴胡皂苷c 0.48mg/mL，柴胡皂苷d 1.07mg/mL，柴胡皂苷b₂ 0.33mg/mL浓度的对照品，分别精密吸取1mL柴胡皂苷a，1mL柴胡皂苷d，2mL柴胡皂苷c，3mL柴胡皂苷b₂，用10mL的容量瓶定容，制成含四种对照品的混合溶液备用。

2.3标准曲线的制备

精密量取柴胡皂苷混合对照品溶液稀释，配制成柴胡皂苷a的浓度分别95μg/mL，47.5μg/mL，19μg/mL，9.5μg/mL，4.75μg/mL，0.95μg/mL，0.475μg/mL，0.2375μg/mL的溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，以柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归处理。线性结果见表1。

表1 4种柴胡皂苷的线性回归方程和线性范围

2.4精密度

取“2.2.2”项下混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂峰面积的RSD分别为0.3％，0.5％，0.8％，0.3％。结果表明仪器的精密度良好。

2.5稳定性

取“2.2.1”项下供试品溶液按“2.1”项下色谱条件分别在0，4，8，16，24h进样6次，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂峰面积的RSD分别为0.6％，0.3％，0.7％，0.7％。结果表明供试品在24h内稳定性良好。

2.6重复性

按“2.2.1”项下方法平行制备6份柴胡浸膏供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，分别测定样品中五种柴胡皂苷的峰面积，RSD分别为柴胡皂苷a 0.4％，柴胡皂苷c 0.2％，柴胡皂苷b₂1.7％，柴胡皂苷d 0.7％。结果表明此方法有较好的重复性。

2.7加样回收率

精密称取已知含量的柴胡浸膏适量，再各分别加入不同量的柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂，分别按“2.2.1”项下制备供试品，并按“2.1”项下色谱条件进样，测定各成分的含量，计算各成分的回收率，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂的回收率分别为98.5％，98.2％，99.4％，99.0％，RSD分别为1.1％，0.7％，1.2％，0.8％。

3样品测定结果

按“2.1”项下条件对五批柴胡浸膏进行含量测定，分别精密吸取供试品、对照品溶液注入色谱仪，结果见图1。5批样品中4种主要成分含量结果见表2。

表2柴胡浸膏中的4种柴胡皂苷含量(mg/g)

3.1柴胡浸膏在未经过前处理的情况下，其中有效成分柴胡皂苷色谱峰附近有干扰，不易准确定量。在采用SPE小柱进行前处理之后，大部分干扰测定的物质被除去，而柴胡皂苷基本可以完全回收，提高了检测的灵敏度和准确性。

3.2在流动相体系选择，由于柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d的最大吸收波长在210nm(柴胡皂苷b₂的最大吸收波长为252nm)，在梯度洗脱的条件下，用甲醇水体系作流动相会使基线有较明显的漂移，故选择乙腈水体系。

3.3柴胡浸膏为半固体粘稠制剂，无法直接称入容量瓶中，故将样品置于小烧杯中，以溶剂分次溶解并转移至量瓶中，以达到充分溶散减少实验误差的目的。

3.4分别将柴胡皂苷混合对照品及供试品溶液进样后用DAD检测器进行峰纯度检测，结果供试品与混合对照品在相同保留时间的色谱峰光谱图一致，不含其它杂质。

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

对照品溶液的制备：取四种对照品，用甲醇分别配制成柴胡皂苷a 0.95mg/mL，柴胡皂苷c 0.48mg/mL，柴胡皂苷d 1.07mg/mL，柴胡皂苷b20.33mg/mL浓度的对照品，分别精密吸取1mL柴胡皂苷a，1mL柴胡皂苷d，2mL柴胡皂苷c，3mL柴胡皂苷b2，用10mL的容量瓶定容，制成含四种对照品的混合溶液备用。

供试品溶液的制备：称取柴胡浸膏0.5g，置25mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，SPE柱经10mL乙腈，10mL水预先活化，上样2mL。用10mL 20％乙腈水溶液淋洗后，再用50％乙腈水溶液洗脱并收集洗脱液，定容至10mL，过0.22μm有机膜，作为供试品溶液备用。

色谱条件：流动相为乙腈(A)-水，梯度洗脱0-18min 38％A，18-35min 38％-60％A；检测波长0-15min 210nm，15-25min 252nm，25-35min 210nm；流速1.0mL/min；柱温30℃，进样量10μL；色谱柱WATERS XBridge ShieldRP C18(4.6mm×250mm，5.0μm)。

样品的测定：精密吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷、柴胡皂苷b₂含量，4种成分的含量分别为3.23、1.33、0.06、1.34mg/g。

实施例2

对照品溶液的制备同实施例1。

色谱条件：流动相为乙腈(A)-水，梯度洗脱0-18min 38％A，18-35min 38％-60％A；检测波长0-15min 200nm，15-25min 260nm，25-35min 210nm；流速0.5mL/min；柱温25℃，进样量10μL；色谱柱WATERS XBridge ShieldRP C18(4.6mm×250mm，5.0μm)。

样品的测定：精密吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷、柴胡皂苷b2含量，4种成分的含量分别为3.72、1.56、0.42、0.99mg/g。

实施例3

对照品溶液的制备同实施例1。

色谱条件：流动相为乙腈(A)-水，梯度洗脱0-18min 38％A，18-35min 38％-60％A；检测波长0-15min 210nm，15-25min 260nm，25-35min 210nm；流速1.5mL/min；柱温35℃，进样量10μL；色谱柱WATERS XBridge ShieldRP C18(4.6mm×250mm，5.0μm)。

样品的测定：精密吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷、柴胡皂苷b2含量，4种成分的含量分别为3.56、1.44、0.22、1.13mg/g。

实施例4

对照品溶液的制备同实施例1。

色谱条件：流动相为乙腈(A)-水，梯度洗脱0-18min 38％A，18-35min 38％-60％A；检测波长0-15min 210nm，15-25min 250nm，25-35min 210nm；流速1mL/min；柱温30℃，进样量10μL；色谱柱WATERS XBridge ShieldRP C18(4.6mm×250mm，5.0μm)。

样品的测定：精密吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷、柴胡皂苷b2含量，4种成分的含量分别为4.03、1.61、0.26、1.28mg/g。

实施例5

对照品溶液的制备同实施例1。

样品的测定：精密吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷、柴胡皂苷b2含量，4种成分的含量分别为3.68、1.51、0.32、1.06mg/g。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种柴胡浸膏中皂苷类成分的高效液相色谱检测方法，其特征在于供试品采用固相萃取柱预处理，色谱条件为采用C₁₈色谱柱，流动相为乙腈-水梯度洗脱，检测器为二极管阵列检测器。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测样品预处理过程为：取柴胡浸膏用水溶解并稀释，上固相萃取柱，用20％乙腈水溶液淋洗后，再用50％乙腈水溶液洗脱并收集洗脱液，过0.22μm有机膜。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于色谱流动相A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱方法为：

0～18min，38％A相

18-35min，38％A→60％A相。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于色谱流动相流速为0.5-1.5mL/min。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于色谱流动相流速为1.0mL/min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于色谱柱温为25-35℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于色谱柱温为30℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于采用二极管阵列检测器变波长扫描，色谱检测器波长为200-260nm。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于色谱检测器波长依次选择为210nm、252nm和210nm。

10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷d，柴胡皂苷b₂的含量测定结果分别为3.23-4.03mg·g^-1、1.33-0.1.61mg·g^-1、0.06-0.42mg·g^-1、0.99-1.34mg·g^-1。