CN103361292B - 蜡样芽孢杆菌b2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治杂交竹白纹羽病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蜡样芽孢杆菌B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治杂交竹白纹羽病中的应用；该菌株已于2013年6月20日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC？NO：7767，分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus？cereus。未发病杂交竹用上述液体制剂100-200倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，可预防白纹羽病发生。发病杂交竹按50-100倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，连续三年，可效治疗白纹羽病。
Description
技术领域
本发明涉及的是一株蜡样芽孢杆菌B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治杂交竹白纹羽病中的应用。
背景技术
撑×绿杂交竹是南方重要的经济用材竹，也是四川等地引种发展的主要经济竹种之一。近年来，由褐坚壳菌[Rosellinia necatrix(Hart.)Berl.]引起的杂交竹白纹羽病导致根系腐烂、竹整株枯死，造成较大的经济损失，极大地威胁着长江中上游地区退耕还林进程和生态屏障建设。目前主要采用化学防治和营林技术，而生物防治措施研究尚未涉及。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分。该病土传根病侵染循环不明显，发病环境相对稳定，最适宜于生物防治，该技术是生态学领域的一个应用学科分支，是基于生态平衡的原理，引进有益生物基因或基因产物，达到稳定、有效地防治靶标病（虫），生物农药是利用生物活体或者其代谢产物对有害生物进行防治的一类制剂，是生物防治的物质基础和重要手段。
发明内容
本发明人在杂交竹根际中发现蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）一新菌株B2，能有效预防和治疗杂交竹白纹羽病。
该菌株于2010年6月14日分离自四川雅安市天全县杂交竹根际。经形态，生理，分子鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；该菌株已于2013年6月20日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO：7767，分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
B2发酵液经稀释后，对杂交竹白纹羽病菌表现出不同的防治效果，原液至200倍以下效果显著，特别是50倍以下，可基本上控制病害不发生。未发病杂交竹用上述液体制剂100-200倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，可预防白纹羽病发生。发病杂交竹按50-100倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，连续三年，可效治疗白纹羽病。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
（一）蜡样芽孢杆菌B2菌株筛选
1.1供试病原菌
供试病原菌为杂交竹白纹羽病菌[Rosellinia necatrix(Hart.)Berl.]。
1.2芽孢的分离和纯化
取杂交竹根际土壤（表层10cm以下）装入无菌样品袋带回实验室，备用。每份样品称量10g转至装有90mL生理盐水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分混匀后制成土壤悬浮液，放入100℃水浴中加热5min。冷却后，无菌条件下取1mL加入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀得到10-2的样品稀释液，按照此法依次稀释，分别获得10-3、10-4、10-5和10-6的土壤稀释液，取10-3、10-4、10-5和10-6的土壤稀释液各0.1mL，分别采用稀释平板涂布法将其涂布在LB培养基上，倒置在30℃恒温培养箱中，48h后根据菌落形态特征，挑取单菌落进行平板划线，以保证菌落纯度，分别保存于斜面中，保存备用。
1.3生防芽孢杆菌的初筛
将斜面培养的产孢白纹羽病菌用无菌水洗出分生孢子，用移液枪取1mL加入无菌培养皿中，然后倒入45℃左右的PDA培养基15mL，充分混合均匀，冷却后制成含菌平板。采用点菌法，接种分离获得的芽孢杆菌，倒置在30℃恒温培养箱中，24h后观察有无抑菌圈产生进行生防芽孢杆菌的筛选，并做好记录。
分离共获得36株芽孢杆菌，根据菌落形态、颜色、边缘、光学特性以及是否产生色素进行合并后，共25株。分别通过点菌法进行拮抗测定，筛选出杂交竹白纹羽病菌具有较强拮抗做用的菌株4株，占总数的16%。抑菌圈直径达到5mm以上的共3株，其中B2菌株拮抗作用最强，抑菌圈直径均达到14mm左右；其次是B21，抑菌圈直径均达到8mm左右；B2A抑菌圈最小，仅达到5mm。
1.4发酵液活性的测定（复筛）
上述1.3中筛选出抑菌活性较强的芽孢杆菌菌株，活化后分别将其接种于LB肉汤培养液中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养24h后，作为种子液以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养48h后取出，用牛津杯法和打孔法进行抑菌试验，检测发酵液是否有抑菌活性。
待测生防菌株发酵后，静置，取上清液，3500r/min，离心5min，取上清液分别采用打孔法、牛津杯法对指示病原菌进行拮抗测定。
采用打孔法，将指示病原菌分生孢子接种在平板上，直径5mm打孔器打孔后，在孔中加入待测的生防菌发酵液，测得B2A、B2-1基本不产生抑菌圈，而B2菌株抑菌圈直径达到20mm±0.6mm，说明B2对杂交竹白纹羽病菌具有较好的抑制作用。
采用牛津杯法对发酵液进行拮抗活性的测定，测得B2具有一定的拮抗活性，发酵液对病原菌的抑菌圈直径达到13mm±0.5mm，而B2A和B2-1基本看不出抑菌圈，发酵液无抑菌活性。
1.5发酵滤液活性的测定
用移液枪吸取5mL经过24h培养的种子液，加入装有45mL含葡萄糖的LB肉汤培养液的250mL三角瓶中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，36h后，经3000r/min，离心5min后，取上清液，用0.2μm细菌过滤器过滤，获得无细胞发酵滤液。取0.1mL病原菌稀释液涂布于平板上，采用牛津杯法、打孔法测定发酵滤液对病原菌的抑菌活性，重复3次，并设对照，2d后测量抑菌圈直径。
同时对发酵液进行121℃，15min高温处理，按照上述方法检测拮抗活性的有无。
结合1.3和1.4实验结果，筛选出最佳生防芽孢杆菌进行后续试验。
B2菌株经发酵后，取其上清液用细菌过滤器（直径0.2μm）过滤后获得无菌发酵滤液，用打孔法和牛津杯法分别测定抑菌活性测定。结果表明，B2菌株经发酵后获得无细胞发酵滤液对指示病原菌表现出一定的拮抗效果，打孔法和牛津杯法产生的抑菌圈带宽分别为4mm±0.5mm和3mm±0.2mm。发酵滤液经过121℃，15min高温处理后仍具有拮抗活性，说明抑菌代谢产物具有耐热性。
1.6盆栽试验
选取一年生盆杂交竹为实验对象，PDA斜面白纹羽病菌分生孢子（3×103）接种根系一周后，用筛选出的生防菌经发酵后，取其发酵液采用灌根法分不同浓度对竹苗进行灌根处理，每盆200mL，并以无菌水作对照，重复3次，统计杂交竹发病情况。
表1盆栽试验30d后的防治效果
B2发酵液经稀释后，表现出不同的防治效果，原液至200倍以下效果显著，特别是50倍以下，可基本上控制病害不发生。
（二）田间防治实例
1、B2液体制剂制作
①一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL），接种蜡样芽孢杆菌B2后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。
②二级液体种子：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，竹根浸渍液1000mL）经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成蜡样芽孢杆菌B2液体种子。
③液体发酵：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，竹根浸渍液1000mL，竹根浸渍液：10g竹根在1000ml水中煮沸10分钟，除去根残体，取其滤液即得）经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种B2液体种子，接种量10%(体积比)，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B2液体制剂。
④制剂保存：瓶装制剂常温保存半年或低温（4度）1年半不影响防治和治疗效果。
2、田间预防与治疗
①预防处理：未发病杂交竹用上述液体制剂100-200倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根，每株100毫升，每年春季施用一次，可预防白纹羽病发生。
②防治处理：发病杂交竹按50-100倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根及附近土壤淋灌，每株200毫升，春、夏各一次，连续三年，可效治疗白纹羽病。
表2蜡样芽孢杆菌（B.cereus）B2预防效果：未发病杂交竹林地（1年生）
表3蜡样芽孢杆菌（B.cereus）B2治疗效果：发病杂交竹林地（处理1年后）
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.蜡样芽孢杆菌B2菌株，保藏编号为CGMCC NO：7767。
2.含有权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌B2菌株的液体制剂。
3.根据权利要求1所述的B2菌株在防治杂交竹白纹羽病中的应用。
4.根据权利要求2所述的液体制剂的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
①一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种蜡样芽孢杆菌B2后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子；
②二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成蜡样芽孢杆菌B2液体种子；
③液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种B2液体种子，接种量10％体积比，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B2液体制剂；营养肉质培养液：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，竹根浸渍液1000mL，竹根浸渍液：10g竹根在1000ml水中煮沸10分钟，除去根残体，取其滤液即得。
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