CN103361309A

CN103361309A - 一种将a型、b型或ab型人红细胞体外转变为o型的方法及其专用试剂与试剂盒

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Publication number: CN103361309A
Application number: CN2013102003527A
Authority: CN
Inventors: 宫锋; 高红伟; 季守平; 李素波; 檀英霞; 张雪; 鲍国强; 王颖丽
Original assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN103361309B

Abstract

本发明公开了一种将A型、B型和AB型人红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的方法及其专用试剂与试剂盒。其中酶解缓冲液是质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液，洗涤缓冲液是生理盐水或PBS。本发明用商品化的产品5％葡萄糖溶液作为酶解缓冲液可以同时给αNAGA和GLA提供高效的酶解环境，易于被临床上接受和使用；本发明可用于将任何非O型红细胞直接转变为O型红细胞而无需过渡转换，试剂配制简便，酶解及洗涤效果好，整个血型转变过程仅需2-3h方法简便，易于操作。

Description

一种将A型、B型或AB型人红细胞体外转变为O型的方法及其专用试剂与试剂盒

技术领域

本发明涉及一种将A型、B型或AB型人红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的方法及其专用试剂与试剂盒。

背景技术

输血是挽救失血患者生命无可替代的方法，但也存在很大风险，包括输血传播疾病风险及非感染性的严重输血风险（Noninfectious serious hazards of transfusion，NISHOT）。其中，输血传播疾病曾经是输血研究热点，但现代检测技术已将这种风险降到极低水平。例如，美国HIV、HCV、HBV的漏检率分别为1/213.5万、1/193.5万和1/205万(Gilliss BM,Looney MR,Gropper MA.Reducing noninfectious risks ofblood transfusion.Anesthesiology.2011,115(3):635-49.)。我国卫生部计划在“十二五”末在全国范围内全面推广核酸检测技术，以杜绝HIV、HBV、HCV等经输血传播的疾病的风险。因此，NISHOT在近年得到越来越多的关注。其中以错误输血(incorrect bloodcomponent transfused，IBCT)的危害最大，虽然血型抗原检测技术的进步及血袋条形码的使用等可降低IBCT的风险，但是由于配型过程中涉及的人为因素较多，因血型鉴定错误、识别错误和人为疏忽等多种主观和客观因素引起的配型错误依旧很难被完全避免。在美国，IBCT发生率仍高达1/1.2万，其中ABO血型不合的错误率为1例/3.3万，死亡率约1例/80万，远高于输血传播疾病的风险，是输血死亡的首要原因（Hendrickson JE,Hillyer CD.Noninfectious serious hazards of transfusion.Anesth Analg.2009,108(3):759-69.）。中国尚未建立IBCT的监控系统，也无相关的权威报道，但ABO血型不合的错误输血同样存在。可见，降低错误输血风险是保障输血安全性的重要问题。

输注通用型红细胞是防止错误输血的有效办法。研究表明，O型红细胞（O RBC）不含A和B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地输给A、B、AB或O型的受血者，因此又被称为“通用型红细胞”。输注通用型红细胞有以下优势：1.从根本上防止因血型不符引起的错误输血，大大提高输血安全性；2.大大节省血型鉴定所需的人力、物力和财力，降低输血成本；3.简化血液采集、储存和配型程序，提高工作效率；4.避免由于血液偏型而导致的血液浪费；5.增加稀有红细胞的利用率。而在战争及紧急状况下，及时输血是挽救严重失血患者的唯一手段，输注通用型红细胞无需考虑受血者的ABO血型，使用简便、迅速、安全，可增强应急输血保障能力，提高患者的存活率。因此，制备、储存和使用通用型红细胞，在临床输血和突发事件中均具有重要意义，这是未来输血医学的一场革命，也是未来输血医学发展的一个重要方向。

ABO血型可分为O、A、B、AB四种，在中国人中O型约占总人口的30％左右，因此将A、B、AB型的红细胞酶解转变成通用的O型红细胞，是增加O型红细胞存有量的重要手段，而ABO血型结构的阐明为血型转变提供了理论基础。ABO血型是由红细胞表面糖蛋白或糖脂末端糖链的种类及排列顺序决定的。O RBC表面的抗原为H抗原；B型红细胞（B RBC）有B抗原和H抗原，B抗原与H抗原相比，不同之处仅在于其非还原端多了一个α-1,3半乳糖苷；A型红细胞(A RBC)较为复杂，又分为A1和A2两种亚型，A2RBC表面含有H抗原和A抗原，A抗原比H抗原多一个由α-1,3糖苷键连接的N-乙酰半乳糖胺，而A1RBC表面的抗原有H抗原、A抗原和A1抗原，A1抗原比A抗原多一个[GalNAcα1→3(Fucα1→2)Galβ]的三糖结构。我国A1亚型占A型的99％以上，即A型血人群中大部分为复杂型抗原；AB RBC在其表面既有B抗原，又有A抗原和H抗原，根据A抗原类型的不同，AB RBC又分为A1B RBC和A2B RBC。人红细胞ABO血型抗原结构的示意图如图1所示。

根据ABO血型抗原结构，人们提出了血型转变的设想。例如，B RBC的B抗原仅比O RBC的H抗原多一个由α1→3糖苷键相连的半乳糖苷，使用α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，简称GLA）便可水解去除半乳糖苷，使之转变为H抗原，从而将B RBC转变为O RBC。B→O血型转变研究始于六十年代，直到八十年代美国纽约血液中心的Goldstein利用从咖啡豆中提取的α-半乳糖苷酶，才首次在真正意义上实现了B→O血型转变，并命名为由B型红细胞酶解转变的O型红细胞(enzymatic convertedgroup O red blood cells from group B red blood cells，简称B-ECO RBC)。但咖啡豆α-半乳糖苷酶用量大，且酶解所需pH为酸性，对红细胞有一定的影响。申请人先前曾从脆弱类杆菌（Bacteriodes.fragilis）中克隆了一个新型的α-半乳糖苷酶基因，经过表达纯化可得到高纯度的α-半乳糖苷酶，实验表明，其酶解B抗原的能力远高于重组咖啡豆α-半乳糖苷酶，并且酶解条件温和，可在pH6.8的中性条件下将红细胞表面的B抗原完全清除。该α-半乳糖苷酶基因记载于专利号为ZL201010189985.9的专利中，该专利的SEQ ID NO:1表示了其氨基酸残基序列。

与B→O血型转变原理类似，α-N-乙酰半乳糖胺酶（α-N-acetylgalactosaminidase，简称αNAGA）能够水解去除A抗原外侧的N-乙酰半乳糖，使之变成H抗原，从而实现A→O血型转变，由此获得的红细胞被称为enzymatic converted group O red blood cellsfrom group A red blood cells，简称A-ECO RBC。申请人2006年从国内脑膜脓毒性金黄杆菌的标本中成功克隆了αNAGA基因(GeneBank号：EU495239)，并在原核细胞中获得高效表达，重组表达的NAGA底物专一性强、比活力高，在接近红细胞的生理条件下，能成功将A型红细胞转变为O型红细胞。该酶记载于专利号为ZL200710176778.8的专利中，该专利序列表的序列3表示了其氨基酸残基序列。

利用上述新型的α-N-乙酰半乳糖胺酶（αNAGA）和α-半乳糖苷酶（GLA），实现了A→O、B→O、AB→O的血型转变。研究中发现新型的α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶发挥酶活性对缓冲液中的离子强度要求较高，低离子强度下与红细胞结合发挥酶解血型抗原的活性，高离子强度下与红细胞脱离，酶解效率降低，因此寻找适合的酶解缓冲液成为所需攻克的难题。已报道α-N-乙酰半乳糖胺酶（A酶）可以在低离子强度的甘氨酸缓冲液中成功实现A→O、AB→B的血型转变，α-半乳糖苷酶（B酶）可以在pH6.8等渗的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中成功实现B→O、AB→A的血型转变，但是甘氨酸缓冲液及柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液没有商品化的产品存在，临床使用时需自行配制，存在操作误差；另一方面，针对不同血型的转变所用的酶解缓冲液不同，不能实现通用，在实际应用中要交叉考虑酶的种类和缓冲液种类双重因素，不仅不方便，而且容易出现混乱而导致严重失误。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种简便可行、实用安全的将A型、B型或AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变方法。

本发明首先提出，质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液可作为通用型酶解缓冲液在将A型、B型或AB型红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）血型转变中应用。

本发明还提出，生理盐水或PBS缓冲液可作为洗涤缓冲液在将A型、B型和AB型红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）血型转变中应用。所述生理盐水为质量浓度0.9％的NaCl溶液，所述PBS缓冲液的配方为：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L。

基于此，本发明将A型、B型或AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变方法，包括以下步骤：

1）用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶处理离体的A型、B型、AB型红细胞，加入5％的葡萄糖溶液进行酶解，将非O型红细胞转变为O型红细胞；

2）洗涤：用生理盐水或PBS洗涤红细胞，清除残留在红细胞上的残留酶，得到O型红细胞。

其中，所述步骤1）具体操作为：用质量百分浓度为5％葡萄糖缓冲液洗涤A型、B型或AB型红细胞，根据红细胞分型加入α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶或两种酶的混合，加入5％的葡萄糖溶液作为酶解缓冲液至红细胞压积为30-40％，在25-26℃缓慢振荡反应1-2小时，将A型、B型或AB型红细胞转变为O型红细胞。

具体的，对A型红细胞，加入0.015-0.06mg/mL压积红细胞，优选0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞）的α-N-乙酰半乳糖胺酶；

对B型红细胞，加入0.005-0.05mg/mL压积红细胞，优选0.005-0.01mg/mL压积红细胞（1-2mg/200mL压积红细胞）的α-半乳糖苷酶；

对AB型红细胞，加入0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞）的α-N-乙酰半乳糖胺酶和0.005-0.01mg/mL压积红细胞（1-2mg/200mL压积红细胞）的α-半乳糖苷酶。

所述步骤1）中优选用质量百分浓度为5％葡萄糖缓冲液洗涤A型、B型或AB型红细胞2次，按1:1(v/v)比例洗涤。

所述α-N-乙酰半乳糖胺酶优选为专利ZL200710176778.8中记载的α-N-乙酰半乳糖胺酶，α-半乳糖苷酶优选为专利ZL201010189985.9中记载的α-半乳糖苷酶。

所述步骤2）中优选用生理盐水或PBS按1:2体积洗涤红细胞4次。

本发明另一目的在于提供一种试剂组配简单的将A型、B型或AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变试剂盒。

该试剂盒，包括α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶、所述的酶解缓冲液和所述的洗涤缓冲液，还包括使用说明书。

其中所述α-N-乙酰半乳糖胺酶优选为专利ZL200710176778.8中记载的α-N-乙酰半乳糖胺酶，所述α-半乳糖苷酶优选为专利ZL201010189985.9中记载的α-半乳糖苷酶；酶解缓冲液为质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液；洗涤缓冲液为生理盐水（质量浓度0.9％NaCl溶液）或PBS（配方：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L）。

本发明通过以上方案，提供了一种将A型、B型或AB型红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的方法及其专用试剂与试剂盒。本发明将A型、B型或AB型红细胞体外转变为O型的机理为：在合适的酶解缓冲液中，αNAGA能够水解去除A抗原外侧的α-N-乙酰半乳糖，使A抗原变成H抗原，从而将A RBC转变为ORBC；GLA能够水解去除B抗原外侧的半乳糖苷，使B抗原转变为H抗原，从而将B RBC转变为O RBC；同时应用αNAGA和GLA，可以清除AB RBC表面的A抗原和B抗原，将AB RBC转变成O RBC。

本发明具有以下优点：

1）用5％葡萄糖溶液作为酶解缓冲液可以同时给αNAGA和GLA提供高效的酶解环境，原因是在5％葡萄糖溶液中αNAGA和GLA都可以与RBC紧密结合而发挥其最佳的酶解效果。此外，由于5％葡萄糖溶液有商品化的产品，而且是在临床上长期应用的大输液制品，因此更容易被临床上接受和使用。

2）适用范围广：本发明可用于将任何非O型红细胞转变为O型红细胞，包括对AB型红细胞，可以一次转变成功，无需如现有技术那样先经过AB→A或AB→B，再转变为O的过程，可直接进行AB→O的血型转变。

3）试剂配制简便（有国家标准），酶解缓冲液（5％葡萄糖溶液）可以从市场上方便地购买到；酶解效率高。

4）血液转型方法简便，易于操作，用时短（整个血型转变过程仅需2-3h）。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为人红细胞ABO血型抗原结构的示意图

图2为Western blot分析α-N-乙酰半乳糖胺酶（A酶）和α-半乳糖苷酶（B酶）与红细胞在不同缓冲液中与红细胞的结合能力

图3为经α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶酶解后的A型、B型、AB型红细胞的血型鉴定结果

图4为流式细胞仪检测在5％葡萄糖溶液中经α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶酶解前后的A型、B型、AB型红细胞表面A抗原、B抗原、H抗原的结果

图5为在5％葡萄糖溶液中经α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶酶解前后的A型红细胞形态的扫描电镜检测结果

具体实施方式

本发明所提供的配制简便、可以为血型转变工具酶提供良好酶解环境即可将A型、B型或AB型红细胞体外转变为O型红细胞（A→O、B→O、AB→O）的血型转变的酶解缓冲液，该酶解缓冲液是质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液。

本发明所提供的用于将A型、B型或AB型红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的血型转变的洗涤缓冲液，是生理盐水（0.9％NaCl溶液）或PBS（配方：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L）。

本发明还提供了一种将A型、B型或AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变方法，可包括以下步骤：

1）用α-N-乙酰半乳糖胺酶和/或α-半乳糖苷酶处理离体的A型、B型、AB型红细胞，将非O型红细胞转变为O型红细胞。具体方法为：用质量百分浓度5％的葡萄糖缓冲液洗涤A型、B型或AB型红细胞，加入剂量为0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞）的α-N-乙酰半乳糖胺酶和/或0.005-0.01mg/mL压积红细胞（1-2mg/200mL压积红细胞）的α-半乳糖苷酶，红细胞压积为30-40％，酶解缓冲液为5％葡萄糖溶液在25-26℃缓慢振荡反应1-2小时，按血站规定的常规方法检测血型，待检测结果为O型时停止酶解；

2）洗涤：用生理盐水或PBS洗涤红细胞，以清除残留在红细胞上的残留酶，得到O型红细胞。

在上述体外血型转变方法中，所述步骤1）中优选用质量百分浓度为5％葡萄糖缓冲液洗涤红细胞2次，按1：1（V/V）进行洗涤。这是两次在酶解之前的洗涤，以将体系更换成酶解缓冲液，去除原来的离子。

所述步骤1）中的α-N-乙酰半乳糖胺酶优选为专利ZL200710176778.8中记载的α-N-乙酰半乳糖胺酶，α-半乳糖苷酶优选为专利ZL201010189985.9中记载的α-半乳糖苷酶。

本发明还提供了一种用于将A型、B型或AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变试剂盒，包括α-N-乙酰半乳糖胺酶（A酶）、α-半乳糖苷酶（B酶）、酶解缓冲液和洗涤缓冲液，还包括使用说明书。

在上述试剂盒中，所述α-N-乙酰半乳糖胺酶优选为专利ZL200710176778.8中记载的α-N-乙酰半乳糖胺酶，α-半乳糖苷酶优选为专利ZL201010189985.9中记载的α-半乳糖苷酶；酶解缓冲液为质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液；洗涤缓冲液为生理盐水（0.9％NaCl溶液）或PBS（配方：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L）。

试剂盒中的使用说明书记载试剂的使用方法，包括：

a.根据红细胞类型选择酶的种类：将A型红细胞转变为O型时选择A酶，将B型红细胞转变为O型时选择B酶，将AB型红细胞转变为O型时选择A酶和B酶。

b.用质量百分浓度为5％葡萄糖缓冲液洗涤A型、B型或AB型红细胞（2次），按1：1（V/V）进行洗涤，离心条件：2500rpm，5min；然后加入5％葡萄糖缓冲液得到红细胞压积为30-40％的红细胞悬液；

c.向A型红细胞液中加入剂量为0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞）的A酶，向B型红细胞液中加入剂量为0.005-0.01mg/mL压积红细胞（1-2mg/200mL压积红细胞）的B酶，或向AB型红细胞液中加入剂量为0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞）的A酶和0.005-0.01mg/mL压积红细胞（1-2mg/200mL压积红细胞）的B酶，在25-26℃缓慢振荡反应1-2小时，按血站规定的常规方法检测血型，待检测结果为O型时停止酶解。

d.酶解结束后，红细胞用生理盐水按1:2（V/V）洗涤4次，得到酶解转变的O型红细胞。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量百分比浓度或体积百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、酶解缓冲液的确定

分别采用常见的缓冲液PBS（配方：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L）、生理盐水（0.9％NaCl溶液）、PCS（77.25mmol/L Na₂HPO₄，11.375mmol/L柠檬酸，53.9mmol/L NaCl，pH6.8）、甘氨酸缓冲液（250mmol/L的甘氨酸缓冲液，pH6.8）和质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液作为酶解缓冲液，酶解体系为1mL，红细胞压积为40％（30％-40％均可），加入不同剂量（见表1）的α-N-乙酰半乳糖胺酶（专利ZL200710176778.8中记载的α-N-乙酰半乳糖胺酶）或α-半乳糖苷酶（专利ZL201010189985.9中记载的α-半乳糖苷酶），26℃（25℃-26℃均可）缓慢上下振荡孵育1小时（1-2小时均可），用血型鉴定试剂鉴定血型是否转变为O型。

本实验中，选择5%葡萄糖溶液是基于以下分析考虑：红细胞的酶解缓冲液首先应是等渗缓冲液，而其它规格如1%、3%的葡萄糖溶液是低渗溶液，8%、10%、20%的葡萄糖溶液是高渗溶液，对红细胞不利。所以本发明中首先予以排除。

检测结果如表1所示，可以看出，在甘氨酸缓冲液和5％的葡萄糖缓冲液中，α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶的酶解效率很高，而在生理盐水、PBS、PCS中，酶解效率较低，不能完全清除A抗原和B抗原。通过红细胞与酶的结合试验（酶与红细胞结合后2500rpm离心5min，取上清进行12％SDS-PAGE检测），发现在生理盐水、PBS、PCS缓冲液中酶与红细胞的结合很少，酶在上清中含量较高，在甘氨酸缓冲液和5％的葡萄糖缓冲液中酶与红细胞结合较多，上清中含量较少（见图2：A、α-N-乙酰半乳糖胺酶B、α-半乳糖苷酶；1.对照（酶量与其它组相同，只是不加红细胞）、2.生理盐水、3.PCS、4.PBS、5.甘氨酸缓冲液、6.0.5％葡萄糖缓冲液）。利用这一特点，可以用生理盐水和PBS作为洗涤缓冲液清除残留在红细胞上的残留酶。

从表1还可以看出，在5％的葡萄糖溶液和甘氨酸缓冲液中可以很好的实现A→O、B→O、AB→O的血型转变，但由于5％葡萄糖溶液有商品化的产品，而且是在临床上长期应用的大输液制品，因此较甘氨酸缓冲液应该更容易被临床上接受和使用。

基于上述检测结果，确定在5％的葡萄糖溶液中酶解A型红细胞的α-N-乙酰半乳糖胺酶的剂量为0.015-0.06mg/mL压积红细胞，优选0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞）；酶解B型红细胞的α-半乳糖苷酶的剂量在0.005-0.05mg/mL压积红细胞均有效，考虑尽量使用较低量的酶，优选为0.005-0.01mg/mL压积红细胞（1-2mg/200mL压积红细胞）；酶解AB型红细胞需两种酶，优选α-N-乙酰半乳糖胺酶的剂量为0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞），α-半乳糖苷酶的剂量为0.005-0.01mg/mL压积红细胞（1-2mg/200mL压积红细胞）。

酶解2h后的红细胞与血型试剂的鉴定结果如图3所示，可以看出，经α-N-乙酰半乳糖胺酶酶解后，A型红细胞表面的A抗原消失；经α-半乳糖苷酶酶解后，B型红细胞表面的B抗原消失；经α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶共同酶解后，AB型红细胞表面的A抗原和B抗原均消失。表明用本发明的试剂（α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶、5％葡萄糖溶液、生理盐水和PBS）及方法可将A型、B型和AB型红细胞转变为O型（即可以实现A→O、B→O、AB→O的血型转变）。

表1酶解红细胞所用酶剂量的摸索及对酶解2h后红细胞的血型鉴定结果

说明：“0”表示不凝集，“1+”表示肉眼可见大颗粒，周围有较多游离细胞，“2+”表示红细胞凝块分成许多凝块，周围可见到游离细胞，“3+”表示红细胞凝集成数小块，“w+”表示可见数个细胞的微弱凝集。

实施例2、洗涤条件的确定

实施例1中将A型、B型和AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）后，用PBS或生理盐水按1:2体积洗涤红细胞4次，2500rpm离心5min弃上清，保留每次洗涤上清和每次洗涤后的红细胞进行检测。

洗涤上清直接用间接ELISA方法检测，红细胞用红细胞裂解液（BD公司产品）按1:9体积裂解后再用间接ELISA方法检测。检测α-N-乙酰半乳糖胺酶用的抗体为兔抗α-N-乙酰半乳糖胺酶的多抗和抗His的单抗，检测α-半乳糖苷酶的抗体为抗α-半乳糖苷酶的兔多抗和鼠单抗。

检测结果表明，用PBS或生理盐水洗涤4次后都可以将残留酶清除到10ng/mL以下。

实施例3、流式细胞仪检测酶解后红细胞表面的抗原

将实施例1中在5％葡萄糖溶液中经α-N-乙酰半乳糖胺酶和/或α-半乳糖苷酶酶解前后的A型（A-ECO）、B型（B-ECO）或AB型（AB-ECO）红细胞和O型红细胞分别用4％多聚甲醛固定过夜（10-12小时），PBS洗涤后取约10⁶个细胞用抗体标记。

A抗原的标记：FITC标记的抗A单抗（终浓度为20μg/mL)室温避光标记1小时，PBS洗2遍，用500μL PBS悬浮，流式细胞仪检测A型红细胞表面的A抗原。

B抗原的标记：抗B单抗(IgM型)标记(终浓度为50μg/mL)：37℃、30min，PBS洗后加入二抗(FITC标记的山羊抗小鼠IgM型抗体,终浓度为100μg/mL)，37℃避光孵育30min，PBS洗后，用500μL PBS悬浮，流式细胞仪检测B型红细胞表面的B抗原。

H抗原的检测：用FITC标记的UEA1(终浓度为40μg/mL)，室温避光标记90min,其余步骤同A抗原。

流式细胞仪检测结果如图4所示，可以看出，A型红细胞表面的A抗原被清除，H抗原增加（参见图4之A幅）；B型红细胞表面的B抗原被清除，H抗原增加（参见图4之B幅）；AB型红细胞表面的A、B抗原被清除，H抗原增加（参见图4之C幅）；酶解后的红细胞抗原检测量与O型红细胞相当，表明酶解后的红细胞已转变为O型红细胞。

该实验进一步说明5％葡萄糖溶液可以作为将A型、B型和AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）红细胞的酶解缓冲液。

实施例4、扫描电镜检测酶解前后的A型红细胞的结构

将实施例1中在5％葡萄糖溶液中经α-N-乙酰半乳糖胺酶酶解前后的A型红细胞固定后用扫描电镜检测红细胞的形态。检测结果如5所示（A、酶解前B、酶解后），显示酶解对红细胞的形态影响不明显。

实施例5、制备将A型、B型和AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变试剂盒

将12mg的α-N-乙酰半乳糖胺酶（专利ZL200710176778.8中记载的，标为A酶）和2mg的α-半乳糖苷酶（专利ZL201010189985.9中记载的，标为B酶）、3袋250ml装的质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液和4袋500ml装的生理盐水（0.9％NaCl溶液）或PBS（配方：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L）共同包装，配有相关使用说明书，得到将A型、B型和AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变试剂盒。以上包装规格的试剂盒适于酶解任意一种A型、B型或AB型红细胞，A型红细胞只用α-N-乙酰半乳糖胺酶，B型红细胞只用α-半乳糖苷酶，AB型红细胞同时使用两种酶。

试剂盒中的使用说明书记载试剂的使用方法，内容包括：

Claims

1.质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液作为将A型、B型或AB型红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）血型转变的酶解缓冲液的应用。

2.生理盐水或PBS缓冲液作为将A型、B型和AB型红细胞体外转变为O型（A→O、B→O、AB→O）血型转变的洗涤缓冲液的应用，所述生理盐水为质量浓度0.9％的NaCl溶液，所述PBS缓冲液的配方为：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L。

3.一种用权利要求1所述的酶解缓冲液和权利要求2所述的洗涤缓冲液将A型、B型或AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变方法，包括以下步骤：

1）用α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶处理离体的A型、B型、AB型红细胞，加入5％的葡萄糖溶液作为酶解缓冲液，将非O型红细胞转变为O型红细胞；

4.根据权利要求3所述的体外血型转变方法，其特征在于：所述步骤1）具体操作为：用质量百分浓度为5％葡萄糖缓冲液洗涤A型、B型或AB型红细胞，根据红细胞分型加入α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶或两种酶的混合，加入5％的葡萄糖溶液作为酶解缓冲液至红细胞压积为30-40％，在25-26℃缓慢振荡反应1-2小时，将A型、B型或AB型红细胞转变为O型红细胞。

5.根据权利要求4所述的体外血型转变方法，其特征在于：

对A型红细胞，加入0.015-0.06mg/mL压积红细胞，优选0.03-0.06mg/mL压积红细胞（6-12mg/200mL压积红细胞）的α-N-乙酰半乳糖胺酶；

6.根据权利要求4或5所述的体外血型转变方法，其特征在于：所述步骤1）中优选用质量百分浓度为5％葡萄糖缓冲液洗涤A型、B型或AB型红细胞2次，按1:1(v/v)比例洗涤。

7.根据权利要求3或4或5或6所述的体外血型转变方法，其特征在于：所述α-N-乙酰半乳糖胺酶优选为专利ZL200710176778.8中记载的α-N-乙酰半乳糖胺酶，α-半乳糖苷酶优选为专利ZL201010189985.9中记载的α-半乳糖苷酶。

8.根据权利要求3或4或5或6或7所述的体外血型转变方法，其特征在于：所述步骤2）中优选用生理盐水或PBS按1:2体积洗涤红细胞4次。

9.一种用于将A型、B型或AB型红细胞转变为O型（A→O、B→O、AB→O）的体外血型转变试剂盒，包括α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶、权利要求1所述的酶解缓冲液和权利要求2所述的洗涤缓冲液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述α-N-乙酰半乳糖胺酶优选为专利ZL200710176778.8中记载的α-N-乙酰半乳糖胺酶，所述α-半乳糖苷酶优选为专利ZL201010189985.9中记载的α-半乳糖苷酶；酶解缓冲液为质量百分浓度为5％的葡萄糖溶液；洗涤缓冲液为生理盐水（质量浓度0.9％NaCl溶液）或PBS（配方：NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g溶于水后定容至1L）。